1

PARTICIPACION DE LAS CELULAS TH 17 EN LA ETIOLOGIA DEL MIELOMA EN RATONES DE LA CEPA BALB/c.

RESUMEN

Para explorar la posibilidad de que el mieloma que se desarrolla en los

ratones de la cepa BALB/c como consecuencia de la inyección de aceite

mineral en la cavidad peritoneal se deba a un número de linfocitos Th 17

mayor a lo normal, se determinó el número de células Th17 en la sangre

periférica y en el bazo de ratones tanto de la cepa BALB/c, como de

ratones con genomas diferentes: C57, NIH y CD1. Se encontró, qu en

contra de lo propuesto en la hipótesis de trabajo, los animales BALB/c

son los que muestran el menor número de estas células en los

compartimentos examinados. Esto nos lleva a proponer una nueva

hipótesis: Las ´celulas Th17 emigran hacia la cavidad peritoneal, donde

manifiestan su potencial inflamatorio, que al no ser regulado, lleva ala

aparición del mieloma. Estamos ya trabajando sobre esta nueva hipótesis.

I. INTRODUCCIÓN.

Mieloma Múltiple

La transformación maligna de los linfocitos B puede ocurrir en cualquier

etapa de su maduración. Los padecimientos malignos que involucran a las

células que se encuentran en la etapa final de diferenciación de los linfocitos B,

las células plasmáticas y los linfocitos plasmocitoides, se denominan

gammapatías monoclonales e incluyen todas las enfermedades que se originan

a partir de la proliferación clonal descontrolada del linfocito B, caracterizadas

por la producción de moléculas o fragmentos de inmunoglobulinas, idénticos

por completo entre sí y que se identifican en suero u orina en forma de una

banda proteica llamada componente monoclonal. Las gammapatías

monoclonales se clasifican en varios grupos: mieloma múltiple,

macroglobulinemia de Waldenstrom, gammapatía monoclonal de significado

indeterminado (MGUS), enfermedades de cadenas pesadas y amiloidosis

primaria (Vela-Ojeda et al, 2006).

2

El mieloma múltiple (MM) descrito, en 1844 por Dr. Samuel Solly, es la

gammapatía monoclonal más importante. Es una enfermedad hematológica en

la cual células plasmáticas anormales (de origen neoplásico) se acumulan en la

médula ósea. Se caracterizan por la proliferación de una clona de células

plasmáticas que produce una proteína monoclonal homogénea, conocida como

proteína M. (Vela-Ojeda et al, 2006).

Al MM lo caracteriza la presencia de dolor óseo (90%), fracturas

patológicas (en un 40%), Anemia (70%), lesiones líticas en huesos (66%), en

México (80- 90%), hipercalcemia, falla renal (50%) (Vela-Ojeda et al, 2006).

Diagnóstico

Se establece por: Electroforesis de proteínas de AMO e Inmunofijación

en suero y orina (Smith A, et al 2005).

Etiología

La causa del mieloma múltiple, así como del resto de las gammapatías

monoclonales, se desconoce. Como en el caso de otras neoplasias, es muy

posible que estén involucrados factores genéticos y medioambientales, y con

mayor probabilidad una combinación de ambos. (Vela-Ojeda et al, 2006).

Patogénesis

El Origen de la clona maligna son: Células B de memoria o un

plasmablasto. La célula del MM tiene su origen en el nódulo linfático. (Vela-

Ojeda et al, 2006).

Actualmente el mieloma múltiple es una enfermedad incurable que tiene

una supervivencia aproximada de tres años. Sin embargo, esto es muy

variable. Algunos pacientes viven pocas semanas, mientras que otros tienen un

curso menos desfavorable, con una supervivencia mayor de diez años. (Vela-

Ojeda et al, 2006)

3

Biología y patogénesis del MM

La IL-6 es un factor crucial para la proliferación de las células

mielomatosas tanto in vivo como in vitro. El factor de necrosis tumoral alfa

(TNF-) también desempeña un papel importante en la patogenia de la

enfermedad.

Figura No. 1. Modelo de oncogénesis temprana del MM. Se muestran las

diferentes alteraciones genéticas que se van acumulando durante la progresión

del MM en la célula plasmática y los oncogenes que se sobreexpresan.

Células Th 17

Descritas por Rouvier et al en 1993. Son células que secretan IL- 17.

Fueron llamadas CTLA8, renombradas IL-17 y recientemente IL-17. Están

implicadas en procesos inflamatorios crónicos, en enfermedades autoinmunes

y en cáncer, en seres humanos y en ratones. Son caracterizadas por la

producción de distintos perfiles efectores de citocinas incluyendo: IL-17 (ó IL

4

17A), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F, IL-22,TNF alfa, IL-6, y GM-CSF.

(Moseley et al., 2003) Inicialmente fueron detectadas en infecciones por

Borrelia burdorferi. (Blauvelt A et al., 2007)

El gen de IL- 17 se localiza en el brazo corto del cromosoma 6 en el

humano, pesa 35 kDA, consta de 155 aminoácidos (aa). Su receptor IL- 17R

puede ser detectado en los linfocitos CD4 de sangre periférica y en las células

del endotelio vascular de humanos. (Moseley et al, 2003)

Se ha demostrado que las células T colaboradoras CD4+ vírgenes (Thp)

pueden convertirse en por lo menos cuatro tipos de células T colaboradoras; Th

1, Th 2, T reguladoras, (Tregs) y Th 17. En seres humanos, hay evidencia de

que las células Th colaboradoras secretan IL- 17 que tiene un papel

proinflamatorio y se han visto implicadas en muchas enfermedades

inflamatorias crónicas en humanos y en ratones. ((BB.. AAffzzaallii eett aall,, 22000077)) TTaabbllaa 11

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS T

ANTECEDENTES:

En 1997 Michael Potter et al, en Boston Massachussets, EU. Recibieron

el premio “Waldenström” en el VI Workshop en mieloma múltiple, por estudios

hechos 40 años antes, introdujeron por vía intraperitoneal “Pristane” en los

ratones de las cepas: BALB/c, DBA/2, C57BL/6 y C3H/He. Solamente en el

espacio peritoneal de los ratones BALB/c se inició una alteración vascular,

seguida de una reacción inflamatoria crónica en los tejidos de la superficie

5

peritoneal, desarrollando granuloma, fibroplasia y finamente plasmocitoma

(PCTs). Con esto concluyeron:

a) La cepa BALB/c es susceptible en 60 a 70 % a desarrollar

plasmocitomas en respuesta a la inducción del Pristane, las cepas: DBA/2, C57

BL/6 y C3H/He, son resistentes a desarrollar plasmocitomas.

b) Existe una T (12; 15) o T (6; 15). Que desregula directa o

indirectamente la trascripción de el protooncogen C-myc. (Suematsu ST et al

1992)

Con esto queda demostrado que la implantación intraperitoneal de

objetos plásticos, aceites parafínicos, pristane ó geles de silicón induce a

plasmocitomas (PCTs) solamente en la cepa BALB/c, (Suematsu ST et al

1992)

JUSTIFICACIÓN

El Mieloma Múltiple es la segunda neoplasia hematológica y el segundo

tumor óseo más frecuente después de las metástasis, y corresponde a 17.6%

de los tumores óseos malignos. En la fisiopatología del MM intervienen algunas

citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, TNF etc. Las células Th 17 están

también involucradas en procesos inflamatorios, por lo cual pueden contribuir

en forma prioritaria en la fisiopatología de esta enfermedad.

Como se sabe que la cepa BALB/c es la única que al inyectarle

coadyuvantes (aceites parafínicos, pristane o geles de siliconas) por vía

intraperitoneal, desarrolla plasmocitomas (MM) en un 60-70 %, como resultado

de un severo cuadro inflamatorio, nos proponemos investigar si el ratón de la

cepa BALB/c sano muestra cantidades elevadas de las células Th 17. Esto

podría explicar por qué un agente irritante induce el Mieloma.

HIPOTESIS

La presencia de las Células Th 17 tiene un papel importante en

diferentes procesos inflamatorios y puede intervenir en la fisiopatología

del MM.

Las células Th17 están elevadas en pacientes con MM de reciente

diagnóstico en comparación con sujetos sanos.

6

Las células Th17 están incrementadas en ratones BALB/c en

comparación con las cepas CD1 (ICR), NIH y C57BL/6.

OBJETIVOS GENERALES

Identificar y comparar la cantidad de células Th 17 en la cepas BALB/c,

CD1 (ICR), NIH y C57BL/6 sanos, en pacientes con mieloma múltiple y

donadores sanos, si esta aumentada y si existe relación del aumento de estas

células con el mieloma múltiple.

OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar la cantidad de células Th 17 en ratones de la cepa BALB/c,

CD1, NIH y C57BL/6.

Comparar la cantidad de células Th17 de ratones BALB/c con ratones de

las cepas CD1, NIH y C57BL/6.

II. MATERIAL Y METODOS

CUANTIFICACIÓN DE CÉLULAS NUCLEADAS

Se utilizará el analizador automático para biometría hematina Cell Dyn

3000 (X106/ μL). Se realizará el análisis morfológico con tinción de Wright para

determinar la cantidad de células de morfología linfoide.

Muestras Biológicas:

Se obtendrán muestras de sangre periférica de ratones de las cepas

BALB/c, CD1, NIH y C56BL/6 machos adultos sanos.

II.4 PROCEDIMIENTOS

El estudio se realizó en ratones machos de 12 semanas de edad de las

cepas BALB/c, CD1,NIH y C57BL/6 de 12 semanas, Se realizo la activación

7

celular para su caracterización fenotípica de los linfocitos Th 17, y se analizaron

por citometría de flujo.

Se obtuvieron muestras de sangre periférica y de bazo de ratones

machos de las cepas BALB/c, CD1, NIH y C56BL/6 adultos de 12 semanas

sanos libres de patógenos. Analizándose 4 individuos de cada cepa por

ensayo, las cepas fueron proporcionadas por el Bioterio Central de la Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, se

conservaron en las mismas condiciones, en el Laboratorio de Inmunología

Clínica I de la misma institución.

El protocolo utilizado cumple con las condiciones estipuladas en el

comité de bioética de justificación para la utilización de animales de

experimentación de acuerdo a la NOM-062-ZOO- 1999.

Obtención de leucocitos de ratón. Se obtendrá de 500 a 1000 μL de

sangre periférica de los ratones anestesiándolos previamente con eter etílico

por 20 segundos, se sujeta al ratón por la nuca sosteniéndolo de las orejas y

cola, se obtiene la muestra del seno retrorbital y recibiremos la sangre

periférica de 4 ratones machos de cepas adultas BALB/c, CD1 (ICR), NIH y

C57BL/6 en un tubo eppendorf de 1500μL con 100μL de heparina como

anticoagulante. Posteriormente se estimularan con 1.0μL de PMA (Forbol

miristado acetato Sigma), 1.0μL de ionomicina y 10μL de brefeldina A (BfA de

BD) se incubaran a 37°C por 4 horas. La viabilidad se determinará con azul

tripano (azul tripano al 0.1% en solución salina al 0.85% estéril), se realizará la

cuenta celular en una cámara de Neubauer y se ajustará a 1 X106 células/mL

en PBS 1X.Terminando el tiempo de incubación se realizara la tinción de

superficie.

Extracción de órganos linfoides (bazo)

1.- Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí

detrás de las orejas, cruzando la nuca, tirar del rabo hacia atrás con la otra

mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca.

2.- Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.

3.- Esterilizar con alcohol la zona de la línea media.

8

4.- Cortar por la línea media con tijeras.

5.- Retirara la piel con los dedos.

6.- Girar al animal para exponer su flanco izquierdo.

7.- Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.

8.- Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo.

9.- Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS.

Disgregación de tejidos linfoides (bazo).

1.- Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que

previamente se ha añadido PBS estéril.

2.- Limpiar de tejido graso y conectivo.

3.- Pinchar repetidas veces con una aguja.

4.- Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla.

5.- Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo.

6.- Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede

la cápsula.

7.- Cuando todo el líquido esté en el tubo, dejar sedimentar los trozos de tejido

no disgregado y transferir el líquido claro a un tubo limpio.

8.- Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos, decantar y añadir 1ml de medio

de cultivo.

Tinción de superficie. Para realizar la tinción de marcadores de

superficie, se utilizaran 5 L de los siguientes anticuerpos monoclonales

acoplados a diferentes fluorocromos; anti-CD4-FITC, anti-CD3 PerCP (BD

Pharmingen). Estos se colocarán en tubos de poliestireno de 12x75 ml (Falcon-

Becton Dickinson), a los cuales se les adicionará 100 μL SP (previamente

estimulada) (1 X106 células/mL). Las muestras se agitarán en vórtex durante 5

segundos y se mantendrán en la oscuridad durante 20 min a 4º C, transcurrido

el tiempo de incubación de las muestras, se lavarán dos veces por

centrifugación a 1500 rpm durante 5 min con PBA (PBS 1X con ASB al 0.5% y

NaN3 al 0.1%).

Para realizar la tinción intracelular, las células marcadas en la superficie

se resuspenderán en 400 μL solución permeabilizadora 1X (BD), se agitarán en

9

el vórtex durante 5 segundos y se incubarán durante 10 min a 4º C en la

oscuridad, se lavarán con 2 mL de solución de lavado PBA (PBS 1X con ASB

al 0.5% y NaN3 al 0.1%) por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min y se les

eliminará el sobrenadante.

Tinción intracelular de IL-17. En un volumen mínimo, a las células

previamente permeabilizadas se les adicionará 5 L de anticuerpo monoclonal

anti-IL-17 PE y su control de isotipo (anti- 1 de rat FITC, anti- 2 de rat PE)

correspondiente, las células se homogenizarán en vórtex 5 segundos y se

incubarán durante 30 min en oscuridad, posteriormente se lavarán dos veces

con 2 mL de solución de lavado PBA (PBS 1X con ASB al 0.5% y NaN3 al 0.1%)

por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min y se les eliminará el sobrenadante.

Se resuspenderán en 0.5 mL de paraformaldehído al 1% en PBS 1X. (Sigma

Aldrich St Louis MO, USA) Las muestras se mantendrán a temperatura de 4º C

en oscuridad hasta su adquisición en el citómetro de flujo.

Adquisición y análisis de los datos. Las muestras se adquirirán en el

programa CellQuest de un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton

Dickinson) se adquirirán como mínimo 50 000 eventos por muestra en la

ventana de células T CD4+ en el canal FL1 y se analizarán en el programa

CellQuest para 4 colores del citómetro de flujo FACSCalibur. Los datos se

compararán con la prueba estadística adecuada.

Materiales

Equipo

Analizador automático para Biometría modelo Cell Dyn 3000 de Abbott

Citómetro de flujo modelo “FACScan” de Becton Dickinson en el

programa de “Cell Quest”

Anticuerpos

Control de isotipos IgG1 IgG2 FITC/ IgG2 PE

Anti-IL-17 PE intracelular

CD3 PerCP

CD4 FITC

10

CD8 FITC/ PE

CD 38 FITC/ PE

CD 138 FITC/ PE

Material

Tubos para el clitómetro de flujo (Falcon 2052)

Tubos de plástico 12 X 75

Tubo vacutainer tapón lila 12 X 75

Papel parafilm

Portaobjetos

Pipetas automáticas de 1.0, 0.1, 1.15, 0.02 mL

Puntas para pipetas automáticas

Criotubos

Tubos eppendorf

Jeringas de 5 y 10 ml

Agujas hipodérmicas con pabellón para insulina

Reactivos

Brefeldina A

PMA (formol mirístato acetato)

Solución de lavado PBA (PBS 1X con ASB al 0.5% y NaN3 al 0.1%)

Solución de lisis 1X Becton Dickinson

Solución permeabilizante 1X de Becton Dickinson

Paraformaldehído al 1% (Sigma)

Colorante de Wright y amortiguador de fosfatos pH 6.4

Heparina Inepar

Amortiguador salino de fosfato pH 7.35 (FACS flow)

Éter dietílico anestésico

11

Resultados

• Identificación y comparación de la cantidad de células Th 17 en las

cepas BALB/c, CD1, NIH, C57BL/6 sanos

SANGRE PERIFERICA

CEPA

SIN ESTIMULO CON ESTIMULO

% Total de Células Th 17

BALB/c 0.1% Células Th 17

0.20% Células Th 17

0.1 %Células Th 17

CD1 0.41% Células Th 17

0.6% Células Th 17

0.19 %Células Th 17

NIH 0.40% Células Th 17

0.64% Células Th 17

0.24 %Células Th 17

C57BL/6 0.44% Células Th 17

2.35% Células Th 17

1.91 %Células Th 17

12

BAZO

CEPA SIN ESTIMULO CON ESTIMULO % Total de Células Th 17

BALB/c 1.37 % Células Th 17

1.5 % Células Th 17

0.13 % de Células Th 17

CD1 1.4 %Células Th 17

1.62 % Células Th 17

0.22% de Células Th 17

NIH 1.8 % Células Th 17

2.20 % Células Th 17

0.4% de Células Th 17

C57BL/6 3.34 % Células Th 17

5.7 % Células Th 17

2.36% de Células Th 17

RESULTADOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Y LA COMPARACIÓN DE

LAS DIFERENTES CEPAS

13

Conclusiones

En contra de lo esperado, la cepa BALB/c tiene menor cantidad de

células Th 17 CD3+CD4+ productoras de IL- 17 en comparación con las

cepas CD1, NIH y C57BL/6. Sin embargo, la determinación se hizo en la

sangre periférica y en el bazo, y los resultados obtenidos nos permiten

suponer que estos números disminuidos reflejen la migración de los

linfocitos Th 17 a la cavidad peritoneal, donde el aceite inyectado causa

el cuadro inflamatorio. Estamos iniciando la determinación de estas

células en la cavidad peritoneal de las cepas indicadas, y siguiendo su

evolución en los meses siguientes al tratamiento con aceite.

14

Nueva hipótesis

En la cepa BALB/c las células Th 17 han migrado al sitio de inflamación.

donde aumentarán el daño crónico y el cambio de los linfocitos B a la neoplasia

que se observa en esta cepa.

Perspectivas

Analizar la funcionalidad de las células Th 17 en el ratón BALB/C y el

ratón C57BL/6 que resultaron las contrapartes, para conocer la relación

que pudieran tener en los procesos inflamatorios crónicos.

Cuantificar las células Th 17 en pacientes con mieloma múltiple y en

donadores sanos.

Presentaciones en Congresos

Ponencia presentada en el XXVII Congreso Nacional de Bioquímica que

se celebro en la Ciudad de Mérida Yucatán los días 16-21 de noviembre del 2008, con el trabajo de investigación “Participación de las Células Th 17 en la Etiología del Mieloma Múltiple en ratones de la cepa Balb/c”

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Afzali B, Lombardi G, Lechler RI, Lord GM. 2007. The role of T helper 17

(Th17) and regulatory T cells (Treg) in human organ transplantation and

autoimmune disease. Clin Exp Immunol 148: 32–46.

Bakkus MH, Van Riet I, De Greef C, Van Camp B, Thielemans K. 1995.

The clonogenic precursor cell in multiple myeloma. Leuk Lymphoma 18

:221-229.

Bataille R, Harousseau JL. 1997. Multiple Myeloma. N Engl J Med

336:1657-1664.

15

Bergsagel PL, Kuehl WM. 2005. Molecular pathogenesis and a

consequent classification of multiple myeloma. J Clin Oncol 23:6333-

6337.

Bergsagel DE, Wong O, Bergsagel PL, Alexanian R, Anderson K, Kyle

RA, Raabe GK. 1999 Benzene and multiple myeloma: appraisal of the

scientific evidence. Blood. 94:1174-82.

Hudson, L., Hay, F.C.1989. Practical inmunology. 3 era Edición.

Blackwell Scientific Publications. London.

Katzel JA, Hari P, Vesole DH. 2007. Multiple Myeloma: charing toward a

Bright Future. CA Cancer J Clin 57: 301 -318.

Bladé J. 2001. Mieloma Múltiple. En: Hematología Clínica. Editorial

Harcourt. Madrid, España. 4ta Edición. PP: 574-588.

Kuehl WM, Bergsagel PL. 2002. Multiple Myelona: evolving genetics

events and host interactions. Nat Rev Cancer 2:175-187.

Kyle RA, Gertz MA, Witzing TE, Lust JA, Lacy MQ, Dispenzieri A,

Fonseca R, Rajkumar SV, Iffird JR, Larson DR, Plevak ME, Therneau

TM, Greipp PR. 2003.Review of 1027 patients with newly diagnosed

multiple myeloma. Mayo Clin Proc 78: 21-33.

Kyle RA. 2000 Multiple Myeloma: an odyssey of discovery. Br J

Haematol 111:1035-1044.

Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM Mattson J, Basham B,

Sedgwick JD, McClanahan T, Kastelein RA, Cua DJ. 2005. IL-23 drives

a pathogenic T cell population that induces autoimmuneinflammation. J

Exp Med 201:233–40.

Lubberts E, Joosten LA, van de Loo FA, Schwarzenberger P, Kolls J,

van den Berg WB. 2002 Overexpression of IL-17 in the knee joint of

collagen type II immunized mice promotes collagen arthritis and

aggravates joint destruction. Inflamm Res 51:102–4.

Lubberts E, Koenders Marije I, B van den Berg W. 2005, The role of T

cell interleukin-17 in conducting destructive artritis: lessons from animal

models. Resp Ther 7: 29-37.

16

Mishell, B.B. Shiigi, S.M. 1980. Selected methods in cellular immunology.

W.H. freeman and col. San Francisco.

Muller, J. R., G.M. Jones, M. Potter, and S. Janz. 1996. Detection of

immunoglobulin/c-myc recombinations in mice that are resistant to

plasmacytoma induction. Cancer Res 56:419-23.

Muller, J. R., G. M. Jones, S. Janz, and M. Potter. 1997. Migration of

cells with immunoglobulin/c-myc recombinations in lymphoid tissues of

mice. Blood 89:291-6.

Sirohi B, Powles R. 2004 Multiple Myeloma. Lancet 363:875-887.

Smith A, Wisloff F, Samson D; UK Myeloma Forum; Nordic Myeloma

Study Group; British Committee for Standards in Haematology 2006

Guidelines on the diagnosis and management of multiple myeloma 2005.

BJH 132: 410 – 451.

Starr TK, Jameson SC,Hogquist KA. 2003 Positive and negative

selection of T cells. Annu Rev Immunol 21:139–76.

Salmon SE, Cassady JR. Plasma Cell Neoplasms. En: DeVita VT Jr,

Herllman S y Rosenberg SA editores. CANCER. Principles and Practice

of Oncology. 4th Edition. Volumen 2. J.B. Lippincot Co. Philadelphia,

Penn.1993. pp 1986.

S.Potter, M.,J. Wax, and G.M. Jones. 1997.Indomethacin is a potent

inhibitor of pristine and plastic disc induced plasmagenesis in a

hypersusceptible BALB/c congenic strain. Blood (in press).

Suematsu,S.,T. Matsusaka,T. Matsuda, S.oho, J. Miyazaki,K Yamamura,

T.Hirano, and T, Kishimoto.1992. Generation of plasmacytomas with the

chromosomal translocation t(12;15) in interleukin 6 transgenic mice.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:232.

Riedel DA, Pottern LM: 1992. The epidemiology of multiple myeloma.

Hematol Oncol Clin North Am 6:225-247.

Rajkumar SV, Kyle RA. 2005. Multiple Myeloma: diagnosis and

treatment. Mayo Clin Proc 80:1371-1382.

Ruiz Reyes G., Ruiz Argüelles A. 2003. Padecimientos

Inmunoproliferativos Malignos. En: Fundamentos de hematología.

17

Editorial Medica Panamericana. México, México. 3ra Edición. PP: 323-

341.

Vela-Ojeda J, Ruiz-Garcia M, Borbolla JR. Mieloma Múltiple. 1ª Ed.

Elsevier. México 2006, pp 1 – 8, 57 - 67, 177 -190.

Weir. D.M. 1986. Cellular inmunology.4 ta Edición. Blackwell scientific

Publications London.