PENGARUH TERAPI KOMBINASI KURKUMIN DAN VITAMIN E …repository.ub.ac.id/434/1/Prastyawati, Citra...
63
PENGARUH TERAPI KOMBINASI KURKUMIN DAN VITAMIN E TERHADAP EKSPRESI Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) DAN B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) PADA UTERUS TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL KANKER MAMMAE HASIL INDUKSI DMBA (7,12-dimetilbenz ( ) antrasen) SKRIPSI Oleh: CITRA YULI PRASTYAWATI 105130100111027 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2017
Transcript of PENGARUH TERAPI KOMBINASI KURKUMIN DAN VITAMIN E …repository.ub.ac.id/434/1/Prastyawati, Citra...
PENGARUH TERAPI KOMBINASI KURKUMIN DAN VITAMIN E TERHADAP EKSPRESI Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS)
DAN B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) PADA UTERUS TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL KANKER MAMMAE
HASIL INDUKSI DMBA (7,12-dimetilbenz ( ) antrasen)
SKRIPSI
Oleh: CITRA YULI PRASTYAWATI
105130100111027
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2017
PENGARUH TERAPI KOMBINASI KURKUMIN DAN VITAMIN E TERHADAP EKSPRESI Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS)
DAN B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) PADA UTERUS TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL KANKER MAMMAE
HASIL INDUKSI DMBA (7,12-dimetilbenz ( ) antrasen)
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh:
CITRA YULI PRASTYAWATI 105130100111027
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2017
ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin Dan Vitamin E Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) Dan B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) pada Uterus Tikus (Rattus Norvegicus) Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA
(7,12-Dimetilbenz ( ) Antrasen)
Oleh : CITRA YULI PRASTYAWATI
NIM. 105130100111027
Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji
pada tanggal 26 Mei 2017 dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Pembimbing I Pembimbing II
Dra. Anna Roosdiana, M.App, Sc drh. Dyah Ayu Oktavianie, M. Biotech NIP. 19580711 199203 2 002 NIP. 19841026200812 2 004
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
DES NIP. 19600903 198802 2 001
iii
LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : Citra Yuli Prastyawati NIM : 105130100111027 Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan Penulis Skripsi berjudul:
Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin Dan Vitamin E Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) Dan B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) pada Uterus Tikus (Rattus Norvegicus) Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA (7,12-Dimetilbenz ( ) Antrasen)
Dengan ini menyatakan bahwa: 1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan
tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran. Malang, 6 Juni 2017 Yang menyatakan. (Citra Yuli Prastyawati) NIM. 105130100111027
iv
Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin Dan Vitamin E Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) Dan B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) pada Uterus Tikus (Rattus Norvegicus) Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA (7,12-
Dimetilbenz ( ) Antrasen)
ABSTRAK
Kanker mammae merupakan tumor ganas yang tumbuh di dalam jaringan mammae yang dapat dipicu oleh agen karsinogenik DMBA (Dymethylbenz( ) Anthrasen). Kanker mammae akibat induksi DMBA mempunyai kemungkinan menyebar ke uterus. Pengobatan kanker selain dengan operasi dan kemoterapi juga bisa menggunakan herbal. Kurkumin merupakan senyawa polifenik yang mempunyai efek sebagai antiproliferasi, pemacu apoptosis dan antioksidan. Vitamin E merupakan antioksidan primer yang mampu memutus reaksi pembentukan radikal bebas. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh terapi kombinasi Kurkumin dengan Vitamin E pada ekspresi iNOS dan BCL-2 pada uterus tikus model kanker mammae yang diinduksi DMBA. Pembuatan hewan model kanker mammae dilakukan dengan induksi DMBA dosis 10 mg/kg BB dan estrogen dosis 20.000 IU/kg BB. Penelitian ini dibagi 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negatif (KN), kontrol positif (KP), perlakuan satu (P1) terapi dengan Kurkumin 48mg/kg BB dan Vitamin E 300 IU/ekor, perlakuan dua (P2) dosis 72mg/kg BB dan 200 IU/ekor, dan perlakuan tiga (P3) dosis 108mg/kg BB dan 100 IU/ekor. Ekspresi iNOS dan BCL-2 diamati dengan Imunohistokimia dan dianalisis dengan uji ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Tukey ( ). Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi kombinasi Kurkumin dan Vitamin E berpengaruh nyata terhadap penurunan ekspresi iNOS dan BCL-2 pada uterus tikus model kanker mammae.. Dosis efektif yaitu 72 mg/kg BB kurkumin dan 200 IU/ekor vitamin E yang mampu menurunkan ekspresi iNOS sebesar 20,29% dan menurunkan ekspresi BCL-2 sebesar 61,65%. Pemberian kombinasi Kurkumin dan Vitamin E dapat digunakan sebagai terapi kanker mammae yang memberikan efek pada uterus.
Kata kunci : Kanker Mammae, Uterus, DMBA, iNOS, BCL-2, Kurkumin, Vitamin
E
v
The Influence of Therapy by Combining Curcumin and Vitamin E towards the Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) And B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) in Uterus Mammary Cancer Rats (Rattus Norvegicus) Model Induced by
DMBA(7,12-Dimetilbenz ( ) Antrasen)
ABSTRACT
Mammary cancer is malignant tumor that grow inside mammary tissue and can be triggered by carcinogenic agent DMBA. Mammary cancer induced by DMBA have possibility to spread to uterus. Another way to stop cancer besides surgery and chemotherapy can be supported by herbal therapy. Curcumin is one of the polyphenols type that has an effect as antiproliferation, trigger apoptosis and antioxidant. Vitamin E is a primary antioxidant that can cut reaction of free radical formation. The purpose of this research was to discover the effect of combination of curcumin with vitamin E toward expression of INOS and BCL-2 in uterus of rats mammary cancer model induced by DMBA. The development of rats mammary cancer model was done by induction of DMBA with dose 10mg/kg bodyweight and estrogen with dose 20.000 IU/kg bodyweight. This research divided 5 groups that is Negative Control Group, Positive Control Group, First Treatment (P1) used 48 mg/kg bodyweight curcumin and vitamin E 300 IU each rat, second Treatment (P2) used 72 mg/kg bodyweight curcumin and vitamin E 200 IU each rat, third Treatment (P3) used 108 mg/kg bodyweight curcumin and vitamin E 100 IU each rat. The expression of INOS and BCL-2 were monitored using immunohistochemistry method. Data analysis was done by one way ANOVA test and continued by Tukey test ( ). The result of the research showed that combination of curcumin and vitamin E significantly reduced expression of INOS and BCL-2 in uterus of rat mammary cancer. The most effective dose is curcumin with 72 mg/kg of bodyweight and vitamin E with dose 200 IU each rat that have an ability to decrease 20.29% of iNOS expression and decrease 61.65% of BCL-2 expression. As conclusion, combination of curcumin and vitamin E can become one of mammary cancer therapy that can affect to uterus.
Keywords : Mammary cancer, iNOS, BCL-2, Curcumin, Vitamin E, DMBA, Uterus
vi
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat sehingga penulis
dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
Kurkumin dan Vitamin E terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase
(iNOS) dan B Cell Lymphoma-2 (BCL-2) pada Uterus Tikus (Rattus Norvegicus)
Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA (7,12 dimethylbenz (
Penulisan skripsi ini adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Kedokteran Hewan di Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.
Dengan penuh rasa hormat dan ketulusan hati, penulis mengucapkan
terimakasih kepada segenap pihak yang secara langsung maupun tidak langsung telah
membantu dalam penyusunan skripsi ini. Ucapan terimakasih terutama kepada:
1. Dra. Anna Roosdiana, M. App, Sc sebagai Pembimbing I atas segala
bimbingan, bantuan, kesempatan, nasihat dan arahan yang diberikan kepada
penulis.
2. Drh. Dyah Ayu O.A.P., M. Biotech sebagai Pembimbing II atas segala
bimbingan, bantuan, kesempatan, nasihat dan arahan yang diberikan kepada
penulis.
3. Drh. Aulia Firmawati, M. Vet selaku Penguji I yang bersedia meluangkan
waktu, nasihat dalam memberikan saran dan kritikan yang membangun kepada
penulis.
4. Drh. Desi Wulansari, M. Vet selaku Penguji II yang telah meluangkan waktu,
nasihat serta banyak memberikan saran dan kritikan yang membangun kepada
penulis.
vii
5. Dekan Fakultas Kedokteran Hewan atas
bantuan dan dukungan yang diberikan secara langsung maupun tidak langsung.
6. Staff Laboratorium Mikrobiologi FKH, Laboratorium Farmakologi Kedokteran
UB, Laboratorium Biokimia FMIPA UB yang telah membantu selama
penelitian berlangsung.
7. Alm. Papa Sarmadun dan Mama Nety yang selalu memberikan doa dan
dukungan tiada henti.
8. Saudaraku tercinta Tika, Neneng, Bagus, Olan, Alya yang selalu memberikan
dukungan yang tak terhingga.
9. Kelompok penilitian kanker mammae yang saling membantu dari proses awal
hingga akhir.
10. Teman-teman seperjuangan di FKH 2010 atas kontribusi, bantuan, dan inspirasi
dalam mengerjakan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, maka saran
dan kritik yang konstruktif dari semua pihak sangat di harapkan demi penyempurnaan
selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak, khususnya penulis
dan para pembaca pada umumnya.
Malang, Juni 2017
Penulis
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... ii LEMBAR PERNYATAAN ......................................................................... iii ABSTRAK ................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................... v KATA PENGANTAR ................................................................................... vi DAFTAR ISI .................................................................................................. viii DAFTAR TABEL ......................................................................................... x DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xii DAFTAR SINGKATAN ............................................................................... xiii BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 LatarBelakang ................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ........................................................................... 4 1.3 Batasan Masalah .............................................................................. 4 1.4 Tujuan Penelitian ............................................................................. 5 1.5 Manfaat Penelitian ........................................................................... 6
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kanker Mammae ............................................................................. 7 2.1.1 Etiologi .................................................................................. 7 2.1.2 Patomekanisme ....................................................................... 7 2.2 DMBA (Dymethyl Bez( )Anthracene) ............................................. 8 2.3 Hubungan Kanker Mammae dengan BCL-2 ................................... 10
2.4 Hubungan Kanker Mammae dengan iNOS ..................................... 11 2.5 Pengaruh Kanker Mammae terhadap Uterus ................................... 12 2.6 Kurkumin ......................................................................................... 12 2.7 Vitamin E ......................................................................................... 13 2.8 Hewan Coba Tikus .......................................................................... 14
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Kerangka Konsep ............................................................................. 16 3.2 Hipotesis Penelitian .......................................................................... 19 BAB 4 METODELOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 20 4.2 Alat dan Bahan ................................................................................. 20 4.3 Rancangan Penelitian........................................................................ 21 4.4 Variabel Penelitian............................................................................ 23 4.5 Prosedur Penelitian ........................................................................... 24 4.6 Analisa Data ...................................................................................... 27 BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN
ix
5.1 Pemeriksaan Hewan Model Kanker Mammae ................................. 28 5.2 Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin dan Vitamin E Terhadap Ekspresi
iNOS pada Uterus Tikus (Rattus norvegicus) Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA .......................................... 29 5.3 Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin dan Vitamin E Terhadap Ekspresi
BCL-2 pada Uterus Tikus (Rattus norvegicus) Model Kanker Mammae Hasil Induksi DMBA .......................................... 35
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ...................................................................................... 41 6.2 Saran ................................................................................................ 41 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 42 LAMPIRAN .................................................................................................. 50
x
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman Tabel 4.1 Tabel Rancangan Penelitian ............................................................. 22 Tabel 5.1 Rata-rata Presentase Area Ekspresi iNOS pada Uteus Tikus ......... 31 Tabel 5.2.Rata-rata Presentase Area Ekspresi iNOS pada Uteus Tikus ......... 37
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman Gambar 2.1 Struktur kimia tokoferol .............................................................. 14 Gambar 3.1 Kerangka Konseptual ................................................................... 16 Gambar 5.1 Ekspresi IHK iNOS pada Uterus Tikus........................................ 30 Gambar 5.2 Ekspresi IHK iNOS pada Uterus Tikus ....................................... 36
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman 1. Kerangka Operasional Penelitian ................................................................. 48 2. Timeline Penelitian ..................................................................................... 49 3. Perhitungan Dosis DMBA ........................................................................... 50 4. Perhitungan Dosis Estrogen ......................................................................... 50 5. Perhitungan Dosis Kurkumin ...................................................................... 51 6. Perhitungan Dosis Vitamin E ........... .......................................................... 51 7. Perhitungan Pelarut Kurkumin dan Vitamin E ........................................... 51 8. Pembuatan Larutan DMBA ................... ............................................................... 52 9. Pembuatan Larutan Kombinasi Kurkumin dan Vitamin E .......................... 52 10. Pembuatan PFA .......................................................................................... 52 11. Pengambilan Organ Uterus ........................................................................ 53 12. Pembuatan Preparat Uterus ........................................................................ 53 13. Teknik IHK ................................................................................................ 54 14. Nodul Mammae Tikus ............................................................................... 55 15. Uji Normalitas Data (One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test) ............... 56 16. Uji Homogenitas Varian ............................................................................ 56 17. Uji ANOVA................................................................................................ 57 18. Uji Tukey..................................................................................................... 59 19. Presentase Area Ekspresi BCL-2 dan Perhitungan .................................... 59 20. Presentase Area Ekspresi iNOS dan Perhitungan ...................................... 60 21. Sertifikat Laik Etik ..................................................................................... 61
xiii
DAFTAR LAMBANG DAN ISTILAH
Simbol/Singkatan Keterangan Ahr Arilhydrocarbon Receptor BCL-2 B Cell Lymphoma 2 CYP Cytochrome DAB Diamone Benzidine DCIS Ductal Carcinoma In Situ DMBA Dymethyl Bez( )Anthracene DNA Deoxyribonucleic Acid KN Kontrol Negatif KP Kontrol Positif IHK Imunohistokimia iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IU International Unit NO Nitrid Oxide ONOO- Peroksinitric PAH Polisiklik Aromatik Hidrocarbon PFA Paraformaldehid PBS Phospat Buffer Saline P53 Protein 53 RAL Rancangan Acak Lengkap ROS Reactive Oksigen Species SA-HRP Strep Avidin-Horseradish Peroxidase
1
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker adalah salah satu penyebab utama kematian pada hewan
kesayangan (Bonnett et al., 2005). Penyakit degeneratif ini merupakan salah
satu penyakit pada hewan kesayangan, khususnya anjing dan kucing (Gunanti
dkk, 2009). Gupta (2008) dalam penelitiannya menyatakan kejadian tumor
mammae pada anjing adalah 25,85%.
Kanker dapat dipicu oleh karsinogen, yaitu karsinogen eksogen dan
endogen. Karsinogen eksogen adalah pemicu kanker yang berasal dari faktor
lingkungan seperti bahan kimia. Karsinogen endogen adalah pemicu kanker
yang berasal dari dalam tubuh seperti hormon dan genetik (Todorova, 2006).
Fungsi utama dari estrogen adalah meningkatkan proliferasi dan pertumbuhan
sel khusus dalam tubuh yang berperan dalam perkembangan sebagian besar
karakteristik kelamin sekunder betina (Britt, 2011). Pada uterus dan organ
kelamin luar, efek estrogen adalah untuk memperbesar ukuran organ genitalia
tersebut (Guyton, 2006).
Estrogen sangat berperan penting dalam regulasi diferensiasi dan
proliferasi dari sel epitel mammae normal (Guyton, 2006). Estrogen dapat
meningkatkan produksi protease seperti pro-cathepsin D sehingga membuat
sel tumor semakin invasif. Estrogen juga berperan dalam meregulasi protein
kunci yang terlibat dalam pengontrolan apoptosis, yakni BCL-2 (Rugo,
2007).
2
Karsinogen yang biasa digunakan untuk menginduksi karsinogenesis
kelenjar mammae pada hewan adalah 7-12-dimethylbenz-[a] anthracene
(DMBA). DMBA merupakan senyawa yang termasuk dalam golongan
polyaromatic hydrocarbons (PAH). Senyawa DMBA adalah prokarsinogen
yang akan menjadi aktif setelah dimetabolisme oleh sitokrom p-540 dan hasil
metabolisme secara kovalen akan berikatan dengan DNA untuk membentuk
DNA adducts yang dapat berubah menjadi pemicu pembentukan tumor
(Lenoir et al., 2005). Kerusakan sel akibat DMBA akan merangsang
munculnya gen p53. Bila terjadi mutasi pada gen p53 dapat mengakibatkan
disregulasi gen ini sehingga terjadi kegagalan apoptosis dan gen BCL-2
meningkat. Sel yang rusak terus mengalami replikasi dan akhirnya terjadi
kanker (Lumongga, 2008).
Hasil metabolisme dari DMBA akan memicu munculnya ROS. ROS akan
memicu munculnya makrofag yang menghasilkan radikal bebas salah satunya
NO. Nitric Oxide (NO) yang dikatalis oleh inducible nitric oxide synthase
(iNOS) berfungsi sebagai sistem pertahanan tubuh dari antigen yang
dihasilkan dari makrofag dan neutrofil. NO merupakan radikal oksigen bebas
yang dapat menyebabkan stres oksidatif pada jaringan yang mengalami
kerusakan. Katalisator iNOS juga terlibat dalam proses autoimun dan
inflamasi jaringan (Yoon et al., 2009). Pada kejadian kanker mammae sangat
banyak didapati inflamasi, salah satu parameter untuk melihat inflamasi yaitu
ekspresi iNOS. NO merupakan salah satu produk dari ROS akibat hasil
3
metabolit DMBA. ROS yang terbawa sirkulasi darah ke organ lain salah
satunya uterus, dapat menyebabkan inflamasi pada uterus (Closa et al., 2004).
Persentasi kejadian penyakit kanker mammae pada hewan cukup tinggi.
Hingga saat ini, penanggulangan penyakit kanker umumnya dilakukan
dengan tindakan operasi, penggunaan radiasi, kemoterapi. Sistem pengobatan
dengan kemoterapi dan radiasi memiliki beberapa kelemahan, antara lain
karena sifat toksiknya dapat menurunkan fungsi fisiologis organ-organ tubuh
lainnya. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa pengobatan herbal dapat
membantu proses penyembuhan ataupun memperpanjang masa hidup
individu (Gunanti, 2009). Kurkumin merupakan senyawa polifenolik yang
memiliki aktivitas farmakologi seperti antiinflamasi, antioksidan, antitumor,
dan antikanker (Aggarwal et al., 2005). Penelitian oleh Jurenka (2009)
dengan menggunakan dosis kurkumin 48 mg/kg BB membutikan bahwa
kurkumin dapat digunakan sebagai antiinflamasi. Venkatesen dan Rao (2000)
melaporkan bahwa kurkumin dapat menetralkan ROS melalui mekanisme
penangkapan gugus radikal bebas.
Vitamin E (tokoferol) merupakan antioksidan primer, senyawa fenol yang
mampu memutus reaksi berantai pembentukan radikal bebas asam lemak.
Pemberian atom hidrogen yang berasal dari hidroksi senyawa fenol dapat
membetuk senyawa yang lebih stabil (Maulida, 2010). Kunci utama
pecegahan stres oksidatif adalah dengan mejaga keseimbangan antioksidan
dan radikal bebas (Sofia, 2006). Vitamin E dengan dosis 400 IU/ekor dapat
menurunkan produksi ROS (Maslachah dkk, 2008).
4
Induksi DMBA pada mammae, tidak hanya mempengaruhi organ
mammae saja tetapi juga adanya kemungkinan mempengaruhi organ lain
seperti uterus. Penggunaan kurkumin dan vitamin E untuk terapi kanker
mammae sudah banyak dilakukan pada kanker mammae yang diinduksi
dengan DMBA secara oral. Namun, terapi kanker mammae menggunakan
kombinasi kurkumin dan vitamin E pada tikus model kanker mammae yang
diinduksi secara subkutan pada daerah mammae belum banyak dilakukan.
Hal ini mendorong penulis untuk melakukan penelitian lebih lanjut tentang
kemungkinan tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E terhadap
ekspresi BCL-2 pada organ uterus tikus model kanker mammae akibat
induksi DMBA ?
2. Bagaimana pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E terhadap
ekspresi iNOS pada organ uterus tikus model kanker mammae akibat
induksi DMBA ?
1.3 Batasan Masalah
1. Hewan model yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih
(Rattus norvegicus) strain Sprague-Dawley betina, berumur 10 minggu
dengan berat badan 150-200 gram yang didapat dari UPHP (Unit
Pengembangan Hewan Percobaan) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini sudah mendapatkan
5
persetujuan laik etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya
dengan nomor 189-KEP-UB.
2. Pembuatan hewan coba kanker mammae dilakukan berdasarkan
modifikasi dari Cordeiro dan Kaliwal (2011), yaitu induksi DMBA
Multiple Low Dose (MLD) dengan dosis 10mg/kg BB yang diberikan
melalui injeksi subkutan pada mammae tikus. Induksi DMBA diberikan
setiap 2 hari sekali sebanyak 10x induksi. Induksi estrogen dengan dosis
20.000 IU/kg BB secara intramuskular (Naciff et al., 2002) setiap 4 hari
sekali sebanyak 5 kali iduksi.
3. Pemberian terapi kombinasi kurkumin dengan vitamin E secara oral.
Kombinasi kurkumin dan vitamin E yang diberikan adalah 48 mg/kg BB
kurkumin dan 300 IU/ekor vitamin E, 72 mg/kg BB kurkumin dan 200
IU/ekor vitamin E, 108 mg/kg BB kurkumin dan 100 IU/ekor vitamin E
yang diberikan sekali setiap hari selama 21 hari.
4. Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah ekspresi BCL-2 dan
iNOS pada uterus tikus dengan menggunakan metode imunohistokimia.
1.4 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E
terhadap ekspresi iNOS pada uterus tikus (Rattus norvegicus) model
kanker mammae yang diinduksi DMBA
2. Untuk mengetahui pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E
terhadap ekspresi BCL-2 pada uterus tikus (Rattus norvegicus) model
kanker mammae yang diinduksi DMBA
6
1.5 Manfaat Penelitian
1. Untuk menambah pengetahuan di dunia kedokteran hewan tentang
pengaruh pemberian kombinasi kurkumin dan vitamin E terhadap kanker
mammae hasil induksi DMBA.
2. Untuk menambah bahan informasi mengenai modifikasi terapi yang dapat
dilakukan dalam dunia kedokteran hewan khususnya pemberian kombinasi
kurkumin dan vitamin E.
7
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kanker Mammae
Kanker mammae adalah tumor ganas yang menyerang jaringan mammae.
Kanker mammae tumbuh progesif dan relatif cepat membesar (Sharma et al.,
2010). Sel kanker adalah sel normal yang mengalami mutasi atau perubahan
genetik dan tumbuh tanpa terkoordinasi dengan sel-sel tubuh lain. Kanker dapat
menyebar ke bagian lain dari seluruh tubuh (metastasis) (Purwoastuti, 2008).
2.1.1 Etiologi
Kanker dapat dipicu oleh karsinogen, yaitu karsinogen eksogen
dan endogen. Karsinogen eksogen adalah pemicu kanker yang berasal dari
faktor lingkungan seperti virus dan bahan kimia. Karsinogen endogen adalah
pemicu kanker yang berasal dari dalam tubuh seperti hormon, genetik dan
sistem imun (Todorova, 2006). Faktor lain yang dapat menjadi faktor
predisposisi terjadinya kanker mammae adalah umur, jenis kelamin, berat
badan dan ras (Gupta, 2012).
2.1.2 Patomekanisme
Proses pembentukan kanker dimulai dengan adanya mutasi gen
oleh karsinogen (Hanahan, 2011). Mutasi gen yang terjadi dapat disebabkan
oleh paparan senyawa karsinogen golongan polisiklik aromatik hidrokarbon
(PAH), seperti DMBA. Senyawa DMBA akan menjadi aktif setelah
dimetabolisme oleh sitokrom p450 dan akan berikatan dengan DNA untuk
membentuk DNA adduct yang memicu pembentukan tumor (Lenoir et al.,
2005).
8
Kerusakan DNA memicu munculnya mutasi. Mutasi gen dapat
mengakibatkan adanya perubahan informasi DNA sehingga menyebabkan
kerusakan DNA (Loeb & Loeb, 2000). Tubuh mempunyai gen tumour
supressor yang mengkode sel protein khusus untuk menghentikan replikasi
jika DNA mengalami kerusakan (Ghosh & Bose, 2005). Ketika sistem
pertahanan ini berfungsi, maka sel yang mengalami mutasi DNA tidak bisa
mengirimkan materi genetik yang rusak ke sel anak. Kerusakan DNA yang
terjadi akan di repair oleh gen p53. Jika kerusakan terlalu luas, maka proses
yang dikenal sebagai kematian sel secara terprogram (apoptosis) akan terpicu
sehingga menghasilkan penghancuran sel sendiri (Ghosh & Bose, 2005).
Ketika gen p53 mengalami mutasi, maka pertumbuhan sel tidak terkendali
dan mengaktivasi BCL-2 sehingga apoptosis tidak terjadi yang akhirnya akan
menjadi kanker (Lumongga, 2008).
2.2 DMBA (7,12-dimetylbenz ( ) antrasen)
Senyawa 7,12-dimetilbenz ( ) antrasen (DMBA) adalah zat kimia yang
termasuk dalam polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) dengan rumus kimia
C20H16 yang merupakan immunosupressor sekaligus karsinogen spesifik organ
yang poten (Miyata et al., 2001). DMBA dapat ditemukan di dalam air, tanah
maupun udara. Kontaminasi DMBA biasa terjadi melalui peroral, inhalasi
maupun kontak kulit. DMBA juga dilaporkan sebagai karsinogen poten pada
hewan coba, dengan target utama pada kulit dan glandula mammae (Widyarini
dkk, 2010).
9
DMBA pada aktivasi metabolitnya memproduksi karsinogen pokok,
yaitu dihydrodiol epoxide, yang dapat memediasi transformasi neoplastik dengan
menginduksi kerusakan DNA, dan membentuk ROS berlebihan, serta memediasi
proses inflamasi kronis. DMBA, menimbulkan karsinogenesis melalui kerusakan
oksidatif jaringan dan sel yang dimediasi radikal bebas. Produksi besar-besaran
ROS karena stress oksidatif pada sistem dapat menginduksi kerusakan rantai dan
dapat memodifikasi basa DNA sehingga terjadi mutagenesis dan karsinogenesis
(Manoharan et al., 2009).
DMBA merupakan karsinogen sekunder (prokarsinogenik), sehingga
harus mengalami aktivasi metabolisme untuk menghasilkan karsinogenesis.
Proses metabolisme DMBA menjadi senyawa yang lebih toksik yaitu DMBA
dioksidasi oleh sitokrom P-450 CYP1B1 menjadi DMBA 3,4-epoksida, kemudian
diikuti hidrolisis epoksida oleh enzim mEH (mikrosomal epoksid hidrolase)
menjadi metabolit proximate carcinogen DMBA-3,4-diol. Metabolit ini kemudian
dioksidasi oleh CYP1A1 atau CYP1B1 menjadi metabolit ultimate
carcinogen yaitu DMBA-3,4-diol-1,2-epoksida yang memiliki kemampuan
membentuk DNA adducts (Miyata, 1999).
Jalur metabolisme DMBA melalui aktivasi enzim sitokrom P-450
menjadi intermediate reaktif yang dapat merusak DNA, yaitu terbentuknya
epoksida dihidrodiol dan kation radikal. Epoksida dihidrodiol akan mengikat
gugus amino ekosiklik purin DNA secara kovalen menjadi bentuk adduct stabil,
sedangkan kation radikal akan mengikat N7 atau C8 purin menjadi bentuk adduct
10 tak stabil yaitu depurinisasi menjadi tempat yang kehilangan apurinik pada DNA
(Melendez-Colon, 1999).
2.3 Hubungan Kanker Mammae dengan BCL-2 (B Cell Lymphoma 2)
BCL-2 (B-cell lymphoma 2) dan beberapa protein sitoplasma lainnya
merupakan kunci regulator apoptosis (Schimmer, 2001). BCL-2 terletak di
membran luar mitokondria dan retikulum endoplasma (Annis dkk, 2001). BCL-2
menghambat apoptosis jalur intrinsik sehingga disebut sebagai protein anti-
apoptosis. BCL-2 menghambat pelepasan sitokrom C dari mitokondria ke sitosol
dengan mempertahankan integritas membran mitokondria (Wang, 2001).
Pada proses apoptosis dapat terjadi kegagalan pada pathway, yang akan
menyebabkan terjadinya kanker. Kegagalan ini lebih sering terjadi pada intrinsik
pathway karena intrinsik pathway ini lebih sensitif dan paling sering disebabkan
oleh mutasi gen p53. Gen p53 ini merupakan gen tumor supresor yang
terakumulasi bila DNA mengalami kerusakan. Fungsi dari p53 ini yaitu mencegah
replikasi sel pada sel yang rusak secara genetik melalui penghentian siklus sel
pada fase G1 atau interfase, sehingga sel mempunyai waktu untuk repair. Selain
itu gen ini juga berfungsi untuk mencetuskan apoptosis bila kerusakan sel cukup
luas dan terjadi kegagalan pada repair (Ghosh dan Bose, 2005).
Bila terjadi mutasi pada gen p53 dapat mengakibatkan disregulasi gen ini
sehingga terjadi kegagalan apoptosis dan gen BCL-2 meningkat. Sel yang rusak
terus mengalami replikasi dan akhirnya terjadi kanker (Lumongga, 2008).
11 2.4 Hubungan Kanker Mammae dengan iNOS (Inducible Nitric Oxide
Synthase)
Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) adalah enzim pengkatalis arginin
menjadi nitric oxide (NO). NO merupakan radikal bebas yang tidak bermuatan,
molekulnya berukuran kecil, bersifat lipofilik dan hidrofilik sehingga mudah
melewati membran plasma dan sitoplasma untuk menuju sel target tanpa
membutuhkan reseptor (Ariesta, 2011). Toksisitas NO berkaitan dengan
kemampuan bergabung dengan singlet oxygen (O2
menyebabkan fragmentasi DNA, oksidasi lipid dan protein. Aktivitas NO yang
berlebih akan memacu kerusakan sel dan jaringan akibat stres oksidatif dan
inflamasi (Weetman, 2002).
Kejadian kanker mammae dapat menyebabkan produksi Reactive Oxygen
Species (ROS) yang meningkat (Weimer et al.,2000). Produksi ROS yang
berlebihan akan merangsang terjadinya inflamasi dengan pengeluaran sitokin
proinflamasi (TNF alfa, IL-1, IL-6) dari monosit dan makrofag (Wang, 2007).
ROS yang dihasilkan bersifat sangat reaktif dan dapat menyebar ke seluruh tubuh.
Makrofag yang teraktivasi oleh antigen akan melakukan respiratory burst melalui
konversi molekul oksigen menjadi reactive oxygen intermediate (ROI) dan
memproduksi nitric oxide (NO). Produksi NO diawali dengan aktivasi makrofag
yang akan memulai perubahan L-arginin menjadi L-citrulin. Proses ini
membutuhkan Flavin Adenin Dinucleotidase (FAD), Flavinmononucleaotidase
12 (FMN), NADPH dan bentuk tereduksi dari bioprotein (BH4) dengan bantuan
enzim nitric oxide synthase (NOS) (Tomer, 2003).
2.5 Pengaruh Kanker Mammae terhadap Uterus
Uterus merupakan salah satu organ reproduksi betina yang sensitif
terhadap hormon selain ovarium dan mammae. Pada kondisi kanker mammae,
hormon esterogen dalam kadar yang tinggi juga ikut berpengaruh pada kondisi
uterus. DMBA yang digunakan sebagai zat karsinogen juga dapat menghasilkan
radikal bebas (ROS) yang akan ikut ke dalam sirkulasi dan menyebar ke organ
lain, termasuk uterus. ROS yang menempel pada uterus, dapat menyebabkan
inflamasi pada uterus (Closa et al, 2004).
2.6 Kurkumin
Kurkumin merupakan senyawa polifenolik yang memiliki aktivitas
farmakologi seperti antiinflamasi, antioksidan, antitumor, dan antikanker
(Aggarwal et al., 2005). Kurkumin biasanya berbentuk bubuk kuning yang larut
dalam minyak, tanpa rasa dan aroma (Yadav et al, 2011). Penelitian yang
dilakukan beberapa tahun terakhir, menunjukkan bahwa kurkumin mempunyai
potensi sebagai antikanker, selain sebagai antiradang, kurkumin juga
diindikasikan sebagai antioksidan. Keaktifan antioksidan kurkumin pertama kali
dibuktikan dengan kemampuan kurkumin dalam menghambat lipid peroksidase.
Kurkumin mampu menekan proliferasi sel kanker melalui mekanisme
menginduksi apoptosis (Murwanti et al., 2002).
Kurkumin dapat memacu proses apoptosis melalui beberapa cara,
misalnya dengan memacu aktivasi caspase 3, caspase 7, dan caspase 9 yang dapat
13 menstimulasi sitokrom C untuk lepas dari mitokondria dan melakukan apoptosis
(Aggarwal, 2005). Mekanisme kurkumin sebagai antiproliferasi dikaitkan dengan
kemampuan kurkumin menghambat NF- dimana NF- merupakan faktor
transkripsi gen-gen seperti BCL-2 dan BCL-XL yang bersifat antiapoptosis dan
cyclin I yang bersifat antiproliferatif. Penghambatan NF- dapat memacu
terjadinya apoptosis dan dapat menekan proliferasi pada uterus (Bharti et al.,
2003). Venkatesen dan Rao (2000) melaporkan bahwa kurkumin dapat
menetralkan ROS melalui mekanisme penangkapan gugus radikal bebas.
2.7 Vitamin E
Vitamin E (tokoferol) merupakan antioksidan primer, senyawa fenol yang
mampu memutus reaksi pembentukan radikal bebas asam lemak. Pemberian atom
hidrogen yang berasal dari hidroksi senyawa fenol dapat membetuk senyawa yang
lebih stabil (Maulida, 2010). Antioksidan ini akan melindungi dari serangan
radikal bebas dan menghentikan reaksi berantai atau oksidasi merusak. Selain itu
vitamin E akan mencegah kerusakan DNA yang menyebabkan mutasi, dan unsur
tubuh yang kaya lemak melawan oksidasi (Lamid, 1995). Kunci utama
pencegahan stress oksidatif adalah dengan menjaga keseimbangan antioksidan
dan radikal bebas (Sofia, 2006). Antioksidan vitamin E mempunyai kandungan
tocoferol yang larut dalam lemak sehingga vitamin E dapat bekerja pada membran
sehingga dapat melindungi membran dan komponen dalam membran sel lain dari
oksidasi radikal bebas (Almatsier, 2009). Radikal-radikal yang terbentuk juga
dapat dideaktifkan dengan jalan mengikatnya dengan senyawa yang dikenal
radical scavenger. Pada tahap permulaan, radical scavenger akan memberikan
14 atom hidrogen kepada radikal bebas, sehingga dapat menghambat pembentukan
radikal peroksida dan memutuskan rantai reaksi. Radikal antioksidan yang
terbentuk bersifat stabil dan dapat bergabung langsung dengan radikal lain untuk
membentuk senyawa yang inert (Wulaningsih, 2008).
Gambar 2.1 Struktur kimia tokoferol (Colombo, 2010)
2.8 Hewan Coba Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Hewan coba adalah hewan yang dipelihara dengan sengaja dan
digunakan sebagai hewan uji coba. Tikus mudah didapatkan dan mudah di
kembangbiakkan sehingga sering digunakan untuk berbagai macam penelitian
medis. Tikus banyak di pakai sebagai hewan model kanker mammae yang
diinduksi dengan DMBA (Kubatka et al., 2002).
Hewan model kanker mammae umumnya menggunakan tikus putih
(Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley dikarenakan memiliki beberapa
keunggulan sehingga memudahkan dalam melakukan penelitian. Keunggulan
tersebut menurut Ranasmita (2008) tikus Sprague Dawley mempunyai tubuh yang
lebih besar dengan berat badan tikus betina antara 250-300 gram. Tikus Sprague
Dawley lebih sensitif terhadap pembentukan tumor (Meiyanto dkk., 2007).
15
Tikus yang digunakan sebagai hewan coba dalam penelitian adalah
Rattus norvegicus strain sprague-dawley yang memiliki klasifikasi sebagai
berikut (Adiyati, 2011) :
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Sub filum : Vertebrata
Klass : Mammalia
Ordo : Rodentia
Sub Ordo : Sciurognathi
Familia : Muridae
Sub Familia : Murinae
Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus
Galur/Strain : Sprague Dawley
16
BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka Konsep
Gambar 3.1 Kerangka Konseptual
AhR+DMBA Estradiol (E2)
ARNT
Sitokrom (P450)
DMBA 3,4 diol 1,2 epoksida
ROS
Makrofag
NO
iNOS
BCL-2
Kerusakan DNA
P53
BCL-2 Inflamasi
Uterus
Kurkumin dan Vitamin E
Apoptosis
HER-2
Proliferasi sel
Kanker Mammae Estrogen + ER
Estrogen DMBA Tikus
17
Keterangan :
: Variabel bergantung : Variabel bebas
: Efek DMBA : Efek kurkumin + vit. E
: Penurunan : Peningkatan
: Penghambatan
Pada penelitian ini dibuat model kanker mammae dengan hewan coba
tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi dengan DMBA. Paparan DMBA akan
mengakibatkan stimulasi reseptor AhR (Aryl hydrocarbon Receptor). DMBA
akan berikatan dengan Ahr di sitoplasma kemudian menuju nukleus untuk
berikatan dengan Ahr Nuclear Translocator Protein (ARNT) kemudian akan
menginduksi enzim sitokrom P450. Toksisitas DMBA terhadap jaringan dipicu
oleh hormon estrogen (estradiol) yang juga menjadi ligand reseptor estrogen dan
substrat pada oksidasi Sitokrom P450. Estradiol akan memicu Sitokrom P450
untuk memetabolisme DMBA menjadi bentuk aktif DMBA-3,4-diol-1,2-epoksida
yang memiliki kemampuan membentuk DNA adducts. Interaksi DNA adduct
dapat menyebabkan kerusakan DNA dan memutasi gen p53 sehingga mengalami
inaktivasi. Gen p53 yang mengalami inaktivasi menyebabkan aktifnya gen BCL-2
yang menghambat apoptosis. Selain itu proto-onkogen seperti HER-2 akan
berubah menjadi onkogen yang memicu proliferasi sehingga proliferasi sel
meningkat dan terjadi kanker.
DMBA dalam tubuh juga dapat menyebabkan produksi ROS (Reactive
Oxygen Species) yang berlebih. Keadaan tersebut tidak hanya mempengaruhi
18
organ target, namun juga dapat mempengaruhi organ lain seperti uterus. Produksi
ROS yang berlebih dapat menyebabkan kerusakan sel. Kerusakan sel akan
mengaktivasi makrofag dan memediasi munculnya mediator inflamasi. DMBA
yang diinduksi ke dalam tubuh dinggap sebagai benda asing oleh tubuh. Nitric
Oxide (NO) yang dikatalis oleh inducible nitric oxide synthase (iNOS) berfungsi
sebagai sistem pertahanan tubuh dari antigen yang dihasilkan dari makrofag. NO
merupakan radikal oksigen bebas yang dapat menembus membran sel tanpa
membutuhkan reseptor. Produksi nitric oxide (NO) menunjukkan adanya
pertahanan imun yang dapat dilihat melalui ekspresi nitric oxide sythaze (iNOS).
Kanker mammae akibat DMBA akan memicu estrogen untuk berikatan
dengan reseptor estrogen yang ada di uterus. Ikatan antara estrogen dan reseptor
estrogen pada uterus akan mengaktivasi BCL-2 yang merupakan gen
antiapoptoasis, sehingga terjadi peningkatan ekspresi BCL-2 pada uterus.
Hewan model kanker mammae yang telah diinduksi DMBA kemudian
diterapi menggunakan kombinasi dari kurkumin dengan vitamin E. Vitamin E
tocopherol yaitu antioksidan yang larut dalam lemak. Kurkumin
yang merupakan senyawa polifenol ini juga mengandung antioksidan,
antiproliferasi dan dapat memacu apoptosis. Antioksidan yang terkandung dalam
kurkumin dan vitamin E dapat menangkap radikal bebas dan dapat menetralkan
ROS melalui penangkapan gugus radikal bebas. Kurkumin dapat memacu
terjadinya apoptosis dan dapat menekan proliferasi pada uterus.
19
3.2 Hipotesis Penelitian
Pemberian Kombinasi Kurkumin dengan Vitamin E dapat digunakan
sebagai terapi kanker mammae yang ditandai dengan adanya penurunan ekspresi
BCL-2 dan iNOS pada uterus hewan model kanker mammae yang diinduksi oleh
DMBA.
20
BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 Januari 2014 di
Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran, Laboratorium Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
4.2 Bahan dan Alat
Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini adalah kandang tikus,
timbangan hewan, spuit 1 ml, spuit 3 ml, botol steril, gloves, masker, kertas
alumunium foil, pot organ, scalple blade, mortar, tabung ukur, tabung reaksi,
cawan petri, pinset, sendok kecil, pengaduk, timbangan analitik, mikroskop.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah hewan tikus (Rattus
norvegicus) strain Sprague-Dawley umur 10-12 minggu dengan berat 150-200
gram, DMBA (7,12- ), alkohol 70%, normal saline,
aquades steril, estrogen, minyak biji bunga matahari, kurkumin, vitamin E, larutan
paraformaldehyde (PFA) 4%, Phosphate Buffer Saline (PBS), antibodi primer
iNOS (Antirabbit iNOS), antibodi primer BCL-2 (Antirabbit BCL-2), antibodi
sekunder (Goat Antirabbit IgG berlabel biotin), CMCNa, blok parafin, larutan
H2O2 , Strep Avidin Horse Radish Peroxidase (SA-HRP), air, pakan standar
berupa buras crumble, etanol, xylol.
21
4.3 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang di gunakan dalam penelitian ini adalah
Rancangan Acak Lengkap (RAK). Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok
yaitu kelompok kontrol negatif (KN), kontrol positif (KP), perlakuan satu (P1),
perlakuan dua (P2), perlakuan tiga (P3). Kontrol negatif (KN) adalah tikus tanpa
perlakuan kecuali diberi makan dan minum, kontrol positif (KP) adalah tikus yang
di induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB,
perlakuan satu (P1) adalah tikus yang di induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg
BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB dan diterapi kombinasi kurkumin dengan dosis
48mg/kg BB dan vitamin E dengan dosis 300 IU/ekor, perlakuan dua (P2) adalah
tikus yang di induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000
IU/kg BB dan diterapi kombinasi kurkumin dengan dosis 72mg/kg BB dan
vitamin E dengan dosis 200 IU/ekor, sedangkan perlakuan tiga (P3) adalah tikus
yang di induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB
dan diterapi kombinasi kurkumin dengan dosis 108mg/kg BB dan vitamin E
dengan dosis 100 IU/ekor.
Penentuan jumlah sampel ditentukan berdasarkan rumus (Kusriningrum,
2008).
P(n-
5(n-1) 15
5n-5 15
5n 20
n 4
Keterangan :
p = jumlah kelompok
n = jumlah ulangan yang diperlukan
22
Berdasarkan perhitungan di atas untuk 5 kelompok diperlukan jumlah
sampel atau ulangan 4 kali dalam setiap kelompok. Sehingga diperlukan 20 ekor
hewan coba.
Tabel 4.1 Tabel Rancangan Penelitian
No. Kelompok Perlakuan 1. Kontrol Negatif (KN) Tikus tanpa perlakuan 2. Kontrol Positif (KP) DMBA dosis 10 mg/kg BB dan
estrogen 20.000 IU/kg BB 3. Perlakuan Satu (P1) DMBA dosis 10 mg/kg BB dan
estrogen 20.000 IU/kg BB. Terapi kurkumin 48mg/kg BB dan vitamin E 300 IU/ekor
4. Perlakuan Dua (P2) DMBA dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB. Terapi curcumin 72mg/kg BB + vitamin E 200 IU/ekor
5. Perlakuan Tiga (P3) DMBA dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB. Terapi kurkumin 108mg/kg BB dan vitamin E 100 IU/ekor
4.4 Variabel Penelitian
Variabel dalam penelitian ini adalah :
Variabel bebas : Induksi 7,12- (DMBA) dan
estrogen, terapi kombinasi kurkumin dengan vitamin E
Variabel tergantung : Ekspresi iNOS dan ekspresi BCL-2
Variabel kendali : Tikus (Rattus norvegicus) betina umur 10-12 minggu
dengan berat badan 150-200 gram, pakan buras crumble,
minum ad libitum dan dalam suhu ruang.
23
4.5 Prosedur Penelitian
4.5.1 Persiapan Hewan Coba
Persiapan hewan coba dilakukan dengan melakukan aklimatisasi selama
1 minggu di Laboratorium Farmakologi Kedokteran Universitas Brawijaya. Tikus
diberikan pakan buras crumble yang disusun berdasarkan standar Association of
Analytical Communities (AOAC) dan diberi air minum adlibitum pada semua
tikus. Semua tikus ditimbang dan diperoleh berat badan 150-200 gram. Tikus
dibagi dalam 5 kelompok yaitu kontrol negatif (KN), kontrol positif (KP),
perlakuan 1 (P1), perlakuan 2 (P2), perlakuan 3, (P3). Tikus dikandangkan dalam
kandang yang berukuran 17,5 x 23,75x 17,5 cm.
4.5.2 Preparasi DMBA
Preparasi DMBA dilakukan dengan menimbang DMBA sesuai dosis
yaitu 10 mg/kg BB, untuk perhitungan dosis lebih lengkap dapat dilihat pada
lampiran. DMBA dihaluskan terlebih dahulu sebelum dilakukan pengenceran.
DMBA diencerkan dengan minyak biji bunga matahari dan larutan NS (Normal
Saline) dengan perbandingan 3 : 1, untuk perhitungan pengenceran DMBA dapat
dilihat pada Lampiran 3. Setelah diencerkan kemudian dihomogenkan dan
dimasukkan dalam wadah tertutup.
4.5.3 Pembuatan Hewan Model Kanker
Pembuatan hewan model kanker dilakukan dengan menginduksi DMBA
yang diinjeksikan di bagian mammae tikus secara subkutan dengan dosis yang
sudah ditentukan yaitu 10 mg/kg BB. Induksi dilakukan setiap 2 hari sekali
24
selama 10 kali dan juga diinduksi estrogen dengan dosis 20.000 IU/kg BB secara
intramuskular sebanyak 0,2 ml/ekor setiap 4 hari sekali sebanyak 5 kali induksi.
4.5.4 Pemeriksaan Tikus Pasca Induksi DMBA
Pemeriksaan tikus paska induksi DMBA bertujuan untuk mengetahui
terbentuknya kanker mammae pada hewan coba. Penimbangan berat badan tikus
dilakukan setelah induksi DMBA selesai dan dilakukan palpasi pada daerah
mammae untuk mengetahui perkembangan kanker secara makroskopis.
4.5.5 Preparasi Kurkumin dan Vitamin E
Preparasi kurkumin dilakukan dengan menimbang kurkumin dengan dosis
untuk P1 adalah 48 mg/kg BB, P2 adalah 72 mg/kg BB, P3 adalah 108 mg/kg BB,
untuk perhitungan dosis kurkumin dapat dilihat pada Lampiran 5. Dosis vitamin
E yang digunakan untuk P1 adalah 300 IU/ekor, P2 adalah 200 IU/ekor, P3 adalah
100 IU/ekor. Kurkumin dihaluskan terlebih dahulu kemudian dicampur dengan
CMCNa sebanyak 5%, untuk perhitungan dosis selengkapnya dapat dilihat pada
lampiran. Vitamin E dicampurkan dengan kurkumin dan CMCNa kemudian
dihaluskan secara bersamaan. Pengenceran kurkumin dan vitamin E dilakukan
dengan penambahan larutan NS sebanyak 1 ml/ekor. Setelah diencerkan
kemudian dihomogenkan dan dimasukkan dalam wadah tertutup.
4.5.6 Terapi Kurkumin dan Vitamin E
Terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E dilakukan dengan cara sonde ke
lambung tikus. Setiap tikus disonde sebanyak 1 ml yang mengandung kombinasi
kurkumin dan vitamin E sesuai perlakuan masing-masing. Terapi dilakukan setiap
24 jam sekali selama 21 hari.
25
4.5.7 Pembedahan dan Pengambilan Organ
Pembedahan dilakukan setelah hewan coba tidak sadarkan diri dengan
memasukkan pada wadah berisi kloroform. Hewan diposisikan rebah dorsal
kemudian dilakukan penyayatan di bagian abdomen. Setelah organ pada bagian
abdomen terlihat dipreparasi untuk dilakukan pengambilan organ uterus. Organ
yang telah diambil dicuci dengan NaCl fisiologis 0,9% untuk selanjutnya
dimasukkan dalam pot berisi larutan PFA 4%.
4.5.8 Pembuatan Preparat Histopatologi
Organ uterus difiksasi pada PFA 4 % kemudian direndam menggunakan
etanol bertingkat (70%, 80%, 90%, 95% ). Setelah itu dilakukan clearing
menggunakan xylol I dan xylol II masing-masing 30 menit. Selanjutnya
dilakukan embedding pada blok parafin dan didinginkan pada suhu 4°C. Organ
uterus dalam blok parafin dipotong dengan ukuran 3-4 µm menggunakan rotary
microtome. Potongan organ dicelupkan dalam air hangat suhu 38-400C lalu
diambil menggunakan objek glass dan dikeringkan dengan hot plate, kemudian
diinkubasi pada suhu 38-400C selama 24 jam. Pembuatan preparat uterus secara
lengkap dapat dilihat pada Lampiran 12.
4.5.9 Pengamatan Ekspresi iNOS dan BCL-2 dengan Imunohistokimia
Pengamatan ekspresi iNOS dan BCL-2 dilakukan dengan metode
imunohistokimia. Langkah pertama preparat uterus direndam ke dalam xylol I,
xylol II masing-masing selama 3 menit, kemudian direndam ke dalam ethanol
absolut , ethanol 90% (2 menit), ethanol 80% (2 menit), ethanol 70% (1 menit),
ethanol 30% (1 menit) dan aquades selama 1 menit kemudian preparat dicuci
26
dengan PBS pH 7,4 selama 3 x 5 menit. Unmusking dalam buffer sitrat pH 6 dan
edta pH 8 selama 10-20 menit pada suhu suhu 9oC lalu angkat slide dan cuci
dengan aquades. Selanjutnya ditetesi H2O2 3% selama 10 menit untuk
menghentikan enzim peroksidase dalam jaringan. Dicuci kembali dengan PBS
pH 7,4 selama 5 menit selama 3 kali. Kemudian diinkubasi dengan antibodi
primer (anrirabbit iNOS dan antirabbit BCL-2) dalam PBS tween pada suhu 4 oC
selama 24 jam lalu dicuci dengan PBS pH 7,4. Kemudian diblok dengan susu
skim 1% dalam PBS tween selama 30 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya
diinkubasi dengan antibodi sekunder goat anti-rabbit berlabel biotin selama 1 jam
dengan suhu ruang. Dicuci kembali dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali.
Preparat ditetesi dengan SA-HRP (Strep Avidin Horse Radish Peroxidase) selama
45 menit dengan suhu ruang selam 45 menit. Kemudian dicuci kembali dengan
PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali. Ditetesi dengan DAB (Diamano Benzidine)
selama 30 menit dengan suhu ruang. Dicuci kembali dengan PBS pH 7,4 selama 5
menit 3 kali. Selanjutnya counterstaning menggunakan Mayer Hematoxylen
selama 5 menit lalu slide direndam dalam air kran selama 10 menit. Dilakukan
mounting dengan entellan lalu keringkan dalam suhu ruang dan ditutup dengan
cover glass. Hasil diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400x
sebanyak lima lapang pandang. Pengamatan preparat imunohistokimia dilakukan
dengan menghitung presentase area yang kemudian di analisa dengan software
axio vision.
27
4.6 Analisa Data
Analisa data terhadap ekspresi iNOS dan ekspresi BCL-2 dilakukan secara
statistik kuantitatif dengan uji One Way ANOVA untuk mengetahui perbedaan
nyata antar perlakuan kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey Test untuk
membandingkan seluruh pasangan rata-rata perlakuan dengan taraf kepercayaan
28
BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Pemeriksaan Hewan Model Kanker Mammae
Hewan model kanker mammae yang diinduksi dengan DMBA 10 mg/kg
BB dengan interval waktu 48 jam secara subcutan pada mammae dan estrogen
20.000 IU/kg BB dengan interval waktu 96 jam secara intramusculardapat
diperiksa keberhasilannya dengan cara pemeriksaan secara makroskopis.
Pemeriksaan makroskopis adalah pemeriksaan yang dapat dilihat yaitu dengan
melakukan palpasi atau perabaan pada mammae tikus. Palpasi dilakukan setiap
seminggu sekali dan didapatkan hasil bahwa pada jaringan mammae terdapat
massa keras dan nodul (benjolan) pertama pada hari ke 14 setelah induksi DMBA
yang bisa dilihat pada lampiran 14. Nodul yang muncul berbentuk tidak
beraturan dan lama kelamaan akan semakin membesar serta tidak dapat
digerakkan. Nodul yang terbentuk adalah berupa proliferasi sel epitel yang
berkembang menjadi sel kanker(Laili, 2015).Chrestella (2009) mengatakan bahwa
ciri-ciri tumor ganas (kanker) biasanya muncul nodul yang sukar digerakkan dan
tumbuh bercabang sehingga memiliki bentuk yang semakin membesar dan tidak
beraturan. Hal ini membuktikan bahwa pada penelitian ini induksi DMBA dengan
dosis 10mg/kg BB dengan interval waktu 48 jam secara subcutan pada mammae
dan estrogen 20.000 IU/kg BB dengan interval waktu 96 jam secara intramuscular
dapat menyebabkan terbentuknya kanker mammae.
29
5.2 Pengaruh Terapi KombinasiKurkumindanVitamin E Terhadap Ekspresi
iNOS pada Uterus Tikus (Rattusnorvegicus) Model Kanker Mammae
Hasil Induksi DMBA
Pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E terhadap ekspresi
iNOS pada uterus tikus model kanker mammae yang diinduksi DMBA dapat
diketahui menggunakan metode imunohistokimia. Pengamatan ekspresi iNOS
yang menggunakan metode imunohistokimia ditandai dengan munculnya warna
coklat. Warna coklat yang muncul diperoleh dari ikatan antara antigen dan
antibodi yang spesifik. Antigen iNOS pada jaringan uterus tikus akan berikatan
dengan antibodi primer (antirabbit iNOS) yang kemudian akan berikatan dengan
antibodi sekunder (goat antirabbit iNOS berlabel biotin). Penambahan substrat
kromagen Diaminobenzidin (DAB) akan menghasilkan warna coklat akibat ikatan
dengan O2 hasil oksidasi H2O2 dalam enzim peroksidase dalam Strep-Avidin
Horse Radis Peroxidase (SA-HRP) (Sudiana, 2005). Warna coklat yang muncul
menandakan bahwa pada jaringan tersebut positif terdapat antigen dari iNOS.
Presentase area ekspresi iNOS diukur dengan menggunakan software Axio
Visiondengan menghitung rata-rata presentase area yang diambil dari 5 lapang
pandang dengan perbesaran 400x.Hasil pewarnaan IHK untuk ekspresi iNOS
uterus tikus pada setiap perlakuan dapat dilihat pada Gambar 5.1.
30
Gambar 5.1 Ekspresi iNOS pada uterus tikus dengan perbesaran 400x. Keterangan (A): Kontrol Negatif (KN); (B): kelompok kontrol positif (KP); (C): kelompok perlakuan dosis 1 (P1); (D) = kelompok perlakuan dosis 2 (P2); (E): kelompok perlakuan dosis 3 (P3); ( ):warna coklat ekspresi iNOS.
A B
C
E
D
31
Ekspresi iNOS pada kelompok kontrol negatif (KN) pada Gambar 5.1
menunjukkan ekspresi iNOS yang lebih sedikit daripada kelompok kontrol positif
(KP). Sedangkan untuk kelompok terapi yang paling mendekati kelompok KN
adalah kelompok terapi 2 (P2) dengan dosis 72mg/kg BB kurkumin dan200
IU/ekor vitamin E. Hasil rata-rata ekspresi iNOS pada uterus tikus model kanker
mammae induksi DMBA yang telah diuji statistik ditunjukkan pada Tabel
5.1.Hasil uji ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Tukey secara lengkap dapat
dilihat pada Lampiran 17 dan Lampiran 18.
Tabel 5.1 Rata-rata Presentase Area Ekspresi iNOS pada Uterus Tikus
Hewan Model Kanker Mammae
Kelompok Rata- rata Ekspresi
iNOS ± SD (%)
Peningkatan
Penurunan
Kelompok Negatif 3,695±0,35a - -
Kontrol positif 8,440 ±0,66d 128,41 % -
Terapi 1 7,067±0,42c - 91,27 %
Terapi 2 4,445±0,18a - 20,29 %
Terapi 3 5,825±0,21b - 57,51 %
Keterangan: Perbedaan notasi a, b, c, dan d menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p<0.05) antar kelompok perlakuan.
Hasil rata-rata ekspresi iNOS pada Tabel 5.1 menunjukkan bahwa pada
kelompok KN sebesar 3,69 ±0,35 dapat digunakan sebagai nilai standar ekspresi
iNOS pada uterus tikus dalam keadaan normal. Nilai standar dari KN dapat
digunakan sebagai acuan untuk menentukan adanya penurunan atau peningkatan.
Ekspresi iNOS dalam keadaan normal ditemukan dalam jumlah sedikit (Tomer,
2003). Petruson (2003) mengatakan bahwa iNOS dalam kondisi normal dapat
32
membantu membunuh zat asing dan menghambat atau tumbuhnya jaringan
neoplastik.
Hasil rata-rata ekspresi iNOS pada kelompok KP menunjukkanpeningkatan
secara signifikan dengan presentase sebesar 128,41 % jika dibandingkan dengan
kelompok KN. Peningkatan ekspresi iNOS menunjukkan bahwa induksi DMBA
yang diberikan berpengaruh terhadap peningkatan ekspresi iNOS pada uterus
tikus model kanker mammae yang diinduksi DMBA. DMBA yang diinduksi pada
tikus akan dimetabolisme oleh sitokrom P450 yang akan menghasilkan senyawa
aktif yaitu dihidrodiolepoksida (DMBA-3,-diol-2,1-epoxides) yang mampu
berikatan dengan DNA dan membentuk DNA adduct. DNA adduct dapat
menyebabkan kerusakan DNA yang merupakan cikal bakal pembentukan kanker.
Kejadian kanker mammae dapat menyebabkan produksi Reactive Oxygen Species
(ROS) yang meningkat (Weimer et al.,2000). ROS yang dihasilkan bersifat sangat
reaktif dan dapat menyebar ke seluruh tubuh salah satunya organ uterus.
Makrofag yang teraktivasi oleh antigen akan melakukan respiratory burst melalui
konversi molekul oksigenmenjadi reactive oxygen intermediate (ROI)
danmemproduksinitric oxide (NO).Produksi NO diawali dengan aktivasi
makrofag yang akan memulai perubahan L-arginin menjadi L-citrulin. Proses ini
membutuhkan Flavin Adenin Dinucleotidase (FAD), Flavinmononucleaotidase
(FMN), NADPH dan bentuk tereduksi dari bioprotein (BH4) dengan bantuan
enzim nitric oxide synthase (NOS) (Tomer, 2003). Semakin banyak NO yang
diproduksi, maka semakin meningkat pula ekspresi INOS dalam mengkatalis
produksi NO (Muhammada, 2014). Pernyataan ini juga diperkuat oleh Aktan
33
(2004) yang menjelaskan produksi dan regulasi iNOS meningkat pada reaksi
inflamasi.
Kelompok tikus yang diterapi menggunakan kurkumin dan vitamin E
menunjukkan hasil penurunan ekspresi iNOSyaitu kelompok terapi 1 (P1) sebesar
91,27%, kelompok terapi 2 (P2) 20,29% dan kelompok terapi 3 (P3) 57,51%.
Kelompok terapi P2 menunjukkan hasil penurunan yang paling mendekati dengan
kelompok KN sehingga dapat dikatan P2 merupakan dosis terapi paling efektif.
Kurkumin merupakan senyawa polifenik yang memiliki aktivitas farmakologi
sebagai antiradang, antibakteri, antikanker, dan antioksidan (Aggarwal et al., 2005,
Widjayakusuma, 2005). Pada uterus tikus terjadi stres oksidatif akibat ROS
berlebih yang dihasilkan akibat induksi DMBA. Pada keadaan stres oksidatif
terjadi ketidakseimbangan antara zat oksidan dan antioksidan. Keadaan tersebut
bisa disebabkan banyak faktor, antara lain kurangnya antioksidan atau kelebihan
produksi radikal bebasdalam tubuh(Cooper, 2001). Dalam kasus ini NO yang
dihasilkan iNOS muncul akibat adanya produksi ROS dalam jumlah banyak.
Semakin banyak NO yang diproduksi, maka semakin meningkat pula ekspresi
INOS dalam mengkatalis produksi NO (Muhammada, 2014). Aktivitas kurkumin
sebagai antioksidan dengan menangkal radikal bebas dan menghambat aktivitas
enzim oksidatif seperti sitokrom P450 (Nurrochmad, 2004). Besar konsentrasi
antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi. Pada
konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan
antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Masuda et al., 2002). Pernyataan
34
Masuda tersebut mendukung hasil penelitian ini dimana kelompok P2
menghasilkan penurunan yang lebih banyak dibanding dengan kelompok P3.
Pemberian terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E mampu menurunkan
ekspresi iNOS pada organ uterus, karena kombinasi kurkumin dan vitamin E
mampu menangkal radikal bebas. Mekanisme kurkumin sebagai antioksidan yaitu
dengan memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal bebas sehingga radikal
bebas tidak lagi bersifat reaktif dan lebih stabil (Trilaksani, 2003). Jumlah radikal
bebas dengan antioksidan yang stabil dapat mengurangi produksi radikal bebas
sehingga produksi NO juga menurun, dan iNOS juga berkurang (Muhammada,
2014). Sari (2008) mengatakan bahwa kurkumin sulit diserap oleh tubuh dan
banyak diekskresikan keluar tubuh sehingga kerja kurkumin perlu dibantu oleh
antioksidan lainnya. Setiap antioksidan mempunyai mekanisme kerja dan
kemampuan antioksidan yang bervariasi. Seringkali, kombinasi dari beberapa
jenis antioksidan memberikan perlindungan yang lebih baik (sinergisme) terhadap
oksidasi dibandingan dengan satu jenis antioksidan saja (Wulaningsih, 2008).
Antioksidan vitamin E mempunyai kandungan tocoferol yang larut dalam lemak
sehingga vitamin E dapat bekerja pada membran dan dapat melindungi membran
dari oksidasi radikal bebas (Almatsier, 2009). Radikal-radikal yang terbentuk juga
dapat dideaktifkan dengan jalan mengikatnya dengan senyawa yang dikenal
radical scavenger. Pada tahap permulaan, radical scavenger akan memberikan
atom hidrogen kepada radikal bebas, sehingga dapat menghambat pembentukan
radikal peroksida dan memutuskan rantai reaksi. Radikal antioksidan yang
terbentuk bersifat stabil dan dapat bergabung langsung dengan radikal lain untuk
35
membentuk senyawa yang inert (Wulaningsih, 2008). Pencegahan kerusakan sel
oleh radikal bebas diperlukan sejumlah antioksidan yang larut dalam lemak dan
larut dalam air dimana vitamin E merupakan antioksidan yang larut dalam lemak
dan kurkumin merupakan antioksidan yang dapat larut dalam air (Muhilal, 2004).
5.3 Pengaruh Terapi Kombinasi Kurkumin dan Vitamin E Terhadap
Ekspresi BCL-2 pada Uterus Tikus (Rattus norvegicus) Model
KankerMammaeHasilInduksi DMBA
Pengaruh terapi kombinasi kurkumin dan vitamin E terhadap ekspresi
BCL-2 pada uterus tikus yang diinduksi DMBA dapat diketahui menggunakan
metode imunohistokimia. Pengamatan ekspresi BCL-2 yang menggunakan
metode imunohistokimia ditandai dengan adanya warna coklat. Warna coklat
yang muncul diperoleh dari ikatan antara antigen dan antibodi yang spesifik.
Antigen BCL-2 pada jaringan uterus tikus akan berikatan dengan antibodi primer
(antirabbit BCL-2) yang kemudian akan berikatan dengan antibodi sekunder (goat
antirabbit BCL-2 berlabel biotin). Penambahan substrat kromagen
Diaminobenzidin (DAB) akan menghasilkan warna coklat akibat ikatan dengan
O2 hasil oksidasi H2O2 dalam enzim peroksidase dalamStrep-Avidin Horse Radis
Peroxidase (SA-HRP) (Sudiana, 2005). Warna coklat yang muncul menandakan
bahwa pada jaringan tersebut positif terdapat antigen dari BCL-2.Presentase area
ekspresi BCL-2 diukur dengan menggunakan software Axio Visiondengan
menghitung rata-rata presentase area yang diambil dari 5 lapang pandang dengan
perbesaran 400x. Ekspresi BCL-2 pada uterus tikus diekspresikan pada sitoplasma
yang dapat dilihat pada Gambar 5.2.
36
Gambar 5.2Ekspresi BCL-2 pada uterus tikus dengan perbesaran 400x. Keterangan (A): Kontrol Negatif (KN); (B): kelompok kontrol positif (KP); (C): kelompok perlakuan dosis 1 (P1); (D) = kelompok perlakuan dosis 2 (P2); (E): kelompok perlakuan dosis 3 (P3); ( ):warna coklat ekspresi BCL-2.
A B
E
D C
37
Ekspresi iNOS pada kelompok kontrol negatif (KN) pada Gambar 5.2
menunjukkan ekspresi iNOS yang lebih sedikit daripada kelompok kontrol positif
(KP). Sedangkan untuk kelompok terapi yang paling mendekati kelompok KN
adalah kelompok terapi 2 (P2) dengan dosis 72mg/kg BB kurkumin dan200
IU/ekor vitamin E. Hasil rata-rata ekspresi BCL-2 pada uterus tikus model kanker
mammae induksi DMBA yang telah diuji statistik ditunjukkan pada Tabel 5.2.
Hasil uji ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Tukey secara lengkap dapat dilihat
pada Lampiran 17 dan Lampiran 18.
Tabel 5.2 Rata-rata Presentase Area Ekspresi BCL-2 pada Uterus Tikus
Hewan Model Kanker Mammae
Kelompok Rata- rata Ekspresi
BCL-2 ± SD (%)
Peningkatan
Penurunan
Kelompok Negatif 2,035 ±0,22a - -
Kontrol positif 11,242 ±1,56d 452,45 % -
Terapi dosis 1 7,715 ±0,64c - 279,11 %
Terapi dosis 2 3,289 ±0,11a - 61,65 %
Terapi dosis 3 5,860 ±0,26b - 187,96 %
Keterangan: Perbedaan notasi a, b, c, dan d menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p<0.05) antar kelompok perlakuan.
Ekspresi BCL-2 pada Tabel 5.2menunjukkan bahwa pada kelompok KN
sebesar 2,035±0,22 dapat digunakan sebagai nilai standar ekspresi BCL-2 pada
uterus tikus dalam keadaan normal. Nilai standar dari KN dapat digunakan
sebagai acuan untuk menentukan adanya penurunan atau peningkatan ekspresi
BCL-2.BCL-2 merupakan protein yang mempunyai fungsi sebagai regulator
utama pada proses apoptosis (Hodgal et al., 2010). Regulasi apoptosis tergantung
pada BCL-2 dan Bax untuk menentukan sel apoptosis atau sel tetap bertahan
38
hidup. Dalam kondisi normal BCL-2 dan Bax banyak dijumpai. BCL-2 bertugas
untuk menghambat apoptosis dengan memperpanjang hidup sel dengan harapan
sel dapat memperbaiki diri, sedangkan Bax bertugas menghapus hambatan
tersebut sehingga terjadi apoptosis (Hsu dan Hsueh, 2000; Kaufmann dan
Hengartener, 2001).
Hasil rata-rata ekspresi BCL-2 pada kelompok kontrol positif (KP)
menunjukkan peningkatan secara signifikan sebesar 452,45% jika dibandingkan
dengan kelompok KN. Peningkatan ekspresi BCL-2 menunjukkan bahwa induksi
DMBA dan estrogen yang diberikan berpengaruh terhadap peningkatan ekspresi
BCL-2 pada uterus tikus. DMBA yang diinduksi pada tikus akan mengakibatkan
stimulasireseptorAhR (Aryl hydrocarbon Receptor). DMBA akan berikatan
dengan Ahr di sitoplasma kemudian menuju nukleus untuk berikatan dengan Ahr
Nuclear Translocator Protein (ARNT). ARNT yang akan menginduksienzim
sitokrom P450 (CYP). Karsinogen kimiawiyaitu DMBA memerlukan
metabolisme (biotransformasi) yaitu cytochrome P-450 (CYP).CYP khususnya
CYP1A1 berperan juga dalam metabolisme estrogen. Metabolisme estrogen,
enzim CYP1A1 berperan dalam mengubah estradiol menjadi 2-hydroxyestradiol
sebagai jalur utama eliminasi estrogen dari dalam tubuh. Enzim CYP1A1 pada
metabolisme estrogen juga berperan dalam menghasilkan ROS (reactive oxygen
species) (Paramita, 2003).ROS yang dihasilkan bersifat sangat reaktif dan dapat
menyebar ke seluruh tubuh salah satunya organ uterus.
Induksi estrogen secara eksogen akan memicu estrogen untuk berikatan
dengan reseptor estrogen yang ada di uterus. Ikatan antara estrogen dan reseptor
39
estrogen pada uterus akan mengaktivasi BCL-2 yang merupakan gen
antiapoptoasis, sehingga terjadi peningkatan ekspresi BCL-2 pada uterus
(Cahyanti, 2008). Adanya estrogen yang tinggi dan reseptor estrogen yang
meningkat akan menstimulasi aktivitas proliferasi sel dan memacu protein yang
menghambat apoptosis yaitu BCL-2 dan mensupresi protein proapoptosis yaitu
BAX. Ekspresi BCL-2 yang meningkat akan mempengaruhi jalur intrinsik dari
apoptosis dimana BCL-2 akan meningkatkan interleukin converting enzym (ICE)-
like protease. Akibatnya BCL-2akan menghambat Fas untuk melakukan
prosesapoptosis dengan tidak mengaktifkan ICE-like protease yang akan
menurunkan kemampuan fungsi Fas-FasL sebagai protein pro-apoptosis dari
anggota keluargaTNF (Tumor Necrosis Factor) pada jalur apoptosis intrinsik.
Faktor transkripsiNuclear Factor- (NF- ) dapat menekan aksi pro-apoptosis
TNF- (Vasvivuo dkk, 2002). NF- merupakan faktor transkripsi gen-gen
seperti BCL-2 yang bersifat antiapoptosis (Bharti, 2003).
Kelompok tikus yang diterapi menggunakan kurkumin dan vitamin E pada
terapi 1 (P1), terapi 2 (P2), dan terapi 3 (P3) menunjukkan hasil penurunan
ekspresi BCL-2 yaitu kelompok P1 sebesar 279,11%, kelompok P2 61,65% dan
kelompok P3 187,96%. Kelompok P2 merupakan kelompok terapi yang
menunjukkan hasil penurunan yang paling mendekati kelompok KN sehingga
dapat dikatakan P2 merupakan dosis terapi paling efektif.
Kurkumin adalah senyawa yang dapat menghambat proliferasi sel pada
beberapa sel tumor termasuk diantaranya B-cell dan T-cell Leukimia (Bharti,
2003). Kurkumin sebagai antiproliferasi sangat bergantung pada reseptor estrogen
40
(ER) (Aggarwal, 2005). Mekanisme kurkumin sebagai antiproliferasi dikaitkan
dengan kemampuan kurkumin menghambat NF- dimana NF- merupakan
faktor transkripsi gen-gen seperti BCL-2 dan BCL-XL yang bersifat antiapoptosis
dan cyclin I yang bersifat antiproliferatif. Penghambatan NF- dapat memacu
terjadinya apoptosis dan dapat menekan proliferasi pada uterus (Bharti et al.,
2003). Kurkumin juga dapat memacu aktivasi caspase 3, caspase 7, dan caspase 9
yang dapat menstimulasi sitokrom C untuk lepas dari mitokondria dan melakukan
apoptosis (Aggarwal, 2005). Antioksidan vitamin E mempunyai kandungan
tocoferol yang larut dalam lemak sehingga vitamin E dapat bekerja pada membran
sehingga dapat melindungi membran dan komponen dalam membran sel lain dari
oksidasi radikal bebas (Almatsier, 2009). Hasil pemberian terapi kurkumin dan
vitamin E dapat menurunkan ekspresi BCL-2 pada uterus.
41
BAB 6 KESIMPULAN
6.1 Kesimpulan
1. Terapi kurkumin dan vitamin E mampu menurunkan rata- rata ekspresi
iNOS secara signifikan pada uterus tikus hewan model kanker mammae
sebesar 20,29% dengan dosis efektif kurkumin 72mg/kg BB dan vitamin E
200 IU/ ekor.
2. Terapi kurkumin dan vitamin E mampu menurunkan rata- rata ekspresi
BCL-2 secara signifikan pada uterus tikus hewan model kanker mammae
sebesar 61,65% dengan dosis efektif kurkumin 72mg/kg BB dan vitamin E
200 IU/ ekor.
6.2 Saran
Perlu dilakukan penelitan lebih lanjut mengenai toksisitas Kurkumin dan
Vitamin E dengan meningkatkan dosis Kurkumin dan Vitamin E.
42
DAFTAR PUSTAKA Adiyati, P.N. 2011. Ragam Jenis Ektoparasit pada Hewan Coba Tikus Putih
(Rattus norvegicus) Galur Sprague dawley. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Aggarwal, B.B., Kumar, A., Aggarwal. M.S. and Shishodia, S. 2005. Curcumin
Derived from Tumeric (Curcuma Longa): A Spice for All Season. CRC Press LLC.
Aggarwal, B.B., Shishodia, S. and Takada, Y. 2005. CurcuminSuppresses The
Paclitaxel-induced Nuclear FactorKappaBPathway in Breast Cancer Cells and InhibitsLung Metastasis of Human Breast Cancer in Nude Mice.Clin Cancer Res 2005;11:74907498.
Aktan, F. 2004. iNOS-mediated Nitric Oxide Production and Its Regulation.
Sciences 75 : 639-653 Almatsier, S. 2009. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. PT Gramedia. Jakarta. Annis, M. G., Zamzami, N., Zhu, W., Penn, L. Z., Kroemer, G., Leber, B. and
Andrews, D. W. 2001. Endoplasmic Reticulum Localized Bcl-2 Prevents Apoptosis When Redistribution of Cytochrome C is ALate Event. Oncogene 20, 1939-1952.
Ariesta, R.I. 2011. Aktivitas Superoksida Dismute (SOD), Kadar Malondialdehid
(MDA), Ekspresi iNOS dan Gambaran Histopatologi Jaringan Pankreas Tikus Diabetes Melitus Tipe I yang Mendapat Terapi Ekstrak Temu Giring. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya.
Bharti, A. C., Donato, N., and Aggarwal, B.B. 2003. Curcumin (diferulomethane)
Down-regulas the Constitutive Action of Nuclear Factor- and I a Kinase in Human Multiple , Leading to Suppression of Proliferation and Induction of Apoptosis. Blood 101 (3): 1053-1062.
Bonnett, B. N., A. Egenvall, A. Hedhammar and P. Olson. 2005. Mortality in Over 350 000 Insured Swedish Dogs from 1 -, gender-, Age- and Causespecific Rates. Acta Veterinaria Scandinavica, 46, No 3,
Britt, K., Razavi Y., Hawthorne S., and Risbridger G., 2011. Estrogen Receptor
Subtype Expression Mediates Breast Cancer Risk Via Breast Epithelial Cell Proliferation. Endocrine Reviews, 32(3):1-64.
43
Budi Tri Ranita, Sitarina Widyarini. 2010. Dampak Induksi Karsinogenesis Glandula Mammae dengan 7, 12-Gambaran Histopatologis Lambung Tikus Sprague Dawley. Jurnal Veteriner Maret 2010 Vol. 11 No. 1 : 17-23.
Cahyanti, Ratnasari Dwi. 2008. BCL-2 dan Indeks Apoptosis pada Hiperplasia
Endometrium Non-Atipik Simpleks dan Kompleks. Tesis.Universitas Diponegoro: Semarang.
Chrestella, Jessy. 2009. Neoplasma. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera
Utara: Medan Closa, Daniel., Folch-Puy, Emma. 2004. Oxygen Free Radicals and The Systemic
Inflammatory Response. IUMBM Life, 56(4): 185-191
Colombo, M.L. 2010. An Update on Vitamin E, Tocopherol and Tocotrienol-Perspectives. Molecules 15, 2103- 2113.
Constantinou, AI., Mehta, R. and Husband, A. 2003. Phenoxodiol, ANovel
Isoflavone Derivative, Inhibits 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced Mammary Carcinogenesis in Female Sprague-Dawley Rats, European Journal of cancer 39,2003:1012-1018.
Cooper, G.M. 2001. The Cell AMolecular Approach 1st Edition. ASM Press.
Washington DC. Page 15-21. Cordeiro, M. C and Kaliwal, B. B. 2011. Antioxidant Acticity of Bark Extract of
Bridelia retusa spreng on DMBA Induced Mammary Carsinogenesis in Female Sprague Dawley Rats. Journal of Pharmacogonosy. 2:14-20.
Cullen, J. M., R. Page and W. Misdorp, 2002. An Overview of Cancer
Pathogenesis, Diagnosis and Management. In: Tumors in Domestic Animals, ed. D. J. Meuten, Blackwell Publishing Company, Iowa State Press, USA, pp.
Egenvall A, Bonnett B N, Ohagen P, Olson P, Hedhammar A and von Euler H.
2005. Incidenceand Survival After Mammary Tumors in APopulation of Over 80,000 Insured Female Dogs in Sweden from 1995 to 2002. Preventive Veterinary Medicine 69: 109 27.
Ghosh, B. and I. Bose, 2005. Gene Copy Number and Cell Cycle Arrest. Physical
Canine Mammary Neoplasms and Their Management with Adjuvant Chemotherapy Using Vincristicine,
44
Methotrexate and CDev Veterinary and Animal Sciences University , Ludhiana.
Gunansti, S., Bambang Pontjo Priosoeryanto, Ietje Wientarsih, Ros Sumarny.
2009. Pengobatan Penyakit Tumor Mammae Melalui Operasi (Masektomi dan Ovariohisterektomi) dan Kombinasinya (Tanaman Herbal) pada Hewan. Jurnalllmu Pertanian Indonesia, April 2009, him. 6-14. ISSN 0853-4217. Vol. 14 No.1
Guyton, AC., and Hall JE., 2006. Textbook of Medical Physiology : eleventh
Edition. Philadelphia : Elsevier. Page 288-289. Hanahan, D and Weinberg, R.A. 2011. Hallmarks of Cancer : the next generation.
Cell. 144:646-674. Haga, S., M. Nakayama, K. Tatsumi, M. Maeda, S. Imai, S. Umesako, H.
Yamamoto, J. Hilgers and N. H. Sarkar, 2001. Overexpression of the p53 Gene Product in Canine Mammary Tumors. Oncology Reports, 8, No 6, 215 - 1219.
Hogdal, E.V., Christensen, L., Kjaer, S.K., Blaakaer, J., Christensen I.J. and
Hogdal, C.K 2010. Limited Prognostic Value of Tissue Protein Expression Levels of BCL-2 in Danish Ovarian Cancer Patient:
118(8);557-564. Hsu, S.Y. and Hsueh, A.J.W. 2000. Tissue-Specific Bcl-2 Protein Partners in
Apoptosis: An Ovarian Paradigm. Physiol. Rev. 80(2):593-614. Jurenka, J.S. 2009. Anti-inflammatory Properties of Curcumin, a Major
Constituent of Curcuma longa : A review of Preclinical and Clinical Research. Alternative Medicine Review Vol. 14 No. 2
Kadowaki, S., Chikumi, H., Yamamoto, H., Yoneda, K., Yamasaki, A., Sato, K.,
and Shimizu, E. 2004.Down-regulation of Inducible Nitric Oxide Synthase by Lysophosphatidic Acid in Human Respiratory Epithelial Cells. Mol. Cell Biochem. 262(1-2):51-9.
Kaufmann, S.H., and Hengarter, M.O. 2001. Programmed Cell Death: Alive and Well in The New Millenium. Trends in Cell biol. 11(12):526-534.
Khar, A., A.M. Ali, B.V. Pardhasaradhi, Z. Begum, and R. Anjum. 1999.
Antitumor Activity of Curcumin is Mediated Through the Induction of Apoptosis in AK-5 Tumor Cells. FEBS Letters 19: 445 (1): 165-168.
45
Kubatka, P., Ahlersova, E., Ahlers, I., Bojkova, B., Kalicka, K., Adamekova, E., markova, M., Chamilova, M. and Cermakova, M. 2002. Variability of Mammary Carsinogenesis Induction in Female Sprague Dawley and Wistar: Han Rats : the Effect of Season and Age. Physiol . 51 : 633-640.
Kusriningrum. 2008. Dasar Perancangan Percobaan dan Rancangan Acak
Lengkap. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga : Surabaya.
Laili, R. 2015. Pengaruh Induksi 7,12-Dimethylbenz ( )Anthracene (DMBA)
Multiple Low Dose (MLD) Terhadap Ekspresi Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER2) dan Histopatologi mammae tikus (Rattus norvegicus). Universitas Brawijaya : Malang.
Lala, P.K. and Chakraborty, c. 2001. Role of Nitric Oxide in Carcinogenesis and
Tumour Progression. Lancet Oncol. 2(3):149-56 Lamid, Astuti. 1995. Vitamin E Sebagai Antioksidan. Media Litbangkes Vol. V
No.01/1995. Bogor. Lee, C. H., W. H. Kim, J. H. Lim, M. S. Kang, D. Y. Kim and O. K. Kweon,
2004. Mutation and Overexpression of P53 as a Prognostic Factor in Canine Mammary Tumors. Journal of Veterinary Science, 5, No 1,63-69.
Lenoir, V., Jobage-Canonico, M.B., Perrin, M.H., Martin, A., Scholler, R. And
Kerdelhue, B. 2005. Preventive and Curative Effect of Melatonin on Mammary Carcinogenesis Induced by dimethylvenz[a]anthracene in the Female Sprague-Dawley Rat. BioMed Central Ltd. <https://breast-cancer-research.biomedcentral.com/articles>
Lin, P., W. Suh and Tzu., H. 2003. Correlation between Gene Expression of Aryl
Hydrocarbon Receptor (AhR), Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT), Cytochromes P4501A1 (CYP1A1) and 1B1.
Loeb, K. R. and L. A. Loeb, 2000. Significance of Multiple Mutations in Cancer.
Carcinogenesis, 21, No 3, 379-385. Lumongga, Fitriani. 2008. Apoptosis. USU Repository. Sumatera Utara. 2-11 Manoharan S, Balakrishnan S, Menon V P, Alias L. M. and Reena A
R.2009.Chemopreventive Efficacy of Curcumin and Piperine During 7,12-dimethylbenz[a]ant;hracene-induced Hamster Buccal Pouch Carcinogenesis. Singapore Med: Singapore. Singapore Med. J. 50 (2) : 139 (abstract)
46
Maslachah, L., Sugihartuti, R. dan Kurniasanti, R. 2008. Hambatan Produksi
Reactive Oxygen Species Radikal Superoksida (O2-) oleh
-tocopherol) pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) yang Menerima Stressor Renjatan Listrik. Departemen Ilmu Kedokteran Dasar Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga. Media Kedoteran Hewan Vol. 24, No.1.
Masuda, T., Yukiko, T., Hiromi, B., Tomomi, M., Yoshio, T. and Hidemasa, Y.
2002. Structural of New Curcumin Dimers and Their Contribution to the Antioxidant of Curcumin. J Agric. Food. Chen, 50, 2524-2530.
Maulida, Dewi dan Naufal. 2010. Ekstrasi Antioksidan (Likopen) dari Buah
Tomat dengan Menggunakan Solven Campuran, N-Heksana, Aseton, dan Etanol. Jurusan Teknik Kimia Fakultas Universitas Diponegoro. Semarang.
Meiyanto, E. 1999. Kurkumin Sebagai Obat Anti Kanker : Menelusuri
Mekanisme Aksinya. Majalah Farmasi Indonesia, 10(4), 224-236. Meiyanto, Edy., Sri T., Sri S., Retno M., dan Sugiyanto. 2007. Penghambatan
Karsinogenesis Kanker Payudara Tikus Terinduksi DMBA pada Fase Post Inisiasi oleh Ekstrak Etanolik Daun Gynuraprocumbens (Lour), Merr Majalah Farmasi Indonesia 18(4), 169 175, 2007. UGM. Yogyakarta.
Melendez-Colon, V.J., Luch, A., Seidel, A., and Baird, W.M. 1999. Cancer
Initiation by Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Result from Formation of Stable DNA Adducts Rather Than Apurinic Sites, Carcinogenesis. 20(10), 1885-1891.
Miyata, M., Kudo, G., Lee, Y., Yang, T.J., Gelboin, H.V., and Gonzalez. F.J. 1999. Targeted Disruption of the Microsomal Epoxide Hydrolase Gene. J. Biol. Chem. 274, 23963-23968.
Miyata, M., M. Furukawa., K. Takahashi., F.J. Gonzalez, and Y. Yamazoe. 2001.
Mechanism of 7, 12-Dimethylbenz[a]anthracene-Induced Immunotoxicity: Role of Metabolic Activation at the Target Organ. Jpn J Pharmacol. 86: 302 309
Moos, PJ., Edes, K., Mullally, J.E., and Fitpatrick, FA. 2004. Curcumin Impairs
Tumor Supressor p53 Function in Colon Cancer Cells. Carcinogenesis, 25(9), 1611-1617.
Muhammada, W.H., Agung P.W.M., dan Dyah A.O.A.P., 2014. Potensi
Imunomodulator Yoghurt Susu Kambing terhadap Ekspresi iNOS
47
dan Gambaran Histopatologi Jaringan Tiroid Tikus Model Autoimmune Thyroiditis (AITD) Hasil Induksi Natrium Iodida. Universitas Brawijaya. Malang.
Murwanti R.,Me E. 2002. Uji Efek Antikanker Ekstrak Etanol Rim pang Temu
Putih (Curcuma zedoaria) dengan Metode Newborn Mice. UGM. Yogyakarta.
Nurrochmad, Arief. 2004. Pandangan Baru Kurkumin dan Aktivitasnya sebagai
Antikanker. UGM. Yogyakarta. Paramita, Swandari. 2003. Polimorfisme Gen CYP1A1 (3801 T/C dan Ile462Val)
pada Pasien Kanker Serviks.Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman : Samarinda.
Petruson, K., Stalfors, J., Jacobsson, K.E.,and Petruson,B. 2005.Nitric Oxide Production in the Sphenoidal Sinus by The Inducible and Constitutive Isozymes of Nitric Oxide Synthase.Rhinology. 43(1):18-23.
Proschowsky, H. F., H. Rugbjerg and A. K. Ersboll. 2003. Mortality of Purebred and Mixed-breed Dogs in Denmark. Preventive Veterinary Medicine, 58, No 1-2, 63-74.
Pugalendhi, P., S. Manoharan., K. Suresh, and N. Baskaran. 2011. Genistein and
Daidzein, in Combination, Protect Celluler Integrity During 7,12- (DMBA) Induced Mammary
Carcinogenesis in Sprague Dawley Rats. Afr J Tradit Complement Altern Med 8(2):91-97.
Purwoastuti, E.2008.KankerPayudara. Yogyakarta: Kanisius.
InternationalResearch Cancer Agency.(2008). Globacon 2008 International Agency forResearch on Cancer.World Health Organization, IRCA.
Ranasasmita, R. 2008.
AktivitasAntikankerEkstrakEtanolDaunAglaiaellipticaBlumePadaTikusBetina yang Diinduksi7,12-Dimethylben (a)antrasena. UniversitasPertanian Bogor
Rugo, HS. 2007. The Breast Cancer Cobtinuum in Hormone-Receptor-Positive
Breast Cancer in Postmenopausal Women : Evolving Management Options Focusing on Aromatase Inhibitors. Annals of Oncology, 1(19): 16-27.
48
Rutterman, G. R., S. J. Winthrow and E. G. Mac Ewen, 2000. Tumors of The Mammary Gland. In: Small Animal Clinical Oncology, 3rd edn, eds S. J. Winthrow and E. G. Mac Ewen, W. B. Saunders Co,
Sari, Fitria W. 2008. Uji Aktiitas Antioksidan Senyawa Campiran Derivat
Kurkumin dan Katekin Hasil Isolasi dari Daun Teh (Camellia Sinensis) (skripsi).Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.Universitas Indonesia, Depok.
Schimmer, A. D., Hedley, D. W., Penn, L. Z., and Minden, M. D. 2001. Receptor and Mitochondrial-Mediated Apoptosis in Acute Leuikimia : A Translational View. Blood. 98 (13):3541-3553.
Setoguchi, A., T. Sakai, M. Okuda, K. Minehata, M. Yazawa, T. Ishizaka, T.
Watari, R. Nishimura, N. Sasaki, A. Hasegawa and H. Tsujimoto, 2001. Aberrations of the P53 Tumor Suppressor Gene in Various Tumors in Dogs. American Journal of Veterinary Research, 62, No 3, 433-439.
Sharma, Ganes N., Rahul Dave, Jyotsana Sanadya, Pius Sharma, and K.K
Sharma. 2010. Various Types and Management of Breast Cancer : An Overview. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology and Research Vol.1 (2).
Smith, A.D. 2000. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology.
Revised Ed. London: Oxford Unversity Press (345). Sofia. 2006. Antioksidan dan Radikal Bebas. <http://www.chemis-
try.org>.Diakses pada tanggal 17 Oktober 2014. Stuart, J. 2001. Breast cancer in the 21st century.Neu Opportunity and Neu
Challenges. Mod Pathol 14 (3): 213-18. Sudiana, I Ketut. 2005. Teknologi Ilmu Jaringan dan Imunohistokimia. Sagung
Seto. Jakarta hal. 36 47. Todorova, I. 2006. Prevalence and Etiology of The Most Common Malignant
Tumours in Dogs and Cats. Bulgarian Journal of Veterinary
Veterinary Medicine, Trakia University, Stara Zagora, Bulgaria. Trilaksani. 2003. Aktivitas Antioksidan dan Imunomodulator Seralia Non Beras.
Skripsi. Bogor. Jurusan Pertanian Institut Pertanian Bogor.
49
Venkatesen, P. and Rao, M.N.A. 2000. Structure-Activity Relationships for the Inhibition of Lipid Peroxidation and the Scavenging of Free Radicals by Synthetic Symmetrical Curcumin Analogues. J.Pharm Pharmacoal. 52:1123-1128.
Vasvivuo, T.E., Stenback, F., and Tapanaenim J. S. 2002. Apoptosis and
Apoptosis-related factors BCL-2, BAX, Tumor Necrosis Factor-Alpha, and NF-kappaB in Human Endometrial Hyperplasia and Carcinoma. 95 (7): 1463-71.
Wang, N. S., Unkila, M. T., Reineks, E. Z. and Distelhorst, C. W. 2001. Transient Expression of Wild-type or Mitochondrially Targeted Bcl-2 Induces Apoptosis, Whereas Transient Expression of Endoplasmic Reticulum-targeted Bcl-2 is Protective Against Bax-induced Cell Death. J. Biol. Chem. 276, 44117-44128.
Weetman, A.P.and L.J. De Groot. 2002. Autoimmunity to the Tyroid Gland.
Clinical Sciences Center Sheffield. England Faculty Medicine, Dentistry and Health The Medical School University of Sheffield.
Weimer, T.L., Ashok, P.R., Ulrich, H., David, A.S., Craig, S., Michael, R.M.,
William, B., Jerry, H., and Bailey, G. 2000. Toxicol Science. 57:217-228.
Widyarini, S. 2010. CYP1A1 and GSTµ Expression of Hepatocytes Induced by
7,12-Dimethylbenz )Anthracene and The Influence of Ethanolic Extract of GynuraProcumbens. Indo J Pharm. 20(4) : 198-206
Wulaningsih, Fitria S. 2008. Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Campuran
Derivat Kurkumin dan Katekin Hail Isolasi dari Daun Teh (Camellia sinesis). Universitas Indonesia. Jakarta.
Yadav, S.S., Meshram, G., Shinde, D., Patil, R., Manohar, S.M.,and Upadhye,
M.V. 2011. Antibacterial and Anticancer Activity of Bioactive Fraction of Syzgium cumini L. Seeds. Hayati Journal of Biosciences. 18:118-122.
Yoon, W.J., M.H. Young, J.S. Baik, N.H., Lee, and C.G. Hyun. 2009.
Suppression of Pro-Inflammatory Cytokines, iNOS and COX-2 Expression by Brown Algae Sargassum micracanthum in RAW 264.7 Macrophages. EurAsian Journal of Biosciences, 3(17):130-143.
