Pectinas
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Annals of Microbiology
September 2012, Volume 62,Issue 3, pp 1199-1205
Production and characterization of polygalacturonase from thermophilicThermoascus aurantiacus on submerged
fermentation
Eduardo da Silva Martins, Rodrigo Simões Ribeiro Leite, Roberto da Silva, Eleni Gomes
Produção e caracterização de poligalacturonase a partir do fungo termófilo Thermoascus aurantiacus
em fermentação submersa
Apresentação: Mauren Silveira
OBJETIVO
AVALIAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA TERMOESTÁVEL
POLIGALACTURONASE PRODUZIDA PELO FUNGO
THERMOASCUS AURANTIACUS
A PARTIR DE MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
Polímeros lineares compostos de resíduos de ácido 1,4 β-d-galacturônico esterificado, unidos mediante ligações glicosídicas do tipo α 1-4
PECTINA• Protopectina: insolúvel em água e tem cátions
divalentes. Frutas imaturas.• Pectina: solúvel em água, formamida e
glicerol. 75% dos grupos carboxílicos são metilados.
• Ác. Pectínico: ác. Poligalacturônico com alta % de metoxila. Forma gel com açúcar, ácidos e íons metálicos.
• Ác. Péctico: ác. Poligalacturônico coloidal, sem metoxila.
As exo-poligalacturonases catalisam a hidrólise das
ligações terminais α1-4 da cadeia de ác.
poliGalacturônico por hidrólise
INTERESSE INDUSTRIAL
CLARIFICAÇÃO
DIMINUIÇÃO DA VISCOSIDADE
EXTRAÇÃO DE ÓLEOS A FRIO E A QUENTE
AROMATIZAÇÃO
MODIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DA COR
À MEDIDA EM QUE OS SUBSTRATOS SÃO HIDROLISADOS PELAS EXO-PG OBSERVA-
SE UM CONSIDERÁVEL AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES
REDUTORES CAUSADA PELA LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS DE ÁC. GALACTURÔNICO
E CONSEQUENTE DECRÉSCIMO DA VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES.
Thermoascus aurantiacus CBMI756
CELOLÍTICA: CELOBIOHIDROLASE, ENDOGLUCANASE E β-GLUCOSIDASE DEGRADAÇÃO DA HEMICELULOSE: ALPHA-D-
GLUCURONIDASE, XILANASE, β-XILOSIDASE, β-MANNOSIDASE E ARABINOFURANOSIDASE.
DEGRADAÇÃO DA PECTINA: HIDRÓLISE:PECTINA LIASE, POLIGALACTURONASE,
AMILASE E α-GLUCOSIDASE.
Ascomycota; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; Thermoascus
Crescimento de hifas: 45-52,5°C
Formação de ascósporos: 47.5-60°C
TERMOESTABILIDADE
• QUANTO À MEMBRANA• Bacteria e Eukarya: Bicamada Lipídica de ác. Graxos saturados gerando
hidrofobia• Archaea: Monocamada Lipídica: Glicerol-Éter-Hidrocarboneto(5 C Isopreno)
> 100°C• QUANTO AO DNA• Bacteria e Eukarya: Purina (Adenina)-Protege RNA Citosina Timina-Estabilidade no pareamento
Codon-Anticodon• Archaea: 2,3difosfoglicerato cíclico de potássio-Impede despurinação DNA Girase Reversa (DNA topoisomerase)-Superenovelamento
Positivo Proteína Sac7d –sulco menor do DNA- aumenta temperatura de
desnaturaturação em 40°C Histonas de Archaea-Compacta o DNA em dupla-fita,mesmo em
temperatura elevada
METODOLOGIA
COMPARAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS SINTÉTICOS COM PECTINA SINTÉTICA
» KHANNA» VOGEL» CZAPEC» SR
EM RELAÇÃO A ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAS CONTENDO PECTINA NATURAL
» CASCA DE LARANJA» CASCA DE MARACUJÁ» FARELO DE SOJA» ÁGUA AMARELA
MÉTODO
MEIOS SINTÉTICOS X PRODUÇÃO DA ENZIMA
• CZAPECK (Sais + Amido + Sucrose)• KHANNA (Muitos sais + Amido)• SR (Poucos Sais + Peptona + Amido)• VOGEL (Poucos sais + Triptona + Glicina)
• PECTINA CÍTRICA (BRASPECTINA)
25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
8 dias com agitação 110 RPMAmostras coletadas a cada 24 horas
Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C
Cada amostra
Atividade enzimáticaProdução de biomassa
Concentração de açúcares redutorespH
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Solução tampão acetato 0,4 ml (0.2 M) pH 5.0 com NaOH1% de pectina comercial esterificada (26 DE Sigma)
+
0,1 ml da enzima retirada da amostraINCUBAR 60°C por 10 min
TESTESDNS para determinar quantidade de açúcares redutores do ácido
D-galacturônico
UMA UNIDADE DE ATIVIDADE DE PG CORRESPONDE A QUANTIDADE DE ENZIMA QUE LIBEROU 1 MICRO-MOL DE AÇÚCAR REDUTOR DE
ÁCIDO POR ml DE SOLUÇÃO POR MINUTO
MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAISA 2%
• Casca de Laranja • Casca de Maracujá• Farelo de Soja• Água Amarela
25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)
8 dias com agitação 110 RPMAmostras coletadas a cada 24 horas
Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C
Cada amostra
Atividade enzimáticaProdução de biomassa
Concentração de açúcares redutorespH
TERMOESTABILIDADEDINÂMICA/CINÉTICA
• Tm 50% das enzimas desdobradas• T1/2 meia vida das enzimas a uma
determinada temperatura
Proteínas desnaturadas: desaminação da Asparagina (ASN) e da Glutamina (GLN) ou quebra da ligação peptídica
Temperatura ótima
Termoestabilidade
• pH ótimo a 55°C: 5.5
• Temperatura ótima: 60-65°C
Para determinar a temperatura ótima da enzima, foram feitos
experimentos incubando o extrato enzimático junto ao substrato, em
diferentes temperaturas, durante 10 minutos, tempo após o qual foi
determinada a atividade enzimática.
ATIVIDADE ENZIMÁTICA/DINÂMICA
ATIVIDADE ENZIMÁTICAMESOFÍLICOS/TERMOFÍLICOS
Temperatura ótima de atividade PG de fungos mesofílicos
Lentinus edodes 50°C
Moniliella sp SB9 55°C
Penicillium sp EGC5 40°C
Temperatura ótima de atividade PG de fungos termofílicos
Thermomyces lanuginosus 70°C
Thermomucor indicae-seudaticae N31 60°C
CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA/CINÉTICA
Enzima bruta
Enzima bruta
91%
60%
Para determinar a termoestabilidade, foram feitos experimentos incubando o extrato enzimático SEM substrato, em diferentes temperaturas, DURANTE 1 HORA. Após 1 hora, dosou-se a atividade enzimática, incubando no substrato, por 10 minutos, o extrato enzimático que ficou exposto por 1 hora nas diferentes temperaturas.
6%13%
Para determinar a estabilidade do pH, incubou-se a enzima sem substrato a 55°C em diferentes tampões:
Acetato de sódio (pH 3.0-5.5)
Fosfato Citrato (pH 6.0-7.0)
Tris-HCl (pH 7.5-8.5)
Glicina-NaOH (pH 9.0-11.0)depois inseriu-se em substrato a 25°C - 24 horas, tempo após
o qual foi feito o teste DNS.
CONCLUSÃO
A atividade enzimática de PG produzida por
T. aurantiacus na Água Amarela (3.2 U/ml) foi melhor que a produzida no meio sintético
SR (2.0 U/ml) suportando uma
temperatura de até 55°C por 1 hora e temperatura ótima no substrato de até
60°C por 10 minutos.
CONSIDERAÇÕES
• Aspergillus niger em casca de limão por FS é capaz de produzir 26.17 U/ml de POLIGALACTURONASE, porém, a uma temperatura de 30°C.
• Sugere-se a pesquisa de isolamento do gene responsável pela expressão da poligalacturonase, sua amplificação e clonagem no vetor de expressão de Aspergillus niger, esperando obter enzima termoestável em maior quantidade.
A CLARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DE
SUCO DE LARANJA PODE
SER REALIZADA A 15°C DURANTE 12
HORAS OU A
54°C POR 1 HORA