PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL PROTEIN DAN ASAM …

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL

PROTEIN DAN ASAM AMINO EKSTRAK AMPAS

BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.) DENGAN

METODE SDS-PAGE DAN KCKT

SKRIPSI

NIA YULIANI DEWI

NIM.108102000030

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL

PROTEIN DAN ASAM AMINO EKSTRAK AMPAS

BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.) DENGAN

METODE SDS-PAGE DAN KCKT

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Far)

NIA YULIANI DEWI

NIM.108102000030

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013


ABSTRAK

Nama : Nia Yuliani Dewi

Program Studi : Farmasi

Judul : Penetapan Kadar dan Analisis Profil Protein dan

Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam

(Nigella sativa Linn.) dengan Metode SDS-PAGE

dan KCKT.

Biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) merupakan salah satu tumbuhan obat yang

antara lain berkhasiat sebagai pelancar ASI, peluruh buang angin, pencegah

muntah, pencahar, pengelat, pengobatan pasca persalinan dan immunomodulator.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar dan profil protein serta asam

amino pada ekstrak ampas biji jinten hitam. Ekstraksi protein dari ampas biji

jinten hitam (Nigella sativa Linn.) menggunakan PBS (phosphate buffer saline)

pH 7,2 dan di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 30

menit. Pengukuran kadar protein digunakan dengan metode Lowry menggunakan

pereaksi folin-ciocalteu yang di ukur pada panjang gelombang 737,5 nm. Hasil

pengukuran kadar protein dengan metode Lowry didapatkan kandungan protein

pada ekstrak ampas biji jinten hitam yaitu 8,5848 mg/ml. Analisis profil protein

dilakukan dengan menggunakan sodium dedosil sulfat poliakrilamid gel

elektroforesis (SDS-PAGE). Elektroforesis gel poliakrilamid digunakan untuk

mengetahui profil protein serta bobot molekul dari ampas biji jinten hitam

(Nigella sativa Linn.). Pewarnaan pita protein menggunakan comassie brilliant

blue. Data dianalisis secara deskriftif berdasarkan nilai migrasi pita protein

sampel dibandingkan dengan pita protein marker (Rf). Hasil analisis profil protein

dengan menggunakan SDS-PAGE menunjukkan pada ampas biji jinten hitam

(Nigella sativa Linn.) terdapat pita protein dengan berat molekul 67,4839 kDa –

8,0872 kDa. Penentuan kandungan asam amino dilakukan dengan menggunakan

KCKT. Hasil analisis kandungan asam amino pada ampas biji jinten hitam

(Nigella sativa Linn.) menunjukkan terdapat 16 asam amino dengan kandungan

total 1,055%. Diantaranya 9 asam amino esensial, yaitu histidin 0,015%, arginin

0,035%, treonin 0,021%, valin 0,032%, metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin

0,020%, leusin 0,030%, fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non esensial,

yaitu aspartat 0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin 0,053%, alanin

0,219%, prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.

Kata kunci : Ampas Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.), Profil Protein,

Asam Amino.


ABSTRACT

Name : Nia Yuliani Dewi

Program Study : Pharmacy

Title : Determination and Analysis Of Protein Profile and

Amino Acid of Black Cumin Seeds Waste Extrac

Using SDS-PAGE and HPLC Method.

Black cumin seeds (Nigella sativaLinn.) is one of herb that had potency like

facilitator milk, laxative flatulence, preventing vomiting, laxatives, postpartum

treatment and immunomodulator. The aims of this research is to determine protein

concentration and profile protein and amino acids on black cumin seeds waste

extract. The extraction of proteins from the black cumin seeds waste (Nigella

sativa Linn.) using PBS (phosphate buffer saline) pH 7.2 and centrifuged at

10,000 rpm at a 40C for 30 minutes. Measurement of protein concentration using

the Lowry method using Folin-Ciocalteu reagent is measured at a wavelength of

737.5 nm. Protein measurement results obtained by the method of Lowry protein

content from black cumin seed waste extrac is 8.5848 mg/ml. Poliacrylamide gel

electrophoresis is used to know determine the molecular weight of the protein

profile of black cumin seeds waste (Nigella sativa Linn.). Staining the protein

comassie brilliant blue was used. Data were analyzed descriptively, based on

score of the migration of the sample protein band compared marker protein band

(Rf). Results of analysis of protein profiles using SDS-PAGE showed the of black

cumin seeds waste (Nigella sativa Linn.) There is a protein band with BM

67.4839 – 8.0872 kDa. Determination of the amino acid content is done using

HPLC. Results of analysis of amino acid content in the black cumin seeds waste

(Nigella sativa Linn.) Shows are 16 amino acids with total amino acid 1,055%.

Nine of them are assential amino acids, they are histidine 0,015%, arginine

0,035%, threonine 0,021%, valine 0,032%, metheonine 0,001%, lysin 0,182%,

isoleucine 0,020%, leucine 0,030%, phenylalanine 0,013%. And the other seven

are non-essential, they are aspartic acid 0,058%, serine 0,064%, glutamic acid

0,071%, glycine 0,053%, alanine 0,219%, proline 0,148%, dan tyrosine 0,005%.

Keywords : Black Cumin Seeds Waste (Nigella sativa Linn.), Protein

Profile, Amino Acid.


KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Allah SWT. Atas segala rahmat-Nya, penulis dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar dan Analisis Profil Protein

dan Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.) dengan

Metode SDS-PAGE dan KCKT”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu

syarat menempuh ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada

Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa, keberhasilan penulisan dan penyusunan

skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan bimbingan serta do’a dari berbagai pihak,

dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu,

penulis mengucapkan terima kasih kepada:

(1) Ibu Farida Sulistiawati, M.Si, Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu Lina

Elfita, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar

dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir penulis ini, semoga

segala pengarahan, nasehat, dukungan serta bantuan kedua pembimbing

mendapat imbalan yang jauh lebih baik di sisi-NYA.

(2) Bapak Prof. Dr. (hc). Dr. M. K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc, Apt, selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4) Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku pembimbing akademik.

(5) Bapak dan Ibu staf pengajar Program Studi Farmasi yang telah memberikan

ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.


(6) Para staf dan karyawan program studi Farmasi. Staf Administrasi Farmasi,

Kak Pia yang telah banyak membantu dalam kelancaran studi kuliah.

(7) Pihak laboratorium Program Studi Farmasi Kak Eris, Mba Rani, Kak Yopi

dan Kak Liken; Pihak Laboratorium Terpadu UIN Kak Prita, Kak Pipit;

pihak Laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech Bogor. Terima kasih

karena telah banyak membantu selama proses penelitian.

(8) Kedua Orang Tua, Ayahanda H. Anan Ardiansyah dan Ibunda Hj. Eni

Suherti yang telah membesarkan, memberikan kasih sayang, mendoakan

dan memberikan dukungan luar biasa baik moril maupun materil kepada

penulis untuk segera menyelesaikan Skripsi ini. Terima kasih bapak dan

mamah. Tiada apapun di dunia ini yang dapat membalas semua kebaikan

yang telah bapak dan mamah berikan, hanya Allah yang bisa membalas

dengan Jannah-Nya.

(9) Kakak penulis Teh Dian yang telah banyak memotivasi, menghibur dan

memberikan do’a serta semangat hingga penulis dapat menyelesaikan

skripsi ini dan adik-adik penulis Epul dan Thalita.

(10) Sahabat penulis Wiwin, Sinthi, Ade, Sivia dan Nurma yang telah menjadi

sahabat-sahabat paling baik dan menjadikan hari-hari berwarna. Serta Imam

Maulana yang telah memberikan dukungan dan doa serta semangat hingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

(11) Teman seperjuangan penelitian Sinthi Ayesha dan Zikriah atas perhatian,

kerjasama dan kebersamaan selama penelitian ini.

(12) Teman-teman seperjuangan Farmasi angkatan 2008 yang sama-sama

berjuang bersama untuk menyelesaikan pendidikan ini.

(13) Teman-teman Komda FKIK dan teman-teman akhwat Al-Kahfi 2008,

terimakasih untuk motivasi dan semangat yang selalu kalian tularkan. Tiada

kata yang dapat penulis ucapkan selain I love u all coz Allah.

(14) Sahabat terbaik penulis, Kariena Febriantin. Terimakasih untuk dukungan,

do’a dan untuk setiap cerita yang selalu kita habiskan bersama. Semoga kita

dapat meraih mimpi-mimpi kita dan sukses dengan profesi kita masing-

masing.


(15) Pihak-pihak lain yang terlibat langsung maupun tidak dalam penulisan ini

yang namanya tidak dapat disebutkan.

Semoga apa yang telah diberikan kepada penulis, baik dalam bentuk doa,

dukungan, motivasi, dan tenaga atau apapun bentuknya. Semoga Allah membalas

kebaikan ini. Aamiin Ya Rabb..

Ciputat, September 2013

Penulis


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan dibawah ini :

Nama : Nia Yuliani Dewi

NIM : 108102000030

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya

dengan judul:

PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL PROTEIN DAN ASAM

AMINO EKSTRAK AMPAS BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa Linn.)

DENGAN METODE SDS-PAGE DAN KCKT.

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 26 September 2013

Yang menyatakan,

( Nia Yuliani Dewi )


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………………….............…...…... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISISNALITAS………………................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………................... iv

HALAMAN PENGESAHAN……………………………………................ v

ABSTRAK………………………………………………………................... vi

ABSTRACT ………………………………………………...….................... vii

KATA PENGANTAR…………………………………...………................. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH................ xi

DAFTAR ISI……………………………………………………................... xii

DAFTAR TABEL………………………………………………................... xiv

DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………....................... xvi

DAFTAR ISTILAH........................................................................................ xvii

BAB 1. PENDAHULUAN............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang………………………………….……................... 1

1.2 Rumusan Masalah…………………………….…………….......... 4

1.3 Tujuan Penelitian…………………………………………............ 4

1.4 Manfaat Penelitian………………………….…………..…........... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA................................................................... 5

2.1 Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)……………………..…..…..... 5

2.1.1 Klasifikasi Tanaman………………………………......……. 5

2.1.2 Nama Botani………………………………………...........… 5

2.1.3 Morfologi……………………………………….…..…….… 5

2.1.4 Kandungan Kimia……………………………..…..……....... 6

2.1.5 Khasiat dan Kandungan………………………....………….. 7

2.2 Ekstrak……………………………………..........................…....... 8

2.2.1 Pengertian Ekstrak…………………………...……….…….. 8

2.3 Protein........…………………..……………................................... 8

2.3.1 Struktur Protein ……………...………………..….……….... 9

2.3.2 Fungsi Prottein………………………………..….………..... 9

2.3.3 Pengukuran Kadar Protein...................................................... 10

2.3.4 Analisis Profil Protein............................................................. 11

2.3.5 SDS-PAGE............................................................................. 12

2.4 Asam Amino….....…………………………..……………..…….. 13

2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)………...……… 13


BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 17

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian......................................................... 17

3.2 Alat dan Bahan................................................................................ 17

3.2.1 Alat......................................................................................... 17

3.2.2 Bahan...................................................................................... 17

3.3 Prosedur Penelitian.......................................................................... 18

3.3.1 Perolehan Simplisia................................................................. 18

3.3.2 Pembuatan Ekstrak Protein...................................................... 18

3.3.3 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry................. 19

3.3.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam....... 20

3.3.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam...... 21

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................... 23

4.1 Determinasi Biji Jinten Hitam ........................................................ 23

4.2 Ekstraksi Protein Ampas Biji Jinten Hitam..................................... 23

4.3 Hasil Pengukuran Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten

Hitam dengan Metode Lowry......................................................... 24

4.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan

SDS-PAGE..................................................................................... 28

4.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan

KCKT............................................................................................. 30

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................... 34

5.1 Kesimpulan.………………………………………………………. 34

5.2 Saran.......…………………………………………………………. 34

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….. 35


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Kandungan Nilai Gizi Ampas Biji Jinten Hitam ............................... 7

Tabel 4.1 Hasil Pengujian Identitas dan Organoleptik Ekstrak........................ . 24

Tabel 4.2. Nilai Serapan Spektrofotometri Seri Konsentrasi Larutan BSA ........ 25

Table 4.3. Hasil Pengujian Kandungan Protein dengan Metode Lowry ............. 27

Tabel 4.4. Hasil Analisis Kandungan Asam Amino ........................................... 32


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.).. ......................................... 6

Gambar 2.2 Prinsip Kerja SDS-PAGE.......................................................... 12

Gambar 2.3 Struktur Asam Amino ............................................................... 13

Gambar 2.4 Alur Proses Penggunaan HPLC ................................................ 14

Gambar 4.1 Kurva dan Persamaan Kalibrasi Konsentrasi terhadap Serapan

Larutan BSA .................................. ......................................... 26

Gambar 4.2 Hasil Analisis SDS-PAGE pada Ekstrak Ampas Biji Jinten

Hitam..................................... ................................................... 30


DAFTAR ISTILAH

SDS-PAGE : Sodium Dedosil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis

KCKT : Kromatgrafi Cair Kinerja Tinggi

BSA : Bouvine Serum Albumin

UV-VIS : Ultra Violet – Visibel

LAF : Laminar Air Flow

TEMED : Tetramethylethylene Diamine

PBS : Phospate Buffer Saline

AABA : Alpha Amino Butiric Acid

AQC : 6-Aminoquinolyl-N-Hidroxysuccsinimidil Carbamate

AMQ : 6-Aminoquinolin


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum ................................ 41

Lampiran 2. Skema Kerja Penetapan Kadar Protein .......................... ........... 42

Lampiran 3. Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE ............................... 43

Lampiran 4. Analisis Asam Amino dengan KCKT ....................................... 44

Lampiran 5. Hasil Determinasi Biji Jinten Hitam .......................................... 45

Lampiran 6. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum ............................... 46

Lampiran 7. Bahan Pereaksi untuk SDS-PAGE ............................................ 47

Lampiran 8. Bahan dan Alat Penelitian ................... ............................... 49

Lampiran 9. Beberapa Hal Terkait SDS-PAGE ............................................. 52

Lampiran 10. Kromatogram Standar Asam Amino ......................................... 55

Lampiran 11. Kromatogram Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam ....................... 56

Lampiran 12. Hasil Analisis Asam Amino menggunakan KCKT ................... 58

Lampiran 13. Pembuatan Larutan Baku untuk KCKT..................................... 60


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh,

karena zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga

berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur (Winarno, 1992).

Jinten hitam merupakan tanaman semusim, famili Ranunculaceae.

Tanaman asli dari daerah Asia Barat, dan banyak tumbuh disekitar Laut

Tengah. Secara tradisional, jinten hitam telah lama dikenal sebagai obat

berbagai macam penyakit di banyak negara, termasuk Indonesia (Indriati

dan Khaerati, 2009).

Selama berabad-abad biji dari tanaman jinten hitam (Nigella sativa

Linn.) telah digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan

dan melawan penyakit terutama di Timur Tengah dan Asia Tenggara (Gilani

et al., 2004).

Jinten hitam diketahui memiliki banyak manfaat sesuai dengan sabda

Rasulullah SAW didalam sebuah hadist Bukhari mengenai khasiat jinten

hitam. Didalam kitab Shahih Bukhari Muslim, Abu Hurairah r.a. berkata

bahwa dia mendengar Rasulullah S.A.W. bersabda sebagai berikut:

عي أبي هريرة رضي الله عٌه أًه سوع رسول الله صلى الله عليه و سلن يقول:

.لاالسام"إى في الحبت السوداءشفاءهي كل داء،" إ

“Dari Abu Hurairah RA bahwa dia mendengar Rasulullah

bersabda,”Sesungguhnya biji hitam itu mengandung obat untuk segala

penyakit, kecuali sam (kematian).” (HR. Bukhari).

Biji jinten hitam diketahui memiliki banyak manfaat antara lain

sebagai pelancar ASI, peluruh buang angin, pencegah muntah, pencahar dan

pengobatan pasca persalinan (Depkes RI, 1985). Selain itu, biji jinten hitam

menunjukkan aktivitas imunopotentiating, immunomodulasi dan memiliki

aktivitas seperti interferon (Hailat et al., 1995). Protein dari biji jinten hitam


yang dimurnikan dengan kromatografi ion exchange juga ditemukan

memiliki efek immunomodulator (Haq et al., 1999).

Dalam penelitian Al- Gaby, A.M, (1998) (tidak dilaporkan jenis biji

jinten hitamnya), dikatakan bahwa biji jinten hitam mengandung konsentrasi

protein sebesar 22,7%. Asam amino yang terkandung meliputi lisin, leusin,

isoleusin, valine, glycine, alanin, fenilalanin, arginin, asparagin, cystine,

asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin, treonin, triptopan dan tirosin.

Berdasarkan hasil analisis ampas biji jinten hitam yang dilakukan oleh

Laboratorium Sucofindo, Bekasi (2011) menyatakan bahwa ampas biji

jinten hitam masih mengandung nutrisi penting bagi tubuh, diantaranya

mengandung karbohidrat 14,18%, lemak 37,58%, protein 21,58%,

phosphor, Fe, Ca dan Zn.

Berbagai studi telah dilakukan untuk menganalisa kadar protein dan

asam amino dari ampas biji jinten hitam. Michel et al (2010) melakukan

analisa profil protein ampas biji jinten hitam yang diekstraksi dengan

menambahkan Tris-HCl kemudian di analisa menggunakan SDS-PAGE

dengan konsentrasi akrilamid 12%. Dari penelitian tersebut, diperoleh hasil

bahwa berat molekul protein ampas biji jinten hitam berkisar antara 91,97

kDa-29,00 kDa. Sedangkan untuk analisis asam amino dilakukan dengan

menggunakan kromatografi penukar ion. Diperoleh hasil bahwa, ampas biji

jinten hitam mengandung 16 asam amino. Diantaranya, asam aspartat

3,07%, Treonin 1,21%, serin 1,31%, asam glutamat 7,78%, prolin 1,58%,

glisin 1,89%, alanin 1,47%, sistein 0,75%, valin 1,34%, metionin 0,53%,

isoleusin 1,06%, leusin 2,04%, fenilalanin 1,16%, histidin 1,05%, lisin

1,10% dan arginin 2,86% (Michel et al., 2010).

Silvia et al (2012) melakukan analisa asam amino dari ampas biji

jinten hitam berdasarkan perbedaan temperatur ekstraksi menggunakan

HPLC dengan derivatisasi AQC (6-Aminoquinolyl-N-Hidroxysuccsinimidil

Carbamate). Diperoleh hasil bahwa, ampas biji jinten hitam mengandung

metionin, treonin, fenilalanin, valin, isoleusin, arginin, lisin, leusin, histidin,

triptofan, glisin, prolin, alanin, serin, asam glutamat, tirosin, sistein dan

asam aspartat.


Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar dan profil protein serta

asam amino dari ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.)

dengan metode SDS-PAGE dan KCKT. Pelarut yang digunakan untuk

mengekstraksi ampas biji jinten hitam adalah PBS (Phosphate Buffer

Saline). Adapun penetapan kadar protein dari ekstrak ampas biji jinten

hitam (Nigella sativa Linn.) dilakukan dengan metode Lowry. Berdasarkan

studi literatur, penetapan kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam

(Nigella sativa Linn.) menggunakan metode Lowry belum pernah

dilakukan. Metode Lowry merupakan metode yang paling banyak

digunakan untuk menentukan kandungan protein suatu sediaan tumbuhan

(Harbone, 1987). Selain itu, uji Lowry seratus kali lebih sensitif

dibandingkan dengan reaksi Biuret (Coligan et al., 2007).

Selanjutnya dilakukan analisis profil protein dengan menggunakan

SDS-PAGE. Identifikasi SDS-PAGE merupakan teknik elektroforesis yang

menggunakan gel poliakrilamida yang bertujuan untuk memisahkan protein

dalam sampel berdasarkan berat molekul (Janson et al., 1998). SDS-PAGE

dinilai lebih menguntungkan dibandingkan elektroforesis kertas dan

elektroforesis pati. Hal ini disebabkan karena besarnya medium penyangga,

serta perbandingan konsentrasi akrilamida dan bis-metilen akrilamida.

Selain itu, gel ini tidak menimbulkan konveksi dan transparan (Bintang,

2010). Selanjutnya dilakukan analisis asam amino secara kromatografi. Cara

kromatografi telah memiliki banyak pengembangan, salah satu yang umum

yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). KCKT mampu memisahkan

senyawa yang serupa dengan resolusi yang baik serta dapat bekerja lebih

cepat sehingga waktu yang dibutuhkan singkat (Adnan, 1997).

Hasil analisa ekstrak ampas biji jinten hitam diharapkan dapat menjadi

informasi awal bagi pengembangan ekstrak sebagai immunomodulator.


1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut di atas, maka dapat dirumuskan

beberapa permasalahan sebagai berikut:

1. Berapakah kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam?

2. Bagaimanakah profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam yang

dianalisa dengan SDS-PAGE?

3. Bagaimanakah profil asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam yang

dianalisa dengan KCKT ( Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:

1. Mengetahui kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam.

2. Mengetahui profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam.

3. Mengetahui jenis dan kadar asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam.

1.4 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumber informasi

ilmiah tentang kandungan protein dan asam amino dari ekstrak ampas biji

jinten hitam (Nigella sativa Linn.) serta dapat memberikan informasi dalam

formulasi sediaan farmasi mengenai kadar protein dan asam amino yang

terkandung didalam ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.).


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi tanaman jinten hitam adalah

sebagai berikut (Depkes RI, 1979):

Kingdom : Plantae

Subkingdom :Traceabionta

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Magnoliopsoda dicotyledon

Subkelas : Magnoliidae

Ordo : Ranunculaceae

Genus : Nigella L

Spesies : Nigella sativa L

2.1.2 Nama Botani

Nigella sativa Linn

Nama Lain

Jawa : Jinten ireng (Jawa)

Sumatera : Jinten item (Melayu) (Anonim, 1983)

2.1.3 Morfologi

Jinten hitam merupakan tanaman perdu dengan ketinggian mencapai

50 cm dan mempunyai batang sedikit berkayu yang berbentuk bulat dan

berusuk, serta berbulu kasar, bercabang dan berwarna hijau. Daun berbentuk

bulat telur, ujung lancip, terdapat 3 tulang daun yang berbulu. Buah

berbentuk bulat panjang, bersegi dan beralur, berbiji kecil warna hitam

(Mursito, 2000). Kelopak bunga 5, bundar telur, ujungnya agak melancip

sampai agak tumpul, pangkal mengecil membentuk sudut yang pendek dan

besar. Mahkota bunga pada umumnya 8, agak memanjang, lebih kecil dari


kelopak bunga, berbulu jarang dan pendek. Bibir bunga dua, bibir bagian

atas agak pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk benang, ujung bibir

bunga bagian bawah tumpul. Benang sari banyak, gundul. Kepala sari

jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat telur atau agak bulat.

Biji hitam, jorong bersudut tiga tak beraturan dan sedikit berbentuk kerucut,

panjang 3 mm, berkelenjar (Depkes RI, 1989).

Gambar 2.1. Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)

Sumber : Bamusa dan Al-Hujaj, 2011.

2.1.4 Kandungan Kimia

Biji jinten hitam mengandung asam lemak (35,6-41,6%), meliputi

asam arakidonat, asam linoleat, asam linolenat, asam oleat, asam palmitat,

asam stearat, dan asam miristat. Minyak atsiri (0,5-1,6%) meliputi

nigellone, thymoquinone, thymohidroquinone, dithymoquinone, thymol,

carvacrol, α dan β–pinene, d-limonene, d-citronellote, dan p-cymene. Data

penelitian yang dilakukan oleh Al-Gaby, A.M, 1998 (tidak dilaporkan jenis

jinten hitam nya), terkandung kadar protein 22,7%, asam amino meliputi

albumin, globulin, lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin,

arginin, asparagin, sistin, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin,

treonin, triptopan dan tirosin. Alkaloid meliputi nigellicine, nigellidine-N-

oxide. Mineral (1,79-3,74%), meliputi Fe, Na, Cu, Zn, P dan Ca. Vitamin

seperti asam askorbat, tiamin, niasin, piridoksin, dan asam folat, serta

karbohidrat (33,9%), serat (5,5%), air (6%), juga memiliki nilai gizi. Selain

itu, terkandung senyawa flavonoid, saponin dan tannin, asam organik.


Bijinya juga mengandung lipase, fitosterol, dan β-sitosterol (Hasan Gilani et

al., 2004).

Tabel 2.1. Kandungan nilai gizi ampas biji jintan hitam (Nigella sativa

Linn.)

Uraian Satuan Hasil

Kadar abu % 4,67

Warna - Hitam

Kadar air % 8,34

Karbohidrat % 14,18

Lemak % 37,58

Kalori Kcal / 100 g 481,26

Protein % 21,58

Serat kasar % 13,65

Phosphor ( P ) % 1,37

Zat besi (Fe ) mg/kg 889,17

Calcium ( Ca ) % 0,84

Zinc ( Zn ) mg/kg 70,28

Sumber : Laboratorium PT. Sucofindo, Cibitung - Bekasi (2011).

2.1.5 Khasiat dan kegunaan

Biji jinten hitam digunakan sebagai pelancar ASI, peluruh buang

angin, pencegah muntah, pencahar, pengelat, dan pengobatan pasca

persalinan (Depkes RI, 1985). Selain itu, biji jinten hitam menunjukkan

aktivitas imunopotentiating, immunomodulasi dan memiliki aktivitas seperti

interferon (Hailat et al., 1995). Protein dari biji jinten hitam yang

dimurnikan dengan kromatografi ion exchange juga ditemukan memiliki

efek immunomodulator (Haq et al., 1999).

Analisis dan publikasi studi-studi yang telah dilakukan dibeberapa

negara, menyatakan bahwa ekstrak Nigella Sativa dapat digunakan sebagai

antimikroba dan antioksidan (Singh, 2005), anti diabetes, antiinflamasi,

antiplasmolitik (Paarakh, 2009), toksisitas terhadap sel kanker usus dan


leukimia karsinoma (Norsharina et al., 2011), peningkat sistem imun

(Swamy et al., 2000) dan anti bakteri (Halawani, 2009).

2.2 Ekstrak

2.2.1 Pengertian Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan menarik

senyawa aktif dari simplisia nabati ataupun hewani menggunakan pelarut

yang sesuai. Ragam ekstraksi yang tepat sudah tentu bergantung pada

tekstur dan kandungan air bahan tumbuhan yang diekstraksi dan pada jenis

senyawa yang diisolasi (Harbone, 1987).

Ekstraksi tanaman obat adalah pemisahan secara kimia atau fisika

suatu bahan padat atau bahan cair dari suatu padatan, yaitu tanaman obat

(Depkes RI, 2000).

Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang

terdapat pada simplisia. Karena didalam simplisia mengandung senyawa

aktif yang berbeda-beda dan mempunyai struktur kimia yang berbeda-beda,

sehingga metode didalam penarikan senyawa aktif didalam simplisia harus

memperhatikan faktor seperti: udara, suhu, cahaya, logam, berat. Proses

ekstraksi dapat melalui tahap menjadi: pembuatan serbuk, pembasahan,

penyarian, dan pemekatan (Depkes RI, 1978).

2.3 Protein

Istilah protein yang dikemukakan pertama kali oleh pakar kimia

Belanda, G.J.Mulder pada tahun 1939, yang berasal dari bahasa Yunani

“proteios”. Proteios sendiri mempunyai arti yang pertama atau yang paling

utama. Protein memegang peranan yang sangat penting pada organisme,

yaitu dalam struktur, fungsi, dan reproduksi (Sumardjo, 2009).

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang

sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping berat

molekul yang berbeda-beda, protein mempunyai sifat yang berbeda-beda

pula. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang sukar

larut dalam air (Poedjiadi, 1994).


2.3.1 Struktur Protein

Berdasarkan strukturnya, protein dibentuk oleh:

1. Struktur primer, dibentuk oleh ikatan peptida antar asam amino. Struktur

ini mengacu pada jumlah, jenis, serta urutan asam amino yang

membentuk rantai polipeptida.

2. Struktur sekunder, dibentuk oleh ikatan hidrogen intramolekular yang

terjadi di antara oksigen karbonil dan nitrogen amida pada perangkat

peptida.

3. Struktur tersier, merupakan rangkaian molekular yang menggambarkan

bentuk keseluruhan dari protein.

4. Struktur kuartener dibentuk oleh beberapa polipeptida yang berikatan

satu sama lain tidak secara kovalen (Bintang, 2010).

2.3.2 Fungsi Protein

Protein memegang peranan penting dalam hampir semua proses

biologi. Peran dan aktivitas protein terlihat dalam contoh berikut ini:

1. Katalis enzimatik.

Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh

makromolekul spesifik yang disebut enzim. Enzim mempunyai daya

katalitik yang besar, umumnya meningkatkan kecepatan reaksi sampai

jutaan kali. Fakta menunjukkan bahwa hampir semua enzim yang

dikenal adalah protein. Jadi protein merupakan pusat dalam

menetapkan pola transformasi kimia dalam sistem biologis.

2. Transport dan penyimpanan.

Berbagai molekul kecil dan ion ditransport oleh protein spesifik.

3. Koordinasi gerak.

Protein merupakan komponen utama dalam otot. Kontraksi otot

berlangsung akibat pergeseran dua jenis filamen protein.

4. Penunjang mekanis.

Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan

protein fibrosa.

5. Protein imun.


Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal

serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel

yang berasal dari organisme lain.

6. Membangkitkan dan menghantar impuls saraf.

Respons sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantai oleh protein

reseptor.

7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi.

Pengaturan urutan ekspresi informasi genetik sangat penting bagi

pertumbuhan yang beraturan serta diferensiasisel.

2.3.3 Pengukuran Kadar Protein

Adapun metode yang dilakukan untuk penetapan kadar protein pada

penelitian ini yaitu dengan metode Lowry.

Metode Lowry dikembangkan pada tahun 1951 dengan menggunakan

reagen pendeteksi Folin-ciocalteu. Reagen ini biasa digunakan untuk

mendeteksi gugus-gugus fenolik. Dalam keadaan basa, ion tembaga divalen

(Cu2+

) dengan ikatan peptida yang mereduksi Cu2+

menjadi tembaga

monovalen (Cu+) (Bintang, 2010). Dalam analisa protein reagen Folin-

Ciocalteu dapat mendeteksi residu oksidasi dimana gugus fenolik tirosin

akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen

tersebut menjadi tungsten dan molibden yang berwarna biru. Hasil reduksi

ini dapat dianalisa lebih lanjut dengan melihat puncak absorpsi yang lebar

pada daerah panjang gelombang sinar tampak (600-800nm).

Kadar protein dapat ditentukan dengan membaca kurva standar, dibuat

dengan larutan protein murni yang telah diketahui kadar proteinnya

misalnya BSA (Bouvine Serum Albumin) yang memiliki rentang konsentrasi

tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada didalam rentang tersebut

dengan konsentrasi yang semakin menaik (Slamet Sudarmadji et al., 1981).


2.3.4 Analisis Profil Protein dengan Elektroforesis Gel Poliakrilamid SDS

(Sodium Dodesil Sulfat)

Pemisahan protein merupakan tahap yang harus dilakukan untuk

mempelajari sifat dan fungsi protein. Protein dapat dipisahkan dari protein

jenis lain atau dari molekul lain berdasarkan ukuran, kelarutan, muatan, dan

afinitas ikatan (Nelson, 2004). Salah satu teknis yang digunakan untuk

melihat profil protein dan menentukan bobot molekulnya menggunakan

SDS-PAGE (Stryer, 1995).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular

berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan

pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Jika

molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui satu medium, misalnya

gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang

berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub

negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada

nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk

molekulnya (Yuwono, 2005).

Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk menentukan berat

molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein atau asam

nukleat, menetapkan titik isoelektrik, serta memisahkan spesies-spesies

yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif (Bintang, 2010).

Kegunaan elektroforesis antara lain, (1) menentukan berat molekul (2)

dapat mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan, (3) dapat mendeteksi

terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan dan

penyimpanan, (4) untuk memisahkan spesies molekul yang berbeda secara

kualitatif maupun kuantitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat

dianalisis, (5) menetapkan titik isoelektrik protein (Yuwono, 2005).


2.3.5. SDS PAGE (Sodium Dedosil Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis).

Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan secara luas pada saat

ini adalah elektroforesis SDS gel poliakrilamida (SDS PAGE).

Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk

memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. Prinsip dasar

SDS-PAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dedosil sulfat yang

dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya

dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel, dalam hal ini yang

digunakan adalah poliakrilamid (Janson et al., 1998).

SDS-PAGE dilakukan pada pH netral. Pada metode ini digunakan

SDS dan beta-merkaptoetanol. SDS merupakan anionic detergent yang

bersama dengan beta-merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan

rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil. Hal

ini disebabkan oleh terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi

menjadi gugus-gugus sulfihidril. (Janson et al., 1998).

Gambar 2.2 Prinsip Kerja SDS PAGE (Sobti, et al 2008 dan Stryer, 2002)

((1) Denaturasi sampel dengan sodium dedocyl sulfate (SDS) menyelubungi

protein. (2) Penempatan protein sampel pada gel kemudian dialiri listrik.

(3) Pewarnaan untuk visualisasi pemisahan pita).


2.4 Asam Amino

Asam amino merupakan unit dasar struktur protein. Suatu asam amino

α terdiri dari gugus amino, gugus karboksil, atom H dan gugus R tertentu,

yang semuanya terikat pada atom karbon α. Atom karbon ini disebut α

karena bersebelahan dengan gugus karboksil (asam). Gugus R menyatakan

rantai samping (Stryer, 2000).

Rumus umum asam amino:

Gambar 2.3 Struktur Asam Amino (Sumardjo, 2009)

Berdasarkan polaritas gugus R, asam amino dibedakan menjadi 4

golongan yaitu (1) asam amino dengan gugus-R yang bersifat non polar,

seperti alanin, leusin, isoleusin, valin, prolin, fenilalanin, triftopan, dan

metionin, (2) asam amino dengan gugus –R polar tidak bermuatan, seperti

serin, treonin, tirosin, aspargin, glutamin, sistein dan glisin, (3) asam amino

dengan gugus –R bermuatan positif, seperti lisin, arginin, histidin, dan (4)

asam amino dengan gugus –R bermuatan negatif, seperti asam aspartat dan

asam glutamat (Bodanszky, 1993 ; Sumarno et al., 2002).

2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari

kromatografi kolom. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah

kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak

baik cairan polar maupun cairan non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi

(Adnan 1997). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu

cara pemisahan komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan


distribusi/absorbsi/adsorbsi komponen di antara dua fase yang berbeda,

yaitu fase diam (stasioner) dan fase gerak (mobil) (Salamah, 1997).

Pelarut yang biasanya digunakan pada KCKT adalah air, metanol,

asetonitril, kloroform, dan pelarut lainnya yang berada dalam keadaan murni

(HPLC grade). Pelarut-pelarut tersebut sebelum digunakan harus disaring

terlebih dahulu dengan kertas saring milipore (0,45 mm) dan harus

dihilangkan gasnya (degassing) (Salamah, 1997). Komponen utama alat

yang dipakai dalam KCKT antara lain (1) reservoir zat pelarut untuk fase

mobil; (2) pompa; (3) injektor; (4) kolom; (5) detektor dan (6) rekorder

(Adnan, 1997). Jantung dari peralatan KCKT adalah kolom dimana terdapat

fase diam dan terjadi pemisahan komponen antara fase diam dan fase

bergerak yang dialirkan dengan bantuan pompa (Salamah, 1997). Alur

proses penggunaan KCKT dapat dilihat pada Gambar :

Gambar 2.4 Alur proses penggunaan HPLC (Husgen dan Schuster, 2001)

Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam

amino atau kandungan protein dan peptida. Sebelum dilakukan analisis

asam amino dengan kromatografi terlebih dahulu dilakukan hidrolisis yang

bertujuan untuk memutuskan ikatan peptidanya dengan hidrolisis asam dan

basa yang kuat atau dengan menggunakan enzim spesifik untuk

mendapatkan asam amino. Pada hidrolisis asam unsur yang dasar yang

diperlukan adalah HCl 6 M, suhu 1100C dan waktu 24 jam. Reaksinya

biasanya dilakukan di tabung kaca yang ditutup rapat, yang sebelumnya

telah dikeluarkan gasnya. Sementara itu, pada hidrolisis basa, ikatan amida

dapat diputus dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M


pada suhu 1000C. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein,

serin, dan treonin (Bailey, 1990). Dengan hidrolisis asam, triptofan tidak

stabil dalam lingkungan asam, sehingga rusak dalam hidrolisis asam dan

sedikit kerusakan juga terjadi pada serin dan treonin, sedangkan asparagin

dan glutamin akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam

glutamat dengan membebaskan ion amonium (Linder, 1992 ; Sumarno et

al., 2002). Selain itu, ada pula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam

tubuh. Untuk menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar

tertentu yang dapat dikatalisi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal

sebagai peptidase. Amino peptidase bekerja cepat dan efisien dalam

hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino

mulai dari ujung N (Bailey, 1990). Pemisahan yang umum dilakukan adalah

dengan cara kromatografi. Di antara teknik kromatografi yang dapat

dilakukan dengan pemisahan, yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi

kertas, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Selain itu, pemisahan asam

amino dapat pula dilakukan dengan elektroforesis kertas (Bailey, 1990).

Kromatografi penukar ion sangat efisien dalam memisahkan

campuran asam amino dengan menggunakan kolom penukar ion secara

paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel

sehingga teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis

campuran asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan

asam amino berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki

afinitas kuat terhadap molekul air, yang terbentuk oleh ikatan hidrogen

dengan gugus OH pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat

dipisahkan dengan sempurna dengan kromatografi kertas sederhana, maka

kromatogram dua dimensi dapat dicoba (Bailey, 1990). KCKT tidak umum

digunakan pada pemisahan asam amino (Bailey, 1990). Banyak senyawa

yang sukar dideteksi oleh detektor KCKT. Salah satu upaya yang dilakukan

untuk mengatasi hal tersebut adalah dengan melakukan proses derivatisasi.

Derivatisasi dalam KCKT bertujuan untuk mengubah analit menjadi bentuk

yang dapat terdeteksi oleh sistem detektor yang digunakan. Proses

derivatisasi dapat dilakukan sebelum sampel diinjeksikan (pre colomn


derivatization), atau sesudah pemisahan dari kolom (post colomn

derivatization) (Adnan, 1997).

Metode analisis asam amino dengan KCKT memiliki beberapa

keuntungan diantaranya dapat bekerja lebih cepat sehingga waktu yang

dibutuhkan singkat serta KCKT mampu memisahkan senyawa yang sangat

serupa dengan resolusi yang baik (Adnan, 1997). Kelemahan dari metode

ini adalah sulitya mendeteksi yang kita inginkan jika sampel yang

digunakan memiliki banyak pengotor. Selain itu, kebersihan kolom KCKT

harus dijaga, karena kolom yang kotor tidak akan mampu mendeteksi

senyawa yang akan dianalisa (Husgen dan Schueter, 2001).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3. 1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan dilaboratorium Jurusan Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium

Terpadu Kampus UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium PT.

Saraswanti Indo Genetech, waktu penelitian ini berlangsung dari bulan

Januari sampai Agustus 2013.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer

UV-VIS (ParkinElmer Lambda 25), pH meter, 1 set alat elektroforesis (Bio-

Rad), mikropipet beserta tipnya, erlenmeyer, labu ukur, sentrifuge beserta

tabungnya, peralatan gelas, pinset, spatula, syringe, tabung reaksi, tabung

ulir, batang pengaduk, vial, oven, timbangan analitik (Wiggen Hauser),

pipet volumetrik, vortex, pipet tetes, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi,

Laminar Air Flow (LAF), 1 set perangkat KCKT (Waters tipe Breeze).

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ampas biji

jinten hitam (diperoleh dari PT. Lantabura Internasional, Depok, berasal dari

negara Ethiopia), aquabidest, dinatrium hidrogen fosfat, natrium klorida,

natriumm dihidrogen posfat, Bovin Serum Albumin (BSA), natrium

karbonat, natrium hidroksida, CuSO4.H2O, Na.K-tartrat, pereaksi folin

ciocalteu, standar berat molekul protein (Bio-Rad Prestained SDS-PAGE

Standars, Broad Range (10 kDa-250 kDa), commasie brilliant blue, larutan


30% akrilamid, 0,8% bisakrilamid, buffer Tris-HCL 1,5 M pH 8,8, buffer

Tris-HCL 0,5 M pH 6,8, larutan 10% ammonium persulfat, larutan 10%

(w/v) SDS, TEMED (tetramethylethylenediamine), sample buffer, buffer

elektroforesis, metanol, AccQ•Tag Reagen Kit dari Waters (Milford,

Massachusetts, USA). Reagen kit terdiri dari Waters AccQ-Tag. Fluor

Borate Buffer, Waters AccQ•Tag Fluor Reagen serbuk (6-aminoquinolil-N-

hidroksi-succinimidil karbamat–AQC), Waters AccQ•Tag Fluor Reagen

Diluent, dan Hidrolisat Asam Amino Standar dari Waters (tiap ampul

mengandung 2.5 mM campuran hidrolisat asam amino yaitu asam aspartat

(Asp), serin (Ser), asam glutamat (Glu), glisin (Gly), histidin (His), arginin

(Arg), treonin (Thr), alanin (Ala), prolin (Pro), tirosin (Tyr), valin (Val),

metionin (Met), lisin (Lys), isoleusin (Ile), leusin (Leu), fenilalanin (Phe),

triptofan, kecuali sistein (Cys) 1.25 mM, asetonitril grade HPLC,

aquabidest.

3.3 Prosedur Penelitian.

3.3.1 Perolehan Simplisia

Bahan yang digunakan adalah ampas biji jinten hitam (Nigella sativa

Linn.) yang diperoleh dari lempeng biji yang dihaluskan. Pembuatan ampas

dilakukan dengan menghaluskan lempeng menggunakan blender hingga

diperoleh serbuk berukuran 40 mesh

3.3.2 Pembuatan Ekstrak Protein (Afrozul Haq et al., 1995)

10 gram serbuk ampas biji jinten hitam di tambahkan 100 ml PBS

(Phosphate Buffer Saline) pH 7,2 dan disentrifugasi pada 10.000 rpm

selama 30 menit pada suhu 40C. Kemudian supernatan dikumpulkan sebagai

ekstrak larut dengan membuang lapisan berminyak dan pelet yang tidak

larut.


3.3.3 Pengukuran Kadar Protein dilakukan dengan Metode Lowry

Pengukuran kandungan protein ekstrak ampas biji jinten hitam

(Nigella sativa Linn.) dilakukan di Laboratorium Terpadu UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

a. Pembuatan Spektrum

Kuvet diisi dengan salah satu larutan protein standar dengan

konsentrasi 200 ppm. Larutan blanko disiapkan dengan menggunakan

aquades. Absorban larutan dibaca pada kisaran panjang gelombang 400-800

nm dengan interval 5 mm. Pada setiap interval panjang gelombang diukur

dengan larutan standar dan blanko. Dibuat kurva hubungan panjang

gelombang dengan absorbans standar terkoreksi. Panjang gelombang yang

tepat untuk larutan tersebut kemudian ditentukan dan digunakan untuk

pengukuran selanjutnya.

b. Pembuatan kurva kalibrasi

Dibuat larutan stok BSA konsentrasi 1000 ppm dengan menimbang

serbuk BSA sebanyak 50 mg kemudian dilarutkan dengan aquades sebanyak

50 ml. Kemudian dilakukan pengenceran dengan seri konsentrai 0, 40, 80,

120, 160, 200 ppm.

Sebanyak 1000 µl larutan protein standar BSA dengan seri

pengenceran konsentrasi (0, 40, 80, 120, 160, 200 ppm). Larutan standar

dimasukkan kedalam tabung. Campuran 50:1 (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1

N dan larutan CuSO4 0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%) disiapkan.

Kemudian campuran tersebut ditambahkan sebanyak 5 ml ke dalam larutan

standar dan dibiarkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 ml pereaksi

folin-ciocalteau, kocok dan dibiarkan selama 30 menit. Absorbannya di ukur

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 737,5 nm.

c. Pengukuran kadar protein ekstrak ampas biji jinten hitam

Sebanyak 20 µl ekstrak ampas biji jinten hitam diencerkan sampai

1000 µl (pengenceran 50 kali). Sampel dimasukkan kedalam tabung.


Campuran 50:1 larutan (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N dan larutan CuSO4

0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%) disiapkan. Kemudian campuran

tersebut ditambahkan sebanyak 5 ml ke dalam larutan sampel dan dibiarkan

selama 10 menit, lalu ditambahkan 0,5 ml pereaksi folin-ciocalteau, kocok

dan dibiarkan selama 30 menit. Absorbannya di ukur dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 737,5 nm.

3.3.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam

Analisis profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa

Linn.) dilakukan di Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada penelitian ini, profil protein dianalisis dengan menggunakan

Sodium dodecyl sulphate polyacrilamyde gel electrophoresis (SDS-PAGE)

berdasarkan metode Laemmli dalam Coligan et al (1995) dengan sistem

buffer Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamid yang digunakan adalah

12%. Gel poliakrilamid dicetak diantara dua buah lempengan kaca. larutan

separating gel yang telah dibuat, disiapkan dimasukkan ke dalam cetakan

gel dengan menggunakan mikro pipet sampai batas tertentu, kemudian

ditambahkan dengan aquades sampai penuh agar permukaan gel rata.

Setelah gel mengering, aquades dibuang dan sisa air pada cetakan gel

diserap dengan kertas saring. Kemudian larutan stacking gel yang telah

dibuat dimasukkan ke dalam cetakan dan permukaan gel dipasang sisir

berlubang lalu didiamkan sampai mengeras. Setelah gel mengeras, cetakan

gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis.

Preparasi sampel dilakukan dengan memasukkan ekstrak ampas biji

jinten hitam yang telah disiapkan sebelumnya ke dalam tabung eppendorf

dan ditambahkan masing-masing sampel buffer dengan perbandingan 1:1

dan 2:1. Kedua tabung dipanaskan pada suhu 1000C selama 5 menit.

Elektroforesis dilakukan dengan cara campuran ekstrak ampas biji

jinten hitam dengan sampel buffer dimasukkan ke dalam sumur yang telah

dicetak pada gel poliakrilamid sebanyak 10 μl, kemudian alat elektroforesis


dihubungkan ke power supply dengan tegangan 200 V selama 55 menit

sampai pewarna mencapai ujung gel.

Visualisasi gel menggunakan coomassie briliant blue selama semalam

dan digoyangkan dengan alat penggoyang shaker. Selanjutnya, gel dicuci

sebanyak dua kali dengan menggunakan larutan destaining masing-masing

selama 15 menit. Setelah pita terlihat, gel dicuci dengan aquades.

Identifikasi dan analisis SDS PAGE membandingkan antara pita

protein yang telah dipisahkan sebelumnya dengan protein standar. Bobot

molekul dari masing-masing protein ditentukan dengan cara menghitung

nilai Rf dari masing-masing pita protein yang tampak. Kemudian dibuat

kurva standar hubungan antara log BM dengan Rf dari protein standar

sehingga nilai BM protein sampel dapat dihitung.

3.3.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam

Analisis asam amino dilakukan di Laboratorium PT. Saraswanti Indo

Genetech Bogor.

Sebelum dianalisis, preparasi sampel dilakukan dengan cara:

sebanyak 0,1 - 0,5 gram ekstrak ampas biji jinten hitam ditimbang lalu

ditambahkan 5 mL HCl 6 N, vortex kemudian ditambahkan gas nitrogen

dan dihidrolisis pada suhu 1100

selama 22 jam. Hidrolisat yang diperoleh

didinginkan pada suhu kamar, lalu dipindahkan ke labu ukur 100 ml,

kemudian ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Lalu disaring dengan

filter 0,45µm. Pipet 500 µl filtrat lalu tambahkan 40 µL AABA ± 460 µl

aquabidest. Pipet 10 µl larutan kemudian tambahkan 70 µl AccQ-Fluor

Borate, vortex. Tambahkan 20 µl reagen fluor A, vortex, diamkan 1 menit.

Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu suntikan pada HPLC.

Dengan kondisi kromatografi menggunakan kolom C18, temperatur 370C,

fase gerak asetonitril 60%, detektor fluorescence, laju alir 1 ml/menit dan

volume penyuntikan 5µl.

Konsentrasi asam amino dapat dihitung sebagai berikut:


AA (mg/100 gram) =

(

)

Keterangan:

Area komponen sampel = area asam amino sampel

Cstd = Konsentrasi standar (

BM = Berat Molekul

FP = Faktor pengenceran sampel

Area komponen satndar = Area asam amino standar


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Determinasi Biji Jinten Hitam

Sampel biji jinten hitam yang diperoleh dari PT. Lantabura

International, Depok, Jawa Barat, dideterminasi di Herbarium Bogoriense,

Puslit Biologi Bidang Botani LIPI Cibinong, Bogor, Jawa Barat,

menunjukkan bahwa jenis sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah

benar biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) dengan family (suku)

Ranunculaceae. Tujuan dilakukan determinasi adalah untuk

mengidentifikasi simplia. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 5.

4.2 Ekstraksi Protein Ampas Biji Jinten Hitam

Ampas biji jinten hitam memiliki ukuran partikel 40 mesh, bau

aromatik, rasa pedas dan pahit. Proses ekstraksi yang dilakukan terhadap

ampas biji jinten hitam menggunakan pelarut PBS (Phosphate Buffer

Saline) pH 7,2 kemudian disentrifuge pada kecepatan 10.000 rpm, pada

suhu 40C selama 30 menit. Menurut Janson dan Ryden (1998) masalah

utama dalam hal ekstraksi protein adalah dapat mengeluarkan protein dari

dalam sel tanpa terdegradasi atau terdenaturasi dan tidak kontaminasi

sehingga hal tersebut dapat diatasi dengan pemilihan medium ekstraksi yang

tepat, waktu persiapan cepat dan pada kondisi temperatur yang rendah.

Adapun sentrifuge digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan berat

molekul. Ekstraksi dilakukan menggunakan PBS (Phosphate Buffer Saline)

pH 7,2 karena buffer ekstraksi yang ideal untuk target protein biasanya

antara pH 7,0 dan pH 8,5 hal ini bertujuan untuk membantu kestabilan

target protein atau menghalangi dari aktivitas protein yang tidak

dikehendaki (Bonner, 2007).

Dari hasil ekstraksi sebanyak 10 gram serbuk ampas biji jinten hitam

diperoleh ekstrak cair 14,01 gram sehingga diperoleh rendemen ekstrak

sebesar 140,1 %.


Pengujian parameter spesifik meliputi identitas ekstrak dan

organoleptik ekstrak.

Tabel 4.1 Hasil Pengujian Identitas Ekstrak dan Organoleptik.

Parameter Hasil

Identitas :

Nama ekstrak

Nama lain tumbuhan

Bagian tanaman

Nama Indonesia tumbuhan

Ekstrak ampas biji jinten hitam

Jinten ireng, jinten item

Biji

Jinten hitam

Organoleptis:

Warna

Bau

Rasa

Bentuk

Kuning kecoklatan

Tidak berbau

Pedas dan sedikit pahit

Ekstrak cair

Pengujian parameter spesifik meliputi identitas ekstrak dan

organoleptik. Tujuan dilakukan identitas ekstrak adalah memberikan

identitas obyektif dari nama dan spesifik dari senyawa, sedangkan

organoleptik ekstrak bertujuan sebagai pengenalan awal menggunakan

pancaindera dengan mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa (Depkes

RI, 2000).

4.3 Hasil Pengukuran Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten

Hitam dengan Metode Lowry

Pengukuran kandungan protein yang terdapat dalam ekstrak ampas

biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) ditentukan dengan menggunakan

metode Lowry. Penentuan kadar protein dengan metode ini didasarkan atas

dua reaksi yang berbeda. Reaksi pertama adalah pembentukan tembaga

monovalen (Cu+). Dalam keadaan basa yang dibentuk oleh larutan Na2CO3


dalam NaOH, ion tembaga divalen (Cu2+

) membentuk suatu kompleks

dengan ikatan peptida yang mereduksi Cu2+

menjadi tembaga monovalen

(Cu+) (Gornall et al., 1949 dan Coligan et al., 2007). Reaksi yang kedua

adalah reaksi reduksi oleh reagen folin-Ciocalteu (fosfomolibdat dan

fosfotungstat). Ion Cu+

dan gugus radikal dari tirosin dan triftopan bereaksi

dengan pereaksi folin untuk menghasilkan suatu produk yang tidak stabil

yang mereduksi molibdenum atau tungsten blue. Protein akan bereaksi

dengan pereaksi folin-ciocalteu membentuk senyawa kompleks yang

memberikan warna biru (Coligan et al., 2007). Warna yang diperoleh

diukur absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang maksimum antara 400-800 nm. Adapun saat penelitian, panjang

gelombang serapan maksimum hasil optimasi yang digunakan adalah 737,5

nm (Lampiran 6). Pembanding yang digunakan adalah BSA (bovine serum

albumin) dengan seri konsentrasi 0, 40, 80, 120, 160 dan 200 ppm.

Tabel 4.2. Nilai Serapan Spektrofotometri UV-Vis Seri Konsentrasi

Larutan BSA (sebagai standar).

Konsentrasi BSA

(µg/ml)

Serapan (λ= 737,5

nm)

0 0,0003

40 0,0234

80 0,0821

120 0,1373

160 0,2006

200 0,2391

Tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai seri

konsentrasi adalah untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel

dengan menggunakan persamaan regresi linear garis lurus yang diperoleh

dari grafik larutan standar.

Dari 6 tabung BSA dengan satu tabung sebagai blanko, diperoleh

angka-angka absorbansi yang menjadi sumbu y dan konsentrasi BSA

sebagai sumbu x.


Gambar 4.1. Kurva dan Persamaan Kalibrasi Konsentrasi terhadap Serapan

Larutan BSA

Dari gambar diatas, kurva menunjukkan slop positif dengan gradien

garis mendekati 1 (0,994). Dengan regresi linear, diperoleh pula nilai a = -

1,343 x 10-2

dan b = 1,272 x 10-3

. Sehingga, untuk persamaan garis y = bx +

a diperoleh persamaan y = 1,272 x 10-3

- 1,343 x 10-2

.

Berdasarkan persamaan dan kurva kalibrasi, kandungan protein dari

ekstrak cair protein ampas biji jinten hitam yang di uji secara duplo dan

diambil nilai rata-ratanya, yaitu 8,5848 mg/ml atau 0,0923% terhadap

ekstrak cair atau 0,8 % terhadap serbuk ampas.

y = 0,001x - 0,013 r = 0,994

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150 200 250

Sera

pan

µg/ml


Tabel 4.3. Hasil Pengujian Kandungan Protein Ekstrak Ampas Biji

Jinten Hitam Nigella sativa Linn dengan Metode Lowry.

Jumlah

Sampel

Serapan (y)

Persamaan

Kalibrasi

Kandungan

Protein(µg/ml)

(x)

Kandungan

Protein

(µg/ml) (x

Faktor

Pengenceran)

20 µl 0,204 0,001272 x -

0,0134

170,91 µg/ml 8.545,6 µg/ml

0,206 0,001272 x -

0,0134

172,48 µg/ml 8.624 µg/ml

Nilai rata-rata

8.584,8µg/ml

atau

8,5848 mg/ml

Merujuk pada hasil kandungan protein ampas biji jinten hitam

sebelumnya yang dilakukan oleh PT. Sucofindo, Bekasi (2011) dengan

metode analisis yang digunakan adalah metode Kjehdal diperoleh

kandungan protein ampas biji jinten hitam sebesar 21,58% sedangkan dalam

penelitian ini dihasilkan kandungan protein terhadap ekstrak ampas biji

jinten hitam dengan menggunakan metode Lowry sebesar 8,5848 mg/ml

atau 0,0923%. Hal ini dikarenakan dalam metode Lowry didasarkan pada

reaksi pembentukan warna yang disebabkan adanya reaksi aatara basa

tembaga dengan kandungan residu triftopan, tirosin dan sistein dalam

ekstrak ampas biji jinten hitam. Kekuatan warna biru yang terbentuk

tergantung pada kandungan residu triftopan, tirosin dan sistein dalam

sampel protein yang diuji (Bintang, 2010). Adapun dalam penelitian ini,

warna biru yang dihasilkan oleh ekstrak ampas biji jinten hitam adalah

warna biru muda (lampiran 8, Gambar 7). Sedangkan dalam metode

Kjehdal, mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat

menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn kemudian

amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator.


Adapun kelemahan dalam metode Kjehdal bahwa purin, pirimidin, vitamin-

vitamin, asam amino besar, kreatin serta kreatinin ikut teranalis dan terukur

sebagai nitrogen protein (Bintang, 2010).

4.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan SDS-

PAGE

Analisis profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam ini dilakukan

dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai

medium pemisahan. Pada sistem ini, gel yang digunakan terdiri dari dua

jenis gel berbeda, yaitu separating gel (gel pemisah) dan stacking gel (gel

penumpuk). Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid

berdasarkan pada perbedaan muatan dan ukuran molekul dapat dilakukan

dengan menambahkan detergen ionik dan menambahkan tahap denaturasi

(Kurniati dan Wanadi, 2001). Pada proses persiapan sampel, sampel

ditambahkan dengan suatu detergen anionik seperti sodium dodesil sulfat

(SDS). Sebelum elektroforesis, sampel yang akan dipisahkan dilarutkan

terlebih dahulu dalam suatu dapar yang mengandung Tris-HCl, SDS,

gliserol, bromfenol biru dan merkaptoetanol.

Tujuan penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan

pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari ptotein, terutama ikatan

disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga

membungkus rantai protein yang terikat dengan muatan negatif yang sama

membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS-protein memiliki

densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan

ukuran protein (Wijaya dan Rohman 2005; Fatmawati et al., 2009). Oleh

karena itu, kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas

yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih

kecil (Fatmawati et al., 2009).

Adapun dalam penelitian, elektroforesis diatur dengan tegangan 200 v

konstan dengan arus sebesar 30 mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi oleh

siapa pun yang melakukan sesuai dengan keperluan dan pengalaman


percobaan. Pengaturan tercatat tersebut dipilih karena telah memberikan

hasil yang paling baik di antara percobaan-percobaan yang telah dilakukan.

Elektroforesis dilakukan sampai pewarna mencapai bagian dasar gel. Waktu

yang diperlukan adalah 55 menit.

Elektroforesis dilakukan terhadap sampel berupa ekstrak ampas biji

jinten hitam hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS (phosphate buffer

saline) pH 7,2 dan menggunakan standar berat molekul pembanding

(marker protein) Prestained SDS-PAGE Standars Broad Range dari Bio-

Rad. Hasil SDS - PAGE berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai

dengan kurva standar protein (Lampiran 10.2), menunjukkan bahwa terdapat

beberapa protein yang tampak. Marker protein yang digunakan adalah

miosin 250 kDa, Β-galaktosidase 150 kDa, BSA 75 kDa, Ovalbumin 50

kDa dan soybin tripsin inhibitor 25 kDa. Kurva standar yang dihasilkan dari

marker protein ini memiliki persamaan linier Y = -1,469 X + 2,352; R =

0,971; r = 0,985. Dengan Y adalah log bobot molekul (BM) dan X adalah Rf

(nisbah antara migrasi pita protein sampel dengan migrasi pita protein

marker).

Hasil SDS-PAGE, berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai

dengan kurva standar protein, menunjukkan terdapat beberapa pita protein

yang tampak. Adapun pita protein yang tampak pada sampel supernatan

hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2

dengan perbandingan sampel yang digunakan 1:1 dan 2:1. Pada

perbandingan 2:1 tampak pita protein yang dihasilkan memberikan warna

yang lebih jelas dibandingkan dengan pita protein dari perbandingan 1:1

karena volume pemipetan yang diberikan besar yaitu 20 µl maka jumlah

proteinnya pun menjadi lebih besar. Pita protein yang tampak pada

perbandingan 2:1 yaitu 67,4839 kDa - 8,0872 kDa.


1 2 3 4 5

Gambar 4.2. Hasil Analisis SDS-PAGE pada Ekstrak Ampas Biji

Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.).

Keterangan gambar :

No. 1 = Marker Prestained SDS-PAGE standars Broad Range

No. 2 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 1:1




4.5 Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan KCKT

Asam amino esensial sangat dibutuhkan oleh manusia karena tidak

dapat disintetis sendiri oleh tubuh. Semakin lengkap dan tinggi kandungan

gizi asam amino dalam biji maka nilai gizi semakin baik dan diharapkan

dapat menyamai protein hewani (Richana, 2000) .

Analisis asam amino dilakukan untuk menduga jenis dan kadar asam

amino yang terdapat pada ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa

250 kDa

150 kDa

75 kDa

50 kDa

25

kDa

67,4839

47,8410

38,0365

33,9156

30,2413

28,5496

25,4566

20,2396

19,1161

16,0916

15,1985

12,0837

10,7746

10,1718

8,0872


Linn.). Analisis asam amino diawali dengan hidrolisis. Pada tahap ini,

hidrolisis rantai polipeptida yang sempurna dilakukan dengan HCl 6 N pada

suhu 1100C selama 22 jam. Hidrolisis dilakukan dengan HCl karena HCl

dapat memecah ikatan peptida secara sempurna dan dapat dengan mudah

hilang dari hidrolisat dengan adanya pengupan (Masuda dan Dohmae,

2011). Setelah larutan di hirdolisis, hidrolisat yang diperoleh kemudian

didinginkan pada suhu kamar dan ditera volume nya dengan aquabidest.

Setelah itu larutan disaring. Sampel asam amino ditambahkan dengan

AABA (Alpha amino butyric acid) sebagai internal standar dan digenapkan

volumenya dengan aquabidest. Penambahan larutan standar internal

digunakan untuk mengoreksi hilangnya residu asam amino selama proses

hidrolisis karena aliran atau penghancuran.

Sampel mulai di derivatisasi dengan reagen AQC (6-aminoquinolyl-N-

hidroxysucsinimidil carbamate) yang sering dilakukan secara prakolom di

ikuti oleh pemisahan fase terbalik KCKT dengan menggunakan detektor

fluoresensi. Penderivat AQC ini merupakan penderivat yang paling stabil

jika dibandingkan dengan agen penderivat yang lainnya. Agen penderivat

AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder

dan menghasilkan derivat fluoresen dengan eksitasi 250 nm dan emisi 395

nm (Bosch et al., 2006 ; Eriksson et al., 2009). Kelebihan reagen AQC

dapat bereaksi dengan air dan membentuk 6-aminoquinolin (AMQ), N

hidroksi succsinimidi (NHS) dan karbondioksida (CO2) (Salazar et al,

2012). AMQ bereaksi sangat lambat dengan reagen AQC berlebih

membentuk bis aminoquinolin urea. Produk-produk samping tidak

mengganggu identifikasi dan kuantifikasi dari salah satu asam amino.

Pengujian asam amino pada ekstrak ampas biji jinten hitam

menghasilkan hampir semua jenis asam amino esensial dan non esensial,

kecuali triptofan. Triptofan tidak stabil dalam lingkungan asam, sehingga

rusak dalam hidrolisis asam. Dengan hidrolisis asam ini serin dan treonin

akan mengalami kerusakan sebagian, sedangkan asparagin dan glutamin

akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam glutamat

dengan membebaskan ion amonium (Linder, 1992 ; Sumarno et al., 2002).


Analisis asam amino dengan metode KCKT menunjukkan data

kandungan asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam Nigella sativa Linn

sebagaimana pada tabel 4.2.

Tabel 4.4. Hasil Analisis Kandungan (% b/b) Asam Amino dalam

Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam Nigella sativa Linn.

Dari tabel diatas, hasil analisis asam amino dari ampas biji jinten

hitam dengan menggunakan KCKT, menunjukkan bahwa ekstrak ampas biji

jinten hitam mengandung 16 asam amino dengan kandungan total 1,055%.

Diantaranya 9 asam amino esensial, yaitu histidin 0,015%, arginin 0,035%,

treonin 0,021%, valin 0,032%, metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin

0,020%, leusin 0,030%, fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non

esensial, yaitu aspartat 0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin

0,053%, alanin 0,219%, prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.

Kandungan asam amino esensial yang tertinggi pada ampas biji jinten

hitam adalah lisin dengan nilai 0,182%. Lisin merupakan asam amino degan

No

Asam Amino

Kandungan Asam Amino (perlakuan duplo)

(%)

1 2 Rata-rata

1 Aspartat 0,060 0,055 0,058

2 Serin 0,061 0,067 0,064

3 Glutamat 0,084 0,057 0,071

4 Glisin 0,063 0,043 0,053

5 Histidin 0,016 0,013 0,015

6 Arginin 0,043 0,027 0,035

7 Treonin 0,018 0,025 0,021

8 Alanin 0,330 0,108 0,219

9 Prolin 0,084 0,213 0,148

10 Sistin 0,058 0,118 0,088

11 Tirosin 0,006 0,004 0,005

12 Valin 0,036 0,029 0,032

13 Metionin 0,001 0,001 0,001

14 Lisin 0,154 0,209 0,182

15 Isoleusin 0,021 0,019 0,020

16 Leusin 0,028 0,031 0,030

17 Fenilalnin 0,009 0,017 0,013

Total 1,070 1,037 1,055


gugus R polar yang digunakan sebagai bahan dasar antibodi darah,

memperkuat sistem sirkulasi, mempertahankan pertumbuhan sel-sel normal

bersama prolin dan vitamin C akan membentuk jaringan kolagen,

menurunkan kadar trigliserida darah yang berlebih (Harli, 2008). Sedangkan

kandungan asam amino non esensial yang tertinggi adalah alanin dengan

kandungan 0,219%. Alanin merupakan asam amino dengan gugus R

nonpolar yang digunakan sebagai prekursor glukogenik dan pembawa

nitrogen dari jaringan permukaan untuk ekskresi nitrogen (Linder, 1992).


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Dari hasil penentuan kadar menggunakan metode Lowry diketahui kadar

protein pada ekstrak ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) adalah

8,5848 mg/ml.

2. Hasil analisis profi protein dengan metode SDS-PAGE terhadap ekstrak

ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) menunjukkan adanya pita

protein dengan bobot molekul 67,4839 kDa – 8,0872 kDa.

3. Hasil analisis asam amino dengan menggunakan KCKT terhadap ekstrak

ampas biji jinten hitam (Nigella sativa Linn.) terdapat 16 asam amino

dengan kandungan total 1,055%. Diantaranya 9 asam amino esensial,

yaitu histidin 0,015%, arginin 0,035%, treonin 0,021%, valin 0,032%,

metionin 0,001%, lisin 0,182%, isoleusin 0,020%, leusin 0,030%,

fenilalanin 0,013%; serta 7 asam amino non esensial, yaitu aspartat

0,058%, serin 0,064%, glutamat 0,071%, glisin 0,053%, alanin 0,219%,

prolin 0,148%, dan tirosin 0,005%.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan ekstraksi dengan menggunakan komposisi buffer

ekstraksi yang lain sehingga hasil kandungan protein dan asam amino

yang didapatkan lebih besar.

2. Perlu dilakukan tahapan purifikasi lebih lanjut setelah ekstraksi agar

pemisahan pita protein pada elektroforesis lebih spesifik.


DAFTAR PUSTAKA

Adnan M. (1997). Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan.

Yogyakarta : Andi Yogyakarta.

Al-gaby, A. M. (1998). Amino Acid Composition and Biological Effects of

Supplementing Broad Been and Com Protein with Nigella sativa (Black Cumin)

Cake Protein,Nahrung. 42: 290-294.

Bachrudin Z. (1999). Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan

Pewarnaan Protein. PAU BioteknologiUGM. Yogyakarta.

Bailey, P.D. (1990). An Introduction to Peptide Chemistry. Wiley interscience.

New York.

Bamusa U.A dan Al-Hujaj A.Y. (2011). Sembuh dan Sehat dengan

Habbatussauda’ Obat Segala Penyakit. Aqwamedika. Solo. Hal : 34

Bintang, Maria. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga, Jakarta. Hal : 99,

103-106.

Bodanszky, M. (1993). Chemistry of Peptide, Spinger-Verlag, Berlin. Hal : 47-52.

Bonner, Philip, L.R. (2007). Protein Purification The Basics. Nottingham Trent

University. Taylor & Francis Group. Hal : 31.

Bosch L, Alegria A, Farre R. (2006). Application of the 6-Aminoquinolyl-N-

Hydroxysccinimidil Carbamate (AQC) Reagent to the RP-HPLC Determination of

Amino Acid in Infant Foods. J.Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci

831 (1-2):176-183.


Coligan, J, Dunn, B, Ploengh, H, Speicher, D, and Wingfield, P. (2007). “Current

Protocols in Protein Sciences,” Vol. 1.John Wiley & Sons, New York. Hal : 332-

340.

Departemen Kesehatan RI. (1979). Materia Medika Indonesia Jilid III. Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hal : 114-117.

Departemen Kesehatan RI. (1985). Tanaman Obat Indonesia Jilid I. Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta. Hal. 33.

Departemen Kesehatan Republika Indonesia. (1989). Vademekum Bahan Obat

Alam.Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hal : 99-100.

Fatmawati, U, Suranto dan Sajidan. (2009). Ekspresi Protein pada

Mikroorganisme Resisten Cr dengan Metode Elektroforesis. Bioteknologi. 6 (1):

40-48.

Eriksson J, Janasson S, Papaefthimiou D, Rasmussen U and bergman B. (2009).

Improving Derivatization Efficiency of BMAA Utilizing AccQ-Tag in a Complex

Cyanobacterial Matrix.Departement of Botany, Stockholm University. 36:43-48.

Gilani Hassan A. (2004). A Review of Medicinal Uses and Pharmacological

Activities of Nigella sativa L,. Departement of Biological and Biomedical Science.

7(4): 441-451.

Gornall, A.G., Bardawill, C.S., and David, M.M.(1949). Determination of Serum

Proteins by Means of the Biuret Method.J. Biol. Chem. 177:751-766.

Hailat, N., Bataineh, Z., Lafi, S. et al. (1995). Effect of Nigella sativa volatile oil

on Jurkal T cell leukemia polypeptides. International Journal of Pharmacognosy,

33, 16–20.


Halawani, Eman. (2009). Antibacterial Activity of Thymoquinone and

Thymohydroquinone of Nigella sativa L. and Their Interaction with Some

Antibiotics.Department of Biology Faculty of Science Taif University. 3 (5-6):

148-152.

Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerbit ITB : Bandung. Hal 6-9.

Harli M. (2008). Asam Amino Esensial. http://www.suparmas.com. [4 september

2013 pukul: 07:00].

Haq, A., Remo, N. R., and Al-Sedairy, S. T. (1996). Fractionation of Black seed

(Nigella sativa Linn) proteins byusing Rotofor. J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 19,

593-599.

Haq, A, Abdullatif Mohammad, Lobob Peter I., Khabar, S.A. Khalid, Shet V.

Kirtikant and Al-sedairy T.sultan. (1995). Nigella sativa: Effect on Human

Lymphocytes and Polymorphonuclear Leukocyte Phagocytic Activity.International

Journal of Immunopharmacology 30. 147-155.

Haq, A, Lobob Peter I., Al-Tufailc Mohammad, Nona R. Ramaa, and Al-Sedairya,

S.T. (1999). Immunomodulatory effect of Nigella Sativa Proteins Fractionated by

Ion Exchange Chromatography.International Journal of Immunopharmacology

21. 283-295.

Haq, A, Abdullatif M, Lobo IP, Khabar, S.A.K, Sheth. V.K and Al-sedairy T.S.

(1995). Nigella sativa; Effect on Human Lymphocytes and Polymorphonuclear

Leukocyte Phagocytic Activity.Immunopharmacology 30 (1995) 147-155.

Husgen AG, Scuhster R. 2001. HPLC for Food Analysis. Germany: Agilent

Technoligies Company.


Indriati G dan Khaerati. (2009). Peluang Budidaya dan Manfaat Jintan Hitam

(Nigella sativa). Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri, Volume

15 Nomor 1. Hal 23-24.

Janson, J.C and Ryden, L. (1998). Protein Purification: Principles, High

Resolution Methodes, and Applications, 2nd edition. A john willey & Sons Inc.

Pub., Hal: 464-484.

Khanza, Abu. (2010). Fit and Fresh Through Habbatussauda. Cicero Publishing :

Jakarta. Hal. 45-56.

Kurniati, Vita dan Wanadi, I,S. (2001). Pemisahan Protein Berdasarkan Berat

Molekul dalam Buku Biokimia: Eksperimen Laboratorium.Biokimia FKUI. Hal.

35-37.

Linder M. C. (1992). Biokimia, Nutrisi dan Metabolisme (diterjemahkan oleh

Aminuddin dan Amwila A,Y). Universitas Indonesia Press. Jakarta 89-115.

Masuda, A dan Dohmae, N. (2011). Amino Acid Analysis Of Sub-Picomolar

Amounts of Proteins by Precolom Fluoresence Derivatization with 6-

Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate. Jepang. Bioscience Trends;

5(6):231-238. DOI: 10.5582/bst.v5.6.231.

Michel, G. C. et al. (2010). Phytochemical and Biological Investigation of the

Extracts of Nigella sativa L. Seed Waste.Drug Testing and Analysis. John Wiley

& Sons, Ltd. DOI 10.1002/dta.225.

Nelson, D.L. dan Michael M.Cox. (2004). Lehninger Principles of

Biochemistry.4th

Edition. New York: W.H. Freeman & Company.


Norsharina, ismail et al (2011). Thymoquinone Rich Fraction from Nigella sativa

and Thymoquinone are Cytotoxic Towards Colon and Leukemic Carcinoma Cell

Lines. Academic Journals. pp. 3359-3366.

Paarakh, Padmaa M. (2010). A Comprehensive Review Nigella sativa Linn.

Department of Pharmacognosy, The Oxford College of Pharmacy. pp.409- 429.

Poedjiadi Anna, Supriyanti Titin F.M. (1994). Dasar-Dasar Biokimia Edisi Revisi.

Penerbit Universitas Indonesia (UI Press): Jakarta. Hal. 81, 109.

Salamah E. (1997). Analisis Kimia Menggunakan HPLC Bagian-I.Buletin

Teknologi Hasil Perikanan. Vol 3:1.

Salazar. C, Armenta JM, Cortes FD, and Shulaev V. (2012). Chapter :2

Combination of an AccQ-Tag Ultra Performance Liquid Chromatoghraphic

Method with Tandem Mass Spectrometry for the Analysis of Amino acids dalam

Amino Acid Analysis: Methods and Protocols, Method in Molecular

Biology.http://www.spinger.com/978-1-61779-444-5 diakses pada tanggal 4

September 2013 pukul 4:00.

Sastrohamidjojo, Hardjono. (1996). Sintesis Bahan Alam.Gadjah Mada University

Press. Yogyakarta. Hal : 169.

Silvia. D. et al. (2012). The Effect of Different Extraction Temperature of the

Screw Press on Proximate Compositions, Amino Acid Contens and Mineral

Contents of nigella sativa Meal. American Journal of Food Technology. 7(4).180-

191.

Singh, gurdip. et al(2005). Chemical Constituents and Antimicrobial and

Antioxidant Potentials of Essential Oil and Acetone Extract of Nigella sativa

Seeds.Chemistry Department, DDU Gorakhpur University. 85:2297–2306.

http://www.spinger.com/978-1-61779-444-5


Stryer L. (1995). Biokimia. Sadikin et al, penerjemah; Soebianto S, editor.Jakarta:

EGC. Terjemahan dari:Biochemistry.

Sudarmadji S, Haryono B, dan Suhardi. (1981). Analisa Bahan Makanan dan

Pertanian. Cetakan ke-3. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas, Universitas Gajah

Mada.

Sumardjo Damin. (2009). Pengantar Kimia. Buku Panduan Kuliah Mahasiswa

Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Penerbit Buku

Kedokteran EGC: Jakarta. Hal. 161-172.

Sumarno, Noegrohati S, Narsito dan Falah II (2002). Estimasi Kadar Protein

dalam Bahan Pangan Melalui Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino.

Majalah Farmasi Indonesia. 13 (1), 34 – 43.

Swamy S.M.K. (1998). Cytotoxic and Immunopotentiating Effects of Ethanolic

Extract of Nigella sativa L. Seeds.Department of Pharmacology, Faculty

ofMedicine, National University of Singapore. 70 (2000) 1–7.

Wijaya SKS, Rahman L. (2005). Fraksinasi dan Karakterisasi Protein Utama Biji

Kedelai. Fakultas MIPA Universitas Jember. Jember.

Winarno FG. (2008). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia.

Yeheya M. (2009). A Review Therapeutic Role of Phrophetic Medicine Habbat El

Baraka (Nigella sativa L.). Departement of Pharmacy. 7 (9): 1203-1208.

Yuwono, T. (2005). Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.


Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum

Ampas biji jinten hitam

Ampas biji jinten hitam dilarutkan dalam phospahate buffer

saline (pH 7,2)

Sentrifuge pada 10.000 rpm selama 30 menit pada suhu 40C

Pelet Supernatan

Freeze dry

Penetapan Kadar Protein Analisis Profil Protein Analisis Asam Amino

SDS-PAGE KCKT


Lampiran 2. Skema Kerja Penetapan Kadar Protein dengan Metode Lowry

a. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Absorbannya di ukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 737,5 nm.

Pembuatan Larutan Induk BSA 1000 ppm

Ditambahkan 5 ml Campuran 50:1 (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N

dan larutan CuSO4 0,5% dalam larutan Na.K tartrat 1%). Kocok dan

dibiarkan selama 10 menit.

Pembuatan seri konsentrasi BSA ( 0, 40, 80, 120, 160, 200 ppm)

Ditambahkan 0,5 ml pereaksi folin-ciocalteau, kocok dan dibiarkan

selama 30 menit

Larutan standar dimasukkan ke dalam tabug


Lampiran 3. Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE

larutan separating gel yang

telah dibuat, disiapkan

dimasukkan ke dalam cetakan

gel dengan menggunakan mikro

pipet sampai batastertentu.

kemudian ditambahkan

dengan aquades sampai penuh

agar permukaan gel rata.

Setelah gel mengering,

aquades dibuang dan sisa air

pada cetakan gel diserap

dengan kertas saring.

Kemudian larutan stacking gel

yang telah dibuat dimasukkan

ke dalam cetakan

permukaan geldipasang sisir

berlubang lalu didiamkan

sampai mengeras.

Setelah gel mengeras, cetakan

gel dipindahkan ke perangkat

elektroforesis.

Preparasi sampel dilakukan dengan

memasukkan sampel yang telah

disiapkan sebelumnya ke dalam tabung

effendorf tabung eppendorf

Masing-masing di tambahkan

sampel bufferdengan perbandingan

1:1 dan 2:1. Kedua tabung

dipanaskan pada suhu 1000C selama

5 menit.

Elektroforesis dilakukan dengan

cara sampel dimasukkan ke dalam

sumur yang telah dicetak pada gel

poliakrilamid sebanyak 10 μl

Gel poliakrilamid dicetak

diantara dua buah lempengan

kaca

Elektroforesis dihubungkan ke power

supply dengan tegangan 200 V

dengan amper 30mA selama 55

menit.


Lampiran 4. Analisis Asam Amino dengan KCKT

Sampel ditimbang

Ditambahkan 5 ml HCl 6

N kemudian vortex

Disaring dengan filter

0,45 µm

Sampel dialiri gas

nitrogen dan di

hidrolisis pada suhu

1100C selama 22 jam.

Hidrolisat didinginkan

pada suhu kamar, lalu

dipindakhan ke labu

ukur dan ditambahkan

dengan aqubidest sampai

tandabatas.

Pipet 10 µl larutan,

tambahkan 70 µl AccQ-

Fluor Borate, kemudian

vortex.

Pipet 500 µl filtrat lalu

ditambahkan 40 µm

AABA ± 460 µl aqubidest.

Dengan kondisi

kromatografi menggunakan

kolom C18, temperatur

370C, fase gerak asetonitril

60%, detektor fluoresen, laju

alir 1 ml/menit dan volume

penyuntikan 5 µl.

Inkubasi selama 10 menit

pada suhu 550C, lalu

suntikan pada HPLC.

Tambahkan 20 µl reagen

flour A, vortex, diamkan 1

menit.


Lampiran 5. Hasil Determinasi Biji Jinten Hitam (Nigella sativa Linn.)


Lampiran 6. Spektrum Panjang Gelombang Maksimum Serapan

metode Lowry


Lampiran 7. Bahan Pereaksi untuk SDS PAGE (berdasarkan metode

Laemmli 1970 dalam Coligan et al 1995)

Pembuatan Larutan Stok 30% akrilamid/0,8% bisakrilamid

Sebanyak 30 gram akrilamid ditambahkan dengan 0.8 gram N’, N’-metilen

bisakrilamid ditimbang, kemudian dilarutkan dengan aquabidest sampai volume

100 ml. Setelah itu, larutan tersebut disaring dengan kertas saring dan disimpan

pada suhu 40C dalam kondisi gelap. dan larutan siap digunakan.

Pembuatan Buffer 4x Tris-HCl/SDS, pH 6,8 (Stacking Buffer)

Sebanyak 6.05 gram Tris dilarutkan dalam 60 ml aquabidest. pH diatur

menjadi 6,8 dengan HCl 6 N. total volume digenapkan sampai 100 ml dengan

penambahan aquabidest. Larutan disimpan pada suhu 40C dan larutan siap

digunakan.

Pembuatan Buffer 4x Tris-HCl/SDS, pH 8,8 (Resolving / Separating)

Sebanyak 18,15 gram Tris dilarutkan dalam 75 ml aquabidest. Atur pH 8,8

dengan HCl 6 N, kemudian ditambahkan aquabidest hingga volume totalnya 100

ml. Larutan disimpan pada suhu 40Cdan larutan siap digunakan.

Pembuatan Buffer Sampel

Larutan dibuat dengan mencampurkan 2 ml larutan SDS 10%, 2,5 ml

gliserol, 1,25 ml buffer Tris HCl pH 6,8, 3,55 aqubidest dan 0,2 ml larutan

bromofenol biru 0,5% atau secukupnya sampai terbentuk warna biru gelap pada

larutan. Terakhir ditambahkan 0,5 ml 2-merkaptoetanol.

Pembuatan 10x Buffer Elektroforesis (Running Buffer)

Sebanyak 30,3 gram Tris, 144 gram glisin, 10 gram SDS dilarutkan dalam

1000 ml aquabidest. Larutan disimpan pada suhu 40C dan larutan siap digunakan.


Pembuatann Separating Gel 12%

Larutan separating gel dibuat dengan cara 30% acrylamide solution 4 ml

ditambahkan separating gel buffer (1,5 M Tris HCl pH 8,8) sebanyak 2,5 ml

kemudian aquabidest 3,4 ml, 10 % SDS 0,1 ml dan Ammonium PerSulfate (APS)

0,2 ml serta TEMED 0,01 ml.

Pembuatan stacking gel (5%)

Larutan stacking gel dibuat dengan cara 30% acrylamide solution 0,85 ml

ditambahkan stacking gel buffer (1,5 M Tris HCl pH 6,8) sebanyak 1,25 ml

kemudian aquabidest 2,85 ml, SDS 10 % 0,05 ml dan 10 % Ammonium PerSulfate

(APS) 0,2 ml serta TEMED 0,01 ml.


Lampiran 8. Bahan dan Alat Penelitian

5.1 Bahan Penelitian

Gambar 1.

Ampas biji jinten hitam

Gambar 2. Serbuk ampas

biji jinten hitam

Gambar 3. Larutan

induk BSA 10.000 ppm

Gambar 4. Ekstrak

terlarut ampas biji jinten

hitam

Gambar 5. Ekstrak Cair

Ampas Biji Jinten Hitam

Gambar 6. Standar BSA

untuk Lowry

Gambar 7. Sampel

untuk Lowry

Gambar 8. Pereaksi folin

ciocalteu

Gambar 9. Standar

marker

Gambar 10. TEMED

Gambar 11. SDS 10%

Gambar 12. Tris-HCl

pH 6,8


Gambar 13.

Tris-HCl pH 8,8

Gambar 14. Bromophenol

Blue

Gambar 15. Larutan

stok acrilamid

Gambar 16. Sampel

buffer + β

merkaptoetanol

Gambar 17. Sampel buffer

Gambar 18 Amonium

Persulfat 10 %


5.2 Alat Penelitian

Gambar 1. J2-H5

Sentrifuse BECKMAN

Gambar 2. Bagian

dalam J2-H5 Sentrifuse

BECKMAN

Gambar 3. Vortex

Gambar 4.

Spektrofotometer

Gambar 5. Tip

mikropipet

Gambar 6. Elektroforesis

gel poliakrilamid

Gambar 7.

Power Supply

Gambar 8.

Wadah Elektroforesis

Gambar 9.

Cetakan Gel Separating gel

dan Stacking Gel


Lampiran 9. Beberapa Hal Terkait Analisis Protein dengan SDS-PAGE

1) Gambar Sticker Katalog Prestained SDS-PAGE Standards, Broad

Range.

Pita Marker yang Muncul pada saat Elektroforesis

Protein MW ( kDa)

Miosin 250

Β-galaktosidase 150

BSA 75

Ovalbumin 50

Soybin tripsin inhibitor 25


2) Tabel dan Kurva Rf terhadap Log BM Pita Marker Protein

Prestained SDS-PAGE Standars – Broad Range

Protein d ( cm ) MW (kDa) Rf Log MW

Miosin 0,1 250 0,016949152 2,397940009

Β-galaktosidase 0,7 150 0,118644067 2,176091259

BSA 1,5 75 0,254237288 1,875061263

Ovalbumin 2,6 50 0,440677966 1,698970004

Soybean trypsin

inhibitor

4,0 25 0,677966101 1,397940009

Loading dye 5,9 cm

y = -1,469x + 2,352 r = 0,985

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

Lo

g B

M

RF


Bobot molekul protein ampas biji jinten hitam

Sampel Migrasi Band Rf b a Log BM BM Kda

AF 2:1 5,9 2,1 0,3559 -1,469 2,352 1,8292 67.483,9 67,4839

5,9 2,7 0,4576 -1,469 2,352 1,6798 47.841,0 47,8410

5,9 3,1 0,5254 -1,469 2,352 1,5802 38.036,5 38,0365

5,9 3,3 0,5593 -1,469 2,352 1,5304 33.915,6 33,9156

5,9 3,5 0,5932 -1,469 2,352 1,4806 30.241,3 30,2413

5,9 3,6 0,6102 -1,469 2,352 1,4556 28.549,6 28,5496

5,9 3,8 0,6441 -1,469 2,352 1,4058 25.456,6 25,4566

5,9 4,2 0,7119 -1,469 2,352 1,3062 20.239,5 20,2395

5,9 4,3 0,7288 -1,469 2,352 1,2814 19.116,1 19,1161

5,9 4,6 0,7797 -1,469 2,352 1,2066 16.091,6 16,0916

5,9 4,7 0,7966 -1,469 2,352 1,1818 15.198,5 15,1985

5,9 5,1 0,8644 -1,469 2,352 1,0822 12.083,7 12,0837

5,9 5,3 0,8983 -1,469 2,352 1,0324 10.774,6 10,7746

5,9 5,4 0,9153 -1,469 2,352 1,0074 10.171,8 10,1718

5,9 5,8 0,9831 -1,469 2,352 0,9078 8.087,2 8,0872


Lampiran 10. Kromatogram Standar Asam Amino

No Peak Name RT Area % Area Height

1 AMQ 9.316 555206 0.51 28687

2 L-Aspartic Acid 12.059 2460839 2.26 191182

3 L-Serine 13.431 3497092 3.21 250256

4 L-Glutamic Acid 14.494 2729011 2.51 195836

5 Glycine 15.553 3161919 2.90 212593

6 L-Histidine 16.340 4738157 4.35 319281

7 NH3 17.140 3932609 3.61 184541

8 L-Arginine 20.264 4707955 4.32 412951

9 L-Threonine 20.788 4571976 4.20 376790

10 L-Alanine 22.142 4926720 4.52 404245

11 L-Proline 24.572 2439341 2.24 240722

12 AABA 26.041 6700235 6.15 700886

13 L-Cystine 27.946 116477 0.11 11910

14 L-Tyrosine 28.282 5800875 5.33 624906

15 L-Valine 29.328 8257559 7.58 862538

16 L-Metheonine 29.817 7377303 6.77 779465

17 L-Lysine HCl 32.158 4894833 4.49 534069

18 L-Isoleucine 32.972 11142373 10.23 1066106

19 L-Leucine 33.462 11701866 10.74 1045770

19 L-Phenylalanine 34.393 14501553 13.31 1403669

20 Tryptophan 35.180 714931 0.66 78946

Total 108928831.20


Lampiran 11. Kromatogram Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam

No Peak Name RT Area % Area Height Amount

1 AMQ 9,699 568038 1.76 29578 1.023

2 L-Aspartic Acid 12.378 168233 0.52 13909 6.836

3 L-Serine 13.713 309021 0.96 23033 8.837

4 L-Glutamic Acid 14.730 236984 0.73 17707 8.684

5 Glycine 15.780 405825 1.26 28333 12.835

6 L-Histidine 16.518 76559 0.24 5446 1.616

7 NH3 17.355 19446079 60.20 881186 4.945

8 L-Arginine 20.344 176779 0.55 13532 3.755

9 L-Threonine 20.865 104470 0.32 9212 2.285

10 L-Alanine 22.260 2782429 8.61 201808 56.476

11 L-Proline 24.577 271346 0.84 22390 11.124

12 AABA 26.045 5914730 18.31 606200 0.873

13 L-Cystine 27.956 16995 0.05 1602 7.295

14 L-Tyrosine 28.280 28241 0.09 3283 0.487

15 L-Valine 29.330 385740 1.19 33162 4.671

16 L-Metheonine 30.112 4893 0.02 750 0.006

17 L-Lysine HCl 32.131 629734 1.95 52478 12.881

18 L-Isoleucine 32.961 271703 0.84 25408 2.438

19 L-Leucine 33.446 385997 1.19 35786 3.299

19 L-Phenylalanine 34.379 119406 0.37 12962 0.840

20 Tryptophan 35.177

Total Asam Amino tanpa

Triftopan

32303202.22


No Peak Name RT Area % Area Height Amount

1 AMQ 9,705 559487 1.94 29275 1.008

2 L-Aspartic Acid 12.404 105018 0.36 8782 4.268

3 L-Serine 13.725 227108 0.79 16845 6.494

4 L-Glutamic Acid 14.749 108995 0.38 8385 3.994

5 Glycine 15.805 186041 0.64 13411 5.884

6 L-Histidine 16.533 40440 0.14 3031 0.853

7 NH3 17.370 19737964 68.28 893396 5.019

8 L-Arginine 20.330 75363 0.26 6727 1.601

9 L-Threonine 20.871 97411 0.34 8731 2.131

10 L-Alanine 22.243 613429 2.12 42647 12.451

11 L-Proline 24.268 462702 1.60 28399 18.968

12 AABA 26.049 5256610 18.19 545279 0.775

13 L-Cystine 27.955 23182 0.08 2105 9.951

14 L-Tyrosine 28.282 12734 0.04 1468 0.220

15 L-Valine 29.320 209829 0.73 22516 2.541

16 L-Metheonine 30.113 6413 0.02 891 0.087

17 L-Lysine HCl 32.121 575399 1.99 44873 11.770

18 L-Isoleucine 32.958 166620 0.58 16330 1.495

19 L-Leucine 33.446 282797 0.98 27446 2.417

19 L-Phenylalanine 34.375 157181 0.54 16032 1.106

20 Tryptophan 35.177

Total Asam Amino 28904723.73


Lampiran 12. Hasil Analisis Asam Amino menggunakan KCKT

a ) Perhitungan Kandungan Asam Amino

No Asam Amino Bobot

Molekul

Area

Standar 1 2

1 Aspartat 133,1 2460839 168233 105018

2 Serin 105,09 3497092 309021 227108

3 Glutamat 147,13 2729011 236984 108995

4 Glisin 75,07 3161919 405825 186041

5 Histidin 155,16 4738157 76559 40440

6 Arginin 174,29 4707955 176769 75363

7 Treonin 119,12 4571976 104470 97411

8 Alanin 89,1 4926720 2782429 613429

9 Prolin 115,13 2439341 271346 462702

10 Sistin 121,16 116477 16995 23182

11 Tirosin 181,19 5800875 28241 12734

12 Valin 117,15 8257559 385740 209829

13 Metionin 149,21 7377303 4893 6413

14 Lisin 182,65 4894833 629734 575399

15 Isoleusin 131,18 11142373 271703 1666620

16 Leusin 131,18 11701866 385997 282797

17 Fenilalnin 165,19 14501553 119406 157181

Bobot sampel (µg) 345800 261400


No

Asam Amino

Bobot

Molekul

Area

Setelah

Perhitungan

Kandungan

Asam Amino (%)

Standar 1 2 1 2

1 Aspartat 133,1 2460839 168233 105018

(Area p nen area AABA a pe C BM p

(Area p nen area AABA an ar r

0,060 0,055

2 Serin 105,09 3497092 309021 227108 0,061 0,067

3 Glutamat 147,13 2729011 236984 108995 0,084 0,057

4 Glisin 75,07 3161919 405825 186041 0,063 0,043

5 Histidin 155,16 4738157 76559 40440 0,016 0,013

6 Arginin 174,29 4707955 176769 75363 0,043 0,027

7 Treonin 119,12 4571976 104470 97411 0,018 0,025

8 Alanin 89,1 4926720 2782429 613429 0,330 0,108

9 Prolin 115,13 2439341 271346 462702 0,084 0,213

10 Sistin 121,16 116477 16995 23182 0,058 0,118

11 Tirosin 181,19 5800875 28241 12734 0,006 0,004

12 Valin 117,15 8257559 385740 209829 0,036 0,029

13 Metionin 149,21 7377303 4893 6413 0,001 0,001

14 Lisin 182,65 4894833 629734 575399 0,154 0,209

15 Isoleusin 131,18 11142373 271703 1666620 0,021 0,019

16 Leusin 131,18 11701866 385997 282797 0,028 0,031

17 Fenilalnin 165,19 14501553 119406 157181 0,009 0,017

Bobot sampel (µg) 345800 261400 1,070 1,037


Lampiran 13. Pembuatan Larutan Baku

Pipet 40 µl mix standar asam amino, lalu tambahkan 40 µl standar

internal AABA, 920 µl aquabides kemudian di homogenkan. Ambil 10 µl

standar, lalu tambahkan 70 µl AccQ Fluor borat, vortex dan diamkan selama

1 menit. Kemudian inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C lalu suntikan

pada KCKT.

Perhitungan Kadar Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam

AA (mg/100 gram)

(

)

PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL PROTEIN DAN ASAM …

Documents

Transcript of PENETAPAN KADAR DAN ANALISIS PROFIL PROTEIN DAN ASAM …