Pemurnian dan Karakterisasi Shiga Toksin 2f, sebuah Subtipe imunologis yang tidak berhubungan Shiga Toksin 2

AbstrakLatar Belakang: Shiga-like toxin 2 (Stx2) merupakan salah satu faktor virulensi yang paling penting dalam Enterohaemorrhagic Escherichia coli (E. coli) strain seperti O157H7. Subtipe Stx2 beragam sehubungan dengan urutan mereka, toksisitas, dan distribusi. Itu paling beragam Stx2 subtipe, Stx2f, sulit untuk mendeteksi secara imunologis, tetapi menjadi lebih sering dikaitkan dengan penyakit manusia.Metode dan Temuan: Sebuah rejimen pemurnian dikembangkan untuk pemurnian Stx2f melibatkan pertukaran kation, interaksi hidrofobik, pertukaran anion, dan filtrasi gel. Berat molekul Stx2f B-subunit adalah sekitar 5 kDa, yang muncul secara signifikan lebih kecil dari Stx2a (6 kDa) pada gel SDS-PAGE, meskipun ukuran subunit A mirip dengan Stx2a (30 kDa). Stx2f ditunjukkan untuk menjadi aktif dalam tes sel-bebas dan berbasis sel. 50% dosis sitotoksik dalam Sel Vero adalah 3,4 atau 1,7 pg (tergantung pada kondisi uji), sekitar 3-5 kali lebih tinggi dari Stx2a archetypical, sedangkan aktivitas Stx2f dan Stx2a dalam sistem retikulosit kelinci bebas sel adalah serupa. Stx2f terikat untuk kedua globotrioselipopolysaccharide (Gb3-LPS) dan globotetraose-LPS (GB4-LPS, meniru untuk globotriaosylceramide dan globotetraosylceramide, masing-masing), namun kemampuannya untuk mengikat GB4-LPS jauh lebih kuat dari Stx2a. Stx2f juga jauh lebih stabil pada rendah pH dan suhu tinggi dibandingkan dengan Stx2a, menunjukkan racun itu sendiri dapat bertahan praktik penyiapan makanan keras.Kesimpulan: Di sini, kami detail pemurnian, sifat biokimia, dan toksisitas Stx2f, dari E. coli galur terisolasi dari merpati liar. Informasi yang diperoleh dalam penelitian ini akan berharga untuk karakteristik Stx2f dan menjelaskan perbedaan Stx2a dan Stx2f dalam host kekhususan dan sitotoksisitas.

PengantarSekelompok kontaminan bakteri utama dan berpotensi mematikan, enterohemorrhagic Escherichia coli (E. coli) subtipe bertanggung jawab bagi banyak wabah penyakit karena makanan terakhir. Sebuah subset dari patogen, toksin Shiga yang menghasilkan E. coli (STEC), dapat menghasilkan gejala dari diare berdarah yang berpotensi mengancam nyawa sindrom uremik hemolitik (HUS) [1]. Yang paling terkenal serotipe STEC adalah E.coli O157: H7, tetapi banyak non-O157 serotipe dapat menyebabkan penyakit parah dan kontaminasi makanan wabah, termasuk mematikan 2011 wabah O104: H4 di Jerman [2-4]. Strain STEC memperoleh banyak virulensi mereka dari pelepasan Shiga-seperti racun (Stxs), yang ada banyak varian dan subtipe yang berbeda [5,6]. Proliferasi non-Serotipe O157 memproduksi Stx menunjukkan bahwa STEC yang menjadi kelompok yang sangat beragam dan heterogen patogen [7]. Stxs sendiri tampaknya tumbuh dalam keragaman juga, menyoroti pentingnya terus meningkatkan metode untuk mereka deteksi dan karakterisasi.

Stxs terdiri dari katalitik Sebuah subunit dengan pentameric B subunit protein kompleks untuk penargetan dan mengikat host reseptor. Oleh karena itu mereka jatuh ke dalam kategori AB5 dari bakteri racun, bersama dengan kolera dan pertusis toksin [8]. Internalisasi dari Stx ke dalam sel target dimediasi oleh B-subunit pentamer, yang melekat pada globotriaosylceramide lipid membran(Gb3Cer) atau globotetraosylceramide (Gb4Cer) [9]. Sebagian besar toksisitas Stx dimediasi oleh katalitik A subunit, yang merupakan rRNA N-glikosidase yang memotong satu adenosine residu dari 28S rRNA dan 28S inactivates subunit ribosom [10]. Dua kelas utama Stxs di E. Coli adalah Stx1, yang hampir identik dengan toksin dari Shigella genus, dan Stx2. Stx1 dan Stx2 dapat ditemukan mandiri atau bersama-sama dalam O157: H7 dan serotipe lain STEC [11]. Urutan Stxs biasanya dilakukan pada lambdoid bakteriofag, membuat mereka

mudah transduced tidak hanya antara serotipe yang berbeda dari E. coli tetapi juga untuk nonpathogenic E. coli dalam usus yang terinfeksi [12]. Produksi Stx2 diprakarsai oleh fag promotor akhir-fase, dan rilis toksin terjadi pada bagian ketika E. coli segaris oleh fag [9,13]. Antibiotik yang menginduksi respon SOS bakteri, seperti mitomycin C dan ciprofloxacin, penyebab lisis dari STEC oleh bakteriofag, dan karena itu membebaskan jumlah yang cukup toksin [14,15]. Fag gen promotor-driven akhir-fase seperti sebagai Stx2 juga responsif terhadap respon SOS. Untuk ini alasan, prognosis untuk individu yang terinfeksi STEC yang memilikitelah diobati dengan antibiotik tertentu (misalnya ciprofloxacin) adalah sebenarnya lebih buruk daripada mereka yang tidak menerima antibiotik pengobatan sama sekali [16].

Meskipun setiap Stx dapat memperburuk E. coli terkait gastroenteritis, ada perbedaan besar di antara toksisitas Stx varian dan subtipe. Nomenklatur baru yang diusulkan oleh Scheutz et al dalam 2012 digunakan dalam penelitian ini [17]. Stx2a, 2c, dan 2d terkait dengan perkembangan HUS, dan memiliki jauh lebih parah konsekuensi klinis dari Stx1 [18]. Meskipun Stx1 telah terbukti lebih beracun bagi Vero (hijau monyet ginjal) sel dibandingkan Stx2a, Stx2a adalah 100 kali lebih beracun daripada tikus Stx1 [18,19], mungkin menjelaskan peningkatan toksisitas pada manusia. Stx1 dan Stx2a juga memiliki toksisitas yang berbeda pada jenis sel yang berbeda: Stx1 adalah lebih (10 kali) beracun dari Stx2a ke makrovaskular otak manusia sel endotel, sementara Stx2a jauh lebih mematikan (1000 kali) untuk sel endotel mikrovaskuler [20]. Strain STEC yang memiliki lebih dari satu jenis Stx, bagaimanapun, mungkin telah dikurangi toksisitas. Ia telah mengemukakan bahwa strain yang mengekspresikan Stx1 dan Stx2a kurang beracun daripada yang hanya mengungkapkan Stx2, mungkin karena kompetisi untuk reseptor sel inang yang sama [21], meskipun perbedaan serotipe atau host latar belakang juga dapat menjelaskan ini. Asosiasi antara berbagai Stx2 subtipe tidak diketahui. Stx2c dan 2g sangat mirip dengan Stx2a prototipikal, sedangkan Stx2e lebih divergen baik di tingkat asam amino dan genom. Stx2e ditemukan dalam strain STEC manusia, tetapi umumnya hanya menyebabkan gastroenteritis ringan [22]. Pada babi, bagaimanapun, produksi Stx2e bisa mengakibatkan penyakit edema mematikan [23]. Stx2f adalah yang paling berbeda (dengan genomik dan urutan asam amino) yang dikenal Stx2 subtipe. Itu pertama kali diisolasi pada merpati [24] dan awalnya dianggap tidak terlibat dalam penyakit manusia. Namun, studi terbaru dankemajuan dalam deteksi Stx2f telah menentukan bahwa Kehadiran Stx2f di STEC manusia terus meningkat [25]. Ini menekankan kebutuhan untuk memiliki murni, atau setidaknya sebagian murni, Stx2f untuk mengembangkan antibodi Stx2f-spesifik untuk imunodiagnose dan menyelidiki peran Stx2f dalam patogenesis manusia penyakit.

Sementara produksi dan pemurnian rekombinan Stx dan yang subunit telah terdokumentasi dengan baik, ada tambahan manfaat untuk memperoleh toksin alami dirilis langsung dari alam liar ketik kultur bakteri. Jika ada modifikasi yang terjadi toksin sementara ia keluar dari E. coli, ini akan dipertahankan. Setiap faktor bakteri lainnya yang mengasosiasikan dengan Stx mungkin juga bertahan selama rejimen pemurnian. Pemurnian prototipe Stx2a dan erat terkait Stx2c, Stx2d, dan Stx2g subtipe sebelumnya telah menunjukkan [26], tetapi pemurnian dan karakterisasi dari subtipe Stx2e dan 2f tetap dilaporkan. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa sebagian antibodi terhadap Stx2a tidak bereaksi silang dengan Stx2e dan 2f [26], dan saat ini tidak ada antibodi efektif terhadap subtipe ini tersedia. Purifikasi Stx2e dan Stx2f rumit karena kurangnya alat pelacakan. Dalam studi ini, kami detail empat langkah skema pemurnian untuk subtipe Stx2f dan membandingkan sifat Stx2f dengan Stx2a relatif lebih dipahami. Sekarang harapan kami bahwa mendapatkan Stx2f murni dapat membuka jalan arah memproduksi antibodi Stx2f-spesifik, dan pengembangan metode deteksi peningkatan dan perawatan untuk penyakit yang disebabkan oleh Stx2f-mengekspresikan STEC.

Bahan dan MetodeE. coli Strain dan Kondisi PertumbuhanSemua strain E. coli yang digunakan termasuk dalam Tabel 1. Stx2a dan Stx2f-mengekspresikan strain RM10638 (Stx2a) dan RM7007 (Stx2f) digunakan untuk produksi toksin [26]. 20 mL kultur starter mengandung LB broth (Fisher) ditumbuhkan semalam di 37uC dengan agitasi, kemudian diencerkan 1/50 dalam 500 mL LB ditambah dengan 50 ng / mL mitomycin C (Sigma-Aldrich) bila diindikasikan. Bakteri kemudian tumbuh selama 24 jam pada 37uC dengan agitasi, kemudian disentrifugasi pada 5 kG selama 15 menit. Pelet sel yang diautoklaf, dikelantang, dan dibuang, dan menengah adalah steril disaring (PVDF, 0,2 mm). K12 E. coli strain digunakan sebagai kontrol non-toksin yang memproduksi untuk kurva pertumbuhan.Amonium Sulfat endapanStx2a diendapkan dari 250 mL supernatan sel dengan menambahkan padat saturasi NH4SO4 sampai 70%. Campuran itu kemudian disentrifugasi (5 kG, 15 min. pada 4uC), dan pelet itu resuspended fosfat buffered saline (PBS, 20 NaPO4 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4). The Stx2a mengandung pelet kemudian penyangga dipertukarkan menggunakan 4 mL Zeba desalting kolom (Thermo Ilmiah) sampai 50 mM natrium asetat (NaOAc) pH 4,3 di persiapan kromatografi penukar kation. pH Memperbaiki dan kation Kromatografi Pertukaran (CEC) Budaya Stx2f supernatan pH ditetapkan untuk 4 menggunakan asetat glasial Asam (sekitar 10 mL 14,3 M asam asetat), maka Campuran disentrifugasi (5 kG, 15 min.) dan steril disaring (PVDF, 0,2 mm) untuk kejelasan. PH ini 4 supernatan sel ditambahkan langsung ke 5 mL SP-HP kolom tukar kation pada A ¨ kta FPLC (GE Life Sciences) yang sebelumnya diseimbangkan dengan 50 mM natrium asetat (NaOAc), pH 5. Setelah mencuci dengan 50 mM NaOAc, pH 5, toksin dielusi dengan 20 ml NaCl gradien (0 sampai 0,6 M) dalam 50 mM NaOAc, pH 5,3, pada 3 mL / menit, dan dikumpulkan dalam 1 mL fraksi. Protein Stx2a dimurnikan dengan cara yang sama, tapi tanpa pH-memperbaiki dan menggunakan 50 mM NaOAc, pH 4.3 gantinya pH 5.Interaksi hidrofobik Chromatography (HIC)Berdasarkan hasil ELISA, fraksi dari CEC mengandung Stx2f dikumpulkan, dan buffer ditukar dengan 50 mM natrium fosfat (NaPO4) +1 M NH4SO4, pH 7 menggunakan 4 mL Zeba desalting kolom. Sekitar 3 mL sebagian (kation exchange) dimurnikan toksin demikian diinjeksikan kedalam 5 ml Phenyl HP kolom, diseimbangkan dengan 50 mM NaPO4 +1 M NH4SO4, pH 7, pada A ¨ kta FPLC. Toksin kemudian dielusi dengan 25 mL NH4SO4 gradien (1-0 M) di 50 NaPO4 mM, pH 7, pada 3 mL /min, dan dikumpulkan dalam 1 mL fraksi.Anion Kromatografi Pertukaran (AEC)Berdasarkan hasil ELISA, fraksi dari HIC mengandung Stx2f dikumpulkan, dan buffer ditukar dengan 20 mM 1,3-diaminopropane (13DAP), pH 9, menggunakan 4 mL kolom desalting Zeba. Sekitar 3 mL yang dimuat pada 1 mL Q HP anion pertukaran kolom, diseimbangkan dengan 20 13DAP mM. Toksin adalah dielusi dengan 10 mLNaCl gradien (0 hingga 1 M) dalam 20 mM 13DAP, pH 9, pada 1 mL / menit, dan dikumpulkan dalam 0,5 mL fraksi.Gel FiltrasiBerdasarkan hasil ELISA, fraksi dari AEC yang mengandung Stx2f dikumpulkan, dan sekitar 0,7 mL disuntikkan ke sebuah Sephacryl 100 16/60 kolom filtrasi gel pra-disetimbangkan dengan PBS pada A ¨ kta FPLC. Kolom dielusi pada 0,5 mL / menit. Fraksi yang mengandung toksin murni (oleh Coomassie pewarnaan) yang dikumpulkan, terkonsentrasi

oleh Amicon Ultra filter (10 ukuran pori kD) (Millipore), dan disterilkan dengan 0,2 mm PVDF filter.Gel SDS-poliakrilamida elektroforesis (SDS-PAGE), Coomassie Pewarnaan, dan Blots BaratSemua sampel untuk analisis SDS-PAGE diinkubasi selama 5 menit pada 75uC sebelum loading ke gel, dengan pengecualian dari sel pelet (95uC selama 10 menit.). Gel (4% -12% NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel dari Invitrogen) dijalankan setelah produsen spesifikasi dan diwarnai dengan SimplyBlue Aman Stain (Invitrogen) untuk visualisasi protein. Untuk bercak Barat, setelah HALAMAN, protein yang electroblotted ke membran PVDF (Ukuran pori, 0,45 mm, Amersham Hybond-P). Membran adalah diblokir dengan 2% ECL Perdana memblokir agen (GE Healthcare) di PBS-Tween-20 (0,05%) (PBST). Stx pada membran yang terdeteksi dengan baik tikus antibodi anti-Stx2f (disiapkan sebagai ditunjukkan di bawah) dan anti-IgG-HRP (Promega), atau kelinci anti-Stx2a-HRP konjugat (dihasilkan dari antibodi disiapkan sebagai bawah, dengan Lightning-Link HRP Konjugasi Kit; Innova Biosciences) dan kemudian dikembangkan dengan Lumigen TMA-6 (Lumigen) substrat. Bercak Barat divisualisasikan dengan eksposur 2 menit menggunakan FluorChem HD2 (Alpha Innotech).Produksi Poliklonal a-Stx2f dan-Stx2a SeraUntuk mengembangkan antibodi poliklonal Stx2f, sebuah Stx2f Nya-tag A subunit konstruk dikembangkan menggunakan pTrcHis2 TOPO kloning kit (Invitrogen). Nya-tag Stx2f Sebuah subunit dinyatakan dalam TOP10 sel (Invitrogen) diinduksi dengan IPTG 1 mM dan dimurnikan menggunakan Ni-NTA afinitas kolom (Qiagen). 5 mg Stx2f di 2 mL PBS digunakan untuk menyusun kembali botol MPL-TDM (Sigma) intraperitoneal ajuvan dan disuntikkan ke dalam Balb / c tikus 3 kali pada 2 minggu interval. Satu minggu setelah injeksi ke-3, sera dikumpulkan menggunakan ekor berdarah vena. Untuk mengembangkan Stx2a antibodi poliklonal, kelinci diimunisasi dengan katalitis aktif Stx2a toksoid (E167Q mutasi) dan serum dikumpulkan dengan pungsi jantung dengan exsanguination (prosedur yang dilakukanoleh Pacific Imunologi).Pernyataan EtikaSemua prosedur dengan hewan dilakukan sesuai dengan pedoman kelembagaan untuk peternakan disetujui oleh Animal Perawatan dan Penggunaan Komite Departemen Pertanian AS, Western Regional Research Center (USDA ACUC Protokol # 09-J-10).Berat Molekul dan Perhitungan titik isoelektrikPerkiraan berat molekul dan titik isoelektrik (pI) adalah dihitung dengan menggunakan ExPASy Compute pI / MW tool (http://web.expasy.org / compute_pi /). Ketika menghitung pI toksin kompleks, urutan asam amino dari subunit A diikuti oleh lima mengulangi urutan subunit B digunakan sebagai input.ELISAsELISAs untuk pemantauan Stx2a dan 2f pemurnian yang directwell tes mengikat. Fraksi dikumpulkan diencerkan 1/25 di final volume 100 ml dalam PBS dan terikat langsung ke Nunc datar baik piring maxisorp bermalam di 4uC. Setelah memblokir piring dengan 200 ml susu 5% dalam PBS-Tween 20 (0,05%) (PBST), mereka kemudian diinkubasi dengan 100 ml antibodi primer: Sifin 2A (clone VT135 /6-B9, Sifin Institute, Berlin, Jerman) untuk Stx2a; tikus poliklonal serum untuk Stx2f. Kedua antibodi diencerkan 1/10, 000 di memblokir penyangga selama 1 jam pada RT. Goat anti-IgG-HRP (Promega) digunakan sebagai antibodi sekunder, dan plat dikembangkan dengan TMB substrat (Pierce), diikuti dengan penambahan 100 ml 0,3 N H2SO4. Absorbansi diukur pada 450 nm pada Victor II plate reader (Perkin Elmer). Antara setiap langkah pelatdicuci 3 kali dengan 200 ml PBST.Gb3-LPS dan GB4-LPS Binding Pengujian

The Gb3/Gb4-LPS binding assay dilakukan mirip dengan tradisional Sandwich ELISA. Sel E. coli Formaldehyde-fixed mengekspresikan globotriose-lipopolisakarida (Id glycan, sebagaimana dimaksud dalam penelitian ini sebagai'' Gb3-LPS'', sebuah Gb3 meniru) atau globotetraose-LPS (Pglycan, dimaksud dalam penelitian ini sebagai'' GB4-LPS'', GB4 meniru) atau Kontrol sel E. coli (CWG308 pJCP-Gb3, CWG308 pJCP-lgtCDE, dan CWG308 ctrl, masing-masing) [27,28] diencerkan menjadi 0,05 OD600 dalam buffer karbonat (0,1 M NaCO3, pH 9.6) dan 100 ml terikat ke sumur dari 96-Nunc Maxisorp plat hitam oleh inkubasi pada 50uC sampai semua cairan telah menguap. Wells adalah kemudian diblokir dengan 200 ml susu 5% / PBST selama 1 jam pada RT. Stx2f atau Stx2a racun kemudian diencerkan dalam menghalangi penyangga ditunjukkan konsentrasi dan diinkubasi di piring selama 1 jam pada RT. Anti- Stx2f mouse atau anti-Stx2a kelinci poliklonal serum kemudian ditambahkan pada, 000 dilusi dalam menghalangi penyangga 1/5 dan diinkubasi selama 1 jam di RT. Kambing anti-IgG HRP atau kambing anti-kelinci IgG HRP (Promega) kemudian ditambahkan (100 ml di 1/5, 000) dan diinkubasi selama 1 jam di RT. Sinyal dideteksi dengan 100 ml SuperSignal Barat Pico chemiluminescent Substrat (Thermo Scientific) dan membaca II plate reader Victor (Perkin Elmer). Antara setiap langkah pelat dicuci 3 kali dengan 200 ml PBST.In vitro Assay TerjemahanTes terjemahan bebas sel dilakukan dengan sebelumnya dijelaskan kelinci retikulosit protokol lisat [29], dengan menggunakan berbagai pengenceran Stx2f dan Stx2a untuk menentukan penghambatan 50%.Perhitungan Koefisien KepunahanAbsorbansi Stx2f murni pada 280 nm pada 200, 100, dan 50 mg / mL dianalisis dengan Nanodrop (Thermo Scientific) di rangkap tiga. Nilai-nilai yang diplot dan, dengan menggunakan standar yang linear kurva, ekstrapolasi untuk memperkirakan koefisien kepunahan Stx2f pada 1 mg / mL.Vero Pengujian Sitotoksisitas yourVero (hijau Afrika monyet ginjal) sel [30] dikultur dalam Dulbecco itu Modified Elang Menengah (DMEM, Invitrogen) ditambah dengan 10% serum janin sapi (FBS) (Invitrogen), dan tumbuh dalam sel dilembabkan budaya inkubator (37uC, 5% CO2). Itu sel trypsinized, diencerkan sampai 105 sel / mL, dan kemudian didistribusikan ke piring kultur sel yang diobati 96-. 24 jam kemudian, sel-sel menerima racun dan diencerkan dalam DMEM +10% FBS (100 ml / volume baik akhir) di salah satu dari dua formulasi. Pada bagian pertama, Sel diinkubasi pada 4uC selama 1 jam, 100 ml / sumur toxincontaining Media telah dihapus dan diganti dengan media yang segar, dan sel dikembalikan ke inkubator untuk tumbuh selama 24 jam. Dalam kedua, racun itu hanya ditambahkan ke sel dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kemudian segaris menggunakan 100 ml / sumur 1/5 pengenceran CellTitre-Glo reagen (Promega), dan pendaran diukur menggunakan II piring pembaca Victor. Dosis sitotoksik 50% (CD50) merupakan jumlah racun yang diperlukan untuk membunuh 50% dari monolayer terpasang sel dalam sumur. CD50 yang didekati dengan memplot tiga poin dalam bagian linear dari grafik, dan pemecahan untuk 50% (0,5). Ini biasanya 2.72 (0.52a) / b untuk semi-log, di mana a dan b ditentukan oleh plot. Semua foto diambil menggunakan Leica DM IL mikroskop di 200xpembesaran.pH dan Panas PerawatanUntuk pH mengobati Stx2f dan Stx2a, 500 ng / mL toksin diencerkan dalam NaOAc penyangga (250 mM) pada berbagai nilai pH dan dibiarkan menetaskan di RT selama 1 jam. Untuk memanaskan mengobati Stx2f dan Stx2a, 500 ng /mL toksin diinkubasi dalam buffer NaOAc pada suhu yang ditunjukkan selama 1 jam. Setelah pengobatan, campuran tersebut diencerkan 100 - lipat dengan DMEM / media kultur FBS, dan diinkubasi 100 ml / sumur

dengan sel Vero selama 1 jam pada 4uC, dan kemudian media digantikan dengan 100 ml segar DMEM / FBS selama 24 jam. Sel-sel segaris danpendaran diukur dengan menggunakan 1/5 pengenceran 100 ml / sumur CellTitreGlo reagen dan II piring pembaca Victor, seperti di atas. Mengobati sel Vero dengan 2,5 mM, pH 1,5 NaOAc di DMEM /FBS kontrol memiliki toksisitas diabaikan (data tidak ditampilkan).

HasilEkspresi dan Pemurnian Subtipe Stx2fE. coli strain (Tabel 1) mengungkapkan Stx2f atau berbagi Stx2a serupa Pertumbuhan kinetika (Gambar 1A), meskipun strain Stx2a tumbuh lebih kokoh dan mencapai densitas optik maksimum yang lebih tinggi (OD). Produksi racun dan lisis sel di kedua strain sangat meningkat pengobatan dengan mitomycin C (Gambar 1B, 1C, masing-masing). Ekspresi maksimal dan pembebasan Stx2f racun ke dalam media kultur dicapai setelah 24 jam pertumbuhan bakteri dengan 50 ng / mL mitomycin C (Gambar 1C). Ini sesuai dengan fase diam dalam budaya ini, dan mirip dengan ekspresi Stx2a. Jumlah Stx di media adalah jauh lebih besar daripada di lisat sel (Gambar 1C), sehingga Stx2f dan Stx2a dimurnikan eksklusif dari media disaring. Skema pemurnian sebelumnya dikembangkan untuk melibatkan Stx2a beberapa langkah menggunakan kromatografi ukuran dan berbasis biaya [31] atau kolom afinitas antibodi [26,32]. Karena tidak ada secara komersial antibodi monoklonal yang tersedia mengikat Stx2f dengan afinitas tinggi, kita difokuskan pada pengembangan pemurnian berbasis kolom semi-otomatis rejimen menggunakan A ¨ kta FPLC (GE Biosciences). Agar memperoleh Stx2f murni, sebuah protokol empat langkah didirikan: media pHfixed kromatografi tukar kation (KTK) (Gambar 2A), diikuti dengan kromatografi interaksi hidrofobik (HIC) (Gambar 2B), kemudian kromatografi penukar anion (AEC) (Gambar 2C), dan akhirnya gel filtrasi (GF) (Gambar 2D). Elusi toksin tersebut dipantau oleh ELISA menggunakan anti-Stx2f A subunit antibodi poliklonal tikus yang dikembangkan dalam penelitian ini. Setelah final pemurnian langkah, GF, persiapan yang dimurnikan 4524 kali lipat dengan pemulihan 2% (yang diukur dengan toksisitas sel Vero) adalah diperoleh (Tabel 2) (Gambar S1). Skema ini pemurnian diproduksi 5.2 mg dimurnikan Stx2f dari 450 mL kultur bakteri supernatan (Tabel 2).Sifat biokimia dari Subtipe Stx2fKemurnian dan molekul bobot untuk subunit Stx2f setelah GF langkah dianalisis menggunakan SDS-PAGE diikuti oleh Coomassie pewarnaan. Hanya dua band yang terlihat pada gel (Gambar 2E, jalur 5). Atas Band memiliki berat molekul mirip dengan A subunit dari Stx2a (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2E, jalur 6), tetapi MW band yang lebih rendah jelas lebih kecil dari subunit B dari Stx2a. Berdasarkan estimasi menggunakan ExPASy Compute pI / Alat MW, para MW dari Stx2f dan Stx2a sangat mirip (Stx2a: 35,8 kDa untuk subunit A, 9,9 kDa untuk subunit B; Stx2f: 35,6 kDa untuk A, 9.6 kDa untuk B). Tidak jelas mengapa Stx2f B subunit muncul kecil pada SDS-PAGE. Perkiraan titik isoelektrik (pI), menggunakan alat yang sama, untuk Stx2a dan Stx2f bervariasi secara dramatis (Stx2a pI: 6.3; Stx2f pI: 9.1). Kepunahan koefisien dimurnikan Stx2f protein toksin kami adalah 0,60 mL mg21 CM21 pada 280 nm.Reseptor-pengikatan Stx2fUntuk membandingkan interaksi Stx2f dengan Gb3Cer dan Gb4Cer reseptor, pengikatan dimurnikan Stx2f ke sel-globotriose atau globotetraose-lipopolisakarida (LPS-Gb3 atau GB4-LPS) pada permukaan diukur dengan'' roti'' ELISA. Sel E. Coli mengekspresikan Gb3-LPS atau GB4-LPS yang bergerak pada 96 - piring baik dan mengikat Stx2f diamati menggunakan mouse antibodi poliklonal terhadap Stx2f untuk deteksi. Ditemukan bahwa Stx2f terikat untuk kedua Gb3-LPS dan GB4-LPS yang mengandung E. Coli sel. Meskipun Stx2f

memiliki preferensi ringan untuk Gb3-LPS (Gambar 3A), itu dipamerkan mengikat relatif kuat untuk GB4-LPS sel bila dibandingkan dengan Stx2a, yang dikenal untuk mengikat Gb4Cer lemah dalam tes lainnya [33]. Dalam kondisi eksperimental kami, Stx2a tidak mengikat sel GB4-LPS, dan dipamerkan luar biasa preferensi mengikat terhadap sel-Gb3 LPS (Gambar 3B).Aktivitas enzimatik dan sitotoksisitas Stx2fSebagian besar situs aktif Stx2f adalah identik dengan Stx2a, termasuk N75, Y77, E167, R170, R176 dan posisi itu, ketika bermutasi, toksisitas dieliminasi [34]. Selain itu, Stx2fcontaining Media menghambat terjemahan dalam in vitro assay [35]. Oleh karena itu kami berasumsi bahwa Stx2f, seperti subtipe lain dari Stx2, memiliki situs katalitik terbuka untuk aktivitas N-glikosidase. Sebuah dalam uji terjemahan vitro dilakukan pada kelinci retikulosit lisat (Promega) menegaskan bahwa utuh (A + B pentamer) dimurnikan Stx2f adalah mampu menonaktifkan ribosom, sehingga penghentian sintesis protein (Gambar 3C). Konsentrasi titik tengah (IC50) untuk penghambatan penerjemahan adalah 3,5 mg / mL, sedikit lebih tinggi daripada bahwa Stx2a (2,5 mg / mL). Meskipun dimurnikan Stx2f efektif membunuh Sel Vero (Gambar 3D-a), itu kurang beracun dari Stx2a (Gambar 3D-b). Sel Vero dirawat oleh dua metode yang berbeda dan 50% dosis sitotoksik (CD50) dari Stx2f ditunjukkan untuk menjadi 3 - atau 5 kali lipat lebih tinggi.dibandingkan Stx2a, menunjukkan Stx2f yang cukup kurang beracun dibandingkan dengan Stx2a (Tabel 3). Perbedaan antara kedua metode adalah (1) menambahkan racun ke sel Vero dan menginkubasi sel-sel pada 37uC semalam atau (2) menambahkan toksin, menginkubasi sel dengan racun selama satu jam di 4uC, dan mengganti racun terikat dengan media segar, maka menginkubasi sel-sel pada 37uC semalam. Kami mengamati bahwa kedua metode ini tidak setara. Metode (1) adalah sebanyak 5 kali lebih sensitif dibandingkan metode (2). Berbeda CD50 nilai telah dilaporkan untuk Stx2a [36,37], perbedaan ini mungkin disebabkan metode Vero sel pengobatan, uji viabilitas sel, kemurnian asli racun, dan protokol pemurnian. Untuk alasan ini, perbandingan nilai absolut yang berlaku dalam studi, tetapi belum tentu seluruh studi.Stabilitas Subtipe Stx2fAsetat diproduksi oleh mikroorganisme komensal mungkin bertanggung jawab untuk menghasilkan pH usus rendah yang menghambat untuk Stxs serta Stx ekspresi [38]. Oleh karena itu, kami meneliti efek dari pH rendah dalam buffer asetat pada Stx2a dan toksisitas Stx2f dalam sel Vero. Setelah inkubasi selama satu jam di 250 mM natrium asetat pada pH 1,5, toksisitas Stx2f dan Stx2a benar-benar dihilangkan. Namun, setelah pH 2 pengobatan, Stx2a telah kehilangan sebagian besar toksisitas, sedangkan Stx2f tetap sangat ampuh (Gambar 4A, Gambar S2). Karena Stx2f lebih stabil pada pH rendah, kita mendalilkan bahwa Stx2f mungkin lebih termo-toleran juga. Meskipun inkubasi pada 95uC benar-benar tidak aktif baik Stx2f dan Stx2a, sebuah inkubasi 72uC diberikan Stx2f lebih beracun dari Stx2a, dengan selisih yang cukup (Gambar 4B). Informasi ini menunjukkan bahwa, sementara Stx2f kurang beracun dari Stx2a dalam kultur sel, umumnya tampaknya menjadi lebih stabil, baik pada pH rendah dan panas.

DiskusiSTECs dan Stxs mewakili serius dan terus berkembang kesehatan masyarakat keprihatinan. STECs bertanggung jawab untuk beberapa yang paling wabah penyakit yang ditularkan melalui makanan luas dan mematikan di akhir sejarah, dan penelitian mendeteksi, karakteristik, dan menetralkan Stxs, khususnya Stx2s, adalah kunci untuk mencegah dan mengobati wabah masa depan. Ini adalah masalah rumit, namun, STEC serotipe dan Stxs sendiri sangat beragam. Ketujuh dominan Stx2 subtipe (Stx2a ke 2g) telah dikaitkan dengan penyakit manusia [39], dan semua yang terdeteksi oleh PCR dan immunoassays, tetapi

masing-masing metode deteksi tampaknya memiliki tertentu subtipe kekhususan. Secara khusus, Stx2f yang tidak terdeteksi oleh semua tapi a immunoassays beberapa komersial (assay VTEC-RPLA menjadi salah satu pengecualian) [6], dan telah menghindari sebagian besar upaya karakterisasi sejauh ini, sejak dimurnikan Stx2f belum terbukti. Di studi ini, kita detail skema pemurnian untuk Stx2f. Menggunakan murni Toksin Stx2f, kami menilai ligan mengikat disukai, katalitik aktivitas, toksisitas pada sel Vero, dan stabilitas di lingkungan itu mungkin temui dalam persiapan makanan atau selama perjalanan ke usus.

Meskipun baru, prosedur pemurnian Stx2f yang sangat murni rinci di sini agak terlibat dan menghasilkan hasil yang rendah dari toksin. Namun, memperoleh toksin murni sangat menyederhanakan produksi toksin spesifik antibodi monoklonal. Setelah afinitas tinggi monoklonal antibodi untuk Stx2f tersedia, satu atau dua langkah afinitas pemurnian harus menjadi rutin dan kuat, baik untuk kemudahan dan menghasilkan. Dalam rangka untuk memantau toksin Stx2f saat melakukan nya pemurnian, Stx2f tikus anti-serum disiapkan. Antigen digunakan adalah versi His-tag dari Stx2f A subunit, diduga menjadi lebih subunit epitop yang kaya, dan kehadiran 6xHis tag membuatnya mudah untuk memurnikan. Untuk antibodi poliklonal masa depan persiapan, bagaimanapun, toksoid rekombinan katalitis aktif kompleks seperti E167Q mutan akan membuat antigen yang lebih baik [26]. Menggunakan antigen ini, yang merakit sebagai AB5 tidak beracun toksoid, kedua subunit A dan B harus terdeteksi. Jika Stx2f a toksoid yang tersedia untuk perbandingan, juga akan menarik untuk catatan jika subunit B dari toksoid lebih kecil daripada Stx2a.Fenomena ini (Stx2f B lebih kecil dari Stx2a B, Gambar 2E) sulit untuk menjelaskan, tetapi murni Stx2f B subunit jelas fungsional (secara efektif membunuh sel Vero dalam budaya). The Stx2f B subunit dapat dikenakan proteolitik yang tidak diinginkan kadang-kadang selama proses pemurnian. Hal ini dapat ditentukan oleh massa analisis spektrometri dari dimurnikan Stx2f (dalam persiapan).

Meskipun menunjukkan hanya 71% dan 82% (A dan B subunit, masing-masing) identitas urutan asam amino untuk Stx2a [35], Stx2f memiliki telah ditunjukkan dalam studi ini dan sebelumnya untuk secara efektif membunuh sel-sel Vero dalam budaya [24], dan sangat mirip dengan Stx2a dalam hal katalitik Kegiatan (Gambar 3C). Namun, tidak seperti Stx2a, kehadiran Stx2fdalam E. coli saat ini tidak terkait dengan HUS. Frekuensi rendah isolat Stx2f dalam penyakit manusia mungkin karena kemungkinan bahwa fag Stx2f belum memantapkan dirinya dalam E. coli galur yang mampu patogenisitas manusia. Jika hal ini terjadi, mungkin hanya soal waktu sebelum Stx2f isolat menjadi manusia yang serius patogen. Meskipun kita tidak tahu bagaimana beracun Stx2f murni in vivo, Stx2f kurang beracun untuk sel Vero dari Stx2a. Karena katalitik kegiatan Stx2f dan Stx2a tampaknya setara, perbedaan preferensi reseptor, afinitas reseptor, atau stabilitas antara Stx2a dan Stx2f subtipe mungkin bertanggung jawab untuk perbedaan toksisitas. Kekhususan atau afinitas reseptor tampaknya menjadi penentu toksisitas [40]. Pilihan reseptor untuk Stx2e adalah GB4, meskipun juga mengikat dengan baik untuk Gb3 [33], dan diperkirakan bahwa ini adalah mengapa Stx2e, yang dapat mematikan bagi babi, biasanya hanya menyebabkan gastroenteritis ringan pada manusia. Di sini, kami melaporkan bahwa Stx2f memiliki afinitas terhadap kedua Gb3-LPS dan GB4-LPS, dengan sedikit preferensi terhadap Gb3-LPS (dalam tes kami melakukan). Ini tidak mengherankan, karena subunit B dari Stx2e dan Stx2f hampir identik, dan berbeda hanya dua asam amino. B subunit jawab tidak hanya untuk mengikat reseptor, tetapi juga reseptor preferensi, seperti yang digambarkan oleh mutasi Stx2e. Ketika Q64E / K66Q mutasi ganda dimasukkan ke dalam Stx2e B subunit, preferensi reseptor berubah dari Gb3/Gb4 ke Gb3 [41]. Stx2f, seperti Stx2e, memiliki Q64/K66, dan mengikat kedua Gb3-LPS dan GB4-LPS. Dalam kasus apapun, ada kemungkinan bahwa Stx2f tidak manjur sebagai Stx2a dalam sel Vero karena pengenceran'''' antara kedua Gb3 dan GB4 reseptor, meskipun mekanismenya

tidak jelas. Kemungkinan lain adalah bahwa, dengan mengikat promiscuous nya, Stx2f lebih merata di seluruh permukaan sel dan terinternalisasi dalam vesikel pada konsentrasi yang lebih rendah, dan konsentrasi tinggi Stx2 dalam vesikula akan menghasilkan sebuah pulsa yang kuat racun, dan lebih besar toksisitas. Tentu saja, mengurangi toksisitas Stx2f juga bisa dimediasi oleh penurunan pengikatan reseptor, internalisasi, atau pelepasan sitoplasma, beberapa faktor lainnya. AB subunit chimera antara Stx2f dan Stx2a dapat membantu dalam menentukan subunit bertanggung jawab atas toksisitas dilemahkan. Perbandingan antara toksisitas mouse dan toksisitas sel Vero bisa sangat mengungkapkan juga. Tentu saja, studi ini akan menjadi fokus futurework.

Stabilitas Stxs juga tampaknya berbeda antara subtipe yang ditandai. Stx2f, meskipun toksisitas relatif rendah dibandingkan dengan Stx2a, lebih stabil untuk kedua pH rendah dan perlakuan termal. Murni Stx2f mempertahankan toksisitas setelah pH 2 atau 72uC pengobatan secara signifikan lebih baik daripada Stx2a (Gambar 4A dan 4B). Hasil penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa stabilitas termal Stx2a, terutama aktivitas katalitik, bisa berubah tergantung pada asal-usulnya dan kemurnian [29]. Namun, Stx2a dan Stx2f dimurnikan menggunakan protokol mirip dengan kemurnian yang sama dalam penelitian ini, menunjukkan bahwa Stx2f mungkin memiliki struktur molekul yang lebih stabil termal. Namun, lebih eksperimen akan diperlukan untuk menentukan apakah toksisitas rendah Stx2a 72uC diobati sebenarnya karena berkurangnya aktivitas katalitik A subunit atau faktor lainnya. Yang relatif rendah stabilitas termal diukur aktivitas toksin Stx2a juga mungkin karena penonaktifan dari subunit B untuk permukaan sel reseptor yang mengikat. Ada kemungkinan bahwa Stx2f AB5 kompleks itu sendiri mungkin akan lebih stabil, dan membutuhkan kondisi yang lebih keras untuk menyebabkannya menjadi berantakan. Menariknya, fenomena serupa jelas untuk pH 2 pengobatan (Gambar 4A), di mana Stx2f kehilangan hanya setengah toksisitas dan Stx2a hampir sepenuhnya tidak beracun. Ini telah ditunjukkan sebelumnya yang Stx2a tetap stabil sampai pH di bawah 3 ketika diinkubasi dengan pH-tetap PBS, yang konsisten dengan hasil kami [30]. Kami telah disebutkan dalam studi ini bahwa asetat dihasilkan oleh mikrobiota usus mungkin tidak hanya menghambat ekspresi toksin Stx2 [38] tetapi juga aktif racun itu sendiri. Pada pH 2 dapat menghambat Stx2a, dan pada pH 1,5 bahkan bisa menghambat Stx2f, tetapi asetat yang dihasilkan oleh bakteri komensal seperti Lactobacillus dan Bifidobacterium adalahmungkin untuk pH usus yang lebih rendah ke tingkat itu: Bifidobacterium menimbulkan konsentrasi asetat usus 56 mM dan menurunkan pH usus hanya 6,75 [42]. pH 2 dekat dengan pH lambung asam, dan menakutkan menunjukkan bahwa Stx2f bisa bertahan perjalanan dari mulut ke usus lebih baik dari Stx2a. Namun, Stxs adalah biasanya dihasilkan dari usus, sehingga stabilitas pH Stx2f mungkin tidak relevan pada tingkat fisiologis patogenisitas manusia. Penelitian lain telah tersirat bahwa Stx berevolusi untuk pertahanan terhadap protozoa predasi, yang resistensi terhadap sangat asam vakuola endolisomal akan menjadi aset berharga [43]. Ini akan memberikan alasan untuk stabilitas asam umum dan Stx2a Stx2f dan menunjukkan bahwa E. coli strain menyimpan Stx2a dan Stx2f mungkin terkena set berbeda protozoa predator.

Meskipun umum dalam vektor hewan di mana-mana (merpati), Stx2f-encoding STEC strain belum dianggap sebagai masalah kesehatan utama karena kurangnya keparahan dan kelangkaan infeksi. Namun, karena kebanyakan Stx immunoassays miskin dalam mendeteksi Stx2f, hal ini menjadi jelas bahwa infeksi Stx2f lebih umum daripada yang kita sadari [25]. Meskipun kurang beracun dari dalam sel Vero Stx2a, Stx2f tidak muncul untuk menjadi umumnya lebih stabil, dan dapat bertahan lebih mudah selama persiapan makanan. Penelitian ini harus menyoroti kebutuhan untuk sistem deteksi kuat untuk Stx2f, sesuatu yang dibuat lebih terjangkau oleh dimurnikan toksin Stx2f, sehingga bahan makanan terkontaminasi dengan Stx2f mengandung STEC dapat dengan mudah diidentifikasi dan dihapus.