PCR, MUTASYON ANALİZ PCR, MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİ VE DNA YÖNTEMLERİ VE DNA

PARMAK İZİPARMAK İZİ

ARŞ.GÖR. ÖZGÜR VATANARŞ.GÖR. ÖZGÜR VATAN

POLİMERAZ ZİNCİR POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONUREAKSİYONU

(POLYMERASE CHAIN (POLYMERASE CHAIN REACTION)REACTION)

(PCR = PZR)(PCR = PZR)

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU, SPESİFİK BİR DNA PARÇASININ KOPYALARININ PRİMERLER TARAFINDAN YÖNLENDİRİLEREK, ENZİMATİK OLARAK SENTEZLENMESİ (AMPLİFİKASYONU)ŞEKLİNDE TANIMLANAN İN VİTRO BİR YÖNTEMDİR.

PCR GENLERİN YA DA DNA DİZİLERİNİN REPLİKASYONUNU HIZLANDIRILMIŞ BİR ŞEKİLDE GERÇEKLEŞTİREN VE DNA MOLEKÜLÜNÜN MİLYONLARCA HATTA MİLYARLARCA KOPYASINI KISA ZAMANDA OLUŞTURABİLEN BİR TEKNİKTİR.

Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum MekanizmasıOluşum Mekanizması

Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler.

DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP) varlığında primerin 3' hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur.

Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması ("annealing") ve uzama bağlanması ("annealing") ve uzama ("extension")("extension") olarak adlandırılan temel olarak adlandırılan temel olarak tekrarlayan üç aşamadan oluşur:olarak tekrarlayan üç aşamadan oluşur:

1- Denatürasyon: Amplifiye edilecek DNA’nın 1- Denatürasyon: Amplifiye edilecek DNA’nın birkaç sn. 94-96ºC ısı ile tek iplikli DNA’ya birkaç sn. 94-96ºC ısı ile tek iplikli DNA’ya ayrılmasıdır.ayrılmasıdır.

2- Bağlanma (annealing): Birkaç dak. 50-65º 2- Bağlanma (annealing): Birkaç dak. 50-65º tutularak primerin tek sarmal DNA’daki tutularak primerin tek sarmal DNA’daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlar.hedef bölgelere hibridizasyonu sağlar.

3- Uzama (Extension): Polimeraz enzimi 3- Uzama (Extension): Polimeraz enzimi yardımıyla DNA kalıplarına bağlanan yardımıyla DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5´→ 3´ yönde uzatılmasıdır.primerlerin 5´→ 3´ yönde uzatılmasıdır. 7272ºCºC

Ardarda tekrarlanan Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerin bağlanması, ve denatürasyon, primerin bağlanması, ve primerin uzaması evreleriyle DNA primerin uzaması evreleriyle DNA fragmentleri üssel olarak artar. Bu üssel fragmentleri üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primer için kalıp görevi yapmasıdır.diğer primer için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır.çıkması ile sonuçlanır.

PCR mixi:PCR mixi:- - dHdH22OO ...............................14.4µl...............................14.4µl- - 10xPCR buffer10xPCR buffer ................2.5µl................2.5µl- - MgClMgCl22 ...............................0.2µl...............................0.2µl- - dNTPdNTP ................................1.25µl................................1.25µl- - Primer1 (F)Primer1 (F) .......................1.25µl.......................1.25µl- - Primer2 (R)Primer2 (R) .......................1.25µl.......................1.25µl--Taq PolimerazTaq Polimeraz ...................0.1µl...................0.1µl((Thermus aquaticusThermus aquaticus))--Kalıp DNAKalıp DNA .........................4-5µl.........................4-5µl

dHdH22OO : Reaksiyon ortamı : Reaksiyon ortamı- - 10xPCR buffer10xPCR buffer : Tampon : Tampon- - MgClMgCl22 dNTP ile çözünebilir kompleks

oluşturur, polimeraz aktivitesini stimüle eder, DNA nın Tm değerini arttırır, Primer kalıp etkileşimini sağlar, düşük olunca üründe azalma, yüksek olunca spesifik olmayan ürün.

- - dNTPdNTP : : deoksinükleozidtrifosfatlar ( A, T, G, deoksinükleozidtrifosfatlar ( A, T, G, C)C)

- - Primer1 (F)Primer1 (F): serbest 3 OH: serbest 3 OH - - Primer2 (R)Primer2 (R) --Taq PolimerazTaq Polimeraz : enzim : enzim ((Thermus aquaticusThermus aquaticus))--Kalıp DNAKalıp DNA

PCR REAKSİYONU

94ºC................2dk Ön Denaturasyon

94ºC................30sn Denaturasyon50-60ºC.......….45sn Annealing 35 döngü72ºC................30sn Uzama

72ºC................5dk Son Uzama 

PCR,genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan PCR,genetik ve moleküler biyolojide en fazla kullanılan teknik lerden biridir. teknik lerden biridir. – Klonlamada kullanılmaKlonlamada kullanılmaktadırktadır – DNA tekrar dizilerindeki ve restriksiyon kesim DNA tekrar dizilerindeki ve restriksiyon kesim

bölgelerindeki farklılıkların kısa sürede bölgelerindeki farklılıkların kısa sürede tanımlanmasında kullanılır. tanımlanmasında kullanılır.

– GGenetik bozukluklardaki mutasyonların yerinin ve enetik bozukluklardaki mutasyonların yerinin ve mutasyonun tipinin hızlı olarak belirlenmesinde mutasyonun tipinin hızlı olarak belirlenmesinde kullanılır. kullanılır.

– Özellikle tek bir hücrenin, tükürük bulaşmış posta Özellikle tek bir hücrenin, tükürük bulaşmış posta pulunun, fosillerin ya da suç bölgesindeki bir saç pulunun, fosillerin ya da suç bölgesindeki bir saç telinin telinin DNA DNA kaynağı olarak kullankaynağı olarak kullanılıldığı örneklerle dığı örneklerle yapılan çalışmalarda, DNA'nın gelişigüzel primerler yapılan çalışmalarda, DNA'nın gelişigüzel primerler kullanılarak, özgül olmayan amplifikasyonu çok kullanılarak, özgül olmayan amplifikasyonu çok yararlıdır. yararlıdır.

Kısaca, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern Kısaca, PCR, çok geniş kullanım alanı olan ve modern genetikte çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridirgenetikte çok yönlü kullanılabilen tekniklerden biridir..

PCR'ın SınırlarıPCR'ın Sınırları

PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına PCR çok gelişmiş bir teknik olmasına rağmen, bazı sınırları vardır. Hedef DNA'nın rağmen, bazı sınırları vardır. Hedef DNA'nın nükleotit dizisi hakkında nükleotit dizisi hakkında bazı bazı bilgilerin gerekli bilgilerin gerekli olması ve nispeten kısa bir ürün elde edilmesi, olması ve nispeten kısa bir ürün elde edilmesi, bunlardan bazılarıdır. Diğer DNA kaynaklarından bunlardan bazılarıdır. Diğer DNA kaynaklarından çok küçük miktarda bir bulaşma bile sorunlara çok küçük miktarda bir bulaşma bile sorunlara neden olabilir. Laboratuar çalışanlarından neden olabilir. Laboratuar çalışanlarından dökülebilecek deri parçaları, bir fosilden ya da dökülebilecek deri parçaları, bir fosilden ya da suç mahallinden alınan DNA örneğine bulaşabilir suç mahallinden alınan DNA örneğine bulaşabilir ve doğru sonuç alınmasını engelleyebilir. PCR ve doğru sonuç alınmasını engelleyebilir. PCR reaksiyonu çok dikkatli ve kontrollü yapılmalıdır.reaksiyonu çok dikkatli ve kontrollü yapılmalıdır.

MUTASYON ANALİZ MUTASYON ANALİZ YÖNTEMLERİYÖNTEMLERİ

SSCP, HDA, RFLP, LOH ve SSCP, HDA, RFLP, LOH ve MSI ANALİZLERİ VE MSI ANALİZLERİ VE

KULLANIM ALANLARIKULLANIM ALANLARI

SSCPSSCP (SINGLE STRAND CONFORMATIONAL (SINGLE STRAND CONFORMATIONAL

POLYMORPHISM = TEK İPLİKLİ POLYMORPHISM = TEK İPLİKLİ KONFORMASYONEL POLİMORFİZM)KONFORMASYONEL POLİMORFİZM)

PCR kullanılarak mutasyon saptama PCR kullanılarak mutasyon saptama yöntemlerinden biri de, tekyöntemlerinden biri de, tek zincir konformasyon zincir konformasyon polimorfizmidir (single strand conformational polimorfizmidir (single strand conformational polymorphism: SSCP).polymorphism: SSCP).

Bir baz değişiminin neden olduğu mutasyonlar bu Bir baz değişiminin neden olduğu mutasyonlar bu yöntemle taranır. yöntemle taranır.

Tek zincirli DNA parçacığı bazı koşullarda nükleotid Tek zincirli DNA parçacığı bazı koşullarda nükleotid dizisine bağlı olarak belirli bir konformasyon alır. dizisine bağlı olarak belirli bir konformasyon alır. Farklı konformasyondaki parçacıklar elektroforezde Farklı konformasyondaki parçacıklar elektroforezde farklı hareket eder. farklı hareket eder.

Bir baz değişimi DNA'nın konformasyonunu, Bir baz değişimi DNA'nın konformasyonunu, dolayısıyldolayısıylaa elektroforezdeki hareketini değiştirir. elektroforezdeki hareketini değiştirir.

Yöntem hızlı ve basittir. DNA dizi analizi Yöntem hızlı ve basittir. DNA dizi analizi yapmadan önce potansiyel baz değişikliği yapmadan önce potansiyel baz değişikliği saptanabilir.saptanabilir.

SSCP (Single Strand Conformational SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism)Polymorphism)

SSCP ile mutasyon saptaması yapmak SSCP ile mutasyon saptaması yapmak için, DNA önce PCR ile çoğaltılır. için, DNA önce PCR ile çoğaltılır.

Çoğaltılan çift zincirli DNA denatüre Çoğaltılan çift zincirli DNA denatüre edilerek, tek zincirli hale getirilir buz edilerek, tek zincirli hale getirilir buz içerisine alındıktan sonra elektroforez içerisine alındıktan sonra elektroforez jeline yüklenir. jeline yüklenir.

Elektroforez sonrası, baz dizisi farklı Elektroforez sonrası, baz dizisi farklı olan DNA normal DNA'ya göre bant olan DNA normal DNA'ya göre bant kayması (shift) gösterir. kayması (shift) gösterir.

Yöntemden iyi sonuç alınması için, Yöntemden iyi sonuç alınması için, kullanılan DNA parçacığının 200 bç'i kullanılan DNA parçacığının 200 bç'i geçmemesi gerekir. Bu durumda genin geçmemesi gerekir. Bu durumda genin tümünü taramak için geni 200 bç tümünü taramak için geni 200 bç uzunlukta parçalara ayırmak uygun olur.uzunlukta parçalara ayırmak uygun olur.

SSCPSSCP

SSCPSSCP

HDA (Heterodubleks Analizi)HDA (Heterodubleks Analizi) Heterodubleks analizi mutasyon saptama Heterodubleks analizi mutasyon saptama

yöntemlerinden biridir. Yöntemin temeli; jel yöntemlerinden biridir. Yöntemin temeli; jel matriksinde heterodubleks DNA moleküllerinin matriksinde heterodubleks DNA moleküllerinin homodubleks yapıdaki DNA moleküllerinden daha homodubleks yapıdaki DNA moleküllerinden daha farklı göç etmesine dayanmaktadır. Yöntem DNA farklı göç etmesine dayanmaktadır. Yöntem DNA örneklerinin yüksek sıcaklıkta denatüre edildikten örneklerinin yüksek sıcaklıkta denatüre edildikten hemen sonra renatüre edilmesi ile hemen sonra renatüre edilmesi ile gerçekleştirilmektedir. gerçekleştirilmektedir.

Renatürasyon esnasında mutant DNA ipliği ile Renatürasyon esnasında mutant DNA ipliği ile yabani DNA ipliklerinin hibridize olması ile yabani DNA ipliklerinin hibridize olması ile mutasyon noktasında yanlış eşleşme yapmış bir mutasyon noktasında yanlış eşleşme yapmış bir baz çifti bulunur, bu da heterodubleks DNA’ların baz çifti bulunur, bu da heterodubleks DNA’ların oluşması anlamına gelir. HDA’nın, 300 baz çiftlik oluşması anlamına gelir. HDA’nın, 300 baz çiftlik veya daha küçük bir DNA fragmanında %90-95 veya daha küçük bir DNA fragmanında %90-95 oranında güvenilirliği mevcuttur. oranında güvenilirliği mevcuttur.

HDAHDA

DENEYİN YAPILIŞI:DENEYİN YAPILIŞI:

PCR ÜRÜNLERİNDEN 7µL YENİ PCR PCR ÜRÜNLERİNDEN 7µL YENİ PCR TÜPLERİNE ALINIR. ÜZERLERİNE 3µL STOP TÜPLERİNE ALINIR. ÜZERLERİNE 3µL STOP SOLÜSYONU KONULUR VE 95ºC’DE 5DK SOLÜSYONU KONULUR VE 95ºC’DE 5DK BEKLETİLİR. BU BASAMAKTA DNA’LAR BEKLETİLİR. BU BASAMAKTA DNA’LAR DENATÜRE OLUR VE İKİ İPLİKÇİK DENATÜRE OLUR VE İKİ İPLİKÇİK BİRBİRİNDEN AYRILIR. SÜRE SONUNDA DNA BİRBİRİNDEN AYRILIR. SÜRE SONUNDA DNA LAR RENATURASYON SICAKLIĞINA ALINIR LAR RENATURASYON SICAKLIĞINA ALINIR (50 ºC ) VE RENATURASYON SAĞLANIR. (50 ºC ) VE RENATURASYON SAĞLANIR. EĞER MUTASYON VARSA HETERODUBLEX EĞER MUTASYON VARSA HETERODUBLEX YAPMIŞ DNA LAR OLUŞACAKTIR.YAPMIŞ DNA LAR OLUŞACAKTIR.

HDAHDA

Deneyin Yapılışı:Deneyin Yapılışı:

Daha önceden hazırlanan poliakrilamid jele yüklenir, Daha önceden hazırlanan poliakrilamid jele yüklenir, yürütülür. Yürütme işleminden sonra gümüş boyama yürütülür. Yürütme işleminden sonra gümüş boyama yapılarak bantların görünür hale gelmesi sağlanır ve yapılarak bantların görünür hale gelmesi sağlanır ve mutasyonun olup olmadığına bakılır.mutasyonun olup olmadığına bakılır.

Eğer ipliklerden birinde mutasyondan kaynaklanan Eğer ipliklerden birinde mutasyondan kaynaklanan bir baz değişimi varsa; bu iplik farklı bir baz değişimi varsa; bu iplik farklı konfigürasyonda olacağından jelde de farklı yürür. konfigürasyonda olacağından jelde de farklı yürür.

Mutasyon yoksa konfigürasyonları aynı olduğundan, Mutasyon yoksa konfigürasyonları aynı olduğundan, jeldeki hareketlerinde farklılık olmaksızın aynı jeldeki hareketlerinde farklılık olmaksızın aynı seviyede yürüyerek, tek bant şeklinde görünürler.seviyede yürüyerek, tek bant şeklinde görünürler.

HDAHDA

HDAHDA

MSI (MICROSATELLIT INSTABILITY)MSI (MICROSATELLIT INSTABILITY) MİKROSATELLİTLER DNA ÜZERİNDEKİ MİKROSATELLİTLER DNA ÜZERİNDEKİ

TEKRAR BÖLGELERİNİN BİR ÇEŞİTİDİR.TEKRAR BÖLGELERİNİN BİR ÇEŞİTİDİR. TEKRARLARDAN OLUŞTUKLARI İÇİN TEKRARLARDAN OLUŞTUKLARI İÇİN

REPLİKASYON HATALARINA DAHA YATKINDIRLARREPLİKASYON HATALARINA DAHA YATKINDIRLAR TAMİR GENLERİ GİBİ BAZI GENLERDEKİ TAMİR GENLERİ GİBİ BAZI GENLERDEKİ

MUTASYONLAR MİKROSATELLİT BÖLGELERİNİN MUTASYONLAR MİKROSATELLİT BÖLGELERİNİN ARTMASINA YADA AZALMASINA NEDEN ARTMASINA YADA AZALMASINA NEDEN OLMAKTADIROLMAKTADIR

BÖYLECE İLGİLİ MİKROSATELLİT BÖLGESİ BÖYLECE İLGİLİ MİKROSATELLİT BÖLGESİ PCR İLE ÇOĞALTILARAK JEL ELKTROFOREZİNE PCR İLE ÇOĞALTILARAK JEL ELKTROFOREZİNE TABİİ TUTULURSA . NORMAL GENLE, TABİİ TUTULURSA . NORMAL GENLE, MUTASYONLU OLANIN MİKROSATELLİTLERİNDEKİ MUTASYONLU OLANIN MİKROSATELLİTLERİNDEKİ UZUNLUK FARKINA BAKILARAK MUTASYON UZUNLUK FARKINA BAKILARAK MUTASYON KARARI VERİLEBİLMEKTEDİRKARARI VERİLEBİLMEKTEDİR

RFLP RFLP (RESTRICTION FRAGMENT (RESTRICTION FRAGMENT

LENGTH POLYMORPHISMS = LENGTH POLYMORPHISMS = RESTRİKSİYON PARÇA RESTRİKSİYON PARÇA

UZUNLUK POLİMORFİZMİUZUNLUK POLİMORFİZMİ))

BAKTERİLERDEN İZOLE EDİLEN VE BAKTERİLERDEN İZOLE EDİLEN VE BAKTERİDE İKEN BAKTERİ DNA SINI BAKTERİDE İKEN BAKTERİ DNA SINI METİLLEYEREK KORUMA GÖREVİNDEKİ METİLLEYEREK KORUMA GÖREVİNDEKİ ENZİMLER KULLANILARAK ENZİMLER KULLANILARAK GERÇEKLEŞTİRİLEBİLİNEN BİR MUTASYON GERÇEKLEŞTİRİLEBİLİNEN BİR MUTASYON ANALİZ YÖNTEMİDİR.ANALİZ YÖNTEMİDİR.

BU ENZİMLER İZOLE EDİLDİKLERİ BU ENZİMLER İZOLE EDİLDİKLERİ BAKTERİLERE GÖRE BAKTERİLERE GÖRE İSİMLENDİRİLİRLER. ÖRNEĞİN İSİMLENDİRİLİRLER. ÖRNEĞİN E.coli’den ECORI.E.coli’den ECORI.

RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN EN RESTRİKSİYON ENZİMLERİNİN EN ÖNEMLİ ÖZELLİĞİ ENDONÜKLEAZ ÖNEMLİ ÖZELLİĞİ ENDONÜKLEAZ AKTİVİTESİNE SAHİP OLMALARIDIR. AKTİVİTESİNE SAHİP OLMALARIDIR. YANİ BU ENZİMLER DNA YANİ BU ENZİMLER DNA MOLEKÜLÜNÜN İKİ İPLİĞİNİ BİRDEN MOLEKÜLÜNÜN İKİ İPLİĞİNİ BİRDEN KESEBİLMEKTEDİRLER.KESEBİLMEKTEDİRLER.

DNA ÜZERİNDE GENELLİKLE DNA ÜZERİNDE GENELLİKLE PALİNDROMİK ( HER İKİ YÖNDEN PALİNDROMİK ( HER İKİ YÖNDEN OKUNUŞLARI AYNI OLAN) DİZİLERİ OKUNUŞLARI AYNI OLAN) DİZİLERİ TANIYARAK KESERLERTANIYARAK KESERLER

HER ENZİMİN KENDİNE ÖZGÜ HER ENZİMİN KENDİNE ÖZGÜ TAYIP KESTİĞİ 4-10 NÜKLEOTİDLİK TAYIP KESTİĞİ 4-10 NÜKLEOTİDLİK DİZİLER VARDIR.DİZİLER VARDIR.

RFLPRFLPRFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

İnsan genomu boyunca (özellikle kodlayıcı olmayan bölgelerde), İnsan genomu boyunca (özellikle kodlayıcı olmayan bölgelerde), her 200 nükleotitte 1 dizi farklılığı görülür. Bu özel bölgelerdeki her 200 nükleotitte 1 dizi farklılığı görülür. Bu özel bölgelerdeki nükleotit değişiklikleri, tek bir nükleotit çiftinde değişiklik veya bir nükleotit değişiklikleri, tek bir nükleotit çiftinde değişiklik veya bir ya da birden fazla nükleotit çiftinin çıkarılması (delesyonu) veya ya da birden fazla nükleotit çiftinin çıkarılması (delesyonu) veya araya sokulması (insersiyonu) şeklinde görülür ve bir restriksiyon araya sokulması (insersiyonu) şeklinde görülür ve bir restriksiyon enziminin kesim noktasını ortadan kaldırabilir ya da yeni bir kesim enziminin kesim noktasını ortadan kaldırabilir ya da yeni bir kesim noktası yaratabilir. Bu şekilde yaratılan bir restriksiyon bölgesi, bir noktası yaratabilir. Bu şekilde yaratılan bir restriksiyon bölgesi, bir kromozomda bulunur fakat diğer homolog kromozomda kromozomda bulunur fakat diğer homolog kromozomda bulunmazsa, bu iki kromozom, restriksiyon parçalarının bulunmazsa, bu iki kromozom, restriksiyon parçalarının membrana aktarılan (blotla nan) profillerinin analizi ile membrana aktarılan (blotla nan) profillerinin analizi ile birbirlerinden ayırt edilebilir. Şekilde, kromozom A'nın bir bölgesi birbirlerinden ayırt edilebilir. Şekilde, kromozom A'nın bir bölgesi üç tane üç tane BamHI BamHI kesim bölgesi içermektedir. Homolog kromozom kesim bölgesi içermektedir. Homolog kromozom B'de ise, aynı bölgede B'de ise, aynı bölgede BamHI'e BamHI'e ait iki kesim bölgesi ait iki kesim bölgesi bulunmaktadır. Kromozom A, bulunmaktadır. Kromozom A, BamHI BamHI ile kesilince 3-kb ve 7-kb ile kesilince 3-kb ve 7-kb büyüklüğünde parçalar oluşurken, kromo zom B aynı enzimle büyüklüğünde parçalar oluşurken, kromo zom B aynı enzimle kesildiğinde, sadece 10-kb büyüklü ğünde bir parça oluşur. Bu kesildiğinde, sadece 10-kb büyüklü ğünde bir parça oluşur. Bu kromozomal bölgeye ait bir prob kullanılarak, bu parçaların kromozomal bölgeye ait bir prob kullanılarak, bu parçaların büyüklükleri Southem blot ile görüntülenebilir.büyüklükleri Southem blot ile görüntülenebilir.

LOH LOH (LOSS OF HETEROZIGOTY = HETEROZİGOTİ (LOSS OF HETEROZIGOTY = HETEROZİGOTİ

KAYBI)KAYBI) ÖZELLİKLE TÜMÖR HÜCRELERİNDE BAZI ÖZELLİKLE TÜMÖR HÜCRELERİNDE BAZI

GENLER SADECE TEK ALLELDEN OLUŞUR , 2. GENLER SADECE TEK ALLELDEN OLUŞUR , 2. ALLEL NONDİSJUNCTİON İLE KAYBOLABİLİR. ALLEL NONDİSJUNCTİON İLE KAYBOLABİLİR. BÖYLECE BİR HETEROZİGOTİ KAYBI OLUŞUR.BÖYLECE BİR HETEROZİGOTİ KAYBI OLUŞUR.

BU ALLEL KAYBININ BELİRLENEBİLMESİ BU ALLEL KAYBININ BELİRLENEBİLMESİ İÇİNDE PCR DA ÇOĞLATILAN DNA LAR İÇİNDE PCR DA ÇOĞLATILAN DNA LAR RESTRİKSİYON ENZİMLERİ İLE KESİLİR VE RESTRİKSİYON ENZİMLERİ İLE KESİLİR VE ELEKTROFOREZE TABİİ TUTULURLAR ELEKTROFOREZE TABİİ TUTULURLAR

GÖRÜNTÜLEME İÇİN RADYO AKTİF GÖRÜNTÜLEME İÇİN RADYO AKTİF İŞARETLİ PROBLARIN KULLANILDIĞI İŞARETLİ PROBLARIN KULLANILDIĞI SOUTHERN BLOT YÖNTEMİ KULLANILIR. SOUTHERN BLOT YÖNTEMİ KULLANILIR. ALLEL KAYBI VAR İSE BELİRLENİR.ALLEL KAYBI VAR İSE BELİRLENİR.

DNA FINGER PRINT DNA FINGER PRINT (DNA PARMAK İZİ = DNA EL (DNA PARMAK İZİ = DNA EL

İZİ)İZİ)

VNTRVNTR Tipik olarak, her bir tekrardaki nükleotit Tipik olarak, her bir tekrardaki nükleotit

sayısı 14'ten 100 nükleotite kadar sayısı 14'ten 100 nükleotite kadar değişebilir değişebilir ve ve her bölgedeki tekrar sayısı her bölgedeki tekrar sayısı ise 2 ila l00'den fazla sayıda olabilir. ise 2 ila l00'den fazla sayıda olabilir.

Bu bölgeler, değişkenBu bölgeler, değişken sayıdaki ardışık sayıdaki ardışık tekrarlar (variable-number of tandem tekrarlar (variable-number of tandem repeats, VNTR olarak bilinir. repeats, VNTR olarak bilinir.

Belirli bir bölgedeki tekrar sayıları Belirli bir bölgedeki tekrar sayıları değişiktir ve her farklı tekrar sayısı bir değişiktir ve her farklı tekrar sayısı bir VNTR allelini oluşturur. Her bir bölge için VNTR allelini oluşturur. Her bir bölge için düzinelerce farklı allelin varlığına bağlı düzinelerce farklı allelin varlığına bağlı olarak, heterozigotluk oranı çok yüksek olarak, heterozigotluk oranı çok yüksek olmaktadır. olmaktadır.

VNTRVNTR VNTR dizileri restriksiyon enzimleri ile VNTR dizileri restriksiyon enzimleri ile

kesilip, Southern blot ile görüntülendiği kesilip, Southern blot ile görüntülendiği zaman, ortaya bir zaman, ortaya bir bant profilibant profili çıkar. Bu çıkar. Bu profil, profil, DNA parmakiziDNA parmakizi olarak bilinen profile olarak bilinen profile bir örnektir. bir örnektir.

Bu profiller gerçek bir parmakizidir, çünkü, Bu profiller gerçek bir parmakizidir, çünkü, DNA kaynağı olarak DNA kaynağı olarak hangi doku hangi doku kullanılırsa kullanılsın, bant profili kullanılırsa kullanılsın, bant profili belirli bir birey için her zaman aynı, belirli bir birey için her zaman aynı, fakat bireyden bireye farklıdırfakat bireyden bireye farklıdır. .

Gerçekte, bireyden bireye bant profillerinde Gerçekte, bireyden bireye bant profillerinde o kadar çok değişiklik vardır ki, teorik olarak o kadar çok değişiklik vardır ki, teorik olarak her bireyin bant profili sadece ona özgüldür her bireyin bant profili sadece ona özgüldür ve bireyler bu profillerin bir kısmını ve bireyler bu profillerin bir kısmını annesinden bir kısmını ise babasından alır. annesinden bir kısmını ise babasından alır.

VNTRVNTR DNA parmakizi analizi, çok az DNA parmakizi analizi, çok az

miktardaki örneklerden [60 mikrolitre miktardaki örneklerden [60 mikrolitre kan örneği] ya da oldukça eski kan örneği] ya da oldukça eski örneklerden bile elde edilebilir (2400 örneklerden bile elde edilebilir (2400 yıldan daha yaşlı Mısır mumyalarında yıldan daha yaşlı Mısır mumyalarında VNTR analizi gerçekleştirilmiştir) ve VNTR analizi gerçekleştirilmiştir) ve bu durum, tekniğin kullanılabilirliğini bu durum, tekniğin kullanılabilirliğini ve önemini artırmaktadır.ve önemini artırmaktadır.