7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In

1/5

PCR merupakan salah satu teknik in-vitro yang digunakan untuk mengaplifikasi suatu

molekul DNA secara eksponensial dengan menggunakan reaksi enzimatis (Yuono! "##$%& PCR

atau polymerisasi 'erantai adalah teknik amplifikasi (per'anyakan% DNA spesifik dengan

melakukan proses pemanangan nukleotida dari Primer yang merupakan pasangan komplementer

dari utas DNA secara simultan& Proses pemanangan nukleotida dilakukan oleh DNApolymerase

'erdasarkan cetakan DNA ()uladno! "##"%&

)enurut )uladno ("##"%! tahap-tahap PCR meliputi tahap denaturasi! penempelan

Primer pada cetakan DNA (annealing% dan tahap pemanangan Primer melalui reaksi

polimerisasi nukelotida (extention%&

a& *ahap pele'uran (melting% atau denaturasi&

Pada tahap ini 'erlangsung pada suhu tinggi +,oC-+$oC& *ahap ini merupakan tahappengudaran DNA utas ganda menadi DNA utas tunggal! dimana masing-masing untai

dapat mencetak pasangannya (komplementer%& iasanya pada tahap aal PCR tahap ini

dilakukan agak lama (sampai . menit% untuk memastikan semua 'erkas DNA terpisah&'& *ahap penempelan atau annealing&

*ahap ini merupakan tahap penempelan Primer pada utas DNA template yang telah

terdenaturasi menadi utas tunggal aki'at kecocokan pasangan 'asa& /ni dilakukan pada

suhu antara ,.oC-$#oC& Penempelan ini 'ersifat spesifik& 0uhu yang tidak tepat

menye'a'kan tidak teradinya penempelan atau Primer menempel disem'arang tempat&

c& *ahap pemanangan atau e1tention&Pemanasan sampai 2"oC merupakan temperatur optimum DNA polymerase untuk

memanangkan Primer oligonukleotida& 3nzimpolymerase mensintesis utas kedua yang

komplementer terhadap template& 0intesis DNA diinisiasi pada uung 4567 dari tiap

Primer& *a8 polymerase tidak dirusak oleh proses denaturasi pada suhu tinggi! sehingga

reaksi dapat diulang tanpa menam'ah enzim Taq polymeraseyang 'aru pada tiap siklus&

9etiga tahap di atas akan 'erulang 'e'erapa kali sehingga proses amplifikasi DNA dapat

teradi& )esin PCR digunakan untuk memudahkan proses reaksi 'erantai ini& )esin PCR terdiri

dari suatu alat pemanas dan pendingin yang dapat diprogram sehingga dapat memanaskan pada

suhu dan selang aktu yang dikehendaki untuk setiap siklus pada suatu reaksi& anyaknya

pengulangan sangat tergantung dari kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis DNA dan

'iasanya 'erkisar antara ". dan ,# siklus&

7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In

2/5

Deteksi E. coli Dengan Menggunakan PCR

Ada 'e'erapa tahapan yang harus dilakukan untuk mendeteksi 3& coli menggunakan PCR

adalah se'agai 'erikut:

;& Penyiapan *emplate DNA dari 0ampel Air

Cara keranya adalah sampel air se'anyak ;!. ml dimasukkan ke dalam ta'ung

mikrosentrifuge eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan ;### rpm selama ;#

menit& 0etelah disentrifugasi supernatan di'uang dan hanya tersisa pelet! selanutnya

pelet diisi kem'ali dengan sampel air yang sama se'anyak ;!. ml dan disentrifugasi

se'anyak < kali& 9emudian diiam'il se'anyak ; ml media Nutrient roth dimasukan ke

dalam ta'ung mikrosentrifuge eppendorf yang 'erisi pelet& Pelet dicampur dengan media

N hingga tercampur& 0elanutnya pelet dimasukkan ke dalam ta'ung reaksi yang 'erisi, ml Nutrient roth lalu diinku'asi pada suhu 42oC selama ", am&

2. Penyiapan *emplate DNA 3& coli&

3kstraksi DNA 'akteri 3& coli dilakukan dengan menggunakan Purification 9it dari &

Adapun prosedur kera ekstraksi DNA 'akteri 3& coli adalah kultur isolat 'akteri diam'il

se'anyak ;!. ml lalu disentrifugasi dan supernatan di'uang& Pelet ditam'ahkan larutan

3D*A se'anyak ,.# => lalu divorte1 sampai homogen& 9emudian pelet ditam'ahkan

$## => cell lysis solution dan divorte1 kem'ali&

d& Pelet ditam'ahkan Proteinase 9 se'anyak . =>! lalu dipanaskan pada

suhu

7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In

3/5

se'anyak $## => disentrifugasi kem'ali dengan kecepatan ;.### rpm

selama ;# menit&

h& 0elanutnya supernatan di'uang sehingga hanya tersisa pelet yang

'erarna putih&

i& Pelet ditam'ahkan $## => etanol 2#? lalu disentrifugasi dengan

kecepatan ;.### rpm selama dua menit&

& 0elanutnya etanol di'uang dan dikeringkan! lalu dikeringanginkan

selama ;. menit&

k& DNA pelet ditam'ah dengan DNA rehydration solution ;## => dan

dipanaskan kem'ali pada suhu $.oC selama ; am& 0elanutnya produk

DNA ekstraksi disimpan dalam kulkas&

;.

4&$&4 Amplifikasi *emplate DNA dengan PCR&

Proses PCR dilakukan dengan menggunakan modifikasi yang telah

dilakukan Radi dkk&! ("#;#%& Adapun cara keranya adalah se'agai 'erikut :

a& Disiapkan reagen seperti dd7"6! PCR 'uffer! DN*P0 (< m)%! )gCl"

(". m)%! Primer ;$3; ! Primer ;$3" masing-masing (;# m)% dan

enzym ta8 polymerase semua reagen dimasukkan ke dalam satu ta'ung

mikrosentrifuge eppendorf yang steril kemudian divorte1 hingga

homogen&

'& Disiapkan ta'ung PCR yang 'erukuran #!. ml yang steril! dimasukkan ;

7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In

4/5

=> produk ektrasksi DNA ke dalam ta'ung PCR! selanutnya

dimasukkan reagen yang sudah dicampur masing-masing se'anyak ",

=> untuk setiap ta'ung sampel&

c& >alu dimasukkan ke dalam mesin PCR dan diatur tahap-tahap PCR yaitu

dengan mengatur profil suhu pra denaturasi PCR +,oC selama . menit!

pasca denaturasi PCR +,oC selama "# detik! annealing ..oC selama "#

detik! pra-ekstension 2" oC selama "# detik! dan paska ekstension 2" oC

selama ;# menit&

4&$&, Analisis Produk PCR dengan 3lektroforesis @el Agarosa&

Adapun cara kera analisis produk PCR dengan elektroforesis gel adalah

se'agai 'erikut :

a& Disiapkan cetakan gel elektroforesis kemudian sisir dipasang dengan

posisi tegak&

'& uat gel agarosa dengan konsentrasi yang dikehendaki! lalu dipanaskan

sampai gel agarosa terlihat 'ening atau terpolarisasi&

c& 0elanutnya gel agarosa dimasukkan ke dalam cetakan gel yang telah

disiapkan! selanutnya di'iarkan mengeras pada suhu ruang&

d& 0etelah mengeras sisir diam'il lalu gel agarosa dimasukkan ke dalam alat

elektroforesis yang 'erisi larutan *A3 'uffer ; 1

e& DNA ladder! DNA kontrol positif! DNA sampel masing-masing diam'il

se'anyak , => dan masing-masing dicampur dengan ; => loading dye

7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In

5/5

dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa&

;$

f& 3lektroforesis dialankan dengan voltase ;## volt selama 4# menit&

g& 0elanutnya gel dimasukkan ke dalam larutan editium 'romida selama

kurang le'ih 4# menit&

h& @el diangkat dan selanutnya dicelupkan ke dalam air selama kurang

le'ih ; menit&

i& @el diletakkan di atas B transluminator&

& ragmen yang terlihat di'andingkan dengan kontrol positif dan DNA

penanda&

4&$&. /dentifikasi

0ampel yang menunukkan positif 3& coli ika terdapat pita pada ukuran

sekitar .