PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 

Gonzalo Greif.  

Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo 

Índice: 

‐ Historia 

‐ La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 

‐ Algunos tips experimentales 

‐ Variantes de la PCR 

‐ Una variante especial: PCR en tiempo real 

 

1. Historia 

La  reacción en  cadena de  la polimerasa  (PCR por  sus  siglas en  inglés: Polymerase  chain  reaction)  fue concebida por el Dr. Kary Mullis (ver recuadro) a principios de la década del 80. Si bien se discute que en el  desarrollo  final  de  la  técnica  participaron  varios  investigadores  y  que  el  proceso  para  la  puesta  a punto de  la técnica  involucró varios años, hay un consenso que  la  idea original fue desarrollada por el Dr. Mullis, y por ello obtuvo el premio Nobel unos años más tarde. En el  libro “Making PCR: a story of biotechnology”, Paul Rabinow  cuenta  en detalle  los  acontecimientos históricos que dieron  lugar  a  la invención de la técnica.

Según cuenta en su página web (www.karymullis.com),  la primera  idea surgió en  la medianoche de un viernes en abril de 1983, conduciendo con su Honda gris entre Cloverdale y Boneville e  imaginando  la reacción.  La  historia  completa  se  encuentra contada de  forma muy poética en  su página web.  

Hasta  ese  momento  obtener  cantidad suficiente  de  ADN  puro  para  realizar experimentos constituía la etapa limitante. La aparición de  las enzimas de  restricción en  la década del 70 y el desarrollo de la tecnología del  ADN  recombinante  a  fines  de  los  70 habían  hecho  posible  la  obtención  de fragmentos precisos de ácidos nucleicos para ser  estudiados  en  detalle.  Sin  embargo,  la invención  de  la  reacción  en  cadena  de  la polimerasa  produjo  un  salto  tecnológico, permitiendo  a  los  investigadores  producir cantidades  ilimitadas  de  ADN  específico,  sin depender del clonado de fragmentos de ADN en  organismos  vivos.  Por  otra  parte  la  PCR mostró  tanta  versatilidad,  que  año  a  año  se fueron  desarrollando  nuevas  aplicaciones  y variantes.  Hoy  es  una  herramienta 

Kary Mullis (1944‐). 

Kary Banks Mullis nació en 1944 en Lenoir, Carolina del Norte. Estudió en el Instituto de Tecnología de Georgia y en 1972 obtuvo un doctorado en bioquímica de la Universidad de California, Berkeley. Luego de un posdoctorado en la Universidad de San Francisco, se incorporó a la Corporación Cetus como químico. En los 7 años que estuvo allí (1979‐1986) trabajó en la síntesis de oligonucléotidos y desarrolló el concepto de la PCR. 

En 1986 fue designado director de biología molecular en Xytronyx Inc. en San Diego, donde continuó su trabajo en tecnologías de ADN y fotoquímica. 

En 1993 recibió el premio Nobel por su invención de la reacción en cadena de la polimerasa. El proceso que Mullis conceptualizó en 1983, es uno de los principales avances de la biología molecular del siglo XX.  

Actualmente es un Investigador en el Hospital de Niños e Insituto de Investigación en Oakland. Vive con su esposa, en Corona del Mar y en Anderson Valley, California. 

Fuente: www.karymullis.com

fundamen

2. El

La  PCR  edeterminamezcla cocopias, (iiregión qu(una  ADN(retrotrancadenas  nfragmento 

Figura 1. D

2004: Guía

 

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ca  in  vitro  ue dos  regionos. Para ello ebadores o pri) una enzimna  ADN  polR)  y  (iv)  los  da  1).  El  resulntre los dos o

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7108864

4217728

8435456

6870912

3741824

unan  a  su  región  blanco.  La  temperatura  de  unión  de  los  cebadores  dependerá  de  la 

composición de bases de los mismos (ver apartado: Cebadores). 

c. Extensión: en este paso,  la temperatura de  la reacción es aquella que permite  la actividad 

óptima de la enzima polimerasa presente en la reacción (ver apartado: ADN Polimerasas). 

 

 

   

Cebadores: 

Los  cebadores  o  iniciadores  de  la  reacción  son 

oligonucleótidos  cortos  (entre  18  y  30 

nucleótidos),  complementarios  a  la  secuencia 

blanco  que  se  desea  amplificar.  Se  utilizan  dos 

cebadores  en  cada  reacción,  cada  uno 

complementario  a  uno  de  las  hebras  del  ADN 

molde,  delimitando  la  región  que  se  desea 

amplificar. A modo de ejemplo: 

 

De la secuencia de estos cebadores dependerá la 

especificidad de la reacción. ¿Veinte nucleótidos 

permiten una  alta  especificidad? Una molécula 

de ADN puede  contener 4  tipos de nucleótidos: 

A,  T,  C  o G.  La  probabilidad  de  encontrar  cada 

uno  de  ellos  es  1/4=0,25,  entonces  la 

probabilidad de encontrar una determinada de n 

bases es  (0,25)n. Un cebador de 20 bases,  tiene 

en  teoría  una  probabilidad  de  (0,25)20=9,9e‐13 

de  ser  encontrada  por  azar.  La  respuesta  a  la 

pregunta planteada más arriba, entonces, es sí.  

Temperatura de anillado. En el segundo ciclo de 

la reacción de PCR, la temperatura utilizada es tal 

que  permite  la  unión  de  los  cebadores  a  su 

secuencia blanco. Esta temperatura se determina 

dependiendo  de  la  temperatura  de 

desnaturalización  o  melting  de  los  mismos.  La 

temperatura de desnaturalización (Tm) se define 

como  la  temperatura  a  la  cual  el  50%  de  las 

moléculas  se  encuentran  desnaturalizadas.  Hay 

varios  algoritmos  que  permiten  calcular  dicha 

temperatura.  En  la  práctica,  una  fórmula  muy 

utilizada es  la  siguiente: Tm=4(G+C)+2(A+T),  (ej: 

para  la  secuencia  AGGTCGTGCA,  la 

Tm=4(4+2)+2(2+2)=32°C,  y  en  general  se  utiliza 

esta temperatura menos 5 grados, como primera 

aproximación a la temperatura de anillado. 

5´….AATCGTAGC………………………………………TACCGTCGAC…..3´

3´….TTAGCATCG……………………………………….ATGGCAGCTG..3´

5´ AATCGTAGC

ATGGCAGCTG     5´Directo

Reverso

ADN Polimerasas:

Las  ADN  polimerasas  son  enzimas  que 

intervienen  en  la  replicación  del  ADN.  Son 

capaces de adicionar dNTPS a partir de  la región 

3’ de un cebador y copiar una secuencia molde.  

Las polimerasas sintetizan el ADN en la dirección 

5'  a  3'.  Ninguna  ADN  polimerasa  conocida  es 

capaz de  comenzar una nueva  cadena. Ella  sólo 

puede  añadir  un  nucleótido  en  un  grupo  3'‐OH 

que ya existe. Por esta razón la enzima precisa un 

cebador  que  presente  un  grupo  3'  ‐OH  al  cual 

puede  añadir  el  primer  nucleótido.  Las  ADN 

polimerasas  requieren Magnesio  como  cofactor 

para ser funcionales.  

En el desarrollo de la técnica, la enzima utilizada 

era una polimerasa aislada de E.coli  (fragmento 

Klenow de la ADN polimerasa I), que presenta su 

actividad óptima a 37 oC, y se inactiva a 94 oC, es 

por ello que en cada ciclo era necesario agregar 

más  enzima.  Luego,  se  sustituyó  por  una 

polimerasa  termoestable  aislada  de  Thermus 

aquaticus  (Taq), una bacteria  termófila que vive 

en  la proximidad de  las  fuentes de agua  termal 

(entre  50  y  80  oC),  es  por  esto  que  su  enzima 

polimerasa es más estable, y permite soportar las 

temperaturas  elevadas  durante  los  ciclos  de  la 

PCR. 

En  la  actualidad  se  han  descrito  y  utilizado 

diferentes polimerasas en  la reacción de PCR. La 

elección  de  la  enzima  dependerá  de  factores 

tales  como:  la  fidelidad de  la  enzima  o  tasa  de 

error  (capacidad  de  producir  errores  o  no 

durante  el  copiado),  la  velocidad  (cantidad  de 

nucleótidos  incorporados  por  segundo  en  la 

cadena  naciente  de  ADN),  la  procesividad 

(capacidad  de  unirse  al  molde),  la  actividad 

exonucleasa  (capacidad  de  corrección  de 

errores), extremos del ADN resultante, etc.  

Figura 3. P

 

3. A

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ncluye 

nzima. 

La  concentración de MgCl2 presente en  la  reacción es una de  las  variables  con  las  cuales  se pueden 

poner a punto algunas reacciones. 

En la realización de la reacción, un punto importante es la homogenización de los reactivos. Las enzimas 

se encuentran en glicerol lo cual las hace más densas y tienden a estar en el fondo del tubo de reacción.  

b. Ciclos y Temperaturas: 

En cuanto a la elección de los ciclos y las temperaturas, los mismos dependerán de la cantidad inicial de 

la secuencia diana que se desea amplificar y las características de composición de bases, tanto del ADN 

blanco  como de  los  cebadores. Típicamente, una  reacción  convencional utiliza 35  ciclos,  siendo  cada 

etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos. El tiempo de extensión también varía 

de acuerdo al  tamaño del  fragmento que  se desea amplificar y  la velocidad de  la enzima  con  la  cual 

estamos  realizando  la  reacción. Cuando  los  fragmentos que  se desea  amplificar  son mayores  a 5000 

bases, la extensión puede necesitar de 5 a 10 minutos. Las temperaturas de desnaturalización utilizadas 

son en general 94 o 95 oC, y la de extensión depende de la enzima utilizada, comúnmente si se utiliza la 

Taq se  recomienda una  temperatura de extensión de 72  oC. La  temperatura de anillado es clave para 

tener éxito en la reacción, esta temperatura depende básicamente de la complejidad del ADN blanco y 

la composición de bases de los cebadores (ver apartado: Cebadores). 

c. Diseño de cebadores: 

Un punto clave de la optimización, quizás el de mayor importancia para realizar una reacción exitosa, es 

el diseño de los cebadores. Algunos puntos a considerar se detallan a continuación. La secuencia de los 

cebadores deberá tener una composición de bases tal que su contenido GC se encuentre entre 40 y 60 

% (esto dependerá de la complejidad del ADN blanco a partir del cual realizaremos la amplificación, por 

lo que no siempre lo podemos respetar). Ambos cebadores deben tener una composición de bases, o al 

menos  un  contenido  GC,  y  un  largo  similar.  Estos  factores  están  implicados  en  la  temperatura  de 

melting, que no debería variar más de 5 oC entre un cebador y el otro. El extremo 3’ del cebador es muy 

importante y se busca que sea una base G o C (lo cual provoca mayor especificidad, debido a que son 

bases que se unen mediante 3 puentes de hidrógeno, en contraste con A y T que se unen mediante 2 

puentes de hidrógeno). En  los extremos 5’ de  los  cebadores, no es necesario que haya un 100 % de 

complementariedad con la secuencia blanco, de hecho pueden adicionarse colas de 10 o más bases que 

luego permiten  la  clonación de estos  fragmentos o  la  secuenciación  con  cebadores universales. Otro 

punto importante a considerar es la capacidad de esos cebadores de hibridarse consigo mismos o entre 

sí. Si un cebador posee una secuencia palindrómica interna, puede formar una horquilla (plegarse sobre 

sí mismo por complementariedad) y de este modo no estar disponible en  la  reacción. Además,  si  los 

extremos  3’  de  ambos  cebadores  son  complementarios  entre  sí,  pueden  dar  lugar  a  dímeros  de 

cebadores, evitando así la amplificación del fragmento deseado y amplificando únicamente los dímeros. 

Generalmente, estos dímeros se forman inespecíficamente y se observan como fragmentos del tamaño 

de  la  suma  del  largo  de  ambos  cebadores.  Finalmente,  para  evitar  la  amplificación  de  secuencias 

inespecíficas,  es  importante  chequear  en  bases  de  datos  de  secuencias  de  ADN  (ej.  GeneBank: 

ww.ncbi.nlm.nih.gov) la posibilidad de amplificación de otros blancos. 

d. Otras consideraciones: 

Otros puntos a tener en cuenta son la calidad y cantidad del molde a partir del cual queremos realizar la 

amplificación. Se recomiendan relaciones espectrofotométricas 260/280 y 260/230 mayores a 1,8‐2,0. 

Estas  medidas  aseguran  una  buena  calidad  de  ADN  con  baja  contaminación  de  proteínas  y  otros 

inhibidores. La utilización de kits de purificación comerciales facilita la obtención de un ADN o ARN (en el 

caso de una RT‐PCR) de buena calidad eliminando muchos de los posibles inhibidores de la reacción. 

e. Contaminación: 

Un punto clave en las reacciones de PCR es la minimización de la posibilidad de contaminación. Debido a 

la sensibilidad de la técnica (dada por la amplificación exponencial de fragmentos), es necesario tomar la 

mayor  cantidad posible de  recaudos para evitarla. En primer  lugar,  lo  ideal es  trabajar en  tres  áreas 

diferentes, separadas en lo posible físicamente, y a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el 

cual una vez llegada a la última área no es posible volver atrás (flujo uni‐direccional). La primera de las 

áreas, con su juego de pipetas exclusivo y zona UV para descontaminación, es para la realización de las 

mezclas de reacción (en esta área sólo debemos hacer  la mezcla que  incluye el tampón de reacción,  la 

enzima,  los dNTPs, el agua y  los cebadores), esta área en general es conocida como área de pre‐PCR. 

Una vez finalizada esta etapa, donde se preparan la cantidad de reacciones necesarias para el trabajo, se 

pasa a la siguiente área, dónde únicamente se agregara tubo a tubo el ADN molde (área PCR). Siempre, 

debemos  incluir  un  tubo  blanco  de  reacción  que  debe  tener  todos  los  componentes  de  la mezcla 

excepto  el molde,  que  sustituiremos  con  agua.  Idealmente  se  pueden  realizar  2  blancos,  uno  que 

cerraremos en el área de pre‐PCR, que permite detectar si 

hay contaminación de  los  reactivos, y otro que dejaremos 

abierto durante toda la manipulación para asegurar que no 

hubo contaminación durante la misma. También, en el caso 

de  contar  con  un  control  positivo,  la  incorporación  del 

mismo en cada  tanda de  reacciones es recomendable. Por 

último  se  pasa  al  termociclador  (ver  apartado: 

Termocicladores)  y  a  la  visualización  de  los  fragmentos 

amplificados  (ver  apartado: Visualización de productos de 

PCR). Esta última área es conocida como área de post‐PCR. 

De  acuerdo  al  flujo  uni‐direccional,  estos  tubos  nunca 

deben pasar al área de pre‐PCR. Se recomienda trabajar con 

túnicas  diferentes  en  cada  área.  Idealmente,  también  se 

puede  hacer  uso  de  presiones  diferenciales  en  las 

diferentes  salas  para  minimizar  los  problemas  de 

contaminación. Como  veremos más  adelante,  la  aparición 

de  la  PCR  en  tiempo  real, minimizó  uno  de  los mayores 

problemas  de  contaminación  al  evitar  la  apertura  de  los 

tubos  una  vez  finalizada  la  reacción  (principal  fuente  de 

contaminación de reacciones). 

Termocicladores:

En los comienzos de la técnica no existían equipos  de  PCR  automatizados,  por  lo cual  se  utilizaban  diferentes  baños termostatizados  (a  las  temperaturas  de desnaturalización, anillado y extensión) y manualmente se cambiaban  los tubos de un  baño  a  otro.  El  primer  equipo desarrollado,  de  hecho,  únicamente automatizó  el  cambio manual  de  tubos. Los  equipos  actuales  constan, básicamente, de un bloque de metal que puede  ser  calentado  o  enfriado rápidamente  (generalmente mediante  el sistema  peltier),  con  posibilidad  de programar  las  temperaturas,  rampas  de subida  y  bajada  de  las  mismas  y  los tiempos  de  cada  etapa  de  los  ciclos,  así como  la  cantidad  de  ciclos.  En  general presentan una  tapa  térmica que  evita  la evaporación  de  la  mezcla  de  reacción durante la etapa de desnaturalización.  

Por  último,  el  trabajo  siguiendo  procedimientos  y  normas  GLP  (Good  Laboratory  Practices)  es 

recomendable para evitar contaminaciones.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Variantes de la PCR 

Una vez que el uso de la PCR se masificó, a partir de la década de 1990, han surgido variantes y nuevas 

aplicaciones a la técnica. El detalle de cada variante escapa a la finalidad del capítulo, por lo cual solo se 

hará mención a alguna de ellas y explicara de forma resumida. 

a. RT PCR: Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN como molde inicial en vez de 

ADN, y emplea una transcriptasa reversa (una polimerasa de ADN‐ARN dependiente) para realizar la 

síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). En esta primera ronda, como cebador se pueden 

utilizar hexámeros (oligonucleótidos de 6 nucleótidos de secuencia aleatoria) que se unen al azar en 

cualquier  región  del  ARN molde,  o  un  oligonucleótido  (en  general  un  oligo  dT)  que  permite  la 

captura y la realización del ADNc a partir del ARNm o ARN con colas poliA. Una vez que se obtiene el 

ADNc, se realiza la reacción de PCR convencional como se detalló más arriba. 

Visualización de productos de PCR: 

El  procedimiento más  común  para  el  análisis  de  los  fragmentos  obtenidos  en  la  PCR  es  la electroforesis,  ya  sea en geles de agarosa o de acrilamida.  La electroforesis permite  separar fragmentos  de  acuerdo  a  su  tamaño.  Los  fragmentos  de  ADN  (cargados  negativamente)  se desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido y son los que vemos más abajo en el gel. La elección de la matriz (agarosa o acrilamida) y el porcentaje en la cual separar los productos, dependerá del tamaño de  los mismos  y  los  largos  diferentes  que  deseemos  separar.  Generalmente,  los  geles  de agarosa  se visualizan agregando Bromuro de etidio, un agente que  se  intercala en el ADN  y fluoresce cuando es expuesto a  la  luz UV, y en el caso de  los geles de acrilamida,  la tinción se realiza con nitrato de plata, que por interacciones electrostáticas se une al ADN.        Ejemplo Gel Agarosa: Gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de Etidio dónde se visualizan productos de amplificación de diferentes tamaños (carriles 1, 2, 3 y 7) entre  250 y 500 bases. En los carriles 3 a 6, el tamaño parece ser el mismo. Sin embargo, la resolución de este tipo de gel no hace posible esta afirmación.  

PM  1     2     3    4     5    6    7

250 pb

500 pb

100 pb

b. PCR anidada o nested: Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR. En este caso 

se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se amplifica de manera convencional con los dos 

cebadores más externos a  la  región que  se desea amplificar. El producto de este primer PCR  se 

utiliza como molde para una segunda ronda que utiliza cebadores internos a la región previamente 

amplificada. La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de contaminación, y además 

no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde presenta en la muestra analizada. 

 

c. PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde 

los  productos  generados  pueden  visualizarse  en  el  sitio  de  amplificación.  Es  realizada  sobre 

preparaciones  fijas  en  un  portaobjetos.  En  la  técnica  de  PCR  in  situ  se  realiza  una  primera 

amplificación  de  ADN  blanco  y  luego  detección  mediante  hibridación  in  situ  convencional  con 

sondas de ADN/ARN. 

 

d. PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos 

o más pares de  cebadores en un único  tubo  con el  fin de amplificar  simultáneamente diferentes 

fragmentos  de  ADN.  Consiste  en  combinar  en  un  único  tubo  de  reacción  todos  los  pares  de 

cebadores  de  las  secuencias  que  queremos  amplificar,  junto  con  el  resto  de  los  reactivos  de  la 

reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola 

reacción,  requiere menor  cantidad  de molde  para  el  análisis  y menor  cantidad  de  reactivos.  Los 

ejemplos de PCR múltiplex  son muy  comunes en el diagnóstico de agentes  infecciosos, donde  se 

intenta  amplificar  varios  tipos  virales  en  el mismo  tubo  y  al mismo  tiempo  (ej. Amplificación  de 

Herpes Virus en muestras biológicas). 

Otras variantes de la PCR incluyen la PCR inversa, PCR de colonia, PCR asimétrica, PCR alelo específica, 

entre otras. 

5. PCR en tiempo real: 

La PCR en tiempo real es hoy una de las variantes más utilizadas. Esta técnica permite, a diferencia del 

PCR convencional,  la cuantificación de  los productos de amplificación, además de otras oportunidades. 

La cuantificación es muy utilizada en lo que refiere al análisis de expresión génica. 

La  PCR  en  tiempo  real  fue  reportada  por  primera  vez  en  un  artículo  de Higuchi  y  colaboradores  (R. 

Higuchi  y  col.,  Biotechnology  1993,  11).  Estos  autores,  utilizando  una  cámara  para  monitorear 

reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron  la acumulación de ADN doble cadena 

en  cada  ciclo  de  PCR,  evidenciado  por  un  incremento  en  la  fluorescencia  producto  de  la  adición  de 

Bromuro de Etidio en la reacción. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número 

de copias de  la molécula que está siendo amplificada, presentes  inicialmente en  la reacción. A menor 

número  de  copias  presentes  inicialmente,  menor  el  número  de  ciclos  necesarios  para  detectar 

fluorescencia.  

Mediante esta variación de  la PCR es posible seguir  la cinética de cada reacción en tiempo real, por  lo 

que permite una cuantificación sensible y específica del blanco que se desea analizar, al utilizar  la fase 

exponenc

cuantifica

En  1997 

Biosystem

destacam

por Qiage

Junto  al 

aproxima

sustituido

presenta 

utilizado 

marcadas

otras alte

A continu

‐ C

‐ Q

‐ C

‐ C

 

a. C

Cómo obs

en cada c

Figura  4. 

utilizando 

Lo que se

curvas de

cial de  la curv

ación.  

surgen  los  p

ms. Desde  en

os el LigthCy

en). 

surgimiento

ciones y estr

o por  el  SYBR

mayor afinida

en  la  actual

s fluorescente

rnativas com

ación nos cen

inética de rea

Químicas utiliz

uantificación 

urvas de desn

inética de rea

servamos en 

orrida de PCR

Curva  de  am

SYBRGreen en

e observa en 

e amplificació

va de amplifi

primeros  equ

tonces han  s

ycler de Roch

o  de  los  eq

rategias para 

R Green, una

ad y especific

idad,  existe 

emente que m

o el diagnóst

ntraremos en

acciones y co

zadas en PCR 

absoluta y re

naturalización

acciones y co

la figura 2 de

R en tiempo r

plificación  rea

 equipo RotorG

la figura 4, co

n de cada un

cación. Adem

uipos  comerc

surgido nume

he  (hoy discon

quipos  de 

detectar  la  f

 molécula qu

cidad que el B

un  amplio  e

muestran may

ico de polimo

n cuatro elem

ncepto de cic

en tiempo re

elativa 

n y detección

ncepto de cic

e este capítu

real que realiz

alizada  con  di

Gene6000. 

orresponde a

na de ellas (10

más, esta técn

ciales  de  PCR

erosos  equip

ntinuado), y 

PCR  en  tiem

fluorescencia

ue  también  s

Bromuro de E

espectro  de 

yor especifici

orfismos punt

entos import

clo umbral 

eal 

 de polimorfi

clo umbral 

lo, la cinética

zamos (figura

luciones  seria

a diluciones s

00.000, 10.00

nica presenta

R  en  tiempo

os  con difere

el RotorGene

mpo  real,  s

. En este sen

se  intercala  e

Etidio. Si bien

estrategias  b

idad y permit

tuales, por ej

tantes: 

ismos 

a de reacción

a  4). 

das  en  base 

eriadas en ba

00, 1.000 y 1

a un amplio r

o  real,  produ

entes  propie

eQ  (producid

surgieron  ta

ntido, el Brom

en  el ADN do

 el SYBR Gree

basadas  en  s

ten además d

emplo. 

 del PCR es l

10  de  un  fra

ase 1:10 del 

00 copias mo

rango dinámi

cidos  por  Ap

dades,  entre

do en  la actua

ambién  difer

muro de Etidi

oble  cadena,

en continúa s

sondas  espec

de la cuantific

o que observ

agmento  de  in

molde inicial,

olde por reac

ico de 

pplied 

e  ellos 

alidad 

rentes 

io  fue 

, pero 

siendo 

cíficas 

cación 

vamos 

 

nterés, 

, y las 

cción). 

La  línea  roja  horizontal  representa  el  valor  umbral  de  intensidad,  a  partir  del  cual  las  muestras 

comienzan su fase exponencial de amplificación. El ciclo umbral de cada muestra, es el ciclo en el cuál 

pasan en el umbral (indicado con la círculo rojo para la muestra de mayor concentración). En el ejemplo, 

queda  clara  la  relación  inversamente proporcional  entre  el  ciclo umbral  y  la  concentración  inicial de 

molde presente en las reacciones. A mayor concentración, antes amplificará la muestra y menor será su 

ciclo umbral. Arriba a la izquierda, en la misma figura, se observa la curva de cuantificación generada a 

partir de estos datos, graficando el ciclo umbral  en las ordenadas y el logaritmo de la concentración en 

las abscisas. Por  lo  tanto, dado una muestra, de  la  cual  se desea  conocer  su  concentración  inicial de 

molde, sólo deberemos interpolar el ciclo umbral de esa muestra en nuestra gráfica de cuantificación y 

obtener un valor de concentración (esto lo veremos con más detalle cuando hablemos de cuantificación 

absoluta). 

b. Químicas utilizadas en PCR en tiempo real: 

Cómo mencionamos antes existen diferentes aproximaciones que utilizan la fluorescencia para medir la 

cinética del PCR, una forma de clasificarlos es la siguiente: 

‐ Agentes intercalantes: En este caso, se utilizan moléculas fluorescentes que aumentan su emisión 

cuando se unen al ADN doble cadena, es el caso del Bromuro de Etidio y SYBR Green. La desventaja 

de  esta  estrategia  es  la  inespecificidad,  ya  que  los  agentes  intercalantes  se  unen  a  cualquier 

producto que este siendo producido durante la reacción, ya sea el específico que queremos medir, 

como productos inespecíficos, dímeros de cebadores, etc. Otra desventaja de esta estrategia es que 

no  puede  utilizarse  en  reacciones multiplex.  Como  veremos más  adelante  en  este  capítulo,  es 

posible  realizar  curvas  de  desnaturalización  y  evidenciar  presencia  de  dímeros  de  cebadores, 

aunque no es posible eliminar esa señal que será un ruido en nuestras medidas, cuando deseemos 

cuantificar. La ventaja de utilizar agentes intercalantes radica en que puede utilizarse para cualquier 

reacción de PCR y que es económico. 

‐ Sondas: La utilización de sondas mejora sensiblemente la especificidad del método. Hay diferentes 

estrategias que se basan en sondas (Taqman, FRET, Molecular beacon, etc.). Aquí desarrollaremos 

únicamente las sondas de hidrólisis (ej.: Taqman) y las de hibridación (ej.: FRET) ya que son las más 

utilizadas. 

Sondas Taqman: 

Las sondas Taqman se hibridan de manera específica a una secuencia del producto de amplificación. 

En uno de  los extremos de  la  sonda  (el 5’)  se encuentra unido un  fluorocromo  reportero el  cual 

mientras  la  sonda  permanece  intacta  la  emisión  es  “apagada”  o  quencheada  por  una  segunda 

molécula  unida  al  extremo  opuesto  de  la  sonda  (el  3’).  Esta molécula  es  un  quencher,  es  decir 

absorbe  la  emisión del  fluorocromo  reportero pero no  la  emite.  Entonces,  cuando  la  sonda  está 

intacta no hay emisión del fluorocromo (Figura 5).  

 

 

 

Cuand

direct

separ

fluore

emisió

Figura 6. Ela enzima ade ADN rec

Sonda

Las  so

pero e

el ext

fluoro

de  on

excita

sonda

(Figur

Figura  5. amplificaclos cebad

do  se  produc

to o  forward

rando  físicam

escencia.  Cuá

ón de luz (Fig

squema de la a partir del cebcién sintetizad

as FRET: 

ondas FRET  t

en este caso 

tremo 3’ y en

ocromo unido

nda  emisión 

ación del  seg

as  se  aproxim

ra 7).  

Esquema  de ción, con el fluores forward (

ce  la  amplifi

)  la actividad

mente  el  flu

ánto mayor  c

gura 6). 

estrategia de sbador forward a.  

también  se h

se trata de d

n  la segunda s

o al extremo 

del  fluorocr

undo  fluoroc

man,  se  excit

la  estrategia uorocromo unidF) y reverso (R

cación,  come

d 5’‐3’ exonu

uorocromo  y

cantidad  de 

sondas Taqman(F), y el fluoro

ibridan de m

os sondas. En

sonda, que d

5´. Las carac

romo  de  la 

cromo. En est

ta  el  primer 

de  sondas  Tado al extremo R). 

enzando  desd

cleasa de  la 

y  el  quenche

producto  ge

n. Se muestra ocromo separad

manera espec

n la primera d

debe hibridar 

cterísticas de 

primera  son

te caso,  se d

fluorocromo

aqman.  Se mu5’ (F) y el quen

de  uno  de  lo

enzima ADN

er,  permitie

enerado, may

la sonda degrado del quench

cífica dentro 

de las sondas

cerca de  la a

los fluorocro

nda,  coincide

da un  interca

o  pero  se  ob

uestra  la  sondncher en el 3’ 

os  cebadores

 polimerasa 

ndo  ahora 

yor  sonda  de

adada, luego der. En naranja

del producto

s se adiciona u

anterior, se a

omos son tale

  con  la  long

mbio de ene

bserva  la  em

da  intacta,  an(Q). Se muestr

s  (en  este  ca

degrada  la  s

sí  la  emisió

egradada  y m

e la amplificac se muestra la 

o de amplifica

un fluorocrom

agrega un seg

es, que  la  lon

gitud  de  ond

ergía, y cuánd

isión  del  seg

tes  de  producra el sitio de un

aso  el 

sonda, 

ón  de 

mayor 

ción de hebra 

ación, 

mo en 

gundo 

ngitud 

da  de 

do  las 

gundo 

cirse  lanión de

Figura  7. 

fluorocrom

equipo, pe

emite en u

En es

tempe

intera

en  la 

ejemp

que la

tempe

estem

desna

ejemp

espec

increm

Algun

Al  igu

conve

tiemp

como

Guan

sonda

recom

cebad

simila

fluore

perm

sonda

 

Esquema  de  l

mos sobre una 

ero al estar pró

una longitud de

te caso,  las s

eratura de la

actuar aumen

posibilidad d

plo, la identif

a mutación q

eratura  de  d

mos  amplific

aturalización 

plo más adela

cificidad  aún 

mento de la s

nos tips en el d

ual que en el

encional, el b

po real. Las so

o cebador. Ad

ina,  ya  que 

as deben ser 

mienda  que 

dores). En el c

ares,  ya  que

escencia. La d

itir  el  interca

as FRET, la en

a  estrategia  d

de las hebras 

óximo la segun

e onda mayor, 

sondas no se 

 reacción. A 

ntando la inte

de  realizar  cu

ficación de po

ue queremos

desnaturalizac

cando  y  est

la presencia e

ante). Tambié

mayor debid

sensibilidad p

diseño de son

 diseño de  lo

uen diseño d

ondas deben 

demás no se 

esta  base  tie

tales que es

se  encuentr

caso de las so

e  ambas  deb

distancia entr

ambio  de  en

zima no debe

de  sondas  FRE

del ADN. El flu

nda sonda la en

que es la dete

degradan, si

mayor cantid

ensidad de se

urvas de desn

olimorfismos 

s detectar se 

ción  de  la  s

te  hecho  h

en homocigos

én permite cu

do  a que util

roducto del F

ndas: 

os  cebadores

e las sondas 

tener su extr

recomienda 

ene  propieda

tén unidas a

re  10  grados

ondas FRET, l

ben  estar  un

re sondas (en

nergía  de  fluo

e poseer activ

ET.  Se muestr

uorocromo ver

nergía emitida 

ectada por el eq

no que se hib

dad de produ

eñal. Una de l

naturalización

puntuales (S

encuentra en

onda  será  d

hace  que  p

sis, heterocig

uantificar, al ig

izamos dos  s

FRET.  

s  se  juega gra

es fundamen

remo 3’ fosfo

que  la base 

ades  de  quen

l molde cuan

s  por  encim

as temperatu

nidas  al  mo

n el caso de F

orescencia.  A

vidad exonuc

ra  la  interacció

rde se excita a

por él es tran

quipo.  

bridan y desh

cto generado

as ventajas d

n al  finalizar 

SNPs). Si diseñ

n la región de

iferente  para

podamos  dis

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e PCR 

e PCR 

actuar 

a una 

de  las 

DN  (se 

de  los 

en ser 

al  de 

, para 

remos 

s. 

c. Cuantificación absoluta y relativa: 

La cuantificación absoluta, es aquella en la cual se utiliza una curva estándar construida a partir de 

concentraciones conocidas del blanco que se desea amplificar y cuantificar. Es la estrategia elegida 

en muchos kits comerciales de PCR en tiempo real para cuantificar cantidad de virus presentes en 

muestras biológicas  (ej. Carga viral de HIV, HCV). Como comentamos más arriba,  se aprovecha  la 

relación  entre  el  ciclo  umbral  y  la  concentración  inicial  de  molde  presente  en  las  muestras  o 

estándares.  

Las  curvas  de  calibración  son  altamente  reproducibles,  específicas  y  sensibles.  Sin  embargo 

debemos  asegurarnos  la  calidad  de  los  estándares  que  utilizamos  ya  que  de  ellos  depende  el 

resultado final de la cuantificación. El rango dinámico de cuantificación puede llegar a 9 órdenes de 

magnitud (ej. 102 – 1011 copias iniciales de ácido nucleico).  

En el caso de  los kits de diagnóstico, muchas veces se utiliza un control  interno que se agrega a  la 

muestra  antes  de  ser  extraído  el  ácido  nucleico  (ARN  o  ADN),  que  sigue  todo  el  proceso  de 

extracción  y  amplificación.  Idealmente  este  control  interno  debe  amplificarse  con  los  mismos 

cebadores que el blanco que se desea cuantificar. En estos casos se utilizan sondas, específicas para 

cada uno de los amplicones, marcadas con moléculas fluorescentes con diferentes propiedades que 

permita distinguirlos. Una estrategia de cuantificación implica la realización de dos curvas estándar, 

uno para cada blanco (el de interés y el control interno) y luego una cuantificación relativa al control 

interno  que  se  agregó  al  comienzo  del  procesamiento  de  la  muestra,  lo  cual  asegura  una 

cuantificación precisa considerando las pérdidas de material durante la extracción. 

La cuantificación relativa es  la estrategia utilizada para estudiar  los cambios en  la expresión génica 

entre  diferentes muestras.  En  este  caso,  se  realiza  una  RT‐PCR  en  tiempo  real,  la  que  permite 

determinar los cambios de los niveles de expresión de un determinado gen en diferentes muestras y 

se  expresa  el  resultado  relativo  a un mensajero que no  cambia durante  el proceso que  estamos 

estudiando (ej. un gen housekeeping) o un control interno que agregamos a cada muestra (como en 

el caso que mencionamos en el párrafo anterior).  

Existen  diferentes  modelos  matemáticos  para  hacer  estudios  de  expresión  génica  diferencial 

mediante cuantificación relativa. Aquí mostraremos dos métodos, uno de ellos no tiene en cuenta la 

eficiencia de la reacción de PCR y el otro sí tiene en cuenta este factor. En el primer caso se asume 

una eficiencia de 100 % (es decir que el blanco de amplificación se duplica en cada ciclo): Ecuación 1.  

Ecuación 1.    R = 2 –(ΔCt gdi – ΔCt gh)Experimental – (ΔCt gdi – ΔCt gh)Control = 2 –( ΔΔCt )    

Dónde gdi=gen de interés y gh =gen housekeeping, de este modo, se obtiene una relación entre dos 

condiciones  (experimental  vs.  control)  para  un  gen  de  interés  utilizando  para  normalizar  un  gen 

housekeeping. (Referencia: Livak and   Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using 

Real‐Time Quantitative PCR and the ΔΔCt Method . Methods 25, 2001). 

 

En el segundo caso, se realiza una corrección basándose en  la eficiencia de cada reacción  (para el 

gen de interés y para el gen normalizador): Ecuación 2. 

 Ecuación 2.    R = Eficiencia gdi –(ΔCt gdi Control – ΔCt gdi Muestra)                                   Eficiencia gh –(ΔCt gh Control – ΔCt gh Muestra) )   

En  este método  desarrollado  por  Pfaff  y  colaboradores  (Nucleic  Acids  Res.  2001  29(9):  E45),  se 

considera  la eficiencia de  la amplificación de cada uno de  los blancos que se analizan. Para ello se 

realiza  una  curva  de  calibración  (sin  necesidad  de  conocer  realmente  la  cantidad  de moléculas 

iniciales  en  la  reacción,  sino  haciendo  diluciones  seriadas  a  partir  de  un  stock)  y  a  partir  de  la 

pendiente de esta curva se calcula la eficiencia de la reacción mediante la Ecuación 3:  

Ecuación 3. Eficiencia (E) = [10 (‐1/pendiente)] ‐1 

De esta manera se realiza una aproximación más realista, ya que la eficiencia de un experimento de 

PCR difícilmente alcance el 100% como plantea el primer método. 

d. Curvas de desnaturalización y detección de polimorfismos puntuales. 

Las  curvas  de  desnaturalización  pueden  realizarse  cuando  se  utilizan  agentes  intercalantes  y  en 

estrategias con sondas de hibridación (no en el caso de sondas de hidrólisis). Estas curvas se realizan 

al finalizar la reacción, es decir, cuando las reacciones alcanzan la fase plateau. Para ello se  aumenta 

la  temperatura  gradualmente  desde  por  ejemplo  50‐60  oC  hasta  95  oC.  De  esta  manera,  los 

productos que se encuentran hibridados, y con una  intensidad de fluorescencia alta (ya sea por el 

agente  intercalante  o  por  la  sonda  hibridada)  comienzan  a  desnaturalizarse  provocando  que  el 

agente  intercalante del ADN doble cadena, o que  las sondas se separen de su blanco, este hecho 

provoca  una  disminución  de  la  señal  de  fluorescencia  que  puede  seguirse  en  función  de  la 

temperatura. Cuando hay un punto de  inflexión en esta curva (Figura 8), el mismo corresponde al 

punto de desnaturalización o temperatura de melting (Tm). Al calcular  la derivada de  la Intensidad 

de  fluorescencia  en  función  de  la  Temperatura,  y  graficarla  nuevamente  en  función  de  la 

temperatura se observan gráficas como las de la Figura 9. 

 

Figura 8. Curva de desnaturalización. Se gráfica  la  fluorescencia en  función de  la  temperatura. Las  líneas verdes corresponden  a  las  muestras  de  la  Figura  4.  La  línea  negra  es  la  curva  correspondiente  a  un  blanco  de amplificación.  

 

Figura  9.  Curva  de  desnaturalización  derivatizada.  Se  gráfica  la  derivada  de  la  fluorescencia  en  función  de  la temperatura en las ordenadas, y la temperatura en las abscisas. Lo que se observa es un pico correspondiente a la Tm para las muestras en verde. En negro, el blanco de reacción presenta un pico de menor Tm que se corresponde con la presencia de dímeros de cebadores.  

La  posibilidad  de  realizar  este  tipo  de  curvas  permite  distinguir  la  presencia  de  dímeros  de 

cebadores en la reacción o productos inespecíficos que presentan, en general, una temperatura de 

desnaturalización  menor  que  la  del  blanco  específico.  En  la  Figura  9,  puede  verse  un  pico  de 

desnaturalización en la muestra que corresponde al blanco de reacción, dónde al no haber muestra 

para amplificar se favorece la formación de dímeros. Por lo tanto, en este caso, se observa una señal 

de amplificación en las curvas de amplificación, que no implica una contaminación de la muestra ya 

que no hay un pico a la Tm esperada. 

Por último es posible detectar polimorfismos puntuales mediante  la realización de estas curvas, ya 

sea  utilizando  sondas  de  hibridación,  como  con  una  nueva  generación  de  agentes  intercalantes 

(Sito9® Green  Fluorescent nucleic  acid  stain o  EvaGreen® dye)  y  la posibilidad de  los equipos de 

realizar curvas de desnaturalización más precisas (HRM: por high resolution melting) (Figura 10). 

ºC72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96

Flu

ores

cenc

e

15

10

5

0

ºC73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

dF/d

T

2

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1

0,5

0

Figura 10. 

caso de un

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diferencias

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alelo muta

En el 

sonda

dismi

Figura 11. 

el caso de 

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ambos pico

 

 

 

 

Curvas de   de

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s  y  es  más  f

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de al homocig

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a en el caso d

nución en la t

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una mutación 

sponde a un h

os, a un hetero

esnaturalizació

puntual G por 

ostrando  la  d

fácil  determin

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de estar pres

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snaturalización

puntual G por

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ón obtenidas c

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nar  los  difere

Las  curvas  e

en azul el hete

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de desnatura

n obtenida con

r A y se muestr

rmal,  la curva 

 mutación estu

con HRM. Se o

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ntes  genotipo

en  rojo  corre

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ran los tres pos

verde a un ho

udiada). 

 

observa  los dif

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muestra  norma

os  (imágenes 

esponden  al 

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os alelos que 

Se observa los

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omocigota mu

ferentes punto

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al,  en  este  ca

obtenidas  de

homocigota 

(es decir un al

provoca una 

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s diferentes pu

os (en este cas

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n en el 

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verde 

G‐ y un 

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xión en 

a curva 

uestra 

Comentarios finales: 

Para  finalizar este capítulo mencionaremos algunas de  las aplicaciones de  la PCR y PCR en tiempo 

real. Las mismas abarcan desde la investigación básica hasta la aplicada, pasando por el diagnóstico 

humano a  la detección de Organismos Genéticos Modificados en vegetales. Algunos ejemplos de 

aplicaciones del PCR son:  

Investigación: 

‐ Clonación 

‐ Búsqueda de nuevos genes 

‐ Metagenómica 

‐ Análisis filogenéticos 

‐ Análisis de ancestría 

‐ Análisis de expresión diferencial 

‐ etc.  

Diagnóstico: 

‐ Detección  de  mutaciones  puntuales  e  Inserciones/Deleciones  asociadas  a  enfermedades 

genéticas 

‐ Análisis de parentesco 

‐ Cuantificación viral 

‐ Pronóstico  de  enfermedades  mediante  análisis  de  cuantificación  de  la  expresión  de 

determinados genes. 

‐ etc. 

   

Lecturas recomendadas:  1. Mullis  y  colaboradores.  Specific  Enzymatic  Amplification  of  DNA  In  Vitro:  The  Polymerase  Chain 

Reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263‐73.).  2. Saiki y colaboradores. Enzymatic amplification of  β‐Globin genomic  sequences and  restriction  site 

analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350‐4. Primer artículo publicado  dónde  se  describe método  de  PCR.  Y  se  observa  una  aplicación  directa.  Este  grupo incluye a Mullis, y a otros investigadores que participaron en la puesta a punto de la técnica y la hicieron posible. Más allá que se considere a Mullis el autor conceptual de la técnica.  

3. Nobel Lecture: Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method. 13 octubre 1993.  

4. Wilhelm y Pingoud. Real‐Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem 2003, 4, 1120‐1128 5. Espinosa Asuar Laura. 2007. Guía práctica sobre  la  técnica dePCR. En: L. E. Eguiarte, V. Souza y X. 

Aguirre (ed Ecología molecular. INE, CONABIO y UNAM.) 6. Livak y  Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real‐Time Quantitative PCR and 

the 2‐[Delta][Delta]CT Method. Methods,25(4):402‐408, 2001. 7. Michael Pfaff. A new mathematical model  for  relative quantification  real‐time PCR. Nucleic Acids 

Research, 29(9):2002‐2007, 2001. 8. Stephen A. Bustin. A‐Z of Quantitative PCR.  International University Line (ISBN 0‐9636817‐8‐8).  

Otros recursos interesantes:  

1. www. Karymullis.com (página personal de Kary Mullis) 

2. http://www.gene‐quantification.info/  (página  web  realizada  y  mantenida  por  Pfaff  y 

colaboradores con mucho material sobre la PCR en tiempo real). 

3. www.idt‐dna.com  (página web de  la  empresa  IDT, proveedora de oligonucleótidos,  se puede 

encontrar material educativo y software para el diseño de cebadores y sondas). 

4. www.wikipedia.com