PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS … · PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS...

PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI TOLUEN-ETIL ASETAT BUAH CABAI

MERAH (Capsicum annuum L.) DENGAN METODE 2,2-DIFENIL-1-

PIKRILHIDRAZIL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Kevin Giovedi

NIM : 138114063

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI TOLUEN-ETIL ASETAT BUAH CABAI

MERAH (Capsicum annuum L.) DENGAN METODE 2,2-DIFENIL-1-

PIKRILHIDRAZIL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Kevin Giovedi

NIM : 138114063

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Hardwork doesn’t guarantee success, but improves its chances.”

-B. J. Gupta-

“All the hardwork, all the sacrifices, all the sleepless nights, struggles, downfalls,

it all pays off.”

-Anonim-

Kupersembahkan skripsi ini untuk :

Tuhan Yesus Kristus

Kedua orangtuaku (Bapak Arijanto Winarti Suwino dan Ibu Nita)

Adikku (Thania Marshella)

Sahabat-sahabatku dan Almamaterku


v


vi

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “PENETAPAN KADAR

KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI TOLUEN-

ETIL ASETAT BUAH CABAI MERAH (Capsicum annuum L.) DENGAN

METODE 2,2-DIFENIL-1-PIKRILHIDRAZIL (DPPH)” sebagai salah satu

syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak lepas

dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini

dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-

besarnya kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah memberikan kesempatan

kepada penulis untuk melakukan penelitian ini.

2. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bantuan dan bimbingan selama pembuatan proposal skripsi hingga

penulisan naskah skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian.

3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing

Akademik dan Dosen Penguji yang telah memberikan motivasi, perhatian,

bimbingan, kritik dan saran selama perkuliahan sehingga skripsi ini dapat

terselesaikan.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan

arahan, kritik dan saran sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

6. Tim Skripsi Selalu Hepi (Regina Hiacinta Eva Angelista, Asti Aprilia Putri dan

Edwin Tesalonika) atas kerjasama, dukungan dan semangatnya selama

pengerjaan skripsi.

7. Teman-teman Farmasi angkatan 2013 atas semua dukungannya dalam

pengerjaan dan penyelesaian skripsi.


https://www.usd.ac.id/profile_detail.php?id=01664

https://www.usd.ac.id/profile_detail.php?id=01468

vii

8. Teman seperjuangan kuliah di Yogyakarta (Aldwin Teguh dan Ricky Winata)

atas canda, tawa dan dukungannya dalam pengerjaan dan penyelesaian skripsi.

9. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan yang tidak dapat

disebutkan satu persatu

Akhir kata, penulis merasa masih banyak kekurangan dalam skripsi ini.

Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati, penulis mengharapkan saran

dan kritik yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini

dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan selanjutnya khususnya

dalam bidang farmasi dan kesehatan.

Yogyakarta, 14 November 2016

Penulis


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………………………v

PRAKATA ............................................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL .................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

ABSTRAK ........................................................................................................... xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE PENELITAN .......................................................................................... 2

Alat dan Bahan ........................................................................................... 2

Determinasi Tanaman ................................................................................ 2

Pembuatan Simplisia .................................................................................. 2

Ekstraksi………………………………………………………………….2

Pembuatan Larutan Standar Kapsaisin ...................................................... 3

Fraksinasi ................................................................................................... 3

Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar ............................................... 3

Penetapan Kadar Kapsaisin dalam Fraksi .................................................. 4

Uji Aktivitas Antioksidan .......................................................................... 4

Perhitungan Nilai IC50 ..................................................................................................................... 5

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 5

KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 11

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 11

LAMPIRAN ........................................................................................................... 13

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 38


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil pengukuran akurasi dan presisi ...................................................... 7

Tabel II. Hasil penetapan kadar kapsaisin dalam fraksi ......................................... 9

Tabel III. Hasil pengukuran akurasi dan presisi metode penetapan kadar ............ 10


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil penotolan ekstrak etanol buah cabai merah dan standar

kapsaisin dengan fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase diam

silika gel 60 F254 dan detektor UV 365 nm ………………………..…6

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi dengan absorbansi standar kapsaisin ...... 9

Gambar 3. Mekanisme kapsaisin dengan radikal bebas........................................ 10

Gambar 4. Buah cabai merah segar....................................................................... 15

Gambar 5. Buah cabai merah kering ..................................................................... 15

Gambar 6. Serbuk simplisia buah cabai merah ..................................................... 15

Gambar 7. Ekstrak etanol buah cabai merah.………...………………………….15

Gambar 8. Hasil KLT preparatif ekstrak etanol cabai merah dan standar

kapsaisin ............................................................................................. 15

Gambar 9. Sampel fraksi toluen- etil asetat cabai merah Replikasi 1,

Replikasi 2 dan Replikasi 3 ................................................................. 16

Gambar 10.Hasil penotolan ekstrak etanol buah cabai merah dan standar

kapsaisin dengan fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase diam

silika gel 60 F254 dan detektor UV 365 nm …………………...…….21

Gambar 11.Hasil uji aktivitas antioksidan etanol, standar kapsaisin, ekstrak

etanol cabai merah dan fraksi toluen-etil asetat cabai merah .............. 24


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman .................................. 13

Lampiran 2. Certificate of Analysis standar kapsaisin ........................................ 14

Lampiran 3. Gambar sampel penelitian .............................................................. 15

Lampiran 4. Penimbangan sampel ...................................................................... 16

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan seri kapsaisin untuk kurva

baku penetapan kadar ..................................................................... 18

Lampiran 6. Hasil scanning pelarut kapsaisin (etanol) ....................................... 19

Lampiran 7. Hasil scanning optimasi panjang gelombang maksimum

kapsaisin ......................................................................................... 19

Lampiran 8. Pengukuran serapan larutan seri kapsaisin ..................................... 20

Lampiran 9. Perhitungan Rf ................................................................................ 21

Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi fraksi ....................................................... 21

Lampiran 11. Pengukuran serapan kapsaisin dan perhitungan konsentrasi

kapsaisin dalam fraksi pengenceran 4x .......................................... 22

Lampiran 12. Perhitungan penetapan kadar .......................................................... 23

Lampiran 13. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan ......................................... 24

Lampiran 14. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ..................................... 25

Lampiran 15. Uji aktivitas antioksidan standar kapsaisin..................................... 27

Lampiran 16. Uji aktivitas antioksidan sampel fraksi........................................... 29

Lampiran 17. Hasil dan perhitungan adisi sampel………………………...…….34


xiii

ABSTRAK

Radikal bebas merupakan senyawa yang dapat merusak sel dan memicu

timbunya penyakit-penyakit degeneratif. Buah cabai merah (Capsicum annuum

L.) memiliki kandungan utama berupa kapsaisin yang memiliki aktivitas

antioksidan. Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak etanol buah cabai merah

memiliki aktivitas antioksidan. Untuk memastikan sumber dari aktivitas

antioksidan, dilakukan tahap purifikasi kapsaisin. Penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui ada tidaknya kapsaisin, kadar kapsaisin dan aktivitas antioksidan pada

fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah. Manfaat dari penelitian

ini adalah penggunaan buah cabai merah sebagai sumber antioksidan alami.

Simplisia buah cabai merah diekstrak dengan metode sokhletasi menggunakan

etanol, lalu dilakukan fraksinasi menggunakan KLT preparatif dengan fase diam

berupa silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa toluen-etil asetat (1:1 v/v).

Penetapan kadar kapsaisin dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis. Uji

aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Hasil dari penetapan kadar

kapsaisin di dalam fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah

menunjukkan terdapat kapsaisin sebanyak 95,262±8,464 μg/mL. Hasil dari uji

aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menunjukkan bahwa fraksi toluen-etil

asetat ekstrak etanol buah cabai merah memiliki aktivitas antioksidan yang

dinyatakan dengan rata-rata nilai IC50 sebesar 319,012±21,997 µg/mL.

Kata kunci : aktivitas antioksidan, cabai merah (Capsicum annuum L.), fraksi

toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah, IC50, kapsaisin, metode DPPH


xiv

ABSTRACT

Free radical is a substance which can cause cell damage and induce

degenerative diseases. Red chilli fruit (Capsicum annuum L.) contains main

compound called capsaicin which has antioxidant activity. Previous research have

indicated that red chilli fruit ethanolic extract has antioxidant activity. In this

research, purification of capsaicin from red chilli fruit ethanolic extract has been

conducted. The aims of this research were to examine the presence and level of

capsaicin also, the antioxidant activity in toluene-ethyl acetate fraction of ethanol

extract red chilli fruit. The benefit of this research was to make red chilli fruit as

another source of natural antioxidant. Red chilli fruit simplisia was extracted

using soxhlet and ethanol as solvent, then fractination was conducted using

preparative TLC using silica gel 60 F254 as stationary phase and toluene-ethyl

acetate as mobile phase. Capsaicin level was determined using spectrophotometry

UV-Vis. Antioxidant activity was assigned using DPPH method. The result

showed that capsaicin level in toluene-ethyl acetate fraction of red chilli fruit

ethanolic extract was 95,262±8,464 μg/mL. Toluene-ethyl acetate fraction of red

chilli fruit ethanolic extract of red chilli fruit has antioxidant activity which

expressed with IC50 value 319,012±21,997 µg/mL.

Keywords : antioxidant activity, red chilli (Capsicum annuum L.), toluene-ethyl

acetate fraction of red chilli fruit ethanolic extract, IC50, capsaicin, DPPH method


1

PENDAHULUAN

Belakangan ini, kasus penderita penyakit degeneratif seperti hipertensi, diabetes

dan kanker terus bertambah. Penyakit degeneratif disebabkan oleh terbentuknya radikal

bebas secara terus-menerus baik melalui proses metabolisme sel maupun akibat dari

paparan dari luar tubuh seperti sinar UV, asap rokok dan makanan. Radikal bebas memiliki

tingkat kereaktifan yang tinggi sehingga dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Maka

dari itu, dibutuhkan senyawa antioksidan yang dapat meredam aktivitas radikal bebas.

Penggunaan bahan alam sebagai sumber antioksidan menarik perhatian dunia selama

beberapa dekade terakhir karena sudah banyak studi yang menunjukkan senyawa-senyawa

yang terkandung di dalam tanaman dapat meredam radikal bebas (Rahal, et al., 2014).

Cabai merah merupakan salah satu tanaman sayur yang banyak tumbuh dan

dikonsumsi di Indonesia. Cabai merah (Capsicum annuum L.) memiliki kandungan utama

berupa senyawa kapsaisin yang bertanggung jawab terhadap rasa pedas yang ditimbulkan

(Peter, 2012). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sellami, et al. (2013), ekstrak

etanol cabai merah diketahui memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH yang

ditandai dengan nilai IC50 sebesar 324,14±9,47 µg/mL. Pada penelitiannya juga dinyatakan

bahwa senyawa fenolik dan flavonoid tidak terlalu berpengaruh terhadap aktivitas

antioksidan yang ditimbulkan. Hal ini disebabkan karena adanya kandungan lain yang

lebih berperan besar seperti vitamin (A, C dan E).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Viktorija, et al. (2014) diketahui

aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol buah cabai merah tidak hanya berasal dari

kandungan vitamin di dalamnya namun juga karena adanya senyawa kapsaisin. Pada

penelitian Zimmera, et al. (2012), kapsaisin murni diketahui memiliki nilai EC50 sebesar

17,62±1,84 µg/mL. Maka dari itu, kapsaisin yang terkandung dalam buah cabai merah

diduga memiliki aktivitas antioksidan. Untuk memastikan aktivitas antioksidan dari

kapsaisin diperlukan tahap purifikasi senyawa kapsaisin karena pada ekstrak masih

banyak senyawa lain yang mungkin menghambat aktivitas antioksidan dari kapsaisin.

Dalam penelitian ini, akan dilakukan purifikasi senyawa kapsaisin dari ekstrak

etanol buah cabai merah dengan fraksinasi menggunakan metode kromatografi lapis tipis

(KLT) preparatif dengan fase diam berupa silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa toluen-

etil asetat. Fraksi yang mengandung senyawa kapsaisin akan diuji aktivitas antioksidannya

dengan menggunakan senyawa 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serta akan dilakukan

penetapan kadar kapsaisin dalam fraksi tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk


2

mengukur aktivitas antioksidan dari fraksi yang mengandung kapsaisin, menentukan kadar

kapsaisin dalam fraksi serta menentukan nilai IC50. Hasil dari penelitian ini diharapkan

dapat menjadikan cabai merah sebagai salah satu sumber antioksidan alami.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas yang biasa

digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany dan Iwaki), seperangkat alat soxhlet,

mikropipet 200-1000 µL; 10-100 µL (Socorex), blender (Miyako), neraca analitik (Scaltec

SBC 22, BP 160P, max 60/120 g, min 0,001 g), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-

Vis Spectrophotometer 1240-090499), waterbath, oven, vacuum rotary evaporator (Buchi),

bejana kromatografi, lampu UV 365 nm dan vortex.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain buah cabai merah yang

didapat dari pasar Beringharjo Yogyakarta yang berasal dari perkebunan cabai di daerah

Kopeng, Semarang. Bahan kimia yang digunakan meliputi DPPH pro analysis (p.a.)

(Sigma-Aldrich), kapsaisin p.a. (Sigma-Aldrich), metanol p.a. (Merck), etanol 96% teknis

(CV Genera Labora), toluen p.a. (Merck), etil asetat p.a. (Merck), alumunium foil, kertas

saring dan TLC silica gel 60 F254 (Merck).

Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman cabai merah dilakukan di Laboratorium Sistematika

Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Bagian yang

digunakan untuk determinasi adalah keseluruhan tanaman cabai (akar, batang, daun, bunga

dan buah).

Pembuatan Simplisia

Buah cabai merah sebanyak 1 kg disortasi terlebih dahulu untuk memisahkan

buah dari pengotor. Buah cabai merah diiris menjadi beberapa bagian lalu dikeringkan di

bawah sinar matahari secara tidak langsung. Proses pengeringan dilakukan sampai

didapatkan buah cabai merah kering yang ditandai dengan mudah hancur apabila diremas

dengan tangan. Lalu pengeringan dilanjutkan dengan oven pada suhu 50°C hingga

didapatkan bobot tetap. Buah cabai merah yang sudah kering dihaluskan dengan blender

sehingga didapatkan serbuk simplisia buah cabai merah.

Ekstraksi

Metode ekstraksi yang digunakan adalah sokhletasi menggunakan 25 g serbuk

simplisia buah cabai merah dengan 350 mL etanol 96% pada suhu 70°C. Sokhletasi


3

dilakukan sampai ekstrak pada tabung sokhlet tampak bening atau sekitar 26 jam lalu

ekstrak dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga volume

ekstrak mencapai kurang lebih setengah dari volume awal. Proses pemekatan dilanjutkan

dengan menguapkan ekstrak di atas waterbath hingga diperoleh ekstrak kental dengan

bobot tetap. Lalu dilakukan perhitungan rendemen ekstrak.

Pembuatan Larutan Standar Kapsaisin

Standar kapsaisin 1000 µg/mL dibuat dengan menimbang 10 mg standar kapsaisin

lalu dilarutkan dengan etanol 96% dalam 10 mL labu takar.

Fraksinasi

Fraksinasi dilakukan dengan metode KLT preparatif dengan fase diam berupa

silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa campuran toluen dan etil asetat. Dilakukan

optimasi fase gerak (toluen-etil asetat) terlebih dahulu dengan menotolkan ekstrak etanol

buah cabai merah dan standar kapsaisin 1000 µg/mL pada plat KLT. Fase gerak yang

dipilih adalah fase gerak yang dapat memberikan pemisahan yang baik ditandai dengan

tidak adanya bercak yang saling menumpuk.

Tahap fraksinasi dilakukan dengan mengambil 0,2 g ekstrak kental lalu dilarutkan

dengan 0,5 mL etanol 96% dan ditotolkan membentuk pita sepanjang plat KLT hingga

larutan ekstrak tersebut habis. Standar kapsaisin 1000 µg/mL ditotolkan sebanyak 5 totol

pada KLT sebagai penanda. Plat KLT dielusi dengan fase gerak optimum. Pita bercak yang

sejajar dengan standar kapsaisin dikerok, dilarutkan dalam etanol dan disaring dengan

corong buchner untuk memisahkan fraksi dengan silika gel. Fraksi diuapkan dengan

waterbath hingga diperoleh bobot tetap. Setelah itu dilarutkan kembali dengan etanol

sebanyak 10 mL dan dilakukan pengenceran sebanyak empat kali.

Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar

Akurasi dan Presisi

Adisi dilakukan dengan 2,5 mL sampel fraksi dimasukkan ke dalam tiga tabung

lalu masing-masing tabung ditambah dengan 1 mL, 2 mL dan 3 mL standar kapsaisin 100

µg/mL dan ditambah dengan etanol 96% hingga 10 mL. Proses adisi dilakukan replikasi

sebanyak 3 kali. Akurasi dilihat dari nilai perolehan kembali (recovery) pada sampel yang

diadisi. Presisi dilihat dari nilai SD dan CV dari pengukuran sampel yang diadisi.

Linearitas dan Rentang

Dilakukan pengukuran absorbansi terhadap 5 seri konsentrasi standar kapsaisin

(20, 40, 60, 80 dan 100 µg/mL) lalu dibuat kurva hubungan antara konsentrasi standar


4

kapsaisin dengan absorbansinya. Linearitas didapat dari nilai r pada persamaan kurva baku.

Rentang didapat dari konsentrasi terendah dan tertinggi yang digunakan pada kurva baku

standar kapsaisin.

Spesifisitas

Dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum kapsaisin terlebih dahulu

menggunakan 3 seri konsentrasi standar kapsaisin (20, 40 dan 60 µg/mL) yang diukur pada

rentang 200-400 nm. Dilakukan scanning terhadap etanol pada panjang gelombang 200-

800 nm. Spesifisitas dilihat dari ada tidaknya spektra yang muncul pada panjang

gelombang maksimum kapsaisin.

Penetapan Kadar Kapsaisin Dalam Fraksi

Fraksi diambil sebanyak 2,5 mL lalu ditambah dengan etanol 96% sampai 10 mL.

Fraksi diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum. Hasil pengukuran

dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku untuk mendapatkan nilai kadar. Dilakukan

replikasi sebanyak 3 kali.

Uji Aktivitas Antioksidan

Uji kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengamati perubahan warna

yang terjadi. 4 tabung reaksi disiapkan dimana tabung A berisi 1 mL etanol, tabung B

berisi standar kapsaisin 100 µg/mL, tabung C berisi 1 mL ekstrak 20 µg/mL dan tabung D

berisi 1 mL fraksi. Masing-masing tabung ditambah dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL dan 3

mL etanol. Semua tabung divortex dan ditunggu selama 30 menit.

Uji kuantitatif aktivitas antioksidan dilihat dari serapan DPPH yang diukur dengan

spektrofotometer Vis. Dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum terlebih dahulu

terhadap larutan DPPH 100 µg/mL pada rentang 400-800 nm. Kemudian dilakukan

penentuan operating time (OT) dengan menyiapkan 4 mL standar kapsaisin 80 µg/mL, lalu

ditambah dengan 1 mL DPPH 80 µg/mL dan diukur pada panjang gelombang maksimum

setiap 5 menit selama 1 jam. OT ditentukan pada waktu dimana absorbansi mulai stabil.

Blanko dibuat dengan 4 mL etanol yang ditambah dengan 1 mL DPPH 100

µg/mL, ditunggu selama OT dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum.

Standar kapsaisin dibuat dalam 5 seri konsentrasi (5, 10, 15, 20 dan 25 µg/mL) dimana

setiap konsentrasi diambil sebanyak 4 mL lalu ditambah dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL,

ditunggu selama OT dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum.

Sampel fraksi juga dibuat dalam 5 seri konsentrasi dimana setiap konsentrasi diambil


5

sebanyak 4 mL lalu ditambah dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL, ditunggu selama OT dan

diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum.

Perhitungan Nilai IC50

Nilai IC50 standar kapsaisin didapatkan dari persamaan pada kurva hubungan

antara seri larutan standar kapsaisin dengan persentase aktivitas antioksidan. Nilai IC50

sampel fraksi didapatkan dari persamaan pada kurva hubungan antara seri larutan fraksi

dengan persentase aktivitas antioksidan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi dilakukan sebagai tahap awal dalam penelitian yang menggunakan

sampel berupa tanaman. Tujuan determinasi adalah untuk memastikan identitas dari suatu

tanaman sehingga menghindari kesalahan dalam pemilihan sampel. Hasil dari determinasi

tanaman menyatakan bahwa sampel yang digunakan adalah tanaman cabai merah.

Buah cabai merah segar didapatkan dari Pasar Beringharjo Yogyakarta yang

berasal dari perkebunan cabai di Kopeng, Semarang. Buah cabai merah dicuci dan disortasi

untuk memisahkannya dari pengotor dan bagian yang tidak terpakai. Buah cabai merah

segar dikeringkan menggunakan sinar matahari secara tidak langsung. Proses pengeringan

berlangsung hingga didapatkan buah cabai merah kering yang ditandai dengan mudah

hancur apabila diremas dengan tangan. Lalu pengeringan dilanjutkan dengan oven hingga

didapatkan bobot tetap. Tujuan dari pengeringan hingga dicapainya bobot tetap adalah

untuk meminimalkan kandungan air di dalam simplisia sehingga tidak ditumbuhi bakteri

atau jamur. Buah cabai merah kering dihaluskan menggunakan blender hingga didapatkan

serbuk simplisia cabai merah. Proses penghalusan simplisia menjadi serbuk bertujuan

untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas permukaan menjadi lebih besar yang

dapat membuat proses ekstraksi menjadi maksimal karena luas area kontak antara simplisia

dan larutan penyari menjadi lebih besar. Didapatkan persentase rendemen serbuk simplisia

sebesar 14,2836% (b/b).

Ekstraksi serbuk simplisia buah cabai merah dilakukan dengan metode ekstraksi

panas yaitu sokhletasi. Sokhletasi merupakan metode ekstraksi yang menggabungkan

metode maserasi dengan perkolasi. Pelarut akan menguap melewati sidearm menuju ke

labu pendingin dan menetes sehingga sampel akan terendam dengan pelarut yang akan

melarutkan zat aktif. Pelarut yang membawa zat aktif akan turun ke labu alas bulat apabila

ketinggian pelarut sudah melewati sifon. Kelebihan dari sokhletasi yaitu adanya

pemanasan yang menyebabkan meningkatnya kelarutan dari senyawa aktif dan adanya


6

sirkulasi pelarut membuat proses ekstraksi lebih maksimal karena pelarut tidak jenuh

(Mandal, Mandal and Das, 2015). Pada proses ekstraksi, digunakan serbuk simplisia buah

cabai merah sebanyak 25 g dan pelarut berupa etanol 96% sebanyak 350 mL. Proses

ekstraksi dilakukan hingga ekstrak tampak bening pada tabung sokhlet atau kurang lebih

selama 26 jam. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan vaccuum rotary

evaporator hingga volume ekstrak mencapai kurang lebih setengah dari volume awal lalu

dilanjutkan diatas waterbath hingga didapatkan ekstrak kental atau sudah mencapai bobot

tetap. Didapatkan rata-rata persentase rendemen ekstrak sebesar 21,2304±0,0073% (b/b).

Purifikasi senyawa kapsaisin dilakukan dengan melakukan fraksinasi terhadap

ekstrak etanol buah cabai merah. Fraksinasi dilakukan dengan metode KLT preparatif yang

merupakan metode pemisahan senyawa dalam tahap purifikasi senyawa berdasarkan

afinitas dari senyawa terhadap fase gerak dan fase diam. Metode ini membutuhkan waktu

yang singkat dalam memisahkan senyawa dan memerlukan sampel dalam jumlah sedikit

(Sarker and Nahar, 2012). Optimasi fase gerak dilakukan untuk menentukan fase gerak

yang dapat memberikan pemisahan yang baik dimana tidak adanya bercak yang

menumpuk pada plat KLT. Optimasi fase gerak dilakukan dengan menotolkan ekstrak

etanol buah cabai merah dan standar kapsaisin 1000 µg/mL pada plat KLT lalu dielusi

dengan varian perbandingan toluen p.a dan etil asetat p.a. Dari hasil optimasi didapatkan

fase gerak optimum berupa toluen – etil asetat (1:1 v/v).

Gambar 1. Hasil penotolan (A) ekstrak etanol buah cabai merah dan (B) standar kapsaisin

dengan fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase diam silika gel 60 F254 dan detektor UV

365 nm


7

Ekstrak kental dilarutkan dengan etanol 96% lalu dilakukan penotolan

membentuk pita sepanjang KLT. Standar kapsaisin 1000 µg/mL juga ditotolkan pada KLT

sebagai penanda lalu plat KLT dielusi dengan fase gerak optimum. Penentuan bercak yang

mengandung kapsaisin didasarkan pada kesamaan nilai Rf (Retardation factor) bercak

ekstrak etanol buah cabai merah dengan standar kapsaisin. Hasil yang didapatkan

menunjukkan terdapat enam bercak yang muncul dan bercak keempat memiliki nilai Rf

yang sama dengan standar kapsaisin yaitu 0,43 (Gambar 1). Pita bercak yang memiliki

nilai Rf 0,43 diasumsikan mengandung senyawa kapsaisin di dalamnya sehingga pita

bercak dikerok. Pita bercak yang sudah dikerok dilarutkan dengan etanol 96% dan

disaring menggunakan corong buchner untuk memisahkan fraksi dengan silika. Fraksi

dipekatkan diatas waterbath sampai kering atau sudah mencapai bobot tetap. Didapatkan

persentase rendemen fraksi sebesar 5,8391±0,0033% (b/b).

Validasi metode analisis dilakukan untuk menilai dan membuktikan bahwa

parameter-parameter tertentu memenuhi persyaratan dan tujuan penggunaannya. Akurasi

adalah kedekatan hasil pengukuran yang diperoleh dengan nilai sebenarnya. Presisi adalah

kedekatan hasil serangkaian pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen di

bawah kondisi tertentu (Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Semua sampel

(Tabel I) memiliki nilai recovery dan CV yang baik menurut Gonzales dan Herrador

(2007) yaitu 80-110% untuk nilai recovery dan <11,3% untuk nilai CV sehingga dapat

dikatakan bahwa metode sudah akurat dan dapat menghasilkan data yang presisi dalam

mengukur kadar kapsaisin dalam fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah.

Tabel I. Hasil Pengukuran Akurasi dan Presisi

Konsentrasi

(µg/mL) Recovery

Rata-rata

(µg/mL) SD CV

Tanpa

Adisi

Replikasi 1 25,272 -

23,815 2,116 8,886% Replikasi 2 24,786 -

Replikasi 3 21,388 -

Adisi 10

µg/mL

Replikasi 1 34,398 91,262%

33,783 1,325 3,923% Replikasi 2 34,689 99,029%

Replikasi 3 32,262 108,738%

Adisi 20

µg/mL

Replikasi 1 44,301 95,146%

43,265 0,918 2,121% Replikasi 2 42,942 90,777%

Replikasi 3 42,553 105,825%

Adisi 30

µg/mL

Replikasi 1 55,757 101,618%

53,556 3,728 6,961% Replikasi 2 55,660 102,913%

Replikasi 3 49,252 92,880%


8

Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk memberikan hasil

pengukuran yang proporsional dengan konsentrasi analit pada sampel. Rentang (Range)

adalah interval konsentrasi tertinggi dan terendah dari kadar analit dalam sampel yang

dapat ditetapkan secara presisi, akurat dan linearitas yang dapat diterima (Pharmaceutical

Convention Incorporation, 2014). Dari kurva perbandingan seri konsentrasi standar

kapsaisin dengan absorbansinya (Gambar 2), didapatkan nilai r sebesar 0,9998 sehingga

dapat dikatakan bahwa metode dapat menghasilkan data yang linier. Rentang pada kurva

ini adalah pada konsentrasi 20-100 μg/mL.

Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mendeterminasi analit

secara spesifik tanpa adanya interferensi dari komponen matrik seperti pengotor.

(Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Spesifisitas metode dilihat dari ada

tidaknya puncak spektra yang muncul saat scanning etanol pada panjang gelombang

maksimum kapsaisin yaitu 280 nm. Hasil menunjukkan tidak terdapat puncak yang muncul

pada panjang gelombang maksimum kapsaisin. Selain itu, panjang gelombang maksimum

kapsaisin yang didapatkan sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Musfiroh, et al.

(2013) dan Viktorija, et al. (2014) dimana untuk mengukur kandungan kapsaisin yang

terlarut dalam etanol digunakan panjang gelombang 280 nm. Maka dari itu, metode yang

digunakan dalam mengukur kadar kapsaisin dalam fraksi toluen-etil asetat buah cabai

merah sudah spesifik.

Penetapan kadar kapsaisin menggunakan metode spektrofotometri. Prinsip metode

ini adalah mengukur absorbsi energi dari suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu,

di mana absorbsi energi sebanding dengan konsentrasi dari senyawa tersebut. Panjang

gelombang maksimum kapsaisin yang didapatkan adalah 280 nm. Panjang gelombang

maksimum yang didapatkan sesuai dengan penelitian yang pernah dilakukan oleh Okada et

al. (2010). Pada tabel II, ditunjukkan hasil penetapan kadar kapsaisin dalam fraksi toluen-

etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah sebesar 95,262±8,464 μg/mL, sehingga

diketahui kadar kapsaisin dalam buah segar sebesar 144,339±15,928 mg/kg atau

0,015±0,002% (b/b).


9

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi dengan absorbansi standar kapsaisin

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH dimana ketika bereaksi

dengan senyawa yang bersifat sebagai antioksidan maka akan terjadi perubahan warna dari

DPPH yang awalnya berwarna ungu menjadi kuning Metode ini merupakan salah satu

metode uji aktivitas antioksidan yang sangat cepat, sederhana, sensitif, dan reprodusibel.

Hasil dari uji aktivitas antioksidan diinterpretasikan dengan nilai IC50 (inhibitory

concentration) yang menunjukkan pada konsentrasi berapa suatu senyawa dapat

menghambat aktivitas senyawa lain sebanyak 50%. Semakin kecil nilai IC50 dari suatu

senyawa maka semakin besar aktivitas antioksidan yang dihasilkan (Kumar, 2016).

Uji kualitatif aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya

aktivitas antioksidan. Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui apakah etanol, standar

kapsaisin, ekstrak etanol buah cabai merah, fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah

cabai merah memiliki aktivitas antioksidan terhadap DPPH. Hasil yang didapatkan berupa

perubahan warna dari ungu menjadi ungu pucat hingga kuning pada senyawa standar

kapsaisin, ekstrak etanol buah cabai merah dan fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah

cabai merah. Etanol tidak menunjukkan adanya perubahan warna yang terjadi. Hasil uji

kualitatif menunjukkan bahwa standar kapsaisin, ekstrak cabai merah dan fraksi toluen-etil

asetat ekstrak etanol buah cabai merah memiliki aktivitas antioksidan sedangkan etanol

sebagai pelarut tidak memiliki aktivitas antioksidan.

Tabel II. Hasil Penetapan Kadar Kapsaisin Dalam Fraksi

Kadar (µg/mL) Rata-rata (µg/mL) SD CV

Replikasi 1 101,087 95.262 8.464 8.885%

Replikasi 2 99,146

Replikasi 3 85,553

y = 0,0103x - 0,0003

R² = 0,99970

0,5

1

1,5

0 50 100 150A

bso

rba

nsi

Konsentrasi (µg/mL)

Standar

kapsaisin


10

Tabel III. Hasil perhitungan IC50 sampel fraksi

IC50 (µg/mL) Rata-rata (µg/mL) SD CV

Replikasi 1 323,621

319,012 21,997 6,895% Replikasi 2 338,340

Replikasi 3 295,076

Uji kuantitatif aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengukur kemampuan

senyawa antioksidan dalam menghambat aktivitas radikal bebas yang dinyatakan dengan

nilai IC50. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk menentukan panjang

gelombang dimana larutan DPPH menghasilkan absorbansi maksimum. Dari hasil

percobaan, panjang gelombang maksimum DPPH adalah pada 516 nm. Penentuan OT

dilakukan untuk menentukan waktu yang dibutuhkan oleh senyawa antioksidan untuk

menghambat aktivitas radikal bebas secara sempurna atau ketika absorbansi mulai stabil.

Dari hasil percobaan, didapatkan OT reaksi pada menit ke-40.

Dari hasil uji aktivitas antioksidan (Tabel III), didapatkan nilai IC50 standar

kapsaisin sebesar 14,417 μg/mL dan IC50 fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai

merah sebesar 319,012±21,997 μg/mL. Menurut Blois (1958), kekuatan aktivitas

antioksidan dibagi menjadi empat tingkatan yaitu nilai antioksidan sangat kuat (IC50 <50

μg/mL), antioksidan kuat (50-100 μg/mL), antioksidan sedang (101-150 μg/mL) dan

antioksidan lemah (>150 μg/mL). Berdasarkan tingkatan tersebut, standar kapsaisin

termasuk dalam antioksidan sangat kuat, sedangkan fraksi toluen - etil asetat buah cabai

merah merupakan antioksidan lemah.

Gambar 3. Mekanisme kapsaisin dengan radikal bebas


11

Nilai IC50 fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah lebih kecil

dibandingkan dengan IC50 ekstrak etanol buah cabai merah yang diteliti oleh Sellami, et al.

(2013) yaitu sebesar 324,14±9,47 µg/mL, yang menandakan bahwa fraksi toluen-etil asetat

buah cabai merah lebih poten dalam memberikan aktivitas antioksidan dibandingkan

dengan ekstrak etanol buah cabai merah. Pada ekstrak etanol buah cabai merah,

kemungkinan kandungan senyawa di dalamnya masih banyak dan kompleks sehingga

memungkinkan adanya reaksi antagonis dengan kapsaisin sehingga aktivitas antioksidan

yang ditimbulkan berkurang. Dari hasil yang didapatkan, senyawa kapsaisin merupakan

senyawa yang mungkin berperan besar dalam aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh buah

cabai merah karena aktivitas antioksidan pada fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah

cabai merah lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol buah cabai merah. Namun

nilai IC50 yang dihasilkan masih tergolong lemah yang mungkin disebabkan oleh masih

adanya senyawa lain yang terkandung di dalam fraksi yang dapat menimbulkan reaksi

antagonis dengan kapsaisin sehingga aktivitas antioksidan yang ditimbulkan berkurang.

Menurut Okada et al. (2010), senyawa kapsaisin bersifat sebagai antioksidan yang

dapat menghambat aktivitas dari radikal bebas. Pada struktur kapsaisin terdapat gugus OH

fenolik yang merupakan asam lemah sehingga dapat memberikan atom H kepada senyawa

radikal. Senyawa radikal akan bersifat netral ketika mendapatkan elektron tambahan

(Gambar 3).

KESIMPULAN DAN SARAN

Terdapat kandungan kapsaisin dalam fraksi toluen-etil asetat buah cabai merah

sebesar 95,262±8,464 μg/mL. Fraksi toluen-etil asetat buah cabai merah memiliki aktivitas

antioksidan yang dinyatakan dalam nilai IC50 sebesar 319,012±21,997 µg/mL.

Saran untuk penelitian berikutnya yaitu melanjutkan tahap purifikasi senyawa

kapsaisin dari fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai merah sampai ke tahap

isolasi untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari senyawa kapsaisin. Diperlukan

pengujian spesifisitas lebih lanjut terhadap fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah

cabai merah untuk mengetahui ada tidaknya spektra yang menumpuk pada 280 nm

sehingga dapat meningkatkan validitas metode yang digunakan.

DAFTAR PUSTAKA

Blois, M. S., 1958. Antioxidant determination by the use of stable free radicals, Nature,

181, 1199-2000.


12

Gonzales, A.G. and Herrador, M.A., 2007. A Practical Guide to Analytical Method

Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in

Analytical Chemistry. 26 (3), 228-238.

Kumar, S., 2016. Analytical Techniques for Natural Product Reasearch. CAB

International, United Kingdom, 167-168.

Mandal, S.C., Mandal, V. and Das, A.K., 2015. Essential of Botanical Extraction

Principles and Applications. Academic Press, New York, 122.

Musfiroh, I., Mutakin, M., Angelina, T., and Muchtardi, M., 2013. Capsaicin Level of

Various Capsicum Fruits. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Science, 5(1), 248-251.

Okada, Y., Tanaka, K., Sato, E., and Okajima, H., 2010. Kinetics and Antioxidative Sites

of Capsaicin in Homogenous Solution. J Am Oil Chem Soc, 87, 1397-1405.

Peter, K.V., 2012. Handbook of Herbs and Spices, 2nd ed. Woodhead Publishing Limited,

New Delhi, 12, 29.

Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014. United States Pharmacopoeia XXXVII/

NF XXXII. Twin Brook Parkway, 1225.

Rahal, A., et al., 2014. Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay.

BioMed Research International, 1-19.

Sarker, S.D. and Nahar, L., 2012. Natural Products Isolation, 3rd ed. Humana Press, New

York, 9, 33, 118-120, 129, 135.

Sellami, M., Ghariani, B., Louati, H., Miled, N. and Gargouri, Y. 2013. Biological

Activities of Extracts of Different Spices and Plants. International Journal of

Current Engineering and Technology. 3 (3), 1051-1060.

Viktorija, M., Liljana, K.G., Tatjana, R., Ana, C., and Rubin G., 2014. Antioxidative Effect

of Capsicum Oleoresins Compared With Pure Capsaicin. IOSR Journal of

Pharmacy, 4 (11), 44-48.

Zimmer, A.R., Leonardi, B., Miron, D., Schapoval, E., Oliveira, J.R., and Gosmann, G.,

2011. Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Capsicum Baccatum:

from Traditional Use to Scientific Approach. Journal of Ethnopharmacology, 139,

228–233.


13

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman


14

Lampiran 2. Certificate of Analysis standar kapsaisin


15

Lampiran 3. Gambar sampel penelitian

Gambar 4. Buah cabai merah segar Gambar 5. Buah cabai merah kering

Gambar 6. Serbuk simplisia buah

cabai merah

Gambar 7. Ekstrak etanol buah

cabai merah

Gambar 8. Hasil KLT preparatif ekstrak etanol cabai merah

(A) dan standar kapsaisin (B)


16

Lampiran 4. Penimbangan sampel dan perhitungan % rendemen

% rendemen = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑥 100%

a. Data penimbangan buah segar

b. Data penimbangan buah hasil pengeringan

c. Data penimbangan serbuk total

Berat wadah 80,200 g

Berat wadah + serbuk 226,850 g

Berat serbuk 146,650 g

Berat tampah 181,5 g

Berat tampah + buah 1208,5 g

Berat tampah sisa 181,8 g

Berat buah 1026,7 g

Berat tampah 181,5 g

Berat tampah + buah 363,8 g

Berat buah 182,3 g

Gambar 9. Hasil sampel fraksi toluen - etil asetat cabai

merah Replikasi 1 (A), Replikasi 2 (B) dan Replikasi 3 (C)

% rendemen = 204,439 𝑔

1026,4 𝑔 𝑥 100%

= 19,918% b/b


17

d. Data penimbangan serbuk untuk ekstraksi

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat cawan 64,2402 64,2402 53,1227

Berat cawan + serbuk 89,2811 89,2850 78,1432

Berat cawan sisa 64,2458 64,2402 53,1229

Berat serbuk 25,0353 25,0448 25,0203

e. Data penimbangan ekstrak


Berat cawan 63,5615 55,9816 52,5895

Berat cawan + ekstrak 68,8130 61,5039 57,7600

Berat ekstrak 5,2515 5,5223 5,1705

Replikasi 1


25,0353 𝑔 𝑥 100%

= 20,976% b/b

Replikasi 2


25,0448 𝑔 𝑥 100%

= 22,050% b/b

f. Data penimbangan ekstrak untuk fraksinasi


Berat vial 6,3310 6,3310 6,3310

Berat vial + ekstrak 6,5314 6,5315 6,5312

Berat vial ekstrak 0,2004 0,2005 0,2002

g. Data penimbangan fraksi


Berat cawan 51,5012 49,6297 55,3545

Berat cawan + fraksi 51,5130 49,6420 55,3655

Berat cawan fraksi 0,0118 0,0123 0,0110

Replikasi 3


25,0203 𝑔 𝑥 100%

= 20,665% b/b


18

Replikasi 1


0,2004 𝑔 𝑥 100%

= 5,888% b/b

Replikasi 2


0,2005 𝑔 𝑥 100%

= 6,135% b/b

h. Data penimbangan standar kapsaisin

Kertas 0,2409 g

Kertas + serbuk 0,2511 g

Kertas sisa 0,2409 g

Serbuk 0,0102 g

i. Data penimbangan DPPH


Berat gelas beaker 62,5867 96,8635 96,8345

Berat gelas beaker +

DPPH 62,5975 96,8744 96,8447

Berat DPPH 0,0108 0,0109 0,0102

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan seri kapsaisin untuk kurva

baku penetapan kadar

Semua larutan seri dibuat dari larutan stok kapsaisin 1000 μg/mL dan diencerkan

dalam labu takar 10 mL.

C1 . V1 = C2. V2

100 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 100 μg/mL.10 mL

V1 = 1 mL

Replikasi 3


0,2002 𝑔 𝑥 100%

= 5,495% b/b

80 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 80 μg/mL.10 mL

V1 = 0,8 mL


19

60 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 60 μg/mL.10 mL

V1 = 0,6 mL

40 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 40 μg/mL.10 mL

V1 = 0,4 mL

Lampiran 6. Hasil scanning pelarut kapsaisin (etanol)

Lampiran 7. Hasil scanning optimasi panjang gelombang maksimum

kapsaisin

20 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 20 μg/mL.10 mL

V1 = 0,2 mL


20

Lampiran 8. Pengukuran serapan larutan seri kapsaisin

a. Hasil scanning larutan seri kapsaisin

b. Kurva baku dan persamaan regresi linier larutan seri kapsaisin

x = konsentrasi (μg/mL)

y = absorbansi

Persamaan regresi linier: y = 0,0103x - 0,0003

r = 0,9998

y = 0,0103x - 0,0003R² = 0,9997

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 50 100 150

Ab

sorb

ansi


Konsentrasi vs Absorbansi Kapsaisin

Seri konsentrasikapsaisin

Konsentrasi

(μg/mL) Absorbansi

20 0,205

40 0,411

60 0,618

80 0,81

100 1,031


21

Lampiran 9. Perhitungan Rf

Ekstrak etanol cabai merah dielusi dengan fase gerak optimum yaitu toluen : etil

asetat (1:1) v/v

Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi fraksi

Semua fraksi dilarutkan dalam labu takar 10 mL

a. Konsentrasi fraksi stok

C = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑘𝑎𝑛

Replikasi 1

C = 0,0118 𝑔

10 𝑚𝐿 = 1180 μg/mL

Replikasi 2

C = 0,0123 𝑔

10 𝑚𝐿 = 1230 μg/mL

b. Perhitungan konsentrasi pengenceran fraksi 4x

Replikasi 1

1180 μg/mL.2,5 mL = C2.10 mL

C2 = 295 μg/mL

Gambar 10. Hasil penotolan ekstrak etanol buah cabai merah dan

standar kapsaisin dengan fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase

diam silika gel 60 F254 dan detektor UV 365 nm

Replikasi 3

C = 0,0110 𝑔

10 𝑚𝐿 = 1100 μg/mL

Replikasi 3

1100 μg/mL . 2,5 mL = C2 . 10 mL

C2 = 275 μg/mL


22

Replikasi 2

1230 μg/mL.2,5 mL = C2.10 mL

C2 = 307,5 μg/mL

Lampiran 11. Pengukuran serapan kapsaisin dan perhitungan konsentrasi

kapsaisin dalam fraksi pengenceran 4x

a. Pengukuran serapan kapsaisin dalam fraksi pengenceran 4x

b. Perhitungan konsentrasi kapsaisin dalam fraksi pengenceran 4x

Perhitungan menggunakan persamaan regresi linier dari kurva baku konsentrasi

vs absorbansi kapsaisin

Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,260 = 0,0103x – 0,0003

x = 25,272 μg/mL

Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,255 = 0,0103x – 0,0003

x = 24,786 μg/mL

Rata-rata = C Replikasi 1+C Replikasi 2+C Replikasi 3

3

= 25,272+24,786+21,388

3 = 23,816 μg/mL

SD = 2,1159

Replikasi Absorbansi

1 0,260

2 0,255

3 0,220

Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,220 = 0,0103x – 0,0003

x = 21,388 μg/mL

CV = SD

Rata−rata x 100%

= 2,1159

23,816 x 100%

= 8,8848 %


23

Lampiran 12. Perhitungan penetapan kadar

Kadar kapsaisin dalam fraksi = konsentrasi yang didapat x faktor pengenceran

Jumlah kapsaisin dalam 10 ml fraksi = kadar kapsaisin dalam fraksi x 10 mL

Kadar kapsaisin dalam ekstrak = jumlah kapsaisin dalam 10 ml fraksi

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑜𝑡𝑜𝑙𝑘𝑎𝑛

Kadar kapsaisin dalam simplisia = kadar kapsaisin dalam ekstrak

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖

Kadar kapsaisin dalam buah segar = Kadar kapsaisin dalam simplisia

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑔𝑎𝑟 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Kadar

kapsaisin

dalam fraksi

25,272 μg/mL x 4

= 101,087 μg/mL

24,786 μg/mL x 4

= 99,146 μg/mL

21,388 μg/mL x 4

= 85,553 μg/mL

Jumlah

kapsaisin

dalam 10 ml

fraksi

101,087 μg/mL x

10 mL

= 1010,874 µg

99,146 μg/mL x

10 mL

= 991,456 µg

85,553 μg/mL x

10 mL

= 855,534 µg = 855,534 µg

Kadar

kapsaisin

dalam ekstrak

1010,874

µg/0,2004 g

= 26,490

mg/5,2515 g

991,456

µg/0,2005 g

= 27,307

mg/5,5223 g

855,534

µg/0,2002 g

= 22,096

mg/5,1705 g

Kadar

kapsaisin

dalam

simplisia

26,490

mg/25,0353 g

= 155,171

mg/146,650 g

27,307 mg

/25,0448 g

= 159,898

mg/146,650 g

22,096

mg/25,0203 g

= 129,508

mg/146,650 g

Kadar

kapsaisin

dalam buah

segar

155,171

mg/1026,7 g

= 151,136 mg/kg

= 0,015% b/b

159,898

mg/1026,7 g

= 155,740 mg/kg

= 0,016% b/b

129,508

mg/1026,7 g

= 126,140 mg/kg

= 0,013% b/b


24

Rata-rata = 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 1+𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 2+𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 3

3

= 151,136+155,740+126,140

3

= 144,339 mg/kg

SD = 15,9279

CV = 𝑆𝐷

𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 x 100%

= 15,9279

144,339 x 100%

= 11,040%

Lampiran 13. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan

Gambar 11. Hasil uji aktivitas antioksidan etanol (A),

standar kapsaisin (B), ekstrak etanol cabai merah (C) dan

fraksi toluen-etil asetat cabai merah (D)


25

Lampiran 14. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time

Hasil serapan standar kapsaisin setiap 5 menit

Waktu

(menit) Absorbansi

Selisih

absorbansi

Waktu

(menit) Absorbansi

Selisih

absorbansi

0 0,754 - 30 0,337 0,022

3 0,661 0,093 35 0,318 0,019

5 0,571 0,09 40 0,301 0,017

10 0,488 0,083 45 0,284 0,017

15 0,425 0,063 50 0,271 0,013

20 0,39 0,035 55 0,26 0,011

25 0,359 0,031 60 0,251 0,009

Kurva Operating Time

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 20 40 60 80

Ab

sorb

ansi

Waktu (menit)

Penentuan Operating Time Standar Kapsaisin

Standarkapsaisin 100µg/mL


26

b. Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3


27

Rata-rata = 𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 1+𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 2+𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 3

3

= 514+516+518

3

= 516 nm

Lampiran 15. Uji aktivitas antioksidan standar kapsaisin

a. Pembuatan seri konsentrasi standar kapsaisin

5 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 5 μg/mL . 10 mL

V1 = 0,5 mL

10 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 10 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL

15 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 15 μg/mL . 10 mL

V1 = 1,5 mL

a. Hasil serapan blanko dan seri konsentrasi standar kapsaisin

b. Perhitungan %S

%S = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 x 100%

Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

5 0,25

10 0,219

15 0,184

20 0,158

25 0,109

Blanko 0,376

20 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 20 μg/mL . 10 mL

V1 = 2 mL

25 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 25 μg/mL . 10 mL

V1 = 2,5 mL


28

5 μg/mL

%S = 0,376−0,250

0,376 x 100%

= 33,511%

10 μg/mL

%S = 0,376−0,219

0,376 x 100%

= 41,755%

15 μg/mL

%S = 0,376−0,184

0,376 x 100%

= 51,064%

d. Kurva baku dan persamaan regresi linier

x = konsentrasi (µg/mL)

y = %S

Persamaan regresi linier: y = 1,8245x + 23,697

r = 0,9950

c. Perhitungan IC50 standar kapsaisin


vs %S kapsaisin

IC50 standar kapsaisin: y = 1,8245x + 23,697

50 = 1,8245x + 23,697

x = 14,417 µg/mL

y = 1,8245x + 23,697R² = 0,9901

0

20

40

60

80

0 10 20 30

%S

(%)

Konsentrasi (μg/mL)

Konsentrasi vs %S Kapsaisin

Seri konsentrasikapsaisin

Linear (Serikonsentrasikapsaisin)

20 μg/mL

%S = 0,376−0,158

0,376 x 100%

= 57,979%

25 μg/mL

%S = 0,376−0,109

0,376 x 100%

= 71,011%


29

Lampiran 16. Uji aktivitas antioksidan sampel fraksi

a. Pembuatan seri konsentrasi sampel

Replikasi 1

- Pengenceran 10x (118 μg/mL)

1180 μg/mL . V1 = 118 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL

- Pengenceran 6,667x (177 μg/mL)

1180 μg/mL . V1 = 177 μg/mL . 10 mL

V1 = 1,5 mL


1180 μg/mL . V1 = 236 μg/mL . 10 mL

V1 = 2 mL


1180 μg/mL . V1 = 295 μg/mL . 10 mL

V1 = 2,5 mL


1180 μg/mL . V1 = 354 μg/mL . 10 mL

V1 = 3 mL

Replikasi 2


1230 μg/mL . V1 = 123 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL

- Pengenceran 6,667x (184,5 μg/mL)

1230 μg/mL . V1 = 184,5 μg/mL . 10 mL

V1 = 1,5 mL


1230 μg/mL . V1 = 246 μg/mL . 10 mL

V1 = 2 mL

- Pengenceran 4x (307,5 μg/mL)

1230 μg/mL . V1 = 307,5 μg/mL . 10 mL

V1 = 2,5 mL


30


1230 μg/mL . V1 = 369 μg/mL . 10 mL

V1 = 3 mL

Replikasi 3


1100 μg/mL . V1 = 110 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL


1100 μg/mL . V1 = 165 μg/mL . 10 mL

V1 = 1,5 mL


1100 μg/mL . V1 = 220 μg/mL . 10 mL

V1 = 2 mL


1100 μg/mL . V1 = 265 μg/mL . 10 mL

V1 = 2,5 mL


1100 μg/mL . V1 = 330 μg/mL . 10 mL

V1 = 3 mL

d. Hasil serapan blanko

Rata-rata = 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜1+𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 2+𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 3

3

= 0,561+0,552+0,564

3

= 0,559


31

e. Hasil serapan seri konsentrasi sampel fraksi

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

118 0,427 123 0,423 110 0,443

177 0,383 184,5 0,382 165 0,390

236 0,345 246 0,339 220 0,338

295 0,300 307,5 0,300 265 0,291

354 0,257 369 0,260 330 0,257

Replikasi 3


32

g. Perhitungan %S

Replikasi 1

- 118 μg/mL

%S = 0,559−0,427

0,559 x 100%

= 23,614%

- 177 μg/mL

%S = 0,559−0,383

0,559 x 100%

= 31,485%

- 236 μg/mL

%S = 0,559−0,345

0,559 x 100%

= 38,283%

Replikasi 2

- 123 μg/mL

%S = 0,559−0,423

0,559 x 100%

= 24,329%

- 184,5 μg/mL

%S = 0,559−0,382

0,559 x 100%

= 31,664%

- 246 μg/mL

%S = 0,559−0,339

0,559 x 100%

= 39,356%

Replikasi 3

- 110 μg/mL

%S = 0,559−0,443

0,559 x 100%

= 20,791%

- 165 μg/mL

%S = 0,559−0,390

0,559 x 100%

= 30,233%

- 295 μg/mL

%S = 0,559−0,300

0,559 x 100%

= 46,333%

- 354 μg/mL

%S = 0,559−0,257

0,559 x 100%

= 54,025%

- 307,5 μg/mL

%S = 0,559−0,300

0,559 x 100%

= 46,333%

369 μg/mL

%S = 0,559−0,260

0,559 x 100%

= 53,488%

- 275 μg/mL

%S = 0,559−0,291

0,559 x 100%

= 47,943%

- 330 μg/mL

%S = 0,559−0,257

0,559 x 100%

= 54,025%


33

- 220 μg/mL

%S = 0,559−0,338

0,559 x 100%

= 39,535%

e. Kurva baku dan persamaan regresi linier

x = konsentrasi (µg/mL)

y = %S

Persamaan regresi linier:

Replikasi 1: y = 0,1283x + 8,4794

r = 0,9997

Replikasi 2: y = 0,1187x + 9,839

r = 0,9998

f. Perhitungan IC50 sampel


vs %S sampel

IC50 Replikasi 1: y = 0,1283x + 8,4794

50 = 0,1283x + 8,4794

x = 323,621 µg/mL

IC50 Replikasi 2: y = 0,1187x + 9,839

50 = 0,1187x + 9,839

x = 338,340 µg/mL

0

10

20

30

40

50

60

0 100 200 300 400

%S

(%)


Konsentrasi vs %S SampelReplikasi1

Replikasi2

Replikasi3

Linear(Replikasi 1)

Replikasi 3: y = 0,1532x + 4,7943

r = 0,9967


34

IC50 Replikasi 3: y = 0,1532x + 4,7943

50 = 0,1532x + 4,7943

x = 295,076 µg/mL

Rata-rata = IC50 Replikasi 1+ IC50 Replikasi 2+ IC50 Replikasi 3

3

= 323,621+338,340+ 295,076

3

= 319,013 µg/mL

SD = 21,997

CV = 𝑆𝐷


= 21,997

319,013 x 100%

= 6,895%

Lampiran 17. Hasil dan perhitungan adisi sampel

a. Hasil serapan sampel

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3


35

Konsentrasi adisi

10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL

Replikasi 1 0,354 0,456 0,574

Replikasi 2 0,357 0,442 0,573

Replikasi 3 0,332 0,438 0,507

b. Perhitungan konsentrasi sampel


vs absorbansi kapsaisin

Adisi 10 µg/mL

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,354 = 0,0103x – 0,0003

x = 34,398 μg/mL

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,357 = 0,0103x – 0,0003

x = 34,689 μg/mL

Rata-rata = C Replikasi 1+ C Replikasi 2+ C Replikasi 3

3

= 34,398+34,689+ 32,262

3

= 33,783 µg/mL

SD = 1,325

Adisi 20 µg/mL

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,456 = 0,0103x – 0,0003

x = 44,301 μg/mL

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,332 = 0,0103x – 0,0003

x = 32,262 μg/mL

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,438 = 0,0103x – 0,0003

x = 42,553 μg/mL

CV = 𝑆𝐷


= 1,325

33,783 x 100%

= 3,923%


36

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,442 = 0,0103x – 0,0003

x = 42,942 μg/mL


3

= 44,301 +42,942 + 42,553

3

= 43,265 µg/mL

SD = 0,918

CV = 𝑆𝐷


= 0,918

43,265 x 100%

= 2,121%

Adisi 30 µg/mL

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,574 = 0,0103x – 0,0003

x = 55,757 μg/mL

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,573 = 0,0103x – 0,0003

x = 55,660 μg/mL


3

= 55,757+55,660+ 49,252

3

= 53,557 µg/mL

SD = 3,728

CV = 𝑆𝐷


= 3,728

53,557 x 100%

= 6,961%

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,507 = 0,0103x – 0,0003

x = 49,252 μg/mL


37

c. Perhitungan % recovery

% recovery = Konsentrasi larutan n setelah adisi− Konsentrasi tanpa adisi

Konsentrasi (jumlah) adisi x100%

Adisi 10 µg/mL

- Replikasi 1

% recovery = 34,398−25,272

10 x 100%

= 91,262%

- Replikasi 2

% recovery = 34,689−24,786

10 x 100%

= 99,029%

Adisi 20 µg/mL

Replikasi 1

% recovery = 44,301−25,272

20 x 100%

= 95,146%

Replikasi 2

% recovery = 42,942−24,786

20 x 100%

= 90,777%

Adisi 30 µg/mL

Replikasi 1

% recovery = 55,757−25,272

30 x 100%

= 101,618%

Replikasi 2

% recovery = 55,662−24,786

30 x 100%

= 102,913%

- Replikasi 3

% recovery = 32,262−21,388

10 x 100%

= 108,738%

Replikasi 3

% recovery = 42,553−30,515

20 x 100%

= 105,825%

Replikasi 3

% recovery = 49,252−21,388

30 x 100%

= 92,880%


38

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar

Kapsaisin dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Toluen-

Etil Asetat Buah Cabai Merah (Capsicum annuum L.)

dengan Metode 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil (DPPH)”

memiliki nama lengkap Kevin Giovedi. Penulis

dilahirkan di Tangerang pada tanggal 2 November 1995

sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan

Arijanto Winarti Suwino dengan Nita. Penulis

menempuh pendidikan formal di TK Kanaan (2000-

2001), SD Penabur Kota Modern Tangerang (2001-2007), SMP Penabur Kota

Modern Tangerang (2007-2010), SMA Terpadu Pahoa Tangerang (2010-2013),

dan kemudian melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta pada tahun 2013. Semasa kuliah, penulis aktif dalam berbagai

kegiatan baik kegiatan fakultas maupun universitas, seperti menjadi seksi

perlengkapan Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

(2013 dan 2014), seksi perlengkapan Titrasi (2014), master of ceremony

Pharmacy 3 on 3 (2014), seksi pendamping kelompok Titrasi (2015), koordinator

keamanan Pharmacy 3 on 3 (2015), asisten praktikum Anatomi Fisiologi Manusia

(2014) dan asisten praktikum Farmakologi Toksikologi (2015 dan 2016).


PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS … · PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS...

Documents

Transcript of PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS … · PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS...