PCR & RealTime [modalità compatibilità] di Biotecnologie... · duplicazione del DNA, ......
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End End pointpoint PCR PCR vs vs
quantitative Realquantitative Real --Time PCRTime PCRquantitative Realquantitative Real --Time PCRTime PCR
Questa tecnica, utilizzando i principi della Questa tecnica, utilizzando i principi della
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).
PCR - Polymerase Chain Reaction
Questa tecnica, utilizzando i principi della Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specificonotevoli quantità di materiale specifico
Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR CyclesPolymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles
22 copiescopies 44 copiescopies 88 copiescopies
DNADNAfragmentfragment
to beto beamplifiedamplified
22 copiescopies 44 copiescopies 88 copiescopies
Resa: 2Resa: 2 n n
Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio
Amplificazione selettiva in vitro di una sequenza di DNA target
COMPONENTI DELLA REAZIONE COMPONENTI DELLA REAZIONE DIDI PCRPCR:
1)1) Sequenza di DNA targetSequenza di DNA target
2)2) DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile ((TermophilusTermophilus2)2) DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile ((TermophilusTermophilusaquaticusaquaticus, , TaqTaq polimerasipolimerasi))
3)3) Due Due PrimersPrimers, , oligonucleotidioligonucleotidi sintetici (20sintetici (20--25 25 bpbp) ) complementari a sequenze fiancheggianti il tratto complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiaredi DNA da studiare
4)4) dNTPsdNTPs
5)5) Ioni Mg++Ioni Mg++
Polymerase Chain Reaction: principioPolymerase Chain Reaction: principio
CICLI TERMICI:CICLI TERMICI:
DENATURAZIONEDENATURAZIONE(94(94--9696°°C)C)
ANNEALINGANNEALING(50(50--6565°°C)C)
EXTENSIONEXTENSION(72(72°°C)C)
Il campione si sottopone al numero di cicli stabili ti (30Il campione si sottopone al numero di cicli stabili ti (30--40), 40), alla alla fine della reazione fine della reazione un’aliquota si sottopone ad un’aliquota si sottopone ad
elettroforesi su gel di elettroforesi su gel di agorosioagorosio per verificare:per verificare:
1.1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in molecolare in bpbp mediante mediante ladderladder))
2.2. L’assenza di frammenti aspecificiL’assenza di frammenti aspecifici
END POINT PCREND POINT PCR
2.2. L’assenza di frammenti aspecificiL’assenza di frammenti aspecifici3.3. La quantità di amplificato ottenuto (proporziona le La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale
all’intensità della banda)all’intensità della banda)
PCR PHASES
All the
L’amplificazione di ogni target è definita da 3 fas i: 1 – esponenziale; 2 – lineare; 3 – plateau.
Cycle
All reagents are present
Some of the reagents start wearing out
All the reagents finished
PCR: PCR: effettoeffetto plateauplateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito ”, Il processo di duplicazione non procede “all’infinito ”, esso è limitato da: esso è limitato da:
Quantità dei Quantità dei primersprimers, , dNTPdNTP, MgCl, MgCl 22, Buffer, BufferAttività della Attività della TaqTaq polimerasipolimerasiReannealingReannealing dei filamentidei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremen to nei Raggiunto il plateau non si osserva più un incremen to nei prodottiprodotti
La PCR end-point non è un metodoquantitativo ma qualitativo.
Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è proporzionale all’intensità della banda ottenuta.all’intensità della banda ottenuta.
Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo.
Polymerase Chain Reaction: Polymerase Chain Reaction: vantaggivantaggi
1) Velocità e facilità d’usoIn poche ore si possono ottenere milioni di copie In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA targetdella sequenza di DNA target
2) Sensibilità2) SensibilitàVirtualmente è possibile utilizzare il DNA di una Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come singola cellula come templatetemplate (contaminazione)(contaminazione)
3) RobustezzaAmplificazione possibile anche utilizzando DNA di Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualitàbassa qualità
PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction : : svantaggisvantaggi
1) Solo sequenze noteNecessario conoscere la sequenza del DNA da amplificare per sintetizzare i primers.
2) Dimensioni e quantità limitateDimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kbQuantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio.
3) Proofreading3) ProofreadingTaqTaq polimerasi manca dell’attività 3’polimerasi manca dell’attività 3’→→5’ 5’ esonucleasicaesonucleasica, 20 cicli di , 20 cicli di reazione su un frammento di 1 reazione su un frammento di 1 kbkb produrranno produrranno ∼∼40% di frammenti con 40% di frammenti con una mutazione puntiforme (una mutazione puntiforme (∼∼1/10000).1/10000).
4)4) Analisi in End Point ed effetto PlateauAnalisi in End Point ed effetto PlateauPer analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione; Per analizzare il campione bisogna aspettare la fine della reazione; raggiunta la fase di plateau la quantità di amplificato non è più raggiunta la fase di plateau la quantità di amplificato non è più proporzionale alla concentrazione iniziale di campioneproporzionale alla concentrazione iniziale di campione..
SoluzioniSoluzioni�� UtilizzareUtilizzare ii datidati ottenutiottenuti durantedurante lala fasefase esponenzialeesponenziale inin cuicui ilil
prodottoprodotto didi PCRPCR èè proporzionaleproporzionale alal templatetemplate inizialeiniziale
�� QuestoQuesto èè resoreso possibilepossibile mediantemediante ilil rilevamentorilevamento didi unaunafluorescenzafluorescenza ilil cuicui accumuloaccumulo seguesegue lala stessastessa cineticacinetica delladellareazionereazione didi PCRPCR ee cheche,, quindiquindi,, èè proporzionaleproporzionale alal prodottoprodotto didiPCRPCRPCRPCR
�� SiSi utilizzanoutilizzano particolariparticolari termociclatoritermociclatori inin gradogrado misuraremisurare lalafluorescenzafluorescenza emessaemessa dada particolariparticolari fluoroforifluorofori adad ogniogni ciclociclo..
Quantitative RealQuantitative Real--time PCRtime PCR
Quantitative RealQuantitative Real--time PCRtime PCR
Tecnica che consente la simultaneaamplificazione e quantificazione del DNAtarget.
AMPLIFICAZIONE:AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR
QUANTIFICAZIONE:QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato.
Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi 2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Fluorocromo
Perché RealPerché Real--Time?Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante lafase esponenziale della PCR, quando cioèl'efficienza di amplificazione è influenzataminimamente dal le var iabi l i d i reazione,permettendo di ottenere risultati molto piùaccurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"
•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di
diverse possibili reazioni chimiche
Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Realper PCR Real--TimeTime
•Le chimiche principali sono basate sia sul legame dicoloranti fluorescenti che si intercalano al dsDNA, come ilSYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR Green
SYBR Green ISYBR Green: principioSYBR Green: principioUtilizzaUtilizza unauna molecolamolecola fluorescentefluorescente non non specificaspecifica cheche sisilegalega al al solcosolco minoreminore didi tuttetutte le le molecolemolecole didi dsDNAdsDNA..
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR GreenSYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR GreenSYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR GreenSYBR Green
SYBR greenSYBR green
�� MetodicaMetodica semplicesemplicePossonoPossono essereessere utilizzatiutilizzati primers in primers in usouso in in qualitativaqualitativa
�� Non Non costosacostosa
�� NonNon--specificaspecifica�� LaLa molecolamolecola fluorescentefluorescente sisi legalega randomrandom aa tuttetutte lele
doppiedoppie elicheeliche,, includendoincludendo ii dimeridimeri didi primersprimers�� ÈÈ necessarionecessario ottimizzareottimizzare lala metodicametodica perper evitareevitare lala
f o r m a z i o n ef o r m a z i o n e d id i p r o d o t t ip r o d o t t i a s p e c i f i c ia s p e c i f i c i
Curva di dissociazioneCurva di dissociazioneDopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldat i
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazioneCurva di dissociazione••T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’T dissociazione proporzionale alla grandezza dell’a mplimeroamplimero..
••La presenza di una o più curve di dissociazione dip ende dal fatto che la La presenza di una o più curve di dissociazione dip ende dal fatto che la popolazione di popolazione di amplimeriamplimeri sia omogenea o eterogenea.sia omogenea o eterogenea.
••L’ampiezza del picco è proporzionale alla quantità di amplificato.L’ampiezza del picco è proporzionale alla quantità di amplificato.
TaqManTaqManTaqManTaqMan
TaqManTaqManLaLa RealReal--TimeTime PCRPCR sisi puòpuò realizzarerealizzare mediantemediante l’impiegol’impiego::
� coloranti intercalanti (( eses.. SYBRSYBR green),green), cheche sisi leganolegano
i ni n m a n i e r am a n i e r a a s p e c i f i c a aa t u t t ot u t t o i li l D N AD N A
� sonde ad ibridazione ,, specifiche perper ilil frammentoframmento didii n t e r e s s e ,i n t e r e s s e , m a r c a t em a r c a t e c onc on mo l e c o l emo l e c o l e f l u o re s c e n t if l u o re s c e n t ii n t e r e s s e ,i n t e r e s s e , m a r c a t em a r c a t e c onc on mo l e c o l emo l e c o l e f l u o re s c e n t if l u o re s c e n t i
Esistono diversi tipi di sonde:Esistono diversi tipi di sonde:DualDual--labeledlabeled (come le sonde TaqMan) (come le sonde TaqMan) Molecular beaconsMolecular beaconsScorpion Scorpion Sonde FRETSonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqManSonde TaqManLaLa sondasonda didi tipotipo TaqManTaqMan èè unun oligonucleotideoligonucleotide che,che, comecome ii
primersprimers delladella PCR,PCR, vieneviene disegnatodisegnato perper essereesserecomplementarecomplementare allaalla sequenzasequenza bersagliobersaglio dada amplificareamplificare
R Q
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’inter no La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’inter no del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR
Primer
Primer3’3’
3’3’
3’3’3’3’
5’5’
5’5’5’5’
5’5’
R Q
5’5’ 3’3’
Forward
ProbeReverse
Sonda TaqManSonda TaqManPresenta all’estremità 5’ un fluoroforo “ Reporter ”ed all’estremità 3’ una molecola “ Quencher ”
5’ 3’
ReporterReporter--QuencherQuencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza 3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R Q
5’ 3’
R Q
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
ReporterReporter--QuencherQuencher
Dye Quencher
5,6 FAM BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE BHQ-2
Texas Red/ROXBHQ-2
Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)
6-carbossifluoresceina
6-carbossitetrametilrodamina
R Q
3’3’
5’5’
RQ
Real-Time PCR: attività 5’>3’ esonucleasica
Q
3’ 5’5’
R Q
3’ 5’5’
Forward primer
Reverse primer
Probe
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati
Reverse primer
RTRT--PCR quantitativaPCR quantitativa
PlotPlot linearelineare
••La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazion e La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazion e viene rilevata e analizzata tramite computer.viene rilevata e analizzata tramite computer.
Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza
Cicli di PCR Cicli di PCR
Plot di amplificazioneN
orm
alis
ed re
port
er fl
uore
scen
ce (R
n) L i n e a s o g l i a s c e l t a
d a l l ’ o p e r a t o r eIn maniera da intersecarele curve di tutti i campioninella fase esponenziale
PCR cycle number
Nor
mal
ised
repo
rter
fluo
resc
ence
(R
E’ il ciclo della reazione diamplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione èmaggiore rispetto a quellod e l l a T h r e s h o l d
Indica il valore al disopra del qualeinizia l’accumulo diu n a m p l i f i c a t o
Curve di amplificazioneCurve di amplificazione
Plot lineareF
luor
esce
nza
Cicli di amplificazione
Flu
ores
cenz
a
Per ogni campione si ottiene una curva di amplifica zione il cui C T(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
QuantificazioneQuantificazione
ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto
�Necessita di standard di cui si conosce la concentr azione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
�Per tutti gli unknowns devono essere saggiate ident iche
quantità di campioniquantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T
�Necessita di controlli endogeni (non si utilizza un a
standard curve)
�Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
∆∆∆∆CT con quello del controllo endogeno
Quantitativa assolutaQuantitativa assoluta
10 610 5
10 410 3
10 210 1
Ct
unknown sample
35
25
10 715
2 3 4 5 6 7
log10 template quantity
3500 copies
1
IlIl valorevalore cosìcosì ottenutoottenuto vieneviene normalizzatonormalizzato rispettorispetto aa quelloquello didi unungenegene espressoespresso costitutivamentecostitutivamente ((ββ--actina,actina, GAPDH,GAPDH, ATPs,ATPs, ββ22 etcetc))
Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il
cambiamento di espressione di un gene target in un campione
rispetto ad un altro campione scelto come calibratore.
Quantitativa relativaQuantitativa relativa
Plot di amplificazione
Numero di cicli
∆∆∆∆CT
SampleControl
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:
• TARGETTARGET – La sequenza di DNA da analizzare.
• CALIBRATORECALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi
comparativa (Trattato/non Trattato , campione al T0 in uno studio time course)
Quantitativa relativaQuantitativa relativa
• CONTROLLO ENDOGENOCONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i
campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di
DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione.
Quantitativa relativa: analisi dei datiQuantitativa relativa: analisi dei dati
�� Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso espresso costitutivamentecostitutivamente (( ∆∆∆∆∆∆∆∆CCTT))
� Comparare ciascun ∆∆∆∆CT così ottenuto con il ∆∆∆∆CT di un calibratore (cb) ( ∆∆∆∆∆∆∆∆CT)
22-- ((∆∆∆∆∆∆∆∆CT,rCT,r-- ∆∆∆∆∆∆∆∆CT,CT,cbcb )= 22-- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT
�� IlIl valorevalore cosìcosì ottenutoottenuto permettepermette didi determinaredeterminare lalac o n c e n t r a z i o n ec o n c e n t r a z i o n e r e l a t i v ar e l a t i v a d e ld e l t a r g e tt a r g e t
StepStep per il calcolo del per il calcolo del 22 -- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT
1.1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)Ct gene interesse – Ct HK = ∆Ct
2. Normalizzazione con il calibratore ∆Ct Campione – ∆Ct Calibratore = ∆∆Ct
3.3. Applicare la formula Applicare la formula 22-- ∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CTCT
ESEMPIOESEMPIOCampione Ct HK Ct gene terget
(IL-10)
Brain (calibratore) 14 32
Liver 16 28
Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?
1. ∆Ct Brain = 181. ∆Ct Brain = 18
∆Ct Liver = 12
2. ∆Ct campione – ∆Ct calibratore = 12-18 = -6
3. 2- ∆∆CT = 26 = 64
L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!