Praktikum yang dilakukan bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E.coli. Praktikum ini dilakukan berdasarkan prinsip sebagai berikut, Pertama, pembuatan sel kompeten yang dapat disisipi vektor DNA rekombinan. E.coli dibiakkan dalam suspensi media dan pada saat mid-log phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es dengan penambahan larutan CaCl2 dingin. Kedua, Transformasi E.coli dengan plasmid rekombinan. DNA plasmid rekombinan ditambahkan ke dalam sel kompeten disertai dengan kontrol. Campuran sel kompeten dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi kejut panas (heat-shock) pada suhu 42Oc dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC. Ketiga, seleksi koloni E.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel, dimana dalam praktikum ini digunakan E.coli sebagai sel inang. Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang, Fenotip strain E.coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA. Vektor pada proses transformasi dapat digunakan sebagai vector kloning dan vector ekspresi, dimana pada pada praktikum ini vektor yang digunakan adalah plasmid Pet DUET. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut.Plasmid Pet DUET mempunyai ukuran 5420 pasang basa dan mempunyai pita restriksi seperti gambar berikut :

Plasmid Pet DUET mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadap ampisillin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta lactamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisis hidrolisis cincin betalaktam, sehingga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan Pet DUET menjadi resisten terhadap ampisillin.Transformasi hanya dapat dilakukan pada sel yang kompeten. Sel yang kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk menerima DNA telanjang. Terdapat beberapa bakteri yang mampu menjadi kompeten secara alami sedangkan bakteri lain umumnya harus dibuat menjadi kompeten. Pada praktikum ini sel bakteri yang digunakan adalah sel E.coli dimana sel E.coli harus diberikan beberapa perlakuan agar menjadi kompeten. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl2).Praktikum ini dimulai dengan pembuatan sel kompeten. Sebanyak 1 ose E.coli BL21 diambil dan dimasukkan ke dalam 5 mL media LB cair. Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam shake-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam. Kemudian pindahkan kultur E.coli BL21 sebanyak 2500 uL hasil inkubasi semalam ke media LB cair dengan cara mengambil sebanyak kultur E.coli BL21 ke dalam 50 mL media LB cair . Setelah itu dilakukan inkubasi dalam shake-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 2 jam pada suhu 37oC. Diperoleh suspensi E.coli BL 21 yang sedang berada dalam log phase setelah diinkubasi selama 2 jam. Sel yang berada pada tahap pertumbuhan logaritmik lebih mudah untuk dibuat kompeten daripada sel yang berada pada tahap pertumbuhan yang lain. Laju pertumbuhan pada kultur bakteri tidaklah konstan. Pada beberapa jam pertama (lag phase), laju pertumbuhan sangat lambat karena sedikitnya jumlah bakteri awal yang membelah. Fase ini diikuti fase pertumbuhan logaritmik dimana terjadi laju pertumbuhan yang tinggi. Panjang waktu dari tiap tiap fase pertumbuhan dipengaruhi oleh suhu inkubasi. Oleh karena itu sel yang digunakan sebaiknya dalam fase logaritmik. Suspensi E.coli BL21 tersebut kemudian dibagi ke dalam dua tabung Eppendorf yang berbeda. Sebanyak 7 mL suspensi E.coli BL21 dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf A sedangkan sebanyak 3 mL suspensi E.coli BL21 dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf B. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kedua tabung yang berisi suspensi tersebut selama 5 menit dengan kecepatan 5700 g. Proses sentrifugasi ini bertujuan untuk memisahkan bakteri dengan media pertumbuhannya. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan kemudian dilakukan penambahan 500 uL CaCl2 75 mM dingin. Penambahan CaCl2 ini bertujuan untuk mempengaruhi dinding sel dan berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Pada proses penambahan ini juga dilakukan pipetting agar terjadi pencampuran merata antara sel bakteri dengan CaCl2 dingin yang ditambahkan. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 5700 g. Proses sentrifugasi dilakukan berulang ulang dengan tujuan untuk memastikan agar plasmid DNA tidak bercampur lagi dengan DNA kromosom. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan kemudian dilakukan kembali penambahan 200 uL CaCl2 75 mM dingin dan diinkubasi dalam es selama 2 jam. Proses inkubasi dalam es ini bertujuan untuk membuat suhu di dalam media menjadi ekstrem dan akan berpengaruh terhadap tahap selanjutnya yaitu tahap heat-shock.. Setelah sel sel bakteri yang terdapat dalam kedua tabung Eppendorf menjadi kompeten, ke dalam tabung Eppendorf A dilakukan penambahan 10 uL plasmid Pet DUET sedangkan ke dalam tabung Eppendor B tidak dilakukan penambahan plasmid Pet DUET. Kemudian kedua tabung Eppendorf tersebut diinkubasi kembali di dalam es selama 20 menit. Selanjutnya diberikan perlakuan kejut panas dengan suhu 42oC selama 90 detik di dalam waterbath. Pemberian perlakuan kejut panas (heat-shock) ini bertujuan untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Setelah itu diinkubasi kembali di dalam es selama 10 menit. Proses inkubasi ini akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel.