BATTERIOLOGIA GENERALE

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Introduzione alla MicrobiologiaClassificazione. Gli organismi microbiologici sono classicamente suddivisi in 3 regni: - Monere - Funghi - Protisti Lo studio degli RNA condotto da Woese introduce un nuovo criterio di classificazione in 3 domini: - ARCHEA: Gruppo di batteri sia eucariotici che procariotici presenti in condizioni estreme (concentrazioni saline elevate, alte temperature, pH elevati.). - BACTERIA: Contiene le tipiche specie batteriche comprese quelle dimportanza clinica per luomo. - EUCARYA: Contiene tutte le rimanenti forme di vita microbiologica tra cui funghi, protisti e vermi patogeni per luomo.

Anatomia BattericaCellule procariotiche ed eucariotiche Materiale genetico non racchiuso da membrana nucleare (procariotiche) mentre la membrana nucleare presente nelle eucariotiche. Cromosoma unico, circolare, non complessato con istoni, con forche di replicazione multiple (procariotiche) mentre nelle eucariotiche il cromosoma pu essere pi di uno, non circolare, complessato con istoni e con un numero maggiore di forche di replicazione. Mancanza di organelli cellulari delimitati da membrana (cellula procariotica) mentre nella cellula eucariotica sono delimitati da membrana. Assenza dei mitocondri, le funzioni respiratorie avvengono sulla membrana citoplasmatica (cellula procariotica), presenza di mitocondri con funzione respiratoria nella cellula eucariotica. Ribosomi procariotici a 70S (50S + 30S); ribosomi eucariotici a 80S. La parete cellulare delle cellule procariotiche presenta caratteristiche diverse rispetto a quella della cellula eucariotica. Presenza di uno o pi plasmidi nelle cellule eucariotica che nelle eucariotiche sono assenti.

Tipi morfologici. COCCHI - Forma sferica - Diplococchi: sono 2 cellule batteriche messe insieme - Streptococchi: catenelle da 4 a 20 cellule batteriche (divisione su un solo piano) - Tetradi: divisione su due piani - Sarcine: divisione su tre piani che da luogo a gruppi di 8. - Stafilococchi: ammucchiamento di numerosi batteri. 3

BACCILI - Forma bastoncellare - Si ritrovano pi frequentemente isolati ma possono dare luogo a corte catene cellulari. SPIRILLI - Forma spiraliforme - Per lo pi isolati BATTERI A FORMA QUADRATA - Si ritrovano nelle aree ad alta concentrazione salina - Non patogeni per luomo Concetto di Pleiomorfismo: cambiamento della forma microbica allinterno di una specie o ceppo batterico dovuto a stress come ad esempio la carenza di cibo.

Metodi di indagine. Microscopio Ottico - Max ingrandimento: 1000 volte - Non si osserva la struttura batterica ma solo qualche incluso Microscopio elettronico a contrasto di fase - Sfrutta la differente trasparenza delle proteine che compongo il batterio - Immagine bidimensionale Microscopio elettronico a scansione - Immagine tridimensionale

Membrana Plasmatica Struttura: - Doppio strato fosfolipidico con spessore 80 - Sono inserite proteine intrinseche ed estrinseche - Glucidi di membrana. Funzioni - Trasporto di nutrienti .) diffusione passiva (H2O, O2) .) diffusione facilitata (tramite proteine carriers ma senza spesa energetica) .) trasporto attivo (tramite proteine carriers con spesa energetica e contro gradiente di concentrazione. - Respiratoria (catena respiratoria e trasporto di e-) - Trasporto di tossine che necessitano di essere espulse dalla cellula - Formazione della parete cellulare (ospita enzimi coinvolti nella costruzione della parete cellulare). - Siti di sintesi per il DNA (mesosomi) che favorisce cono lancoraggio della molecola di DNA quando viene sintetizzata. - Racchiudere e confinare il contenuto cellulare.

Parete cellulare Funzioni - Protezione del batterio e della membrana cellulare dallambiente esterno - Permette al batterio di assumere forme diverse da quella sferica - Permette ai batteri di riunirsi in colonie - Permette ladesione allospite 4

Ha un ruolo nella fagocitosi perch espone gli antigeni Ha un ruolo nel processo infiammatorio (gram -) in quanto in grado di rilasciare endotossine - Permette al batterio di non lisare anche in soluzioni ipertoniche che porterebbero fuoriuscita di acqua dal batterio e di conseguenza il suo collasso. Struttura - Due tipi di parete cellulare: gram + o a seconda della struttura della parete cellulare. - Pectidoglicano: il componente fondamentale per tutti .) costituito da diversi strati di catene polisaccaridiche unite da catene peptidiche con legami 1,6 e 1,4 .) componente proteica .) componente glucidica: acido N-acetilmuramico alternato con N-acetilglucosamina. - Batteri gram + .) il pectidoglicano costituisce il 50-60 % dellintera parete .) il resto fatto dallacido teicoico - Batteri gram .) strato di pectidoglicano soltanto il 5-10 % della parete .) la membrana esterna, alloggiata esternamente, costituisce la restante parte. .) Tra pectidoglicano e membrana esterna: periplasma, uno spazio in cui si accumulano le sostanze esterne da modificare prima della loro entrata nella cellula. - Struttura della membrana esterna .) doppio strato fosfolipidico come la membrana plasmatica .) contiene proteine (porine) con funzioni di trasporto .) contiene molecole lipopolisaccaridiche (endotossine) con la parte lipidica (lipide A), a cui va imputata la tossicit, disciolta nel dilayer fosfolipidico e la componente saccaridica libera allesterno. Vengono tuttavia liberate insieme. .) la membrana esterna collegata al pectidoglicano da lipoproteine. - Lisozima .) degrada la parete cellulare attaccando i legami 1,4 .) contenuto in tutti i fluidi umani ad eccezione di urina, sudore, liquidi cefalorachidiano. La parete cellulare determina la sensibilit di un batterio agli antibiotici.

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Ciglia o Flagelli. Struttura proteica formata in tutti i batterei dal polipeptide flagellina che costituisce un antigene non timo dipendente. Dimensioni: - spessore: 0,1 0,2 m - lunghezza: 6 7 m Funzione: permettere lo spostamento del batterio in zone a maggior concentrazione di : - cibo (chemiotassi) - luce (fototassi) - aria (aerotassi) Morfologia: - monotrico (1 solo) - lofotrico (tutti addensati ad un polo) - anfitrico (ai due poli estremi) - peritrico (originati lungo tutto il perimetro del batterio) Formato da: - filamento 5

uncino corpo basale (da cui origina) .) corpo basale o blefaroblasto .) origina al di sotto della membrana plasmatici .) il contatto con il citoplasma gli permette di recuperare prontamente ATP .) passa i successivi stati della parete cellulare e si ritrova al di fuori del batterio. Filamenti assiali: - si ritrovano nelle spirochete - localizzate al di sotto della membrana citoplasmatica - lassenza di attrito tra filamento assiale e ambiente esterno permette alla spirocheta di muoversi pi rapidamente. Fenomeno della sciamatura: nei batteri cresciuti in coltura si assiste a spostamento dovuto alla presenza dei flagelli.

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Pili o Fimbrie Strutture filiformi di tipo proteico costituite da diverse proteine ognuna delle quali costituisce un differente antigene. Dimensioni: 0,2 0,3 mm (molto pi corte dei flagelli). Funzioni: - pili sessuali .) nei gram .) da 1 a 3 .) trasporto di DNA da un batterio ad un altro durante la coniugazione - pili comuni o adesivi .) nei gram + e nei gram .) numerosi, originano da tutta la superficie cellulare .) permettono ladesione e lancoraggio ai tessuti Partono dal citoplasma al di sotto della membrana plasmatici o passano in successivi strati di parte cellulare.

Capsula o Strato Mucoso Sono EPS (Extracellular Polymeric Substances) Si parla di: - capsula se aderisce tenacemente alla parete - strato mucoso se ladesione alla parete pi lassa. Natura polisaccaridici e pi raramente proteica. Funzioni: - adesione al substrato o tra batteri stessi - inibizione della fagocitosi - antigenica, in quanto in grado di promuovere la produzione di anticorpi anticapsula. Costituisce un fattore di virulenza: maggiore lo stato capsulare, maggiore la virulenza del batterio. Non si colora con nessuna colorazione; si colora solo il batterio. Se coltivati in vitro i batteri perdono la capsula perch non serve pi un ostacolo alla replicazione

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Sporulazione e germinazione. Non un sistema riproduttivo ma un CICLO REPLICATIVO che permette al batterio di sopravivere anche in condizioni avverse. La moltiplicazione batterica normale avviene per fissione: - Viene attuata dal batterio in fase vegetativa - Fasi: .) duplicazione del DNA .) formazione di un setto trasverso (parete trasversale) .) formazione di due cellule separate La germinazione si verifica se subentrano condizioni si stress quali: - carenza di cibo - carenza di H2O - pH alcalini - alte concentrazioni di sale - alte temperature Fasi della sporulazione: - Il DNA batterico si distende longitudinalmente al batterio. - Una parte della membrana plasmatica del batterio si invagina e racchiude parte del DNA batterico (inizio prespora). - La prespora in formazione viene circondata da una seconda membrana plasmatici. - Tra le due membrane plasmatiche si forma una corteccia costituita da dipicolinato di calcio, un pepcidoglicano che gli conferisce resistenza alle alte temperature. - Sopra la corteccia vengono disposti strati di peptidi impermeabili allacqua. - Lo sporangio viene listato e la spora liberata. Fattori di resistenza della spora - dipicolinato di calcio .) resistenza alle alte temperature .) sterilizzazione raggiunta a 121C, 15, 15 psi. - peptici con ponti disolfuro .) resistenza allacqua e ai disinfettanti in essa disciolti Morfologia dello sporangio - Sporangio a Battridio: la spora non deforma il corpo dello sporangio.

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Sporangio a Clostridio: La spora deforma il corpo dello sporangio.

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Sporangio a plettridio: La spora si dispone a uno dei due poli dello sporangio deformandolo.

Metabolismo della spora - Vita vegetativa mantenuta al minimo .) assenza di sintesi proteica .) assenza di un metabolismo - La spora pu sopravvivere per moltissimi anni. - Nella forma sporadica sono attivati geni per la produzione di anti-antibiotici che conferiscono resistenza alla spora contro gli antibiotici. - Uneventuale aggiunta di acqua, nutrienti o uno shock termico, provocano la germinazione. Fasi della germinazione - Attivazione dei geni per la germinazione. - La cellula assume acqua dallesterno. - La corteccia si rompe e migra ai poli dove viene confinata dalla crescita cellulare. - Perdita di dipicolinato di calcio e peptidi che toglie alla spora la resistenza a temperatura ed acqua. - Attivazione del metabolismo vegetativo normale (il ch richiede un po di tempo).

Colorazioni.COLORAZIONE SEMPLICE Metodologia: - Preparare lo striscio di materiale da colorare - Evaporazione dellacqua - Fissazione al calore - Aggiunta di un colorante basico a scelta (violetto di genziana) per 2 minuti - Risciacquo in acqua - Goccia di olio di cedro (stesso indice di rifrazione) - Osservazione al microscopio ottico a massimo ingrandimento. Dallosservazione il medico pu comprendere se si tratta di un cocco, di un bacillo o di una spirocheta, se tende a raggrupparsi, ecc Tale informazioni permetto al medico di avviare un primitivo schema terapeutico. COLORAZIONE DIFFEREBZIALE DI GRAM Metodologia: - Preparare lo striscio di materiale da colorare. - Evaporazione dellacqua. - Fissazione al calore. .) il calore denatura le proteine favorendo ladesione del batterio al vetrino. - Violetto di genziana (2 minuti). 8

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.) Coloro sia la parete del batterio sia il suo interno applicandosi sulle rispettive proteine. Risciacquo con acqua per togliere leccesso di colorante. Liquido di Lugol (soluzione iodo-iodata di potassio) per 2 minuti. .) Il liquido di Lugol penetra allinterno del batterio dove, con il cristal violetto, forma un complesso violetto-iodio che, a causa del suo ingombro sterico, non pi in grado di fuoriuscire dal batterio, rimanendovi intrappolato allinterno. - Risciacquo con acqua. - Etere Acetone (95% + 5%). .) Il complesso violetto-iodio, insolubile in acqua, invece facilmente solubile in alcool, quindi ha la possibilit, disciogliendosi, di fuoriuscire dal batterio, qualora questo sia gram -. .) Nei batteri gram infatti, il complesso violetto-iodio fuoriesce. Non sono chiari i meccanismo molecolari che determinano luscita del colorante primario dal batterio. Una prima ipotesi prevede che laggiunta di etere, sciogliendo i lipidi presenti nella parete cellulare, provochi nella stessa dei buchi attraverso cui il complesso violettoiodio potrebbe essere perso. Tali buchi non si formerebbero nella parete cellulare dei gram + perch meno ricca di lipidi. Una seconda ipotesi vede nelletere il responsabile di un raggrinzimento della parete cellulare dei batteri gram + che impedirebbe cos al colorante primario di uscire. Tale raggrinzimento non si verificherebbe nei gram per cui il colorante pu uscire. - Fucsina basica per 30-45 secondi. .) Il colorante secondario viene assunto dai batteri gram che hanno perso quello primario, mentre i batteri gram + mantengono il colorante primario, respingendo il secondario. - Risciacquo con acqua - Asciugare allaria - Goccia di olio di cedro con ugual indice di rifrazione. - Osservazione Dallosservazione si traggono informazioni circa la forma (come dalla colorazione semplice), inoltre si pu discriminare tra batteri gram + (blu) e batteri gram (rossi). Lassunzione di tali due informazioni permette al medico di determinare con buona approssimazione lantibiotico da somministrare.

COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI ZIEHL-NEELSEN. Metodologia - Preparare lo striscio del materiale da colorare. - Fare evaporare lacqua. - Fissare alla fiamma. - Aggiungere fucsina fenilata (fucsina basica + fenolo 5%) a caldo. .) Ci favorisce la penetrazione del colorante a livello dei lipidi della parete cellulare non direttamente esposti in superficie. .) Il riscaldamento deve perdurare fino alla comparsa dei primi vapori (tempo di attesa 1 minuto circa). .) Tale procedura pu anche essere fatta a freddo aspettando dalle 24 alle 48 ore. - Risciacquo con acqua. - Aggiunta di H2SO4 2% per 1 minuto. .) Nella maggior parte dei batteri laggiunta di H2SO4 provoca la fuoriuscita del colorante primario; il batterio potr cos acquistare il colorante secondario.

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.) I batteri superiori presentano uno spesso strato lipidico che impedisce lattacco dellacido conservando il colorante primario ed evitando di assumere quello secondario. - Risciacquo con acqua. - Aggiunta di blu di metilene (3 minuti). - Risciacquo con acqua. - Goccia di olio di cedro a pari indice di rifrazione. - Osservazione. Allosservazione i micobatteri (agente etiologico della tubercolosi) appaiono colorati di rosso perch provvisti di lipidi nella parete cellulare che gli fanno acquisire il colorante a caldo ma che impediscono allacido di attaccare. Tutti gli atri appaiono colorati in blu perch non hanno assunto il colorante secondario. Con questa tecnica si possono colorare anche le spore. La corteccia dello spore, formata da uno spesso strato lipidico, a caldo assume la fucsina basica ma non pi in grado rilasciarla anche se attaccata dagli acidi. Il batterio che accoglie la spora (sporangio) si decolora con lacido e assume il blu di metilene, per cui appare blu.

Metabolismo BattericoGeneralit sul metabolismo batterico. Lo scopo del metabolismo batterico quello di produrre energia (sottoforma di molecole di ATP) da impiegare nelle attivit vitali del batterio quali la sintesi molecolare (anabolismo), il movimento, il trasporto dei nutrienti. Alcuni batteri ricavano energia dalla luce o da elementi inorganici (Fe e S) ma non sono patogeni. I batteri patogeni ricavano energia dalla demolizione (catabolismo) di molecole organiche (ricche di protoni e di elettroni) quali zuccheri. Nella demolizione delle molecole organiche si determina il rilascio di elettroni e protoni che vengono trasferiti ad altre molecole organiche o inorganiche tramite molecole trasportatrici quali il NAD+. La molecola organica demolita cede elettroni ossidandosi (donatore) mentre la molecola organica che li acquista si riduce (accettare). Tale trasferimento di elettroni genera unenergia che viene immagazzinata nei legami ~ dellATP due differenti modalit: - Fosforilazione a livello del substrato: lADP acquisisce il gruppo fosfato presente in unaltra molecola organica che ne rimane priva. Si forma cos ATP. G~PO4 + ADP ATP + G - Fosforilazione ossidativi: lADP acquisisce una molecola di fosfato inorganico libera immagazzinando cos lenergia liberata nella catena respiratoria. 10

Fermentazione. Processo metabolico di produzione di energia (ATP) attraverso trasferimento di elettroni da una molecola organica che si ossida (donatore) ad una molecola organica che si riduce (accettore). Processo anaerobico: lossigeno non viene coinvolto. Glicolisi: - Glucosio (molecola di partenza) - Trasformazione del glucosio in 2 molecole a 3 atomi di carbonio con consumo di 2 ATP: .) diidrossiacetonfosfato (DHAP) gliceraldeide 3P .) gliceraldeide 3P - Le due molecole di gliceraldeide 3P vengono trasformate in due molecole di fosfoenolpiruvato con: .) produzione di 2 ATP per fosforilazione a livello del substrato .) riduzione di NAD+ a NADH2 - Le due molecole di fosfoenolpiruvato vengono trasformate in due molecole di acido piruvico .) produzione di 2 ATP per fosforilazione a livello del substrato. - Lacido piruvico accetta riducendosi i due protoni ed elettroni e si trasforma in acido lattico. - Resa energetica: 2 ATP = (-2 ATP + 4 ATP = 2 ATP) Altre vie di fermentazione del glucosio: - via dei pentoso fosfati - via di Entner-Doutoroff Possono essere fermentate anche molecole differenti dal glucosio come amminoacidi, purine, ecc

Respirazione. Processo biochimico-metabolico di produzione di energia nel quale una molecola organica ricca di protoni ed elettroni (glucosio) si ossida completamente e gli elettroni liberati vengono raccolti da una molecola trasportatrice quale NAD+ FAD+ che scaricano gli elettroni sulla catena respiratoria. Gli elettroni percorrono la catena respiratoria al termine della quale presente laccettore finale di elettroni che pu essere: - Ossigeno che si riduce ad H2O (respirazione aerobica) - Nitrati, solfati e carbonati in grado di accettare elettroni e ridursi (respirazione anaerobica). La prima parte della respirazione: la glicolisi: - Come la glicolisi fermentativa: .) parto dal glucosio .) spendo 2 ATP per romperlo in 2 molecole a 3 atomi di carbonio .) produco 4 ATP per fosforilazione a livello del substrato .) ottengo piruvato - Al contrario della glicolisi fermentativa: .) i due FADH2 prodotti scaricano gli elettroni sulla catena respiratoria e non pi sul piruvato. .) il piruvato non diventa pi lattato ma perde un carbonio come CO2 diventando Acetile .) lAcetile si lega al CoA e diventa acetil-CoA La seconda parte della respirazione: il ciclo di Krebs: - Produzione di molti NADH2 e qualche FADH2. 11

- Queste molecole trasportatrici di elettroni scaricano sulla catena respiratoria gli elettroni. Catena respiratoria: - Situata nella membrana plasmatica. - Formata da molecole che si ossidano e si riducono alternativamente trasferendosi gli elettroni. - Si formano 3 siti in cui il salto energetico tale da consentire la fosforilazione ossidativa di ADP ad ATP (i siti diventano due se il trasportatore FAD+). - La liberazione di energia in quantit discrete permette di immagazzinare lenergia in legami P~ADP senza che la cellula bruci. Resa energetica: 38 ATP.

Classificazione batterica in base al metabolismo. AEROBI OBBLIGATI: - Cresce solo con O2 a 1 atm e 20% di pressione parziale del gas. - Produzione di prodotti tossici per il batterio come H2O2 e superossidi ma possiedono catalasi e superossido dismutasi in grado di neutralizzare rispettivamente i due agenti tossici per la cellula. - Applicano abitualmente la respirazione aerobica. MICROAEROFILI: - Cresce solo con O2 a 0,2 atm e 4% di pressione parziale del gas. - Producono anchessi prodotti tossici come H2O2 e superossidi e in loro risposta dispongono di catalasi e superossido dismutasi. Questi ultimi prodotti vengono prodotti ma in quantit ridotte quindi se c poco ossigeno, e quindi pochi prodotti tossici, questi riescono ad essere neutralizzati. Se le quantit di ossigeno presenti aumentano, aumenteranno con esso anche la produzione di prodotti tossici per i quali gli antidoti si renderanno insufficienti con conseguente morte cellulare e inibizione alla crescita. - Respirazione aerobica ANAEROBI FACOLTATIVI: - Crescono sia in presenza che in assenza di ossigeno. - Se lossigeno presente applica la respirazione aerobica completa. Se lossigeno assente attua la fermentazione per cui il glucosio viene ossidato ad acido lattico. Possono attuare anche una respirazione anaerobica. - Se attuano la respirazione aerobica (in presenza di ossigeno che rappresenta la condizione ottimale) sono in grado di produrre catalasi e superossido dismutasi. ANAEROBI OBBLIGATI: .) Tempo di Germinazione: Tempo necessario a raddoppiare il numero di elementi batterici presenti in

Crescita BattericaCurva di crescita Grafico che, mettendo in relazione la concentrazione batterica nel tempo di una coltura batterica effettuata in un terreno completo, rende conto delle caratteristiche e delle fasi della crescita batterica tipiche di ogni specie. 12

FASE DI LATENZA: - I batteri appena coltivati si adattano al terreno. - Non c divisione cellulare ma i batteri si adattano a tale evento quindi osserviamo: .) aumento di volume .) sintesi proteica - Eventuale sintesi di enzimi inducibili (es. della -galattosidasi per E. Coli). - Al termine della latenza la velocit di crescita si incrementa. FASE ESPONENZIALE: - Corrispondenza di tipo lineare tra log2 dei batteri e tempo dovuta a: .) divisione dei batteri secondo fissione binaria (asessuata) .) la crescita batterica segue quindi una progressione geometrica. - Non tutti i batteri in tale fase sono in divisione poich la crescita sfalsata nel tempo. .) Tempo di Germinazione: Tempo necessario a raddoppiare il numero di elementi batterici presenti in un dato istante. Corrisponde al tempo necessario per una duplicazione batterica. - La velocit di crescita influenzata da: .) specie batterica .) temperatura .) ricchezza di nutrienti nel terreno. FASE STAZIONARIA: - Equilibrio tra i batteri che muoiono e quelli che vanno incontro a divisione. - Determinato da: .) esaurimento dei nutrienti .) accumulo di sostanza tossiche (capaci ad esempio di fare cariare il pH) .) affollamento esaurimento O2 - Pu essere prolungata: .) a 4C .) per congelamento o liofilizzazione. Nella fase esponenziale si ottenuta una corrispondenza lineare perch la crescita dei batteri nel tempo non era sincronizzata. Se si sincronizza, facendo coincidere per tutti i batteri della cultura di crescita, divisione e latenza, otteniamo un grafico a gradini che indica che tutti i batteri ad un certo istante si dividono incrementando ad un solo istante il loro numero. La sincronizzazione della crescita si riesce a mantenere solo per pochi cicli riproduttivi poi viene persa. 13

Nutrienti ACQUA - Trasporto di nutrienti allinterno della membrana perch li discioglie - Idrolizzare le molecole CARBONIO - Utilizzato per ricavare energia da C6H12O6 - Liberato come CO2 nellaria - Produzione di molecole organiche molto complesse. AZOTO - Utilizzato per la sintesi di aminoacidi, purine e pirimidine - Recuperato da: .) ammoniaca NH3 .) nitrati e nitriti (NO3 NO2) .) azoto gassoso N2 ZOLFO - Fornito come solfato di ammonio, convertito in acido solforico e impiegato per la sintesi dellaminoacido cisteina. FOSFORO - Fornito come fosfato inorganico e impiegato per sintetizzare DNA, RNA, ATP IONI INORGANICI - Mg++, Mn++, Fe++, Na+, K+, Mo. - Funzioni: .) cofattori di enzimi .) conservazione di energia .) trasporto di elettroni.

Fattori fisici che influenzano la crescita. PH - La maggior parte dei batteri cresce ad un pH compreso tra 6 e 8. - Esistono tuttavia acidofili e basofili che crescono meglio a pH acidi o basici. TEMPERATURA - Ogni batterio ha una temperatura di crescita ottimale. - Psicrofili: 14

.) crescono tra i 10 e i +20 C .) nellacqua o nel terreno .) nelle zone temperate ma colonnina anche zone fredde. - Mesofili: .) Tra i 30 e i 37 C .) Lo sono la maggior parte dei batteri patogeni per luomo. - Termofili: .) Tra i 40 e i 75 C .) Sono per lo pi archebatteri abituati a condizioni estreme. .) Nelle acque termali solforose CONCENTRAZIONE SALINA - La concentrazione salina determina la generazione di una differenza di pressione osmotica che pu fare scoppiare il batterio o lo pu fare svuotare. - Batteri alofori: .) Crescono a concentrazioni saline elevate .) Lo Stafilococcus Aureus resiste bene a diverse concentrazioni saline per questo pu provocare infezioni alimentari. .) Conservazione di cibo sotto sale. OSSIGENO

Terreni di coltura Pu essere liquido o solido. - liquido brodo - solido brodo + agar .) Agar: carboidrato estratto dalle alghe marine che non viene degradato dai batteri e che quindi pu essere aggiunto al terreno do coltura senza che funga da nutriente. .) Passa dal sol a gel a 95C e da gel a sol a 40C. Avere temperature di gelazione e salificazione cos distanti perch mi permette di scioglierci dentro un sacco di sostanza. .) Posso coltivarci dentro tutti i batteri (psicrofili, termofili) Composizione di un terreno di coltura generico: - Dado (estratto di carne) - Peptoni: insieme di proteine parzialmente digerite. - In un terreno generico non crescono tutti i batteri Terreni speciali: - Terreno sintetico composizione chimica definita. - Terreno arricchito o supplementato: .) terreno in cui vengono aggiunte sostanza nutrienti (es. agar sangue / aggiunta di sangue defibrinato di cavallo). .) impiegato se una specie batterica non cresce in un terreno generico. - Terreno selettivo: .) consente la crescita di una sola specie batterica rispetto alle altre. .) si ottengono agendo su: 1. nutrienti 2. pH 3. sali 4. O2 - Terreno Differenziale: .) Nonostante consenta la crescita di pi di una specie batterica, consente di riconoscerla attraverso lidentificazione del colore o di altre caratteristiche macroscopiche. 15

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Terreno di arricchimento: .) Impiegato per inibire la crescita di una specie batterica indesiderata che potrebbe sopraffare numericamente la specie batterica che si intende coltivare. Terreni di trasporto: .) preserva il campione fino allarrivo in laboratorio .) contengono tamponi salini che inibiscono la crescita batterica

Coltivazione di anaerobi Giara per anaerobi o Gas Pack - Contenitore in policarbonato chiuso ermeticamente. - Allinterno un involucro di alluminio contente H2O - Lacqua contenuta nellinvolucro di alluminio forma H2 e CO2. - Il platino presente nel coperchio catalizza la reazione di H2 e O2 a formare H2O creando un ambiente anaerobio. Bio-Bag - Busta gas impermeabile contenente una fiala di gas e un indicatore. - Rompendo questa fiala di gas questo si libera, si elimina O2 e si forma un ambiente anaerobio Cappa per anaerobi. - Cappa in plastica con guanti per lavorarci dentro.

Tecniche per lisolamento batterico Coltura pura isolare una singola specie batterica da una coltura mista. Semina su piastra - Distribuzione di una coltura batterica mista con unansa sterile su una piastra Pedri. - La distribuzione sulla piastra permette ai batteri di distanziarsi gli uni dagli altri e di crescere uno per volta separati in aree distanti. Semina per inclusione - Diluire la cultura mista iniziale. - Versarlo sul fondo di una piastra Pedri vuota e sterile. - Riempire la piastra con agar liquido. - Agitare. - Le colonie si sviluppano sia sulla superficie della piastra sia nel suo spessore Coltura su filtro - Filtrare il campione in una membrana filtro. - Porre la membrana in terreno. - Permette di conoscere il numero di microrganismi presenti semplicemente contando le colonie sviluppatesi.

Terreni per isolamento primario TIOGLICOLATO - Agar e acido tioglicolico - Consente la crescita di anaerobi grazie allinstaurarsi di un ambiente riducete AGAR SANGUE - Consente la crescita delle specie batteriche pi esigenti. - Valutazione dellattivit emolitica di un microrganismo FENITELILALCOOL AGAR 16

- Crescono i gram + e muoiono i gram -. EMB AGAR - Crescono i gram - e muoiono i gram +. AGAR CIOCCOLATO - Agar + sangue scaldato - Cresce solo Neisseria Haemophilus.

Metodi di prelievo e trasporto di un campione microbiologico in laboratorio Prelievo: - Va effettuato quando si sicuri che ci sia il microrganismo. - Va effettuato dove si sicuri che ci sia il microrganismo - Va tenuto conto di eventuali terapie in corso. Trasporto: - Se possibile coltivare subito il microrganismo ricercato. - Se non fosse possibile occorre fornirsi dei metodi migliori per conservare il microrganismo intatto fino allarrivo in laboratorio. - Non esiste un metodo universale per il trasporto perch ogni microrganismo ha esigenze culturali differenti rispetto allaltro - Per questo occorre avere almeno unidea di quale tipo di microrganismo si vuole ricercarne la presenza. - Esistono in commercio terreni di trasporto. Esame microscopico primario in laboratorio: - Da subito unindicazione almeno generale (presenza di inclusi cellulari, ecc) - Questo determina la scelta di un certo tipo di semina. Esame culturale: - Se cerco il microrganismo i un tessuto normalmente sterile (sangue, liquor) impiego un terreno culturale che fa crescere quanta pi roba possibile. - Se uso campioni normalmente contaminati (feci), uso un terreno che mi selezioni in qualche modo il microrganismo di cui voglio indagare al presenza. - Per le urine la densit con cui presente il microrganismo sintomo o meno di infezione (a concentrazioni maggiori di 105 il test positivo). - Se cerco un fungo uso il terreno di Sabourund.

Identificazione di un batterio Confronto del batterio sconosciuto X con il batterio conosciuto A: - X uguale o diverso da A? - Se X = ad A deve essere diverso da B, C, D, E Si considerano - aspetti morfologici - caratteristiche culturali - comportamento metabolico - composizione chimica (enzimi) - indicibilit antigenica - costituzione genetica Classificazione secondo due metodi - Gerarchica dando importanza ad alcuni aspetti rispetto ad altri. Considerare determinati caratteri prioritari rispetto ad altri pu condurre a schemi classificativi notevolmente differenti. 17

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Numerica che la classificazione odierna. Si opera una grande distinzione in gram + o . A tutte le altre caratteristiche si assegna lo stesso peso. Ogni batterio viene classificato in base al possesso di diversi caratteri ai quali viene assegnato per sempre lo stesso peso (assegnazione di codici numerici).

Conta cellulare Conta al microscopio - Distribuisco la soluzione microbica su una camera di Bunker. - Conto il numero di batteri per celletta e ne faccio la media - Conoscendo il volume do ogni celletta posso risalire alla concentrazione batterica della soluzione. - Occorre: .) aggiungere formalina per uccidere i batteri e impedire loro di muoversi .) attendere che tutti i batteri sedimentino per avere un unico piano focale Conta su piastra - Diluire la soluzione originale con soluzione fisiologica allo scopo di diminuire la concentrazione batterica - Prelievo di una quota di soluzione e distribuzione su piastra Pedri - La conta del numero delle colonie sviluppatesi sulla piastra relazionato al volume della quota prelevata e ai rapporti di diluizione fornisce il numero di batteri presenti in coltura. Spettrofotometro: - La torpidit di una soluzione microbica aumenta proporzionalmente al numero di batteri presenti - Lo spettrofotometro rivela lassorbanza o densit ottica e la mete in relazione con la concentrazione batterica della soluzione.

Genetica BattericaStruttura del cromosoma batterico. Unico A doppia elica Di forma circolare ma avvolto su se stesso per poter alloggiare allinterno del batterio. Non complessato con istoni Con forche di replicazione multiple

Operoni Raggruppamento di geni la cui espressione produce proteine diverse ma adibite tutte ad un unico scopo o funzione. Struttura di un operone: - Geni Strutturali la cui sintesi produce proteine funzionali per la cellula. - Operatore non viene trascritto ma in grado di legare un eventuale repressore della sintesi; considerato come linterruttore delloperone.

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Promotore situato a monte delloperatore, lega la RNA polimerasi e d inizio alla sintesi. - Gene Regolatore situato esternamente alloperatore, responsabile della sintesi di un eventuale repressore. Lac-Operone: - Geni strutturali presenti: .) Z -galattosidasi dissocia il lattosio in glucosio e galattosio .) Y permeasi proteina per il trasporto intracellulare del lattosio. .) A transacetilasi permette limpiego di zuccheri diversi dal lattosio. - Se il lattosio non presente: .) il gene regolatore produce il repressore .) il repressore si lega alloperone impedendo la sintesi della RNA polimerasi .) i geni strutturali per limpiego del lattosio non vengono trascritti. - Se il lattosio presente: .) il gene regolatore continua a produrre il repressore .) il repressore si lega al lattosio formando un complesso molecolare incapace di legarsi alloperatore .) I geni strutturali per limpiego del lattosio possono essere prodotti dalla RNA polimerasi e il lattosio, di conseguenza, viene impiegato.

Operone Triptofano: - Geni strutturali presenti: .) da A ad H enzimi per la sintesi del triptofano. - In presenza di triptofano nel terreno: .) il gene regolatore produce il repressore .) il repressore si lega al triptofano che gli fa da corepressore e solo cos pu legarsi alloperatore. .) la RNA polimerasi non pu trascrivere i geni per la produzione del triptofano - In assenza di triptofano: .) il gene regolare produce il repressore .) Lassenza del corepressore triptofano impedisce al repressore di legarsi alloperatore. .) la RNA polimerasi ha libero accesso alla sintesi degli enzimi per la produzione di triptofano.

Mutazioni Cambiamenti di un carattere specifico di un batterio determinato da alterazioni del suo materiale genetico. Insorgono con frequenza 10-7 10-9 nei batteri anche se esistono zone di materiale genetico denominate hot spots per le quali la frequenza di mutazione aumenta salendo a 10-11. Mutazioni spontanee: - Dovute a modificazioni elettrochimiche (tautomeria chetoenolica) delle basi azotate al momento della duplicazione del DNA. - Dovute allinserimento delle sequenza dinserzione (che hanno la capacit di cambiare di posizione allinterno del DNA) in segmenti di codice genetico che codificano per proteine funzionali o strutturali. Mutazioni indotte: 19

Dovute ad agenti fisici: .) Raggi X e g alto contenuto energetico formazione di radicali liberi rompono le molecole di DNA spezzandole. .) raggi UV producono dimeri di timina. - Dovute ad agenti chimici .) HNO3 e acridine provocano errori nellaccoppiamento di basi Possiamo ottenere tre tipi di mutazioni: - Mutazioni di resistenza ad un antibiotico: .) la mutazione ha reso il batterio resistente a certi antibiotici. - Mutanti auxotrofi: .) batteri mutanti che hanno perso la capacit di sintetizzare certi enzimi. .) occorre quindi fornire loro questi enzimi. .) possono essere individuati tramite replica plating su velluto in un terreno minimo. .) i ceppi da cui derivano e che sono completi sono definiti prototrofi. - Mutanti temperatura sensibile: .) la mutazione ha legato lattivit biologica del batterio ad una determinata temperatura. La duplicazione cromosomica precede la divisione citoplasmatica; di conseguenza: - Se la mutazione precedente alla duplicazione cromosomica entrambe le cellule presentano la mutazione. - Se la mutazione postuma alla duplicazione cromosomica, solo una delle due cellule la presenta.

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Trasformazione Metodo di trasferimento di geni tra un batterio donatore ed uno ricevente consistente nella cattura di segmenti di DNA estranei da parte del batterio ricevente. Si verifica solamente in certe specie batteriche che hanno acquistato competenza, avvero che sono provviste di recettori capaci di legare le molecole di DNA libere. Fasi: - Legame del DNA .) deve essere a doppio filamento .) anche di specie batteriche differenti - Internalizzazione del DNA - Riduzione del DNA a doppio filamento introdotto a DNA a singolo filamento. - Integrazione del DNA .) il DNA viene inserito nel cromosoma batterico attraverso un evento di ricombinazione .) vale solo per le sequenza omologhe. - Distruzione del DNA non omologo a quello ricombinativi attraverso nucleasi Esperimento di Griffith: - Produzione di capsula (virulenza) da parte di ceppi non capsulari (non virulenti) quando batteri vivi non capsulari vengono messi insieme a batteri capsulari ma morti. - Dimostra che nei batteri si pu aver passaggio di materiale genetico da una specie allaltra. - Mette in luce per la prima volta la trasformazione.

Coniugazione

Metodo di trasferimento di geni tra un batterio donatore (F+) e un batterio ricevente (F-) mediato attraverso il fattore F. Fattore F o Fattore Sessuale o Fattore di Fertilit: 20

- Segmento di DNA a doppia elica, circolare, esterno al cromosoma batterico circolare. - Per questo dotato di autonomia replicativa. - Permette la produzione di pili sessuali nella cellula che lo possiede (F+) Pili sessuali: - Si produce nella cellula F+ ad opera del fattore F. - Permette lattacco della cellula donatrice alla ricevente. - Trasferisce materiale genetico da F+ a F- trasformando cos F- ad F+ per acquisizione (trasferimento) del fattore sessuale dopo che sia stato duplicato nella cellula donatrice. Nel batterio ricevente il fattore F pu: - Rimanere libero nel citoplasma formando un plasmide indipendente dal cromosoma batterico, come lo era nella cellula di origine. - Integrarsi nel cromosoma batterico, trasformando la cellula in HFR (High Frequency of Recombination) .) una cellula F+ .) forma pili sessuali .) trasferisce materiale genetico per coniugazione ma spesso non trasferisce il fattore F ch in coda al materiale genetico trasferito. Il pilo sessuale tra cellula e cellula permane per un tempo troppo breve per cui, passa gran parte del DNA ma non il fattore F che rimasto in coda. .) il materiale genetico inglobato va incontro a ricombinazione. Scoperto da Landemberg: - Ceppo batterico A-B-C+D+ in coltura minima: .) avrebbe bisogno di A e B per crescere .) coltivato isolatamente non cresce. - Ceppo batterico autotrofo complementare A+B+C-D- in coltura minima: .) avrebbe bisogno di Ce D per crescere .) coltivato isolatamente non cresce. - Coltivati insieme i due ceppi crescono senza aggiungere nulla la terreno e le specie si trasformano in A+B+C+D+. - Perch? .) mutazioni retrograde? NO incompatibilit con il numero di mutanti! .) Trasformazione o Trasduzione? NO! .) stata la coniugazione!!!

Trasduzione Metodo di trasferimento di materiale genetico tra batterio e batterio che sfrutta i virus batteriofagi (che infettano i batteri) e il loro ciclo lisogeno. Ciclo lisogeno: - Il batteriofago si attacca al batterio. - Trasferimento di materiale genetico virale al batterio (infezione). - Replicazione e traduzione del materiale genetico virale utilizzando la macchina biosintetica batterica. - Il materiale genetico formatosi viene chiuso in numerose capsule formando cos i virioni. - Il batterio si rompe, i virioni fuoriescono e infettano altre cellule. Durante la produzione dei virus il DNA batterico viene rotto in tanti pezzi pi piccoli. Se nella capsula virale viene chiuso uno di questi pezzi di genoma batterico anzich di quello virale, ecco che il virus diventer un mezzo di trasferimento di materiale genetico da un batterio ad un altro. 21

In caso di infezione il batterio ricever il materiale genetico di un batterio nonostante ad infettarlo sia stato un virus.

Plasmidi Molecola di DNA a doppio filamento indipendente dal cromosoma batterico. Possono essere: - Coniugativi possiede i geni per la formazione di un pilo sessuale (Fattore F) - Non coniugativi non possiede il Fattore F per cui si trasferiscono solo tramite processi trasduttivi o trasformativi. Plasmidi R: - Resistenza agli antibiotici - Molto diffuso perch: .) un elemento coniugativi (contiene il Fattore F) .) formato da trasposoni, sequenza di DNA con facile trasferibilit.

Sterilizzazione e DisinfezioneTerminologia. STERILIT: Assenza di qualsiasi forma microbica vitale su un oggetto. - Concetto assoluto: un oggetto sterile o non lo . - Possono essere contenute forme microbiche ma morte. SEPSI: Distruzione di un tessuto vivente da parte si un microbo accompagnato da unintensa reazione infiammatoria. DISINFEZIONE: Distruzione dei microrganismi patogeni allo stato vegetativo; non prevede: - Distruzione di microrganismi non patogeni - Distruzione di microrganismi patogeni presenti come spore.

Metodi fisici.CALORE Calore umido - Tempi di distruzione .) batteri in forma vegetativa: 30 min a 60C oppure 8 min a 80C .) muffe e lieviti vegetativi: 30 min a 60C oppure 8 min a 80C .) virus: 30 min a 60C oppure 8 min a 80C .) batteri sotto forma di spore: 15 min a 121C - Bollitura: .) non sporicida .) tutte le forme vegetative vengono per comunque distrutte. - Autoclave o vapore sotto pressione: .) metodo elettivo .) 15 min a 121C a 15 psi distruggono qualsiasi spora. - Pastorizzazione 22

.) si applicano temperature non troppo alte allo scopo di distruggere le forme vegetative di batteri che possono alterare le qualit organolettiche del liquido (latte). Calore secco (forno di casa): - Il calore agisce sulle proteine denaturandole - Il calore secco richiede pi tempo rispetto a quello umido - Tempi di sterilizzazione: .) 16 ore a 121C .) 2 ore a 160C .) 1 ora a 170C

FILTRAZIONE Impiego: - Ogni volta che il calore, denaturando le proteine, renderebbe inutilizzabile loggetto. - Liquidi - Aria: filtri HEPA per cappa a flusso laminare e camere sterili separano fino a 0,3 m con 99,97% di efficienza. - Preparazioni di soluzioni acellulari di tossine. - Determinazione delle dimensioni delle particelle virali.

ULTRASUONI Metodo di pre-sterilizzazione applicato allo scopo di rimuovere la materia interferente in oggetti da sterilizzare. RADIAZIONI Radiazioni UV - Agiscono formando dimeri di timina negli acidi nucleici, interrompendo la duplicazione del DNA e portando quindi il batterio a morte. - Poco usata perch: .) i microrganismi devono essere direttamente a contatto con i raggi; se sono schermati, causa la bassa penetranza dei raggi UV, non muoiono. .) problemi di esposizione per le persone. - Impiegate per abbassare la carica batterica in un ambiente attraverso lapplicazioni di lampade sul tetto perch: .) non colpiscono luomo .) laria calda sale verso lalto portando con se i batteri che vengono uccisi dalle lampade. Radiazioni ionizzanti (X e ) - Azione: .) diretta colpiscono il batterio e lo uccidono. .) indiretta formano perossidi tossici e radicali che attaccano il DNA spezzandolo. - Usate per sterilizzare confezioni gi chiuse come le siringhe.

Metodi chimiciFENOLO Non pi impiegato a causa delle sue propriet irritanti ed anestetiche. Ottima efficacia su saliva, feci, simili. 23

ALCOLI Efficace su tutto ma non sulle spore. Azione: - Denatura le proteine. - Sciogli i lipidi di membrana e gli involucri. ALOGENI Attivi perch inducono alogenazione o ossidazione delle proteine. Cloro: - Stato puro depurazione acque. - Ipocloriti a rilascio graduale sbiancanti - Candeggina (NaOCl) ottimo germicida. Iodio: - Germicida tra i pi impiegati su ferite e infezioni cutanee, strumenti operatori. - Non si diluisce i acqua ma in alcool dove da luogo a tinture. - Iodofori: sostanza contenenti iodio che offrono maggior stabilit ed un rilascio graduale dello oidio. TENSIOATTIVI Saponi: - Sali sodici o potassici di acidi grassi a lunga catena. - Rimuovono i germi attraverso unazione meccanica, emulsionando lo strato oleoso della pelle. - Alcuni possono contenere sostanze antibatteriche. Detergenti: - Sono agenti sintetici igienizzanti ad azione tensioattiva. - Anionici: .) come i saponi .) non hanno unazione disinfettante - Cationici: .) rimuovono i batteri perch attratti dalla polarit negativa della membrana dei batteri. .) non hanno azione sporicida. - Non ionici .) nessuna azione antibatterica. AGENTI ALCHILANTI Funzionano perch sostituiscono gli idrogeni delle molecole con gruppi alchilici. Formaldeide - In soluzione (formalina) un fissativo di campioni anatomici e istologici. - Molto irritante. Glutaraldeide: - Al 2% uccide ogni cosa. - Molto irritante. Ossido di etilene (ETO): - Richiede tempi molto lunghi per il raggiungimento della sterilit. - Urticante e tossico. - Esplosivo con laria si usa con CO2 e N2. METALLI PESANTI Cu e Ag inibiscono la crescita microbica. 24

Nitrati di argento usato in pomate come disinfettante per prevenire le infezioni della congiuntiva nei neonati

CLOREXIDINA

Chemioterapia.Caratteristiche generali degli antibiotici. I chemioterapici possono essere: - Sintetici: interamente costruiti in laboratorio. - Antibiotici: prodotti biologicamente da latri microrganismi. - Semisintetici: hanno un nucleo attivo prelevato da sostanze antibiotiche create naturalmente da altri microrganismi a cui vengono aggiunti code chimiche particolari che ne modificano e ne migliorano lattivit. Tossicit selettiva - Concetto introdotto da Herlic. - Un agente antimicrobico deve essere pi tossico per le cellule dellagente infettante che per quelle dellospite. Spettro antibatterico: - Ristretto lantibiotico pu agire solo su poche specie. - Largo lantibiotico pu agire su numerose specie sia Gram + che Gram Attivit batteriostatica: - Porta ad una inibizione temporanea della crescita batterica che pu riprendere appena venga allontanato lantibiotico (fenomeno reversibile) - Un batteriostatico non indicato ogni volta che il paziente abbia una sistema immunitario compromesso. Attivit battericidica: - Lantibiotico provoca alterazioni cellulari che non sono pi reversibili. - Molto spesso uno stesso farmaco pu avere attivit batteriostatica o battericidica a seconda delle differenti concentrazioni con cui viene somministrato. Combinazioni di antibiotici: - Al fine di allargare lo spettro di attivit (associo un antibiotico attivo sui Gram + e sui Gram -). - Per evitare linsorgenza di specie farmaco resistenti. Le mutazioni spontanee avvengono con una frequenza di 10-7. La somministrazione di un solo farmaco potrebbe favorire la selezione di eventuali specie mutagene resistenti al farmaco. Lassociazione di due differenti antibiotici, abbatte la frequenza di insorgenza di fenotipi batteriologici mutati a 10-14. - Associando differenti farmaci le concentrazioni di ciascuno diminuiscono e con essa anche la tossicit nei confronti delle cellule ospite. - Per agevolare una sinergia. Tuttavia, lassortimento di due farmaci, pu essere anche in antagonismo, non sempre in sinergia poich interferiscono luno contro laltro. Meccanismi di azione degli antibiotici: - Inibizione della sintesi della parete cellulare. - Inibizione della sintesi proteica - Alterazione della membrana cellulare. - Inibizione della sintesi degli acidi nucleici. 25

Inibitori della sintesi della parete cellulare. I costituenti della parete cellulare: - Vengono sintetizzati a livello citoplasmatica - Trasportati al di fuori della membrana cellulare attraverso un trasportatore lipidico. - Assemblati al di fuori della membrana a formare il pectidoglicano. Gli antibiotici che agiscono sulla sintesi della parete cellulare possono agire: - A livello citoplasmatico - Sui carriers lipidici (bacitracina) - Sulla polimerizzazione della molecola. Penicillina. - Scoperta da Fleming che si accorge che in una piastra di coltura per gli stafilococchi, contaminata da muffe, la crescita batterica era stata bloccata. - Costituita da un anello -lattamico fondamentale. - Antibiotico ideale perch ha bassa tossicit e agisce gi a dosaggi limitati. - Derivati della penicillina: .) acido penicillamico lanello -lattamico chiuso e presenta una forte reattivit. Viene usato per la preparazione delle penicilline sintetiche. .) acido penicilloico lanello -lattamico aperto e non pi attivo. Provoca tuttavia delle reazioni allergiche a livello tissutale. - Meccanismo dazione: .) nella membrana cellulare batterica sono presenti delle particolari proteine dette PBP (Penicillin Bilding Proteins) che sono transpeptidasi ovvero permettono la formazione del legame peptidico che costruisce il pectidoglicano. .) tali proteine, come indica il nome, sono anche in grado di legare lanello -lattamico della penicillina. .) quando viene somministrata la penicillina, questa si lega con le PBP impedendole di formare il legame peptidico che origina il pectidoglicano. .) linstabilit molecolare dovuta alla non formazione dei legami peptidici allinterno del pectidoglicano determina lattivazione di enzimi autolitici che portano a morte la cellula batterica. .) se lantibiotico si lega a PBP alterato, se ci sono -lattaminasi che trasformano la penicillina in acido penicilloico, la cellula batterica sopravvive. .) la penicillina ha come bersaglio una struttura assente nelle cellule eucariotiche che costituisce un vantaggio per luomo. Cefalosporine - Sono -lattamici - Azione su numerose specie batteriche sulle quali la penicillina non ha effetto. Bacitracina - Inibizione dei soli Gram + - Molto tossico per questo usato solo a livello regionale Vancomicina.

Alteratori del funzionamento delle membrane cellulari. Polieni - Farmaci antifungini - Si legano agli steroli della membrana plasmatica formando dei buchi che provocano perdita di nutrienti e morte della cellula. 26

- Relativamente tossici Polimixina: - Attaccano i lipidi di membrana causando perdita di componenti cellulari - Tossici, vengono impiegati prevalentemente per uso locale, mai per uso generale.

Antibiotici che inibiscono la sintesi proteica. Aminoglicosidi - Si legano ai ribosomi provocando errori nella sintesi proteica dei costituenti strutturali che porta a lisi la cellula batterica. Tetracicline - Impediscono lallungamento della catena peptidica nascente Cloramfenicolo. Eritromicina (macrolidi)

Inibizione della sintesi degli acidi nucleici. Non sono antibiotici ma antimetaboliti ovvero sostanza che competono con i prodotti del metabolismo cellulare. Sulfamidici (meccanismo dazione) - I batteri non sono in grado di utilizzare lacido folico presente nei tessuti ma devono sintetizzarlo a partire dai costituenti presenti nei tessuti. - Per la costruzione dellacido folico viene impiegato il sulfaminamide. - Se al posto di questultimo si introduce lacido paraminobenzoico, analogo strutturale del sulfaminamide, i batteri diventano incapaci di produrre acido folico. - Non vi rischio di tossicit per le cellule eucariotiche dellospite perch utilizzano lacido folico preformato. La tossicit quindi selettiva per i batteri. - Venendo meno lacido folico, il batterio non pu pi moltiplicarsi per mancanza di acidi nucleici per la sintesi proteica. Si ha quindi attivit batteriostatica (blocco della crescita batterica) che permette allorganismo di eliminare i batteri e giungere a guarigione. - I sulfamidici vengono impiegati per la terapia di infezioni da streptococchi. Chinoloni: - Agiscono a livello della DNA girasi che svolge un ruolo molto importante nei batteri.

Resistenza batterica agli antibiotici. Avviene con 4 meccanismi fondamentali: - Alterazione del bersaglio dellantibiotico. - Alterazione a livello dei ribosomi o di altre strutture. - Impossibilit di ingresso (alcuni batteri buttano fuori lantibiotico). - Inattivazione enzimatica del farmaco (possesso di -lattaminasi nella maggior parte dei Gram -) - Via metabolica alternativa a quella inibita dallantibiotico. Costituisce un problema importante soprattutto in ambiente ospedaliero. Viene codificata da geni contenuti sui cromosomi o plasmidi con trasferimento della farmaco resistenza da un batteri allaltro (fattore R).

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BATTERIOLOGIA SPECIALE

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StafilococchiStaphylococcus aureus. Famiglia delle Micrococcaceae. Appartiene al genere Stafilococco che comprende due specie importanti per la patologia umana: - S. aureus - S. epidermidis Gram + Cocchi disposti a grappolo. Privi di capsula Non cigliati Asporigeni Aerobi o Anaerobi facoltativi. Fermenta il mannitolo Produce catalasi. - Scinde la H2O2 prodotta dai macrofagi nellintento di fagocitare il batterio - in grado di sopravvivere allinterno del fagocita. Produzione di coagulasi Consente la coagulazione di sangue o plasma trattato con citrato od ossalato senza che occorra la presenza di Ca++. - Importante fattore di virulenza in vivo perch forma uno strato di fibrina intorno al batterio che lo protegge dalla fagocitosi. Proteina A - Presente sulla parete cellulare. - Lega frammenti Fc delle IgG. - Il legame allo stafilococco blocca lattivit delle immunoglobuline. Fattori di virulenza: - Capsula (non esiste una capsula completa piuttosto degli antigeni polisaccaridici pseudocapsulari presenti solo in alcuni ceppi). - Catalasi - Coagulasi - Proteina A - Proteasi - Ialuronidasi permette di penetrare il connettivo. - DNAsi - Enzimi lipolitici - Tossine: .) emolisine , , , , .) leucocidina attivit litica sui soli globuli bianchi. Il pi importante PV, causa degranulazione dei globuli bianchi consentendo cos allo stafilococco di albergare nella cellula. .) enterotossina (solo certi ceppi) .) tossine epidermolitiche (solo certi ceppi sindrome della cute sfogliata) .) tossina da shock tossico (TSST-1) e tossine pirogene. Ubiquitario, presente sulla cute e nel nasofaringe. Crescita: - Nei comuni terreni di coltura 31

- Con O2 colonie gialle - Capace di moltiplicarsi anche in presenza di alte concentrazioni di NaCl (fino al 7%). Patologie provocate: - Infezione delle ferite e della cute (ascessi, foruncoli, orzaioli favi, impetigine) - Sindrome della cute ustionata .) tipica dei neonati e degli immunodepressi .) dovuta ad una tossina epidermolitica (tossina esfoliativa) prodotta solo da alcuni ceppi. .) provoca sfaldamento degli strati superficiali della cute. - Setticemia e endocardite .) dovuta alla diffusione a livello ematico dellinfezione. - Sindrome da Shock Tossico. .) dovuto a ceppi producenti tossina pirogena (TSST-1) .) sintomatologia: diarrea, vomito, coagulazione intravascolare) - Infezioni polmonari - Enfisema pleurico - Artrite settica - Osteomielite .) infezione ossea da parte di S. aureus difficilmente eliminabile. - Intossicazione alimentare .) dovuta alla contaminazione del cibo da parte di ceppi di S. aureus producenti enterotossina .) gastroenterite acuta. .) pu provocare pericolosa disidratazione negli anziani e nei bambini piccoli. Diagnosi: - Attraverso isolamento culturale del batterio e osservazione al microscopio. - Distinto da S. epidermitis per: .) fermentazione del mannitolo (presente in S. aureus e assente in S. epidermitis) .) produzione di coagulasi da parte di S. aureus ma non dello S. epidermitis. Terapia: - Penicillina (solitamente) - Meticillina (se il batterio resistente alla penicillina) - Vancomicina (se il batterio resistente alla penicillina)

StreptococcoCaratteri comuni del genere. Cocchi disposti a catenelle. Gram + Crescita in agar sangue. Comprendono numerose specie le cui pi importanti sono: - S. piogenes - S. pneumoniae - S. agalactiae. Criteri di classificazione: - Morfologici - In base allattivit emolitica presentata in agar sangue: 32

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.) emolisi emolisi completa che da un alone trasparente .) emolisi emolisi incompleta con un alone verdastro (viridante). .) emolisi non emolisi. Antigenico sierologica ottenuta in base alla tipizzazione di un carboidrato di membrana detto sostanza C. .) si sono ottenuti gruppi da A ad O, ma i patogeni sono solo i gruppi A, B, C, D, G. .) ad ogni gruppo si sono assegnate una o pi specie. .) gruppo A S. piogenes .) gruppo B S. agalactie

Streptococcus piogenes Streptococco di classe A. Cocco disposto a catenelle Gram + Capsula formata da acido ialuronico (non ha capacit immunologica). Presenta emolisi. Non produce catalasi Produce la proteina M: - Uno dei pi importanti fattori di virulenza - Inibisce la fagocitosi - Esistono pi di 80 differenti tipi antigenici di proteina M, ci ha portato allimpossibilit di costituire un unico vaccino per lo Streptococco. Fattori di virulenza: - Proteina M - Fattori di invasivit (enzimi) tra cui ialuronidasi, nucleasi, ecc - Streptolisina O .) ossigeno labile .) attivit emolitica solo in anaerobiosi .) immunogena .) cardiotossica - Streptolisina S .) attiva anche in assenza di O2 .) provoca alone intorno alle colonie. - Tossina Eritrogenica .) responsabile della scarlattina .) molecolarmente simile alle tossine da shock tossico. .) pirogena .) prodotta solo da particolari ceppi. Patogenesi: - Il contagio avviene attraverso numerosi portatori sani che albergano il batterio nellorofaringe e nella cute. - Lingresso avviene tramite le gocce di flugge, ed promosso da: .) acido lipoteicoico .) proteina M. - Si ha diffusione del batterio: .) linfezione di cute e mucose tendono a rimanere isolate. .) linfezione di ferite tende a diffondere. - Il virus si moltiplica resistendo alla fagocitosi grazie a: .) proteina M .) capsula di acido ialuronico 33

.) peptidasi. Nei tessuti lesionati di ha lo sviluppo di intensa reazione infiammatoria con produzione dei fattori di virulenza da parte del batterio quali: .) streptolisine .) esotossine pirogene A, B, C - Sviluppo di infezioni: .) suppurative (primarie) .) non suppurative (secondarie) Infezioni suppurative: - Cutanee (epidermiti) - Respiratorie (faringiti) Infezioni non suppurative: - Reumatismo articolare acuto: .) manifesta con poliartrite ed eventuale danno cardiaco. .) insorge solo come complicanza di infezioni da S. piogenes a livello faringeo .) malattia autoimmune dovuta verosimilmente alla capacit della proteina M di mimare alcuni componenti molecolari self e di indurre quindi anticorpi contro s e contro antigeni self. - Glomerulo Nefrite Acuta: .) si manifesta con proteinuria ed ematoinuria .) conseguenza sia di infezioni faringee che di infezioni cutanee .) dovuta ad una risposta infiammatoria agli immunocomplessi localizzati a livello renale .) nei cappi di S. piogenes nefritogeni contenuta una proteina chiamata endostreptosina a livello del citoplasma e della membrana citoplasmatica responsabile della formazione degli immunocomplessi. Diagnosi: - Coltura ricerca dello streptococco con tamponi e coltivazioni in agar sangue e aggiunta di bacitracina. - Sierologia valutazione del titolo antistreptolisinico (oltre 80 differenti sierotipi) e di anti-ialuronidasi e antinucleasi. Terapia: penicillina. -

Streptococcus Pneumoniae Pneumococco. Diplococco Gram +. Capsulato solo nella fase S, non nelle altre fasi. Attivit emolitica Viene lisato dai sali biliari. Molto labile, va facilmente incontro ad autolisi Fattori di virulenza: - Capsula tipo specifica antifagocitaria. - Tossina emolitica (pneumolisina) - Fattori di colonizzazione. - Proteasi contro le IgA secretorie. Linfezione da pneumococchi subentra prevalentemente in pazienti immuno depressi. Agente etiologico di: - Polmoniti lombari - Otiti medie - Meningiti. Diagnosi: semina in agar sangue e test della lisi dei sali biliari. 34

Terapia: penicillina Profilassi: inesistente ma in corso di studio.

NeisseriaCaratteri comuni del genere. Diplococchi (cocchi) gram . Il nome del genere non deriva dalla forma ma dallo scopritore. Parassitano le mucose delluomo dando infezioni suppurative con formazione di pus. Batteri aerobi ed anaerobi facoltativi. Il genere raccoglie 2 specie patogene per luomo, pi numerose altre specie non patogene commensali del cavo orale: - meningitis: agente etiologico della meningite cerebrospinale, si diffonde per via ematica e si localizza a livello delle articolazioni e delle ghiandole surrenali dove pu portare a morte improvvisa - Gonorrhoeae: trasmesso per via sessuale ed responsabile delle uretriti. Producono una citocromo ossidasi che ne consente la distinzione dagli altri batteri. Lapplicazione di tetrametilfurantoina sulle colonie batteriche cresciute nellagar cioccolato, determina un viraggio al colore rosso delle colonie stesse che evidenzia la presenza della ossidasi. I gruppi patogeni: - Sono sensibili alle variazioni di pH, temperatura ed acqua (essiccamento). - A causa della rapida autolisi che si determina nei ceppi patogeni, non possibile conservare il batterio a freddo ma, anche per periodi brevi quali quelli determinatisi nel trasporto fino al laboratorio, occorre coltivare subito il batterio. - Crescono solo in terreni arricchiti con siero di sangue in cui lalbumina elimina gli acidi grassi a corta catena tossici per i batteri (agar cioccolato). I gruppi non patogeni crescono anche a temperatura ambiente e in terreni culturali generici.

Neisseria Meningitis Classificazione: - Famiglia: Neisseriacee - Genere: Neisseria - Specie Meningitis Presenta tutti i caratteri generali del genere Neisseria. Fattori di virulenza: - Antigeni capsulari polisaccaridici il cui assortimento determina la divisione della specie meningitis in vari sierogruppi e sierotipi. - Pili: adesione alla mucosa - Capsula: impedisce la fagocitosi - Proteasi che scinde le IgA. - Endotossina (essendo gram -) .) costituita da un lipooligosaccaride (LOS) 35

.) il maggior responsabile dello shock indotto da infezione da Neisseria Meningitis .) effetto diretto provocando coagulazione intravascolare disseminata .) effetto indiretto inducendo il rilascio di TNF, IL-1, IL-6 da parte dei macrofagi da essa attivati. - Capacit di sopravvivere allinterno dei fagociti nonostante non sia in grado di replicarsi al loro interno. Patogenesi: - Il contagio si determina per entrata del batterio nel cavo orofaringeo attraverso inalazione respiratoria delle gocce di Flgge (in casi di contagio in caserme, bastata aumentare la distanza tra i letti della camerata per scongiurare lepidemia meningitica). - Il batterio aderisce alle mucose e pu portare localmente infezione (nasofaringite) per lo pi fugace e asintomatica. - Il batterio pu: .) permanere in tale distretto (portatore sano) .) migrare nelle meningi attraverso la via ematica o passando la lamina cribrosa dellosso etmoide. - Nel passaggio nel sangue pu dare luogo a setticemia: .) si manifesta con febbre alta ed eruzione cutanea. .) complicanza sepsi fulminante: produce necrosi emorragica delle ghiandole surrenali con conseguente morte improvvisa del paziente. - La meningite si manifesta con febbre alta, forte cefalea, dolore e rigidit di collo e spalle. Diagnosi: - Segni e sintomi clinici - Il prelievo di liquido cefalorachidiano effettuato tramite puntura lombare, svela che il liquor, anzich essere limpido, presenta torpidit dovuta alla presenza di fagociti. Questi sono costituiti fa macrofagi con allinterno i batteri come si pu osservare attraverso una colorazione di Gram. Epidemiologia: - Infetta esclusivamente luomo - La maggiore incidenza si verifica nei bambini sotto i 5 anni con picco dopo i 6 mesi di vita quando il bambino perde la protezione fornitagli dalla permanenza in circolo degli anticorpi materni e non ancora in grado di produrne di propri. - Sarebbe facilmente debellabile se non esistessero i portatori sani. - Nei paesi industrializzati il rischio di infezione comunque basso. Terapia: - Rapida somministrazione di: .) penicillina .) amoxicillina (meglio ancora) passa pi rapidamente la barriera ematoencefalica. - Se la terapia non tempestiva si possono verificare danni permanenti quali ritardo mentale. - Esistono vaccini non obbligatori in Italia che prevedono limpiego di polisaccaridi di ceppo. La loro efficacia scarsa in quanto determinano una risposta esigua soprattutto nei bambini che costituiscono il bersaglio di elezione per Neisseria Meningitis.

Neisseria Gonorrhoeae. Classificazione: - Famiglia: Neisseriacee - Genere: Neisseria - Specie Gonorrhoeae 36

Presenta tutti i caratteri generali del genere Neisseria. Privo di capsula. Necessita di CO2 per crescere. Patogenesi: - Trasmissione per via sessuale. - Infetta le mucose dellapparato sessuale maschile e femminile e quelle del nasofaringe permanendovi protetto dalle cellule epiteliali che lo fagocitano impedendo la fagocitosi dei macrofagi. - Nel maschio linfezione provoca uretrite acuta con formazione di un abbondante essudato ricco fagociti neutrofili contenenti il batterio. - Nella donna linfezione coinvolge oltre che luretra anche le ghiandole di Skene e Bartolino, lendocervice e il retto e pu essere: .) acuta con formazione di pus .) cronica con dolore di schiena e delladdome inferiore alla palpazione o addirittura asintomatica. .) pu evolvere nella Malattia Infiammatoria Pelvica (PID) con infezioni dellutero, delle tube di Falloppio, delle ovaie e delle superfici peritoneali a cui associato un rischio di sterilit. Infetta solo luomo. Terapia: somministrazione di penicillina protratta nel tempo a causa della lontananza del distretto corporeo che lantibiotico deve raggiungere. In tale periodo possibile che il batterio sviluppi resistenza verso lantibiotico. Durante il parto naturale c la possibilit per il neonato di contrarre infezione da Neisseria Gonorrhoeae nel tragitto lungo la vagina nel caso in cui la madre sia portatrice sintomatica o asintomatica del batterio. Ci pu portare alla cecit del neonato. Per questo si applica al neonato un collirio antibatterico come profilassi (metodo di Cred).

Branhamella Catarralis Classificazione: - Famiglia: Neisseriacee - Genere: Branhamella - Specie Catarralis - Un volta era classificata come Neisseria Catarralis, in seguito nuovi studi ne hanno modificato lappartenenza al genere, costituendone uno nuovo. Diplococco (cocchi) gram . Localizzato a livello dellorofaringe. Non patogeno per luomo ma nei soggetti immunodepressi pu diventare causa di infezione causando sinusite e otite media nei bambini e pi raramente polmonite, bronchite, endocardite, meningite, congiuntivite e setticemia. Sensibile a eritromicina e rifampicina. La colorazione semplice con blu di metilene applicato per 30 secondi permette la colorazione di solo questa specie batterica.

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CorynebacteriumCaratteri comuni del genere. Bacilli Gram +. Forma a clava e spiccato pleiomorfismo. Granuli metacromatici costituiti da polimetafosfati che si colorano di rosso con il blu di metilene (metodo diagnostico). La parete cellulare costituita da acidi grassi e acido micolico conferisce al genere una certa resistenza agli acidi. In alcune specie tale resistenza particolarmente spiccata grazie ai componenti di membrana. Non hanno mobilit, non sono sporigeni. Sono per lo pi aerobi o anaerobi facoltativi nonostante vi siano specie strettamente anaerobiche. Producono le catalasi che ne impediscono la fagocitosi da parte dei macrofagi. La divisione asessuata avviene sempre in senso trasversale e porta ad una disposizione a palizzata delle colonie batteriche. Crescono in qualsiasi terreno culturale anche semplice ma per riconoscerle si usa il terreno di Loeffler, un terreno relativamente povero in cui il batterio cresce molto bene. Le specie patogene per luomo, in quanto producono esotossina, sono: - Corynebacterium Difteritae - Corynebacterium Ulcerans - Corynebacterium Pseudotubercolosis.

Corynebacterium Difteritae Gram + al limite in quanto se si decolorano a lungo con alcool tendono a perdere il violetto e appaiono Gram -. Fermentano saccarosio, maltosio e glucosio. Se coltivato in terreno selettivo per lisolamento del batterio, si formano delle colonie di aspetto grigiastro il cui aspetto dovrebbe indicare i tre possibili gradi di gravit della malattia: - Mitis (batteri appartenenti a questo ceppo dovrebbero produrre poco o nulla tossina) - Interrmedius - Gravis. La tossina (esotossina) difterica: - Il gene per la produzione della tossina portato da un fago attraverso un fenomeno di conversione fagica. - Caratterizzata da un solo tipo antigenico - Formata da due frazioni proteiche unite da ponti disolfuro: .) A Active .) B Binding. - La quantit di tossina difterica prodotta determina la gravit della malattia. - Il meccanismo di azione della tossina difterica dovuto alla sua capacit di bloccare la sintesi proteica allinterno della cellula. - Forte pantropismo ovvero in grado di infettare diversi tipi cellulari. - Si pu ritrovare la tossina anche in distretti corporei distanti dal luogo primario di infezione e provoca il danno maggiore a livello cardiaco.

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Se si isola il Corynebacterium Difteritae dobbiamo essere in grado di sapere se produce la tossina. Ho due metodi: 1) Coltivo il batterio in brodo e filtro il brodo. In questo modo allontano i batteri dal liquido nel quale per rimane la tossina eventualmente prodotta. Inoculo il filtrato in due differenti cavie; una stata precedentemente trattata con antitossina difterica, laltra no. Se la tossina non stata prodotta dal ceppo isolato sopravvivono entrambe le cavie, se la tossina stata prodotta invece, sopravvive esclusivamente la cavia vaccinata. 2) Altro modo per testare la produzione di tossina imbevere una striscia di carta da filtro nel brodo gi filtrato, disporre successivamente la carta in una capsula Pedri insieme a del terreno di crescita. Nella capsula vengono poi strisciati tre differenti campioni batterici: uno che produce tossina, un altro che non la produce, e il ceppo di cui vogliamo saggiare la tossicit. Questultimo, se produce tossina, dar reazione di agglutinazione come la da il primo ceppo posto in coltura, dovuta alla presenza di anticorpi antitossina. In tale modo posso sapere se il campione che sto testando contiene batteri tossigeni o meno (prova di Elek). Patogenesi: - Linfezione si contrae per contatto con oggetti contaminati. - Il batterio si localizza primariamente a livello: .) del nasofaringe, .) della vagina delle bambine, .)in eventuali ferite aperte - Qui si moltiplica dando infezione primaria localizzata che provoca la necrosi tissutale, richiama leucociti che rilasciano di citochine. - Si vengono a creare delle pseudomembrane contenenti batteri, cellule della linea bianca a fibrina che: .) se permangono possono provocare lostruzione delle vie respiratorie fino al soffocamento .) se vengono rimosse provocano unimportante sanguinamento. - Linfezione localizzata guarisce se curata ma la morte sopraggiunge comunque perch il batterio attraverso il circolo sanguigno si colloca in organi vitali (fegato, cuore, SNC) provocandone la necrosi. Terapia: - Antibiotica: Il batterio sensibile a penicillina ed eritromicina ma non pu essere lunica terapia adottata in quanto la patogenicit dovuta alla tossina. - Antitossica: tanto pi efficace quanto pi rapida la somministrazione. A 24 ore dal contagio, la somministrazione di antitossina riduce il tasso di mortalit a zero, e in tempi successivi aumenta. Vaccinazione: - Effettuata con antitossina inattivata in formalina a 37 C in modo da eliminarne le propriet tossiche ma mantenere quelle immunogene. - La prima vaccinazione si fa a sei (anni), dopo ci sono successivi richiami in et adulta. - La presenza di portatori sani non ci permette di eradicare la malattia: .) ospitano un ceppo non tossigeno. .) ospitano un ceppo tossigeno ma producono anticorpi capaci di neutralizzare la tossina prodotta. - Il vaccino va somministrato con attenzione nelladulto in quanto possono subentrare problemi dovuti alla allergenicit dello stesso. - Come si determina se un soggetto vaccinato o meno? Inoculo una quantit pari a 1/50 di dose minima letale per la cavia sotto la pelle. Se il soggetto protetto si sviluppa una reazione infiammatoria locale, altrimenti non si assiste ed alcun arrossamento della cute (prova di Schlick). 39

Altre specie di Corynebacterium. Le precedenti tre specie indicate del genere Corynebacterium sono quelle di maggiore importanza per la patologia umana. Esistono tuttavia altre specie: Ulcerans: - Commensale di bovini ed equini - Presente nella faringe delluomo - Produce una tossina simildifterica che causa una malattia simildifterica. Pseudotubercolosis: - Presente nel tratto respiratorio degli animali domestici - Produce una Fosfolipasi D che distrugge la sfigmomielina - Pu causare polmonite Hofmanii: - Presente nellorofaringe - Pu causare endocardite Honis: interessa gli animali Xerosis: infetta la cute Jeikenium: - Presente nella cute delluomo - Da infezioni in pazienti ricoverati, che hanno subito un trattamento prolungato con antibiotici. - Causa endocarditi in pazienti chirurgici.

Listeria Monocitogenes Bacillo gram +. Ciglia peritriche, asporigeno. Contiene acidi lipoteicoici importanti per le attivit biologiche di tipo tossico. Produce catalasi, non produce ossidasi. Aerobio o anaerobio facoltativo Capace di moltiplicarsi anche a 4 C (psicrofilo) e in un intervallo di pH compreso tra 5 e 9. Questo gli permette di causare infezioni alimentari in quanto vive in frigorifero. Ha una grande diffusione nellambiente ma normalmente non causa di comparsa di malattie. Si trova nei foraggi animali per cui le bestie di allevamento nutrendosi del foraggio si contagiano del batterio. La Listeria si ritrova nel latte prodotto dagli animali che, se non viene correttamente pastorizzato, costituisce il vettore per il contagio umano. Nelluomo in grado di sopravvivere allinterno dei monociti che lo fagocitano senza tuttavia causare malattia se non in soggetti immunocompromessi. La Listeria Monocitogenes, penetrata nel monocita si moltiplica. Qui in grado di crearsi attorno alla parete cellulare un assembramento protettivo formato da filamenti di actina. Una volta fuoriuscito dal monocita lassembramento actinico creatosi gli conferisce resistenza agli antibiotici ed il batterio pu infettare uno monocita. In soggetti immunodepressi provoca: - Meningite - Listeriosi neonatale .) Granulomatosi infantisettica: costituisce la forma pi precoce di listeriosi neonatale.Conduce la donna gravida allaborto a causa della formazione di granulomi con diffusa infezione intrauterina. 40

.) Secondo nome: Costituisce la forma pi tardiva di listeriosi neonatale. Lesordio della malattia si presenta dopo la nascita ma il contagio avviene quando il neonato ancora nellutero materno per passaggio della Listeria Monocitogenes nel circolo placentare. Nel neonato si manifesta spesso come meningite. - Sepsi - Infezioni di: .) ossa .) articolazioni .) occhio .) endocardio .) milza Fattori di virulenza: emolisina chiamata listerotossina O. Terapia: sensibile a penicillina e ampicillina.

BacillusCaratteristiche generali del genere. Bacilli (forma bastoncellare) Gram + Aerobi o anaerobi facoltativi Producono spore che rilasciano nellambiente esterno e che sono causa di malattie negli animali e nelluomo. Saprofiti del terreno, si ritrovano anche nellintestino umano. Il genere comprende oltre 60 specie diverse. Quelle patogene per luomo nel quale provocano infezioni alimentari e oculari sono: - B. Anthracis - B. Cereus - B. Subtilis

Bacillus Anthracis Bacillo Gram + Dimensioni: lunghezza 7-8 m, diametro 1 m. Le estremit si presentano nettamente tagliate. Immobile (criterio diagnostico) Quando virulento i bacilli si presentano in catenelle rivestite da ununica capsula Produce spore: - Solo se si trova al di fuori dei tessuti animali - La spora localizzata al centro del batterio (spora a battridio) Fattori di virulenza: - Capsula i geni per la sua produzione sono sul plasmide px02 - Complesso tossico i geni per la sua produzione sono sul plasmide px01 La capsula: - Formata da materiale polipeptidico (acido glutammico) - Viene prodotta solo in presenza do CO2 41

- Conferisce al batterio la capacit di resistere agli antibiotici e alla fagocitosi. Il complesso tossico formato da tre fattori tutti indispensabili perch si svolga la attivit tossica: - Edema Factor .) forma inattivata della Adenilato Ciclasi .) la sua attivazione dipende da secondo fattore (Antigene Proteico) che la veicola allinterno dove .) si lega ad una calmodulina intracellulare attivandosi. .) responsabile della reazione edematosa - Antigene Proteico .) si lega ad un recettore di membrana delle cellule dellospite favorendo lingresso degli atri due fattori del complesso tossico. .) gli anticorpi diretti contro questo antigene proteico danno protezione nei confronti della malattia. - Fattore Letale: .) una metallo proteina .) attiva una map-chinasi che trasduce un segnale apoptotico .) responsabile della morte dei soggetti affetti da carbonchio. Negli animali provoca una zoonosi, il carbonchio. Le spore di Bacillus Anthracis possono essere presenti nel terreno dove cresce il foraggio di cui gli animali si nutrono. Questi ruminando lerba contaminata, possono provocarsi delle escoriazioni nella bocca attraverso cui le spore del batterio penetra nel circolo sanguigno e possono diffondere. Nel sangue le spore germinano e i batteri si moltiplicano per cui nel prelievo ematico possono essere riscontrati numerosi batteri. Lanimale va quindi abbattuto e deve essere incenerito o sepolto a profondit notevoli, quindi ricoperto di calce viva per impedire il crearsi di cosiddetti campi maledetti in cui animali sani che vanno al pascolo possono infettarsi del bacillo. Nelluomo lagente patogeno del carbonchio ematico e si presenta sotto tre forme: - Pustola maligna che si forma qualora linfezione sia avvenuta per contatto cutaneo con bastie infette od oggetti contaminati. Eventuali spore si sono infiltrate in soluzioni di continuo della cute e germinano nel sottocutaneo. Si ha quindi la formazione di una pustola necrotica al centro ed edematosa perifericamente che stenta a guarire (carbonchio cutaneo). Quando il torrente circolatorio viene invaso la forma pu essere fatale. - Forma polmonare: tipica dei cardatori di lana che a causa della professione inalano le spore provenienti da animali infetti. Le spore si localizzano nel polmone dove germinano provocando emorragie e edema. Si ha linstaurarsi di una setticemia diffusa che se non curata pu portare a morte (malattia dei cardatori). - Forma intestinale: rara, dovuta allingestione di carne contenete spore di B. Anthracis (carbonchio gastrointestinale). Lepitelio intestinale va incontro ad una serie di modificazioni simili a quelle che caratterizzano lepidermide nel carbonchio cutaneo. Si ha quindi emorragia e desquamazione dellepitelio enterico. Cresce in tutti i terreni di coltura (in particolare agar sangue pecora) dando colonie a caput medusae con margini frastagliati a serpente a causa della concatenazione dei bacilli. Come faccio a stabilire se in oggetto sono presenti spore di Bacillus Anthracis? Posso provare a vedere se da tamponi effettuati dalloggetto crescono bacilli. In caso crescessero: - Inoculo il prodotto della crescita nel topo e vedo se sopravvive. - Esamino il DNA batterico attraverso PCR e cerco se sono presenti i geni per la produzione del complesso tossico. Terapia: - B. Anthracis sensibile a: penicillina, streptomicina, tetracicline, eritromicina. - Anticorpi anti-complesso tossico. 42

Vaccinazione: - Pasteur aveva ottenuto il vaccino per il Bacillus Anthracis, coltivandolo a 42C - Esistono oggi vaccini pu sofisticati specifici per il complesso tossico - La vaccinazione verso questo batterio non obbligatoria perch porta semplicemente ad una zoonosi. - Obbligatoria la vaccinazione degli animali di allevamento (ovini, ovini, verso questo batterio per evitare il diffondersi di uneventuale epidemia di carbonchio nelluomo causata da carni infette.

Bacillus Cereus Bacillo Gram + Si differenzia da B. Anthracis per: - Grosse dimensioni - Produzione di emolisine che gli conferiscono attivit emolitica. - Produzione di una tossina letale per il topo che nelluomo provoca forme diarroiche simili a quelle indotte dalla tossina colerica. - Produzione di una enterotossina capace di indurre vomito. Da infezioni alimentari contaminando il cibo non correttamente conservato, alimenti in scatola (tonno), riso, altro. Pu dare infezioni oculari che se non curate conducono alla cecit. Tutte le patologie instaurate da B. Cereus (tranne quelle oculari) non richiedono terapie in quanto sono forme auto limitanti che regrediscono da s.

ClostridiumCaratteri generali del genere Bacilli Gram + Sporigeni Anaerobi Vi appartengono numerose specie tra cui alcune di importanza agraria in quanto sono batteri fissatori di azoto nel terreno, altre specie sono patogene per luomo. Criteri di classificazione delle varie specie di Clostridium: - In base alla forma e alla posizione della spora nello sporangio: .) la spora pu trovarsi in posizione centrale o terminale .) lunica in posizione a plettridio C. Tetani. - In base alle capacit fermentative: .) tutti i clostridi fermentano gli aminoacidi .) solo alcuni sono capaci di fermentare glucosio o lattosio - In base alle tossine prodotte. Malattie sostenute dai batteri del genere Clostridium: - Botulismo C. Botulinum - Tetano C. Tetani - Gangrena gassosa numerosi clostridi 43

La tossina prodotta da questi batteri pu essere di tre differenti specie: - Neurotossina (C. Tetani e C. Botulinum) agisce sul sistema nervoso centrale - Citotossina (C. Perfringens e altri clostridi che danno gangrena gassosa) agisce sulle cellule su cui ha una attivit necrotizzante. - Enterotossina: (C. Difficile e C. Perfringens) da tossicit intestinale Crescono generalmente in agar sangue.

Clostridium Tetani. Bacillo Gram + Spora in posizione terminale (a plettridio) Assenza di capsula Ciglia peritriche che gli danno motilit in condizioni anaerobiche Il diverso assortimento degli antigeni ciliari presenti ci consente di individuare ben 10 differenti ceppi di C. tetani. Produce una emolisina ossigeno labile che gli conferisce attivit emolitica. Produce una tetanospasmina, la neurotossina responsabile del tetano. Cresce in terreni aggiunti di glucosio in stretta anaerobiosi Patogenesi: - Le spore di C. tetani sono presenti nel terreno. - Luomo si contamina attraverso ferite lacero-contuse nelle quali la spora tetanica si introduce e, se trova condizioni di anaerobiosi, germina. - In forma vegetativa C. tetani produce la neurotossina tetanica sempre uguale in tutti i ceppi del batterio che si lega alle giunzioni neuromuscolari attraverso le quali penetra nei nervi, diffonde e giunge ai motoneuroni del SNC. - Qui inibisce il rilascio di GABA e glicina, neurotrasmettitori ad attivit inibitoria. Questo provoca eccitazione continua della muscolatura che non pu pi rilassarsi con conseguente paralisi spastica contrattiva diffusa che si manifesta primariamente a livello del muscolo massetere. - Una diffusione ematica si ipotizzata ma sembra improbabile perch non si mai dimostrata presenza di C. tetani n tanto meno della sua tossina nel circolo ematico. - Se non si interviene con rilassanti del sistema nervoso la morte sopraggiunge per paralisi respiratoria. Vaccinazione: - Effettuata con anatossina ricavata dalla esotossina tetanica inattivata in formalina a 37C: .) perde il potere patogeno .) mantiene quello immunogeno. - Ha validit per 10 anni: .) in tale periodo sono presenti in circolo anticorpi antitossina tetanica. .) in periodi successivi devono essere fatti dei richiami con anatossina tetanica. Terapia: - In caso di infezione se lindividuo non vaccinato somministrare anatossina tetanica inattivata non avrebbe senso in quanto la produzione di anticorpi da parte del sistema immunitario sarebbe troppo lenta e la morte sopraggiungerebbe rapidamente. - Si procede a sieroterapia somministrando anticorpi preformati, principalmente IgG che prima venivano ricavate dal cavallo, oggi sono disponibili quelle umane, permettendo di evitare eventuali reazioni allergiche indesiderate. - Il batterio sensibile alla penicillina ma non serve a evitare la morte che causata dalla tossina. 44

Epidemiologia: - Fino a 25 anni lincidenza 0. - Sopra i 60 anni lincidenza aumenta gradualmente perch: .) i richiami non vengono pi effettuati .) si ha un concomitante depotenziamento delle difese immunitarie.

Clostrdium botulinum. Bacillo Gram + Anaerobio Sporigeni Crescita di C. botulinum: - I ceppi batterici B, E, F sono in grado di crescere anche a 3 C. - La crescita dei patogeni inibita da pH acido e concentrazioni saline superiori al 10%. Nelluomo C. botulinum non trova lambiente ideale per vivere per cui: - Da per lo pi intossicazioni di tipo alimentare - In talune condizioni pu rendersi responsabile dellinsorgere di patologie quali: .) intossicazioni alimentari gravi .) botulismo da ferite .) botulismo infantile La tossina botulinica: - il fattore di virulenza fondamentale - Presenta 8 differenti tipizzazioni antigeniche: .) caratterizzano gli 8 diversi ceppi batterici .) i ceppi importanti per la patologia umana sono: A, B, E, F. - Presenta comunque una medesima struttura indipendentemente dal peso molecolare: .) toxic neurotossina che svolge lattivit tossica attribuita a tutta la molecola .) insert tratto polipeptidico di separazione senza alcuna funzione .) emoagglutinina protegge la neurotossina dagli acidi dello stomaco

- La tossina completa sensibile al calore. Patogenesi: - La contaminazione con spore di C. botulinum pu avvenire in modi differenti ma pi facilmente per ingestione di cibo inscatolato contaminato. - Se la spora trova nelluomo un ambiente anaerobio, germina e il batterio in forma vegetativa produce la tossina botulinica. - Questa agisce a livello delle giunzioni neuromuscolari ostacolando il rilascio di acetilcolina per cui, anche in caso di stimolazione nervosa del muscolo, questo non pu essere contratto a causa del mancato rilascio del neurotrasmettitore. - Questo fenomeno, nel complesso, appare come una paralisi flaccida diffusa - I primi sintomi di infezione botulinica grave sono sdoppiamento della visione, difficolt di deglutizione e respirazione, nausea, vomito, poi sopraggiungono le prime paralisi flaccide ma a tale punto gi troppo tardi sia per la somministrazione della terapia antitossica (con anticorpi) che per quella antibiotica. - Sia il botulismo da ferite che quello infantile sono possibili ma rari. Diagnosi: - Segni e sintomi clinici (flaccidit diffusa). 45

Eventuale presenza di ferite (botulismo da ferite). Ricerca della tossina nel siero e nelle feci. .) il siero ricavato pu essere reinoculato nella cavia che muore nel giro di 1-4 giorni in caso di presenza di tossina botulinica. Terapia: somministrazione di tossina trivalente contro le tossine A, B, E, ancor prima della diagnosi batteriologica.

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Clostridium Perfringens Bacillo Gram +. Presenza capsula, non presenta ciglia (non ha quindi mobilit) Sporigeno Anaerobio Produce 11 diversi tipi di tossina: - Il gene per la produzione delle tossine presente su un plasmide allinterno della cellula. - Ogni tossina ha una funzione differente - In base al tipo di tossina prodotta i C. Perfringens vengono dividi in 5 diversi ceppi: - Solo i ceppi A e C danno patologia nelluomo .) ceppi A producono la tossina che una fosfolipasi C emolitica. .) ceppi C producono la tossina che agisce a livello gastroenterico .) sia A che C producono una collagenasi che degrada il collagene presente nel tessuto muscolare e si rende responsabile dello sfaldamento dei piani muscolari che caratterizza la gangrena gassosa, di cui C. perfingens il principale agente etiologico. Patogenesi: - Il contagio avviene per: .) ingestione di cibi contaminati da spore di Clostridium perfringens .) penetrazione di queste in soluzione di continuo della pelle. - Nelluomo il batterio trova un ambiente anaerobio (soprattutto a livello dello stomaco), germina e produce diverse tossine. - Il batterio invade i vari piani muscolari e la tossina induce necrosi a livello del tessuto muscolare. - Durante linfezione si ha rilascio di gas (H2 e CO2) che tendono la ferita e la fanno arrossare. - La morte sopraggiunge per una tossemia elevata. - C. perfringens pu provocare anche intossicazioni alimentari, ci accade se viene ingerito attraverso cibi contaminati. La maggior parte di queste forme sono auto limitanti ma, in sporadici casi, pu portare allo sviluppo di una enterite necrotizzante caratterizzata da emorragia e gangrena intestinale che conduce a morte il paziente. Terapia: - Rimozione del tessuto necrotico e pulitura delle ferite - Antitossica, iniettando siero contenente anticorpi antitossine delle specie coinvolte nello sviluppo della gangrena gassosa. - Antibiotica: sensibilit a penicilline e tetracicline. - Ossigeno terapia iperbarica: la presenza di elevate quantit di O2 nei tessuti, induce la produzione da parte dei clostridi di perossido di idrogeno e superossido, che sono tossici per il batterio. La gangrena gassosa pu essere provocata oltre che da C. perfringens anche da altre specie tra cui: - C. novyi - C. bifermentas 46

- C. septicum - C. ramosum - C. histoliticum Presente in grandi quantit nelle feci.

Clostridium difficile Lo si ritrova nel terreno, nelle feci degli animali e delluomo e nella flora intestinale normale delluomo. Agente etiologico della colite pseudomembranosa (CPM). Patogenesi: - La colite pseudomembranosa insorge pi frequentemente in sogg