PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ......

45
End End point point PCR PCR vs vs quantitative Real quantitative Real-Time PCR Time PCR quantitative Real quantitative Real-Time PCR Time PCR

Transcript of PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ......

Page 1: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

End End pointpoint PCR PCR vs vs

quantitative Realquantitative Real --Time PCRTime PCRquantitative Realquantitative Real --Time PCRTime PCR

Page 2: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Questa tecnica, utilizzando i principi della Questa tecnica, utilizzando i principi della

ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction

Questa tecnica, utilizzando i principi della Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, duplicazione del DNA,

permette di ottenere in poco tempo permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specificonotevoli quantità di materiale specifico

Page 3: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR CyclesPolymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles

22 copiescopies 44 copiescopies 88 copiescopies

DNADNAfragmentfragment

to beto beamplifiedamplified

22 copiescopies 44 copiescopies 88 copiescopies

Resa: 2Resa: 2 n n

Page 4: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio

Amplificazione selettiva in vitro di una sequenza di DNA target

COMPONENTI DELLA REAZIONE COMPONENTI DELLA REAZIONE DIDI PCRPCR:

1)1) Sequenza di DNA targetSequenza di DNA target

2)2) DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile ((TermophilusTermophilus2)2) DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile ((TermophilusTermophilusaquaticusaquaticus, , TaqTaq polimerasipolimerasi))

3)3) Due Due PrimersPrimers, , oligonucleotidioligonucleotidi sintetici (20sintetici (20--25 25 bpbp) ) complementari a sequenze fiancheggianti il tratto complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiaredi DNA da studiare

4)4) dNTPsdNTPs

5)5) Ioni Mg++Ioni Mg++

Page 5: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio

CICLI TERMICI:CICLI TERMICI:

DENATURAZIONEDENATURAZIONE(94(94--9696°°C)C)

ANNEALINGANNEALING(50(50--6565°°C)C)

EXTENSIONEXTENSION(72(72°°C)C)

Page 6: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Il campione si sottopone al numero di cicli stabili ti (30Il campione si sottopone al numero di cicli stabili ti (30--40), 40), alla alla fine della reazione fine della reazione un’aliquota si sottopone ad un’aliquota si sottopone ad

elettroforesi su gel di elettroforesi su gel di agorosioagorosio per verificare:per verificare:

1.1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in molecolare in bpbp mediante mediante ladderladder))

2.2. L’assenza di frammenti aspecificiL’assenza di frammenti aspecifici

END POINT PCREND POINT PCR

2.2. L’assenza di frammenti aspecificiL’assenza di frammenti aspecifici3.3. La quantità di amplificato ottenuto (proporziona le La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale

all’intensità della banda)all’intensità della banda)

Page 7: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

PCR PHASES

All the

L’amplificazione di ogni target è definita da 3 fas i: 1 – esponenziale; 2 – lineare; 3 – plateau.

Cycle

All reagents are present

Some of the reagents start wearing out

All the reagents finished

Page 8: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

PCR: PCR: effettoeffetto plateauplateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito ”, Il processo di duplicazione non procede “all’infinito ”, esso è limitato da: esso è limitato da:

Quantità dei Quantità dei primersprimers, , dNTPdNTP, MgCl, MgCl 22, Buffer, BufferAttività della Attività della TaqTaq polimerasipolimerasiReannealingReannealing dei filamentidei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremen to nei Raggiunto il plateau non si osserva più un incremen to nei prodottiprodotti

Page 9: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

La PCR end-point non è un metodoquantitativo ma qualitativo.

Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è proporzionale all’intensità della banda ottenuta.all’intensità della banda ottenuta.

Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo.

Page 10: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Polymerase Chain Reaction: Polymerase Chain Reaction: vantaggivantaggi

1) Velocità e facilità d’usoIn poche ore si possono ottenere milioni di copie In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA targetdella sequenza di DNA target

2) Sensibilità2) SensibilitàVirtualmente è possibile utilizzare il DNA di una Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come singola cellula come templatetemplate (contaminazione)(contaminazione)

3) RobustezzaAmplificazione possibile anche utilizzando DNA di Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualitàbassa qualità

Page 11: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction : : svantaggisvantaggi

1) Solo sequenze noteNecessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers.

2) Dimensioni e quantità limitateDimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kbQuantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio.

3) Proofreading3) ProofreadingTaqTaq polimerasi manca dell’attività 3’polimerasi manca dell’attività 3’→→5’ 5’ esonucleasicaesonucleasica, 20 cicli di , 20 cicli di reazione su un frammento di 1 reazione su un frammento di 1 kbkb produrranno produrranno ∼∼40% di frammenti con 40% di frammenti con una mutazione puntiforme (una mutazione puntiforme (∼∼1/10000).1/10000).

4)4) Analisi in End Point ed effetto PlateauAnalisi in End Point ed effetto PlateauPer analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione; Per analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione; raggiunta la fase di plateau la quantità di amplificato non è più raggiunta la fase di plateau la quantità di amplificato non è più proporzionale alla concentrazione iniziale di campioneproporzionale alla concentrazione iniziale di campione..

Page 12: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

SoluzioniSoluzioni�� UtilizzareUtilizzare ii datidati ottenutiottenuti durantedurante lala fasefase esponenzialeesponenziale inin cuicui ilil

prodottoprodotto didi PCRPCR èè proporzionaleproporzionale alal templatetemplate inizialeiniziale

�� QuestoQuesto èè resoreso possibilepossibile mediantemediante ilil rilevamentorilevamento didi unaunafluorescenzafluorescenza ilil cuicui accumuloaccumulo seguesegue lala stessastessa cineticacinetica delladellareazionereazione didi PCRPCR ee cheche,, quindiquindi,, èè proporzionaleproporzionale alal prodottoprodotto didiPCRPCRPCRPCR

�� SiSi utilizzanoutilizzano particolariparticolari termociclatoritermociclatori inin gradogrado misuraremisurare lalafluorescenzafluorescenza emessaemessa dada particolariparticolari fluoroforifluorofori adad ogniogni ciclociclo..

Quantitative RealQuantitative Real--time PCRtime PCR

Page 13: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Quantitative RealQuantitative Real--time PCRtime PCR

Tecnica che consente la simultaneaamplificazione e quantificazione del DNAtarget.

AMPLIFICAZIONE:AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR

QUANTIFICAZIONE:QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato.

Page 14: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Real-Time PCR: la reazione

COMPONENTI DELLA REAZIONE:

1) DNA target

2) DNA polimerasi 2) DNA polimerasi

3) Due oligonucleotidi

4) dNTPs

5) Fluorocromo

Page 15: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Perché RealPerché Real--Time?Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale durante lafase esponenziale della PCR, quando cioèl'efficienza di amplificazione è influenzataminimamente dal le var iabi l i d i reazione,permettendo di ottenere risultati molto piùaccurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

Page 16: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea
Page 17: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di

diverse possibili reazioni chimiche

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Realper PCR Real--TimeTime

•Le chimiche principali sono basate sia sul legame dicoloranti fluorescenti che si intercalano al dsDNA, come ilSYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Page 18: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

SYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR Green

Page 19: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

SYBR Green ISYBR Green: principioSYBR Green: principioUtilizzaUtilizza unauna molecolamolecola fluorescentefluorescente non non specificaspecifica cheche sisilegalega al al solcosolco minoreminore didi tuttetutte le le molecolemolecole didi dsDNAdsDNA..

Page 20: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR GreenSYBR Green

Page 21: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR GreenSYBR Green

Page 22: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’aumento del

numero di copie dell’amplicone

SYBR GreenSYBR Green

Page 23: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

SYBR greenSYBR green

�� MetodicaMetodica semplicesemplicePossonoPossono essereessere utilizzatiutilizzati primers in primers in usouso in in qualitativaqualitativa

�� Non Non costosacostosa

�� NonNon--specificaspecifica�� LaLa molecolamolecola fluorescentefluorescente sisi legalega randomrandom aa tuttetutte lele

doppiedoppie elicheeliche,, includendoincludendo ii dimeridimeri didi primersprimers�� ÈÈ necessarionecessario ottimizzareottimizzare lala metodicametodica perper evitareevitare lala

f o r m a z i o n ef o r m a z i o n e d id i p r o d o t t ip r o d o t t i a s p e c i f i c ia s p e c i f i c i

Page 24: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Curva di dissociazioneCurva di dissociazioneDopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldat i

e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

Page 25: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Curva di dissociazioneCurva di dissociazione••T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’a mplimeroamplimero..

••La presenza di una o più curve di dissociazione dip ende dal fatto che la La presenza di una o più curve di dissociazione dip ende dal fatto che la popolazione di popolazione di amplimeriamplimeri sia omogenea o eterogenea.sia omogenea o eterogenea.

••L’ampiezza del picco è proporzionale alla quantità di amplificato.L’ampiezza del picco è proporzionale alla quantità di amplificato.

Page 26: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

TaqManTaqManTaqManTaqMan

Page 27: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

TaqManTaqManLaLa RealReal--TimeTime PCRPCR sisi puòpuò realizzarerealizzare mediantemediante l’impiegol’impiego::

� coloranti intercalanti (( eses.. SYBRSYBR green),green), cheche sisi leganolegano

i ni n m a n i e r am a n i e r a a s p e c i f i c a aa t u t t ot u t t o i li l D N AD N A

� sonde ad ibridazione ,, specifiche perper ilil frammentoframmento didii n t e r e s s e ,i n t e r e s s e , m a r c a t em a r c a t e c onc on mo l e c o l emo l e c o l e f l u o re s c e n t if l u o re s c e n t ii n t e r e s s e ,i n t e r e s s e , m a r c a t em a r c a t e c onc on mo l e c o l emo l e c o l e f l u o re s c e n t if l u o re s c e n t i

Esistono diversi tipi di sonde:Esistono diversi tipi di sonde:DualDual--labeledlabeled (come le sonde TaqMan) (come le sonde TaqMan) Molecular beaconsMolecular beaconsScorpion Scorpion Sonde FRETSonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Page 28: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Sonde TaqManSonde TaqManLaLa sondasonda didi tipotipo TaqManTaqMan èè unun oligonucleotideoligonucleotide che,che, comecome ii

primersprimers delladella PCR,PCR, vieneviene disegnatodisegnato perper essereesserecomplementarecomplementare allaalla sequenzasequenza bersagliobersaglio dada amplificareamplificare

R Q

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’inter no La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’inter no del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR

Primer

Primer3’3’

3’3’

3’3’3’3’

5’5’

5’5’5’5’

5’5’

R Q

5’5’ 3’3’

Page 29: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea
Page 30: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Forward

ProbeReverse

Page 31: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Sonda TaqManSonda TaqManPresenta all’estremità 5’ un fluoroforo “ Reporter ”ed all’estremità 3’ una molecola “ Quencher ”

5’ 3’

Page 32: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

ReporterReporter--QuencherQuencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette

fluorescenza 3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che

spegne la fluorescenza del reporter

R Q

5’ 3’

R Q

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

Page 33: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

ReporterReporter--QuencherQuencher

Dye Quencher

5,6 FAM BHQ-1/TAMRA

HEX/JOE BHQ-2

Texas Red/ROXBHQ-2

Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)

6-carbossifluoresceina

6-carbossitetrametilrodamina

Page 34: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

R Q

3’3’

5’5’

RQ

Real-Time PCR: attività 5’>3’ esonucleasica

Q

3’ 5’5’

R Q

3’ 5’5’

Page 35: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Forward primer

Reverse primer

Probe

L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati

Reverse primer

Page 36: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

RTRT--PCR quantitativaPCR quantitativa

PlotPlot linearelineare

••La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazion e La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazion e viene rilevata e analizzata tramite computer.viene rilevata e analizzata tramite computer.

Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza

Cicli di PCR Cicli di PCR

Page 37: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Plot di amplificazioneN

orm

alis

ed re

port

er fl

uore

scen

ce (R

n) L i n e a s o g l i a s c e l t a

d a l l ’ o p e r a t o r eIn maniera da intersecarele curve di tutti i campioninella fase esponenziale

PCR cycle number

Nor

mal

ised

repo

rter

fluo

resc

ence

(R

E’ il ciclo della reazione diamplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione èmaggiore rispetto a quellod e l l a T h r e s h o l d

Indica il valore al disopra del qualeinizia l’accumulo diu n a m p l i f i c a t o

Page 38: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Curve di amplificazioneCurve di amplificazione

Plot lineareF

luor

esce

nza

Cicli di amplificazione

Flu

ores

cenz

a

Per ogni campione si ottiene una curva di amplifica zione il cui C T(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla

quantità di template iniziale

Page 39: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

QuantificazioneQuantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto

�Necessita di standard di cui si conosce la concentr azione

assoluta (utilizzo di una standard curve)

�Per tutti gli unknowns devono essere saggiate ident iche

quantità di campioniquantità di campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T

�Necessita di controlli endogeni (non si utilizza un a

standard curve)

�Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro

∆∆∆∆CT con quello del controllo endogeno

Page 40: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Quantitativa assolutaQuantitativa assoluta

10 610 5

10 410 3

10 210 1

Ct

unknown sample

35

25

10 715

2 3 4 5 6 7

log10 template quantity

3500 copies

1

IlIl valorevalore cosìcosì ottenutoottenuto vieneviene normalizzatonormalizzato rispettorispetto aa quelloquello didi unungenegene espressoespresso costitutivamentecostitutivamente ((ββ--actina,actina, GAPDH,GAPDH, ATPs,ATPs, ββ22 etcetc))

Page 41: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il

cambiamento di espressione di un gene target in un campione

rispetto ad un altro campione scelto come calibratore.

Quantitativa relativaQuantitativa relativa

Plot di amplificazione

Numero di cicli

∆∆∆∆CT

SampleControl

Page 42: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:

• TARGETTARGET – La sequenza di DNA da analizzare.

• CALIBRATORECALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi

comparativa (Trattato/non Trattato , campione al T0 in uno studio time course)

Quantitativa relativaQuantitativa relativa

• CONTROLLO ENDOGENOCONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i

campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di

DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.

Page 43: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

Quantitativa relativa: analisi dei datiQuantitativa relativa: analisi dei dati

�� Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso espresso costitutivamentecostitutivamente (( ∆∆∆∆∆∆∆∆CCTT))

� Comparare ciascun ∆∆∆∆CT così ottenuto con il ∆∆∆∆CT di un calibratore (cb) ( ∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

22-- ((∆∆∆∆∆∆∆∆CT,rCT,r-- ∆∆∆∆∆∆∆∆CT,CT,cbcb )= 22-- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT

�� IlIl valorevalore cosìcosì ottenutoottenuto permettepermette didi determinaredeterminare lalac o n c e n t r a z i o n ec o n c e n t r a z i o n e r e l a t i v ar e l a t i v a d e ld e l t a r g e tt a r g e t

Page 44: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

StepStep per il calcolo del per il calcolo del 22 -- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT

1.1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)Ct gene interesse – Ct HK = ∆Ct

2. Normalizzazione con il calibratore ∆Ct Campione – ∆Ct Calibratore = ∆∆Ct

3.3. Applicare la formula Applicare la formula 22-- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT

Page 45: PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ... Quantitative RealQuantitative Real--time PCR time PCR Tecnica che consente la simultanea

ESEMPIOESEMPIOCampione Ct HK Ct gene terget

(IL-10)

Brain (calibratore) 14 32

Liver 16 28

Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?

1. ∆Ct Brain = 181. ∆Ct Brain = 18

∆Ct Liver = 12

2. ∆Ct campione – ∆Ct calibratore = 12-18 = -6

3. 2- ∆∆CT = 26 = 64

L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!