Pemanfaatan miroorganismedalam pengembangan obat

Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

Tokoh mikrobiologi dunia

Louis Pasteur Alexander Flemming

Penyakit Infeksi

Disebabkan oleh Mikroba patogen• Bakteri• Fungi• Algae• Parasit

Mikroba pada Gigi

Streptococcus sobrinus

Streptococcus mutans

Karies pada gigi Perlu Antibiotik untukmengobati nya ??

SUBCUTANEOUS MYCOSES

PARACOCCIDIOIDOMYCOSISBLASTOMYCOSIS

Antibotik : sulfamethoxypyridazine and sulfadimethoxine

HISTOPLASMOSIS - DARLING'S DISEASE

Antifungi yang digunakan : Amphotericin B, Ketokenazol

Antibiotik

• Antibiotik didefinisikan sebagai suatu senyawayang dapat membunuh atau menghambatpertumbuhan bakteri.

• Sampai hari ini ketergantungan kita terhadapantibiotik tidak dapat dipungkiri. Di tahun 1998, di United States, dilaporkan sekitar 80 juta resep(prescriptions) antibiotik diterbitkan untukkeperluan penyembuhan penyakit infeksi padamanusia , dan hal itu equivalen dengan sekitar12.500 ton antibiotik dalam 1 tahun .

Secara umum cara kerja antibiotikmerupakan salah satu dari 5 cara berikut :

• Inhibisi sintesis asam nukleat(mis. Rifampicin; Chloroquine)

• Inhibisi sintesis protein (mis. Tetracyclines; Chloramphenicol)

• Aksi pada membran sel (mis. Polyenes; Polymyxin) • Interferensi dgn sistem enzyme

(mis. Sulphamethoxazole) • Aksi pada dinding sel (mis. Penicillin; Vancomycin)

Mekanisme kerja antibiotik pada bakteri

Penemuan baru dan perkembanganantibiotik

• In 1928, Alexander Fleming menemukan penisilinantibiotik pertama yang dihasilkan oleh suatu jamur(mould) Penicillium notatum yang tumbuh di atascawan yagng berisi bakteri Staphylococcus yang sedang tumbuh.

• Selanjutnya walaupun telah diencerkan 800 kali kultur jamur tersebut tetap dapat menghambatpertumbuhan bakteri.

Struktur dasar Penisilin

Alexander Flemming, 1928

Biosintesis penisilin dan sefalosporin

L-α-aminoadipic acid L-cysteineL-valine

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cystein-D-valine

Isopenicilin N

Penicilin N Penicilin G

Deacetoxycephalosporin C

Deacetylcephalosporin C

Penicillium chrysogenumC.Acremoneum, Streptomyces sp.

Cephalosporin C

3 prekursor asam amino:

L-valine, L-cystein, L-α-aminoadipat

Siklisasi 2 tahap

Perkembangan penemuanantibiotik

• Di tahun 1939, Ernst Chain dan Howard Florey mengembangkan cara mengisolasi penisilin dan menggunakannya pada Perang Dunia II.

• Beberapa strategi telah dilakukan untuk menemukan senyawaantibiotik baru. Kandidat yang Potential sebagai natural antibiotics ditemukan dengan cara screening terhadapspesies bakteri dan fungi yang memiliki aktivitas antimikroba.

• Semi-sintetik antibiotik dibuat dengan cara memodifikasinatural antibiotics

• Obat Sintetik dirancang dengan mempelajari mekanismevirulensi bakteri patogen

Pembentukan eritromisin

• Oleh karena penggunaan antibiotik semakinluas, prevalensi resistensi antibiotik olehbakteri sangat meningkat

• Hasil evaluasi di Atlanta USA, 25% dari kasuspneumonia oleh bakteri terbukti resistenterhadap pensilin, sementara 25% lainnyasudah resisten terhadap lebih dari satuantibiotik.

• Kasus retensi mikroba patogenmenaikkandosis nya atau mengganti dengan antibiotikbaru

Resistensi Bakteri

• Kasus resistensi yang meluas, memaksa para penelitiuntuk mencari dan mengembangkan antibiotik baruagar memperoleh obat yang efektif dalam mengobatipenyakit infeksi yang disebabkan oleh bakateripatogen.

• Modifikasi antibiotik yang telah ada termasuk salahsatu usaha meningkatkan kinerja antibiotik

Terjadinya resistensi

• Diperoleh melalui mutasi spontan• Vertical gene transfer• Lateral or horizontal gene transfer

(transduksi, transformasi atau konjugasi)• Inaktivasi enzim terhadap antibiotik

The first rule of antibiotics is try not to use them, and the second rule is try not to use too many of them—Paul L. Marino, The ICU Book

Mekanisme resistensi pada bakteri

• Bakteri menjadi drug-resistant melalui berbagai cara , salah satunya adalah dengan memproduksi enzimyang dapat meng”inaktif”kan molekul antibiotik yang ada sehingga tidak lagi efektif membunuh bakteri

Kasus MRSA (Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus)

Supergerm

Proses multiresistensi antibiotik

Beberapa contoh kasus resistensi

Penggunaan antibiotik dalam makanan ternakmerupakan salah satu penyebab resistensibakteri terhada antibiotik . Beberapa bakteriyang ada dalam makanan (Foodborne), sepertiSalmonella, E. coli dan Campylobacter adalahbakteri yang bersimbiosis dengan hewan ternaksapi dan ayam.

Salah satu penggunaan yang salah : antibiotik untukmengatasi penyakit yg disebabkan virus

Usaha memerangi resistensi bakteri

• Para peneliti mempelajari bentuk molekul dari enzimyang dihasilkan oleh drug-resistant bacteria, kemudian mencoba untuk mendesain "fighter molecules" yang secara tepat dapat men”deaktif”kanenzim tersebut, sehingga bakteri akan sensitifkembali terhadap antibiotik yang sama.

• Mencari sumber antibiotik baru

The discovery of antibiotics

• Untuk memerangi terjadinya kejadianresistensi bakteri, industri farmasi harus selalumengembangkan penelitian bersamaperguruan tinggi dan lembaga penelitiandalam menemukan antibiotik baru demi mempertahankan efektivitas pengobatanpenyakit infeksi dengan antibiotik

Top 25 Biotechnol Company (2011)

• Abbott Laboratories • Amgen, Inc. • AstraZeneca Pharmaceuticals • Bayer HealthCare Pharmaceuticals • Biogen Idec Inc. • Boehringer Ingelheim

Pharmaceuticals, Inc.• Bristol-Myers Squibb Company • Chiron Corporation• Eli Lilly and Company • Forest Laboratories. • Genentech, Inc. • Genzyme Corporation

• Gilead Science, Inc. • GlaxoSmithKline LLC • Johnson & Johnson • Merck / Schering-Plough

Pharmaceuticals• MGI Pharma, Inc./ Eisai• Millennium Pharmaceuticals, Inc. • Mylan Pharmaceuticals Corporation • Novaris Pharmaceuticals Corporation• Pfizer• Roche Diagnostics Corporation • Sanofi-Aventis • Takeda Pharmaceuticals North America,

Inc. • Teva Pharmaceutical Industries Ltd.

• Kebutuhan antibiotik sejak 1940 sampaisekarang (Sumber : Timeline of Antibiotics)

Berbagai cara penemuan obat baru

Obat baru untuk TBSetelah Percobaan klinik tahap I dilanjutkan kepada tahap II dan III, persetujuan dari Badan pengawasanMakanan dan Obat (FDA) diberikankepada Antibiotik bagi TB itu kinidiberi nama diarylquinolones. Diarylquinolone TMC207 merupakanpreparat baru yang mempunyaipotensi sebagai antituberculosis. Mekanisme antituberculosis daridiarylquinolone TMC207 ini adalahdengan cara menghambat sintetase-ATP dari kuman Mycobaterium.

Pegagan bahan alam untukmengobati TB

• Centella asiatica

Tahapan pencarian antibiotik baru

• Skrining awal kandidat antibiotik(in-vitro, in-silico)

• Uji mutagenitas (uji Ames)• Uji toksisitas (LD50)• Uji aktivitas antimikroba (MIC,MBC) (CLSI

method)• Uji potensi antibiotik (Kirby Bauer method)

Peneliti Norwegian meneliti new antibiotik baru dari bakteriyang ada di laut sekitar perairan Norwegia. The Norwegian

University of Science and Technology (NTNU) dan PusatPenelitian SINTEF telah melakukan bioprospecting selama 5-6

tahun untuk mencari seenyawa-senyawa penting yang dihasilkanoleh bakteri laut (marine bacteria). Bakteri-bakteri tersebut

dievaluasi fisiologi dan genetik nya, dilakukan screening modern dan dicoba produksinya di laboratorium fermentasi

Metabolit sekunder untuk pertahanan diri atau kompetisi dengan mikroba lain

Seleksi mikroorganisme

• Mikroorganisme yang digunakan dalam proses fermentasibiasanya bukan yang wild type. Umumnya telah dilakukanmodifikasi atau mutasi secara genetik untuk menghasilkangalur mikroba yang unggul

• Strain improvement (pemuliaan galur) dilakukan secarafisik, kimia maupun rekayasa genetik

• Mutasi fisik misalnya dengan penyinaran ultraviolet , x-rays• Mutasi kimia dengan senyawa kimia tertentu, • Mutasi biologi dengan cara gene amplification,dimana

beberapa salinan gen pengkode enzim yang terlibat dalamproduksi antibiotik yang dituju dapat diinsersikan ke dalamsuatu plasmid, lalu di insersi kan ke dalam sel host untukproduksi.

Menguji aktivitas antimikroba

Perubahan morfologi pada Streptomyces.sp saatdiinduksi oleh senyawa atau molekul tertentu

Uji sensitivitas mikroba terhadapbeberapa antibiotik

Menggali potensi mikroorganismedalam penemuan obat baru

• Perbaikan prosedur Culturing• Extremophiles• Endophytes• Mikroba laut• Biosintesis Kombinatorial

Perbaikan Prosedur Culturing

• Perkembangan terbaru tentang teknik pengambilanbiakan dari alam (terutama dari laut dan tanah) (sea-water and soil)

• Gel-encapsulated single cells (gel micro-droplets = GMDs)

• Proses ini mencegah terjadinya “over growth” olehmikroba yang cepat tumbuh, dan dapat menstimulasipertumbuhan mikroba yang termasuk slow-growing microbes

• Mikroba yang sulit di biak kan secara in-vitro

Acuan dalam mengeksplor tanah untukmenggali potensi mikroba nya serta guideline

untuk proses produksi

Extremophiles

• Mikroba yang hidup dalam habitat yang ekstrem, misalnya yang bersifat asidofil(acidic sulfurous hotsprings) atau alkalofil(danau yang bersifat alkali)

• Mikroba termofil dan hipertermofil• Mikroba yang hidup dalam air yang

mengandung metal atau lingkungan denganpolusi tinggi

Endophytes

• Mikroba yang berasosiasi dengan tumbuhan• Dapat bersifat simbiosis atau patogenik• Banyak ditemukan senyawa bioaktif baru,

contoh: • kakadumycin dari endofit Streptomycete pada

tanaman Grevillea pteridifolia, • Endofit Aspergillus nidulans anti-cancer

agent

Mikroba laut

• Sedimen laut dalam merupakan sumber yang potensial karena terdapat bakteri Actinomyceteyang unik , misalnya Salinospora yang menghasilkan senyawa Salinosporamide Asuatu inhibitor proteasome yang sangat poten

• Endo-symbiosis antara fungi dan bakteri : Rhizopus dan Burkholderia menghasilkansenyawa Rhizoxin , semula dikembangkansebagai pest-control, lalu menjadi anticancer drug

Biosintesis Kombinatorial

• Penggalian informasi tentang peran dan fungsi PKS (Polyketide Synthase Enzymes) dan gen nya padabeberapa bakteri

• Peran dan fungsi NRP (Non-Ribosomal peptide synthetase)

• Kombinasi informasi ini dapat diarahkan kepadasintesis senyawa baru melalui proses rekayasagenetik

• Contoh : sintesis Epothilone dari myxobacteriumSorangium cellulosum

Bagaimana produksi antibiotik /obatbaru setelah ditemukan kandidat nya?

Pengembangan skala lab

Pengembangan skala pilot

Pengembangan skala industri

• Antibiotik diproduksi dalam skala industrimelalui proses fermentasi atau total sintesiskimia atau kombinasi kedua nya

• Proses Fermentasi dengan menggunakaninokulum mikroba minimum dalam large containers (100,000–150,000 liters or more), dengan pengaturan oksigen dialirkan ke dalammedium cair, pengaturan suhu dan pH.

• Oleh karena antibiotik adalah metabolitsekunder, jumlah nya harus dikontrol dengan baikuntuk mendapatkan hasil yang optimal. Setelahproses produksi selesai, antibiotik yang terbentukharus diekstraksi, isolasi, dan dimurnikan.

• Berbagai cara pemurnian telah dikembangkanantara lain melalui cara kromatografi penukarion, adsorpsi, atau pengendapan kimiawi .

• Cara sintesis kimia melibatkan reaksi berantaiyang menggunakan pelarut organik, katalis danproses kimia lainnya.

Tahapan dalam proses fermentasi

• Formulasi medium untuk mikroorganisme• Sterlisasi medium dan persiapan lainnya• Produksi yang aktif dan inokulasi kultur murni• Ekstraksi produk dan pemurnian• Penanganan produk limbah (effluent)

Proses fermentasi secara umum :contoh Sacharomyces cereviseae

Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksimenggunakan mikroorganisme

• Sistem batch (kultur curah)• Sistem fed-batch (kultur curah umpan)• Sistem continuous (kultur sinambung)

Batch Fed-batch Continuous

Fermentor

Kontrol pada proses fermentasicontoh : produksi Sefalosforin

Modifikasi sruktur antibiotik kuinolon

MODIFIKASI EFEK

Satu atom Fluor di posisi C-6 Meningkatkan aktivitas inhibisi DNA girase

Atom Fluor kedua pada posisi C-8 Meningkatkan absorpsi , memperpanjangwaktu eliminasi, memingkatkanfototoksisitas

Gugus Piperazin pada posisi C-7 Meningkatkan aktivitas terhadap bakteriGram negatif Staphylococci danPseudomonas

Alkilasi cincin C-7 Memperbaiki aktivitas terhadap bakteriGram positif

Gugus metil pada atom N di cincin C-7 piperazin

Meningkatkan eliminasi dan memperbaikibioavalibilitas

Uji bakteriostatik dan bakterisida

KLT untuk identifikasi kandungan metabolitsekunder dari biakan mikroba

Proses PCR dilanjutkan dengan Elektroforesis

1 2 3 4 5NOTE :

1. DNA marker λ/HindIII/EcoRI2. DNA plasmid pSTA14 (isolated)3. DNA plasmid pSTA14 (PCR product/ positive control)4. DNA transformants (PCR product with plasmid)5. DNA mutant (PCR product / negative control)

Conclusion : gene niaD in pSTA14 plasmid proved existed in transformant cells

811 bp546,15 bp

KONDISI DI INDONESIA

• Bidang usaha kefarmasian nasional masihdidominasi oleh perdagangan (trading), danmasih sangat lemah dibidang manufakturing

• Perusahaan farmasi lokal, yang sampai saat iniberjumlah 344 masih terkonsentrasi padapengembangan formula, yang bahan bakuobatnya 95% masih diimpor

• Untuk pasar antibiotik, amoksisilin masih merupakan kebutuhan tertinggi

Sumber :

• Kebutuhan tahun 2007: Amoksisilin 892,7 ton; Ampisilin: 79,8 ton; Sefalosporin dan derivatnya 260 ton (Data Deputi I Badan POM)

• Baru satu industri di Indonesia yang memproduksiamoksisilin dengan bahan baku diimpor dari China (6-APA dan Dane Salt)

• Perlunya kemandirian nasional dalam pemenuhankebutuhan amoksisilin

Sumber :

Fakta dan Data

NO JENIS ANTIBIOTIK JUMLAH PRODUKSI (Kg) PRESENTASE (%)

1 Amoxicillin 892,713.21 72.54

2 Cefadroxil 224,775.96 18.26

3 Ampicillin 79,763.39 6.48

4 Cefotaxime 13,148.97 1.07

5 Ceftriaxone 13,039.53 1.06

6 Cefixime 3,234.18 0.26

7 Cefuroxim 1,623.03 0.13

8 Cefotiam 1,319.63 0.11

9 Ceftazidime 682.55 0.06

10 Cefradin 371.61 0.03

Produksi Sepuluh Antibiotik Terbesar (2007) Sumber :

Biosintesis penisilin dan turunannya (Ferreira et al., 2000)Sumber :

Topik Penelitian dengan Mahasiswa S3 di Sekolah Farmasi ITB

• Fermentasi antibiotik Sefalosporin dan Pemuliaan galurCephalosporium acremonium dengan cara mutasi sinar uv

• Produksi antikolesterol (Lovastatin) dari Aspergillus terreus danMonascus purpureus dengan cara fermentasi

• Pemuliaan galur Aspergillus terreus melalui fusi protoplast, copy gen produksi.

• Studi Transformasi genetik Monascus purpureus. • Studi protein spesifik dari Mycobacterium tuberculosis untuk

mencari kandidat vaksin baru untuk penyakit TBC• Fermentasi dan modifikasi pigmen karotenoid dari jamur oncom

Neurospora sp. untuk pewarna obat, makanan dan kosmetika• Produksi Plantaricin dari Lactobacillus plantarum sebagai anti

Candida albicans

Contoh Topik Penelitian Mahasiswa S1 dan S2 di Sekolah Farmasi ITB dalam rangka pencarian

senyawa antimikroba

Antibacterial Activity of Cinnamomum cassia L. Barks and Salvadora persica L.

Heartwood Extracts Against Dental Caries BacteriaMarlia Singgih, Irda Fidrianny, Khaliesah Aimi Kamal Ariffin

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF INDONESIAN TEA LEAVES (Camellia sinensis L.) AGAINST Streptococcus mutans ISOLATED FROM DENTAL CARIES

PATIENTSMarlia Singgih Wibowo, Irda Fidrianny, Novrita Lestia Utami

AKTIVITAS ANTIMIKROBA REMPAH – REMPAH TERHADAP BAKTERI PATOGEN PADA MAKANAN

KERANG LAUT Marlia Singgih, Amanda Bernadine

FORMULASI SAMPO ANTI KETOMBE YANG MENGANDUNG

TEA TREE OIL DAN PENGUJIAN AKTIVITAS SEDIAAN TERHADAP MALASSEZIA FURFUR

Jessie S.Pamudji, Marlia Singgih, Angelia

Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, 000 – 000 DOI10.1002/mnfr.200700282Research Article

Identification and quantification of methylglyoxal as the dominant antibacterial constituent of Manuka (Leptospermum scoparium) honeys from New Zealand

Elvira Mavric, Silvia Wittmann, Gerold Barth, and Thomas HenleInstitute of Food Chemistry, Technische Universitt Dresden, Dresden, GermanyInstitute of Microbiology, Technische Universitt Dresden, Dresden, Germany