PapilloCheck - GBO · Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu4 0,5 µL - 10 µL 0,5 µL - 20...

Avusturya'da üretilmiştir TEHLİKE

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2 72636 FrickenhausenAlmanya

4 °C

8 °C

60

465 060505 060

Sağlık Açısından Gücümüz

6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 (PapilloCheck®) tip ve 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (PapilloCheck® high-risk risk) tip insan papillomavirüs-lerin rahim boynu örneklerinde genotiplenmesi için tanısal kit.

Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafındanin-vitro tanılarda kullanılması içindir

PapilloCheck®

PapilloCheck® high-riskKullanım Kılavuzuna Bakınız

HPV DNA-Chip

Revizyon: BQ-013-09 / Mart 2016



4 °C

8 °C

60

465 060505 060


PapilloCheck® ve PapilloCheck® yüksek risk - Kullanım TalimatlarıRevizyon: BQ-013-09 / Mart 2016

2

TELİF HAKKI BİLGİLERİPapilloCheck® Test Kitinin Kullanımı için Talimatlar

©Telif hakkı, 2015 - Greiner Bio-One

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2, 72636 Frickenhausen, AlmanyaTel: +49 (0) 7022 948-0, Faks: +49 (0) 7022 [email protected], www.gbo.com

BildirimTüm hakları saklıdır.

Bu belgede yer alan bilgiler, daha önceden duyuru yapılmaksızın her an değişebilir. Bu belgenin, Greiner-Bio-One GmbH'nin önceden verilmiş yazılı onayı olmadan herhangi bir biçimde ya da şekilde kopyalanması ya da çoğaltılması yasaktır.

Ticari marka hakkıKullanılan marka adları ve etiketler, ilgili sahiplerinin mülkiyetindedir.

Kullanıcı için önemli bilgilerPapilloCheck® Test Kitinin doğru kullanımı için kullanıcının bu talimat kılavuzunu dikkatli bir şekilde okuması ve izlemesi gerekmektedir.

Üretici, bu sistem testinin bu belgede açıklanmayan şekilde kullanımı ya da test sisteminin kullanıcısı tarafından yapılan değişiklikler konusunda herhangi bir sorumluluk kabul etmeyecektir.

KULLANIM AMACIPapilloCheck® bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA preparatlarında 24 türde insan papillomavirüsünün kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır.

PapilloCheck® high-risk risk bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA preparatlarında 14 türde high-risk riskli insan papillomavirüsünün (hrHPV) kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır.

PapilloCheck®, İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazları Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. PapilloCheck® kullanılarak elde edilen her tanı sonucu diğer klinik bulgular veya laboratuar bulguları ile birlikte yorumlanmalıdır.

PapilloCheck® Test Kitleri yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır.Bu ürünler, yalnızca moleküler biyolojik teknikler konusunda uzmanlaşmış teknisyenler ve doktorlar gibi profesyonel kullanıcılar tarafından kullanma amaçlıdır.

Aksi belirtilmediği sürece, bu Kullanım Talimatlarında PapilloCheck® adı, hem PapilloCheck® hem de PapilloCheck® high-risk riski ifade etmek için kullanılacaktır.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



3

!SEMBOLLER SÖZLÜĞÜ

tr Parti kodu

Yeniden kullanmayın

Son kullanma tarihi

Kullanım Talimatları-na Başvurun

Katalog Numarası

Üretici Ambalaj hasarlıysa, kullanılmamalıdır

Sıcaklık limiti

<n> test için yeter-li içerik

TEHLİKE ve UYARI işaretlerine sahip

GHS resimleri

tr CE işaretleri

In vitro tıbbi tanı cihazı

Karanlık yerde saklayı-nız

Önemli Not

!I V D



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



4

İÇİNDEKİLER

1. KİT İÇERİĞİ ...................................................................................................................6

2. GEREKLİ SARF MALZEMELERİ, EKİPMANLAR VE DONANIMLAR ........................ 7

3. NAKLİYE VE SAKLAMA ............................................................................................... 9

4. GÜVENLİK TALİMATLARI .......................................................................................... 10

5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ ........................................................................................ 11

6. GİRİŞ ............................................................................................................................ 12

6.1 Arka Plan Bilgileri ............................................................................................................ 126.2 PapilloCheck® ile saptanabilir HPV tipleri .................................................................... 126.3 Miktar tayini prensibi ....................................................................................................... 136.4 PapilloCheck® çipinin tasarımı ....................................................................................... 15

6.4.1 PapilloCheck® çip düzeni .....................................................................................................156.4.2 Çip üstü kontroller ................................................................................................................16

7. PAPILLOCHECK® İŞ AKIŞI İÇİN TALİMATLAR ......................................................... 18

7.1 Genel talimatlar ................................................................................................................ 187.2 Oda ayrımı ........................................................................................................................ 187.3 Uyarılar ve önlemler ........................................................................................................ 19

7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi ...............................................................................................197.3.2 Çipleri ile işlem yapma talimatı ............................................................................................197.3.3 Genel önlemler .....................................................................................................................197.3.4 Güvenli çalışma ...................................................................................................................20

8. PAPILLOCHECK® PROSEDÜRÜ ................................................................................ 21

8.1 Numune toplama ve DNA izolasyonu ............................................................................ 218.1.1 Örnek toplama .....................................................................................................................218.1.2 DNA Ekstraksiyon ................................................................................................................23

8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ................................................................................ 238.2.1 Termal döngüleyici kurulumu ...............................................................................................248.2.2 Urasil-N-Glikolaz (UNG) tedavisi11 ......................................................................................248.2.3 PCR reaksiyonu kurulumu ...................................................................................................25

8.3 Hibridizasyon ve yıkama ................................................................................................. 278.3.1 Hazırlık ve kurulum ..............................................................................................................278.3.2 Hibridizasyon .......................................................................................................................288.3.3 Yıkama ve kurutma ..............................................................................................................30

8.4 PapilloCheck® çipinin taranması ve değerlendirilmesi ................................................ 32

9. SORUN GİDERME .......................................................................................................33

10. TEKNIK DESTEK .........................................................................................................34



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



5

11. PAPILLOCHECK® PERFORMANS ÖZELLİKLERİ .................................................... 35

11.1 PapilloCheck® Analitik Performansı .............................................................................. 3511.1.1 Analitik hassasiyet ...............................................................................................................3511.1.2 Analitik özgüllük – HPV türleri ..............................................................................................3611.1.3 Analitik özgüllük – HPV dışı organizmalar ...........................................................................36

11.2 Yinelenebilirlik (Ara Yeniden Üretilebilirlik) .................................................................. 3611.3 Yeniden Üretilebilirlik ...................................................................................................... 3711.4 Dayanıklılık ....................................................................................................................... 3711.5 PapilloCheck® Klinik Performansı .................................................................................. 38

12. PAPILLOCHECK® KISA PROTOKOL .........................................................................40

12.1 Oda 2: Reaksiyon karışımı PCR kurulumu .................................................................... 4012.2 Oda 2: PCR-DNA şablon eklentisi / PCR reaksiyonu ................................................... 4112.3 Oda 3: Hibridizasyon - Hazırlık / Hibridizasyon reaksiyonu ........................................ 4212.4 Oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme ............................................... 43



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



6

1. KİT İÇERİĞİ

PapilloCheck® vePapilloCheck® high-risk risk Test Kiti1

İçerik Miktar

PapilloCheck® (REF 465 060)

PapilloCheck® PCR MasterMix 5 x PapilloCheck® PCR MasterMix2 5 x 300 µL

PapilloCheck® Slide kutusu, 5 x 12 Dizi

1 x PapilloCheck® Slide kutusu, 5 PapilloCheck® çipli3, 12 dizili, 60 numune için 1

PapilloCheck® Hib. Tamponu 2 x PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponu 2 x 1.000 µL

PapilloCheck® TAMP A kons. 2 x PapilloCheck® Yıkama tamponu A, konsantratı 2 x 40 mL

PapilloCheck® TAMP B kons. 1 x PapilloCheck® Yıkama tamponu B, konsantratı 1 x 15 mL

Broşür Kullanım Talimatlarını İndir 1

PapilloCheck® high-risk risk (REF 505 060)

PapilloCheck® high-risk risk PCR MasterMix 5 x PapilloCheck® high-risk risk PCR MasterMix 5 x 300 µL

PapilloCheck® high-risk risk Slide kutusu, 5 x 12 Dizi

1 x PapilloCheck® high-risk risk Slide kutusu, 5 PapilloCheck® high-risk risk çipli3, 12 dizili, 60 numune için

1

PapilloCheck® high-risk risk Hib. Tamponu

2 x PapilloCheck® high-risk risk Hibridizasyon Tamponu 2 x 1.000 µL

PapilloCheck® high-risk risk TAMP A kons.

2 x PapilloCheck® high-risk risk Yıkama tamponu A, konsantratı 2 x 40 mL

PapilloCheck® high-risk risk TAMP B kons.

1 x PapilloCheck® high-risk risk Yıkama tamponu B,konsantratı

1 x 15 mL

Broşür Kullanım Talimatlarını İndir 1

1 Bir PapilloCheck® veya PapilloCheck® high-risk risk Test Kiti 60 numunenin analizi için yeterlidir.2 DNA Taq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz dışında PCR için gerekli olan tüm bileşenleri içerir.3 Bir PapilloCheck® çipi, 12 PapilloCheck® mikro dizisi içerir. Bu Kullanım Talimatlarında, çip ve slide kelimeleri eşanlamlı



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



7

olarak kullanılmaktadır.

2. GEREKLİ SARF MALZEMELERİ, EKİPMANLAR VE DONANIMLAR

PapilloCheck®'in listelenen sarf malzemeleri, ekipmanlar ve donanımlar ile birlikte ve yalnızca profesyonel personel tarafından kullanılması önerilmektedir.

Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar

PapilloCheck® Test Kiti 465 060 60 reaksiyon için 1 test kiti

PapilloCheck® high-risk risk Test Kiti 505 060 60 reaksiyon için 1 test kiti

PapilloCheck® Toplama Kiti 465 075 50 numune için 1 test kiti

oCheck® DNA İzolasyon Kiti / Tek KolonPreparasyon 515 040 50 hazırlama için 1 test kiti

Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu4

0,5 µL - 10 µL0,5 µL - 20 µL10 µL - 100µL10µL - 200 µL100 µL - 1000 µL

765 288774 288772 288739 288750 288

96/96096/96096/96096/96060/600

50 mL polipropilen tüp5

1,5 mL reaksiyon tüpü 210 261616 201

25/450500/4000

Pipetleyici için plastik pipetler

Pipet 10 mLPipet 25 mLPipet 50 mL

607 180 veya 607 160760 180 veya 760 160786 180 veya 768 160

1/2001/2001/200

4 Belirtilen uç boyutlarından bazıları kullanılabilir mikropipetlere bağlı olarak isteğe bağlıdır.5 Yalnızca slide santrifüj mevcut değilse gerekir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



8

Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar

CheckScanner™ 862 070 1

CheckReport™ Yazılımı Temel 862 080 1

CheckReport™ Yazılımı PapilloCheck® eklentisi 862 081 1

CheckReport™ Yazılımı PapilloCheck® high-risk risk eklen-tisi 862 088 1

Bilgisayar sistemi: CheckReport™ Yazılımı vePapilloCheck® veya PapilloCheck® high-risk risk eklentisi 862 910 1

Başlangıç Paketi CheckScanner™ (CheckScanner™, bilgisayar sistemi, CheckReport™ Yazılımı, PapilloCheck® veya PapilloCheck® high-risk risk eklentisi)

862 170 1

oCheck® Hibridizasyon Odası, slide tutuculu 447 070 1

Slide tutucu için manyetik tutucu 447 001 1

oCheck® Washbox6 447 020 1

Gerekli enzimler

• Taq Polimeraz: HotStarTaq® DNA Polimeraz 5 U/μl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)• Urasil-N-Glikosilaz: Urasil-DNA Glikosilaz 1 U/µL (Thermo Scientific; #EN0361, #EN0362)

Gereken ek sarf malzemeleri

• PCR-kalitesinde su• Saflaştırılmış su• Tek kullanımlık eldivenler• DNA Away™ (Thermo Scientific; #7008, #7009, #7010)• Lütfen yalnızca kullanılan döngüleyicinin üreticisi tarafından üretilen, uygun ve PCR ile uyumlu 8 tüplü şeritler, teli

tüpler veya levhalar kullanın.• İş akışını optimize etmek için 8 tüplü şeritlerin kullanılması önerilir.

Gereken ek ekipmanlar

• 1,5 ve 2 mL reaksiyon tüpleri için mikrosantrifüj• 50 mL polipropilen tüpler için santrifüj• Tekli 0,2 mL reaksiyon tüpleri veya 8'li tüp PCR şeritleri için mikrosantrifüj • PCR termal döngüleyici: GeneAmp® PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH)• Su banyosu (50 °C)• Mikropipetler (1 - 1000 μl arası farklı aralıklar)• 8-Kanallı multipipet (aralık: 5 - 50 μl), örn. Brand Transferpette®-8 (Marka)• Cam ve plastik pipetler için pipetleyici• Vortex çalkalayıcı• Farklı reaksiyon tüpleri için raflar• Süreölçer• Atık kabı

Gerekli ek donanımlar

• Bilgisayar (sistem gereksinimleri için CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız)

6 PapilloCheck® yıkama prosedürü için üç adet oCheck® Yıkama teknesi gerekmektedir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



9

3. NAKLİYE VE SAKLAMA

PapilloCheck® Test Kitinin nakliyesi ortam sıcaklığında gerçekleştirilir. Bununla birlikte kit teslim alındıktan hemen sonra 4 ila 8 °C'de saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. PapilloCheck® çiplerinin bulunduğu slide kutusunu daima nem giderici ile birlikte kapalı, fermuarlı bir çantada saklayın. Serilerin karışmasını önlemek için tüm bileşenler orijinal kit ambalajlarında saklanmalıdır. Doğru bir şekilde saklanan PapilloCheck® Test Kiti ve bileşenleri belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Ayrıca bu koşullar altında raf ömrü, kitin ve bileşenlerinin ilk kez açılmasından sonra son kullanma tarihinden sapmaz.

PapilloCheck® Test Kitinin 4 ila 8 °C sıcaklıkta saklanması, Hibridizasyon Tamponu ve Tampon B'de tuzların çökelmesine neden olabilir. Oda sıcaklığına (18 ila 25°C) dengelenme, karıştırma ve tüp/şişe vorteksleme öncesinde çökeltiler çözünmelidir.

Ürün Depolama

PapilloCheck® Test Kiti 4 ila 8 °C, ışıktan korunan şekilde

PapilloCheck® high-risk risk Test Kiti 4 ila 8 °C, ışıktan korunan şekilde



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



10

4. GÜVENLİK TALİMATLARI

PapilloCheck® Test Kiti yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Slidelar üzerinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi, tatmin edici olmayan veya geçersiz sonuçların elde edilmesine neden olabilir.

! Her zaman uygun bir laboratuar önlüğü giyin, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde verilen güvenlik talimatlarını izleyin.

Mevzuat Bilgileri:PapilloCheck® Test Kitinin aşağıdaki bileşenleri zararlı veya tehlikeli bileşenler içerir.

Kit Bileşeni

Miktar Tehlikeli içerik

1272/2008 (EC) numaralı

Düzenleme için

sınıflandırma

GHS resimli çizelgesi ve

sinyal kelimesi

Tehlike ve tedbir ifadeleri

PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponu, guanidin tiyosiyanat, %20-60, CAS No. 593-84-0

akut toksisite, oral (kategori 4), akut toksisite, soluma (kategori 4), kronik suda toksisite (kategori 3), cildi tahriş edebilir (kategori 1c)

TEHLİKE

H302H332H314H412P273P280

P305+ P351+P338

EUH032

Yutulursa zararlı.Solunursa zararlı.Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarlarına neden olur.Uzun süreli etkiler ile birlikte su altı yaşam için tehlikelidir.

Çevreye salınmasından kaçının.Koruyucu eldivenler/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu takın/giyin.GÖZE KAÇMASI HALİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin.

İlave tehlike bilgileri (AB) Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır.

PapilloCheck® Tampon B, sodyum dodesil sülfat, < %20, CAS No. 151-21-3

cilt irritasyonu (kategori 2), ciddi göz hasarı (kategori 1)

TEHLİKE

H315H318P280

P305+ P351+P338

Cilt irritasyonuna neden olur.Ciddi göz hasarına neden olur.Koruyucu giysi/göz koruması/yüz koruması kullanın.GÖZE KAÇMASI HALİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin.

Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



11

5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ

PapilloCheck® çipi yıkandıktan ve kurutulduktan sonra yıkama çözeltileri I ve II özel bir tedbir olmaksızın atılabilir. Kullanılmış PapilloCheck® çipi, kullanılmamış kit bileşenlerini ve kullanılmamış hibridizasyon karışımını laboratuar kimyasal atıklarıyla birlikte bertaraf edin.

Bertaraf etme ile ilgili tüm ulusal düzenlemelere, devlet düzenlemelerine ve yerel düzenlemelere riayet edin.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



12

6. GİRİŞ

6.1 Arka Plan Bilgileri

Hemen hemen tüm rahim boynu kanseri vakalarında karsinojenik insan papillomavirüs (HPV) ile kalıcı enfeksiyon tespit edilmiştir – ikincisi tüm dünyada kadınlarda en yaygın görülen kanserdir7. Bugüne kadar 100'den fazla HPV tipi saptanmıştır, bunların yaklaşık 40 tanesi cinsel yolla bulaşır ve genital mukozayı enfekte eder. Rahim boynu HPV tipleri high-risk risk (high-risk riskli HPV, hrHPV) ve düşük risk grubunda (düşük riskli HPV, lrHPV) sınıflandırılır. High-risk risk HPV türleri, rahim boynu kanseri oluşum riskinin artışı ile ilişkilendirilmiş olsa da düşük risk HPV türleri, genel olarak benign genital siğillere neden olur8. Ancak high-risk riskli grupta dahi, kanser veya rahim boynu intraepitelyal lezyonu (CIN) gelişim riski türe bağlıdır9. Tüm rahim boynu kanseri vakalarının yaklaşık %70'i, HPV 16 veya 18'in kalıcı enfeksiyonu ile bağlantıldır. En baskın düşük risk türleri HPV 6 ve 11'dir. Karsinojenik HPV ve rahim boynu kanseri arasında neredeyse mutlak bir etiyolojik bağlantıya dayalı olarak, artı hrHPV testleri birincil rahim boynu kanseri taraması açısından göz önünde bulundurulmaktadır10.

6.2 PapilloCheck® ile saptanabilir HPV tipleri

PapilloCheck® 18 high-risk risk ve 6 düşük risk tür insan papillomavirüslerin (HPV) (Tablo 1), tespitini sağlarken PapilloCheck® high-risk risk, 14 high-risk risk türde insan papillomavirüslerin (hrHPV) (Tablo 2) tespitini sağlar.

Tablo 1: PapilloCheck® ile saptanabilir HPV tipleri

HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6





HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55*

* PapilloCheck® HPV 44 ile HPV 55'in ayırt edilmesini sağlamaz.

Tablo 2: PapilloCheck® high-risk risk ile saptanabilir hrHPV tipleri

HPV 16 HPV 51

HPV 18 HPV 52

HPV 31 HPV 56

HPV 33 HPV 58

HPV 35 HPV 59

HPV 39 HPV 66

HPV 45 HPV 68

7 Walboomers, J. et al (1999). İnsan papillomavirüsü, tüm dünyada invaziv rahim boynu kanserinin gerekli nedenidir. J Pathol. 189(1):12-9., Cinsel Yolla Yayılan Enfeksiyonlar 76:80-87

8 Burd EM. İnsan papillomavirüsü ve rahim boynu kanseri. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.9 Bosch F.X. et al. (2008). İnsan papillomavirüs enfeksiyonlarının epidemiyolojisi ve doğal geçmişi ve rahim boynu neoplazideki tipe özgü sonuçları. Aşı. 26 Suppl 10:K1-16.

10 Meijer, C.J. et al. (2009). 30 yaş ve üstü kadınlarda birincil rahim boynu kanser taramasına yönelik insan papillomavirüs DNA test gerekliliklerine ilişkin kılavuzlar. Int J Cancer (Uluslararası Kanser Dergisi). 124(3):516-20.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



13

6.3 Miktar tayini prensibi

PapilloCheck®, insan papillomavirüs (HPV) genomu E1 geninin bir parçacığının tespit edilmesine ve genotiplemesine yönelik mikrodizi tabanlı bir test kitidir. Miktar tayini prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir.

PapilloCheck® analizinden önce bir rahim boynu smear'i numunesinden DNA izole edilmelidir. Numune toplama ve DNA izolasyonu PapilloCheck® Test Kitinin parçaları değildir. Greiner Bio-One numune toplama (PapilloCheck® Toplama kiti) ve DNA izolasyonuna (oCheck® DNA İzolasyon Kiti) yönelik özel ürünler de sunmaktadır ve bu ürünler ayrı olarak satın alınmalıdır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız).

Bir rahim boynu numunesinden viral ve insan genomik DNA'sının izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı HPV'ye özgü primerler grubunun bulunduğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir. Aynı reaksiyonda insan tek kopya geni ADAT1 (insan tRNA-özgül adenozin deaminaz1), rahim boynu numunesinde insan numunesi materyalinin varlığını (numune kontrolü) ve PapilloCheck®'de bulunan dahili kontrol şablonunu izlemek için amplifiye edilir. PCR MasterMix, PCR (PCR kontrolü) performansını izlemek için amplifiye edilir. Ayrıca PapilloCheck® PCR MasterMix, dUTP içerir. Böylece, önceki PCR reaksiyonlarından kaynaklanan taşınma kontaminasyonu Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması ile giderilebilir (bkz. bölüm 8.2.2).

PCR ürünleri daha sonra spesifik DNA problarına hibridize edilir ve PapilloCheck® çip yüzeyine çip üstü kontrolleri eklenir. Her çip 12 DNA-mikro dizisi içerir, 12 rahim boynu numunesinin eş zamanlı analizine olanak tanır. Hibridizasyon sırasında bağlı DNA floresanla etiketlenir ve bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. Hibridizasyon etkinliği izlenir (hibridizasyon kontrolü).

Son olarak PapilloCheck® çipi sırasıyla CheckScanner™ ve CheckReport™ Yazılımı kullanılarak otomatik olarak taranır, analiz edilir ve değerlendirilir (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). CheckScanner™, iki renkli lazer tarayıcısı olup (532 nm ve 635 nm eksitasyon dalgaboyları) HPV'ye özgü amplifikasyon ürünlerinin yanı sıra kontrollerinin varlığı ile oluşturulan floresan sinyalinin tespit edilmesini sağlar (bkz. bölüm 6.4.2). CheckReport™ Yazılımı, sonuçların görüntülenmesine, analizine ve değerlendirilmesine olanak sağlar ve tespit edilen HPV türlerinin ve kontrollerin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda otomatik olarak gösterir.

Rapor, tespit edilebilir bir veya daha fazla 24 HPV türünün veya 14 hrHPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösterir ve kapsamlı çip üstü kontrolleri analizi son derece güvenilir kılar.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



14

1. PCR reaksiyonu

2. Hibridizasyon

3. Yıkama ve kurutma

4. Tarama ve analiz

veya

Şekil 1: PapilloCheck® miktar tayini prosedürü1. PCR reaksiyonu: DNA izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı ve iki kontrol hedefinin parçacıkları

PCR ile amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra çip üzerinde tamamlayıcı DNA problarına hibridize edilir. 2. Hibridizasyon: Her bir HPV türü, beş kopya halinde bulunan spesifik DNA probu ile tespit edilir. Hibridizasyon sırasında

floresan etiketleme uygulanır.3. Yıkama ve kurutma: Bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır.4. Tarama ve analiz: PapilloCheck® çipi, CheckScanner™ ve CheckReport™ Yazılımı kullanılarak taranabilir, analiz edilebilir

ve değerlendirilebilir. Tespit edilebilir bir veya daha fazla HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösteren bir rapor oluşturulur.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



15

6.4 PapilloCheck® çipinin tasarımı

6.4.1 PapilloCheck® çip düzeni

Her PapilloCheck® veya PapilloCheck® high-risk risk çipi, kuyucuk A1 - B6 olarak tayin edilmiş 12 mikrodizi içerir. Her kuyuda, farklı problardan oluşan tekli bir mikrodizi incelenir. Her bir tekli mikro dizi, yükseltilmiş bir kenarla çevrelenir. Her prob beş kez damlatılır. Mikro dizi düzeni Şekil 2 kısmında gösterilmektedir. Tanımlanan çip üstü kontrolleri, 6.4.2. bölümde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

oryantasyon kontrolü

HPV 31HPV 18HPV 16HPV 11HPV 6


hibridizasyon kontrolü

HPV 44/55HPV 43

numune kontrolü




HPV 82HPV 73




hibridizasyon kontrolü

HPV 44/55HPV 43

numune kontrolü




HPV 82HPV 73

a) kırm

ızı k

anal

(635

nm

)ye

şil k

anal

(532

nm

)

b)

c)

Şekil 2: PapilloCheck® çipinin tasarımıa) PapilloCheck® çipinin şematik çizimi. b) ve c) Kırmızı kanal taraması (b) için kullanılan iki farklı ikaz dalga boyutu için CheckReport™ Yazılım tarafından görüntülenen görseller: Yazılımı 532 nm) ve PapilloCheck® mikrodizi yerleşim planının şematik çizimleri. HPV türü spesifik problar ve çip üstü kontroller belirtilir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



16

6.4.2 Çip üstü kontroller

PapilloCheck® DNA-çipinin tasarımı kapsamlı çip üstü kontrolleri içerir. Çeşitli kontrol sistemleri, numune kalitesi ve DNA izolasyonu (numune kontrolü), PCR reaksiyonunun kalitesi (PCR kontrolü), hibridizasyon etkinliğinin (hibridizasyon kontrolü) yanı sıra nokta homojenliği ve baskı kalitesi (işletim kontrolü ve baskı kontrolü) de dahil olmak üzere miktar tayini ve çip işlemenin tüm kritik adımlarını izler. HPV türlerinin varlığına veya yokluğuna ek olarak CheckReport™Yazılımı kontrollerin ve tespit edilen HPV türlerinin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda gösterir. Farklı kontrollerin okunması için CheckScanner™'in her iki eksitasyon dalgaboyu kullanılır. Miktar tayini performansının kontrolü için (numune ve PCR kontrolü) kırmızı kanal kullanılırken (635 nm eksitasyon dalgaboyu), hibridizasyonun ve çipin kalitesi (hibridizasyon, oryantasyon ve baskı kontrolü) yeşil kanalda değerlendirilir (532 nm eksitasyon dalgaboyu).

Numune kontrolüPapilloCheck®, insan tek kopya geni ADAT1'in (insan tRNA-spesifik adenozin deaminaz1) bir parçacığını amplifiye ederek numunenin numunenin ve/veya DNA izolasyonunun kalitesini izler. İnsan DNA'sı rahim boynu numunesinden izole edilen DNA'da yeterli miktarda mevcut ise numune kontrol noktalarında bir floresan sinyali verilir.

ADAT1 amplifikasyonu yoksa ya da yetersizse, CheckReport™ Yazılımı örnek kontrolünü "başarısız" olarak gösterecektir. Bunun da patojene özgü noktalardan gelen sinyale bağlı olarak iki farklı sonucu bulunmaktadır. HPV için bir örnek pozitif olduğunda analiz geçerlidir. Bu durumda, başarısız numune kontrolü, eşlik eden DNA ve PCR sırasında hedef DNA fazlalığı arasındaki karşılaştırmanın doğrudan sonucudur. Bir diğer yandan, örnek HPV için negatif sonuç verdiğinde, CheckReport™ Yazılımı, analizi kötü numune toplama (numunede yetersiz sayıda hücre bulunması) ve/veya etkisiz DNA izolasyonu nedeniyle "başarısız" olarak gösterecektir. Bu durumda, analizin DNA izolasyonu ile veya gerekli olduğunda yeni bir numune alınarak yinelenmesi önerilir (bkz. bölüm 9).

PCR kontrolüPapilloCheck® ayrıca PCR performansını da izler. PapilloCheck® PCR MasterMix'de bulunan dahili kontrol şablonunun amplifikasyonu PapilloCheck® çipindeki PCR kontrol noktalarında bir sinyal oluşturur. Amplifikasyon reaksiyonunun kalitesi aynı zamanda CheckReport™Yazılımı ile de otomatik olarak değerlendirilir. PCR performansı önceden tanımlanmış eşiğin altında ise CheckReport™Yazılımı PCR kontrolünü "başarısız" olarak gösterir ve analiz tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9).

Numunedeki HPV DNA çok high-risk ise, PCR kontrol noktalarının floresan sinyali, PCR reaksiyonu sırasındaki rekabete bağlı olarak düşük olabilir veya olmayabilir. Bu durumda testin geçerli olarak kabul edilebilmesi için en az bir HPV-spesifik probunun floresan sinyali önceden tanımlanmış eşiği aşmalıdır.

Hibridizasyon kontrolüPapilloCheck®, PapilloCheck® çipinde spesifik DNA dizilerine hibridize olan PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponu içinde floresan ile etiketlenmiş prob kullanımı ile hibridizasyonun etkinliğini izler. Yeterli bir hibridizasyon etkinliği her bir dizi noktasında floresan sinyalleri ile sonuçlanır. PapilloCheck® çipindeki beş hibridizasyon kontrol noktasının sonuçları ayrıca CheckReport™ Yazılımı ile de değerlendirilir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



17

Oryantasyon ve baskı kontrolüPapilloCheck® çipinin oryantasyon kontrol noktaları, hibridizasyon prosesinin etkinliğine bakılmaksızın floresan sinyalleri verir. Bu noktalar, sinyallerin doğru analizi için bir ön koşul olan doğru nokta tespitine yönelik kılavuz noktaları olarak CheckReport™ Yazılımı tarafından kullanılır. PapilloCheck® çipi üzerindeki yazdırma kontrolü, nokta varlığını ve hibridizasyonunu kontrol eder. Ayrıca baskı prosesinin kalitesi her bir çip noktasında (baskı kontrolü) yeşil bir floresan sinyali ile izlenir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



18

7. PAPİLLOCHECK® İŞ AKIŞI İÇİN TALİMATLAR

Aşağıdaki iş akışı açıklaması, PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk risk ürünlerinin uygulanması için aynıdır. Lütfen yalnızca PapilloCheck® Test Kitinin bileşenlerini kullanarak PapilloCheck® için verilen açıklamayı izleyin. Lütfen yalnızca PapilloCheck® high-risk risk Test Kitinin bileşenlerini kullanarak PapilloCheck® high-risk risk için verilen açıklamayı izleyin.

7.1 Genel talimatlar

Moleküler biyolojide halihazırda kullanılan en gelişmiş teknikler bir laboratuvara uygulandığında, laboratuar personelinin azami güvenliğini ve high-risk kaliteli sonuçlar sağlamak amacıyla aşağıdaki talimatlar göz önünde bulundurulmalıdır.

DNA izolasyonu, amplifikasyon ve amplifikasyon ürünlerinin tespiti uygun nitelikli personel gerektirir. Ayrıca DNA bozunması veya amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyon nedeniyle ortaya çıkanlar gibi hatalı sonuçları engellemek için net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gerekmektedir. Bunu sağlamak için Bölüm 7.2'de tanımlandığı gibi izolasyon, amplifikasyon ve tespit alanlarının ayrılması gerekir.

Her alanda ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. Laboratuvar önlüklerini, eldivenleri veya ekipmanları kesinlikle farklı bir alandan bir başka alana aktarmayın.

7.2 Oda ayrımı

Şekil 3 bir laboratuvarın nasıl üç farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNA izolasyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir.

Oda 1 Oda 2 Oda 3

Şekil 3: Manuel işleme alma için oda ayırma

Oda 1: DNA izolasyon prosedürünün tamamı bu odada gerçekleştirilmelidir.Oda 2: Bu odada, PCR reaksiyon karışımı ayarlanır ve alikuotlara bölünür (en uygunu bir PCR ocağı altında). Oda 1'de

izole edilen DNA numunelerinin eklenmesi oda 2 içinde ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir.Oda3: Hibridizasyon reaksiyonu, yıkama adımları ve çip kurutma üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca CheckScannerTM,

CheckReport™ Yazılımı ile birlikte PapilloCheck® miktar tayininin nihai analizi için kullanılır.

! Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. Bu nedenle, laboratuvara ekipman temin edilirken ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



19

7.3 Uyarılar ve önlemler

7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi

• Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır.

• Laboratuvar temizliği: Çalışma alanı, çalışma öncesinde ve sonrasında DNA-AWAY™ (Thermo Scientific) veya uygun bir temizleme solüsyonu ile dekontamine edilmelidir.

• Analizin her adımında eldiven takılmalıdır ve özellikle DNA izolasyonu sırasında sık sık değiştirilmelidir.

• Numune tüpleri: Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır.

• Pipetleme: Aerosol bariyerli uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (steril, DNase, Rnase ve insan DNA'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir.

7.3.2 Çipleri ile işlem yapma talimatı

• DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Çip yüzeyinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi önlenmelidir.

• Çip yüzeyindeki hibridizasyon bölgesine dokunulmamalıdır.• Çipin yalnızca etiketli tarafı hibridizasyona yöneliktir.• Çip üzerinde spesifik olmayan floresana yol açtıklarından DNA çiplerinin tanımlanması için işaret

kalemleri kullanılmamalıdır.• DNA çipleri yalnızca tek kullanımlıktır. Hibridize edilen çipler yeniden kullanılamaz.• Kullanılmamış çipler, teslim edilen ve nem çekici fermuarlı torba içinde, orijinal kutusunda saklanır.

7.3.3 Genel önlemler

• Teslim alındığında kit bileşenlerinin hasarlı olup olmadığını kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Bu komponentlerin kullanılması, kit performansını zayıflatabilir.

• Kit, son kullanma tarihinden sonra kullanılmamalıdır.• Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın.• Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın.• Yalnızca kitle birlikte sağlanan ve üretici tarafından tavsiye edilen reaktifleri/ekipmanları kullanın.• Tüm ekipman üzerinde (ör. PCR döngüleyiciler veya pipetler) düzenli kalibrasyon/bakım işlemleri

gerçekleştirilmelidir.• Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle olabildiğince doğru bir

şekilde pipetlemeye dikkat edin.• Reaktiflerin mikrobik kontaminasyonunu önlemek için alikuotlar reaktif tüplerinden alınırken dikkatli

olunmalıdır.• Kullanılmayan reaktifler ve atık materyal, federal yönetim ve eyalet düzeyindeki kılavuz ilkelere

uygun olarak bertaraf edilmelidir.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



20

7.3.4 Güvenli çalışma

• Daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu önlükler kullanın.• Kitler yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar

uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır.• İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken dikkatli

olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numune lizisi tamamlanana kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek kullanın ve bertaraf edin.

• Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten kaçının, bu numuneleri sıçratmayın ve püskürtmeyin. İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük kullanın.

• Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin.• Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler

kullanmayın.• Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.

Bu ürüne ait Güvenlik Veri Formunun güncel sürümü Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir:www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi

21PapilloCheck® ve PapilloCheck® yüksek risk - Kullanım TalimatlarıRevizyon: BQ-013-09 / Mart 2016

8. PAPİLLOCHECK® PROSEDÜRÜ

Aşağıdaki bölümde, her bir analiz edilen rahim boynu numunesinde tespit edilebilir bir veya daha fazla HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça belirten ayrıntılı bir raporun hazırlanması ile sonuçlanan farklı çalışma adımları ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. Şekil 4, gerekli olan farklı çalışma adımlarına bir genel bakış sunar. Ayrıca spesifik miktar tayini adımının tanımlandığı ilgili alt bölümü de gösterir. Çalışma adımları bu bölümde belirtilen sırada gerçekleştirilmelidir. Her adım mavi ok ile gösterilmiştir.

!CheckReport™ Yazılımı ile örnek toplama, DNA izolasyonu ve analiz PapilloCheck® Test Kitinin parçaları değildir. Bu nedenle bu çalışma adımlarının tanımı bu bölümde kısaltılmıştır. Daha ayrıntılı bilgi için lütfen Kullanım Kılavuzuna bakın, örn: PapilloCheck® Toplama Kitinden, oCheck® DNA İzolasyon Kiti ve CheckReport™ Yazılımından.

8.1 Numune toplama ve DNA izolasyonu

8.1.1 Örnek toplama

Örnek toplama, PapilloCheck® Test Kitinin bir parçası değildir. Greiner Bio-One tarafından rahim boynu örneklerine yönelik özel bir toplama kiti (PapilloCheck® Toplama Kiti) de sunulmaktadır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız).

PapilloCheck® aşağıdaki toplama sistemleri veya araçlarından biri ile toplanan insan rahim boynu smear'larından oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile hazırlanan DNA kullanılarak valide edilmiştir:

• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya)• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, ABD)• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD)• STM™ (Qiagen, Hilden, Almanya).• Easyfix (VWR, Radnor, PA, ABD)• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Fransa)

Uygun taşıma araçları veya DNA izolasyon sistemleri ile ilgili daha fazla bilgi için yerel Greiner Bio-One distribütörünüz ile iletişime geçin veya Greiner Bio-One internet sitesine başvurun: www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi


Bölüm 8.1.2 DNA izolasyonu

oCheck®

DNA İzolasyon Kiti

Bölüm 8.3.2 Hibridizasyon

Bölüm 8.2 PCR

Bölüm 8.4 Tarama ve değerlendirme

Bölüm 8.3.3 Yıkama ve kurutma

veya

Şekil 4: Farklı PapilloCheck® çalışma adımlarına genel bakış


8.1.2 DNA Ekstraksiyon

DNA izolasyonu, PapilloCheck® Test Kitinin bir parçası değildir. PapilloCheck® analizinden önce Greiner Bio-One tarafından sağlanan oCheck® DNA İzolasyon Kiti (bkz. Bölüm 2) kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir. oCheck® DNA İzolasyon Kitini kullanırken lütfen Kullanım Kılavuzunu izleyin.

oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile DNA izolasyonu için 250 µl numune çözeltisi kullanılmalıdır.

Aşağıdakiler ile toplanan insan rahim boynu smear numuneleri: • PapilloCheck® Toplama Kiti ile (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya)• PreservCyt® toplama ortamında (Hologic, Bedford, MA, ABD)• Easyfix içinde (VWR, Radnor, PA, ABD) veya• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Fransa)doğrudan işlenebilir.

Surepath™ toplama ortamında (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) • toplanan rahim boynu numuneleri kullanım öncesinde yıkanmalıdır: 5 dakika boyunca 11.000 x

g'de 250 µL numuneyi santrifüje alın ve peleti 250 µL distile edilmiş suda bekletin. Daha sonra 250 µl oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.

STM™ toplama ortamında (Qiagen, Hilden, Almanya) • toplanan rahim boynu numuneleri seyreltilmelidir: 100 µL numune ve 150 µL distile edilmiş su

kullanın. 250 µL seyreltilmiş numune oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.

Genel olarak rahim boynu smear numunesi çok konsantre görünüyorsa ve zaten agrege olmuşsa, DNA izolasyonuna başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!

Oldukça seyreltilmiş olan ve görünür hücresi bulunmayan rahim boynu smear numuneleri, DNA izolasyonu için daha high-risk hücre verimi elde etmek üzere konsantre hale getirilmelidir: 5 dakika boyunca 11.000 x g'de 1000 µL numuneyi santrifüje alın ve peleti 250 µL distile edilmiş suda bekletin. Daha sonra 250 µl oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.

! Bu konsantrasyon adımı yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti ile, PreservCyt®, Easyfix ve Cyt-All toplama ortamında ya da Surepath™ toplama ortamında toplanan rahim boynu smear numuneleri için uygundur. STM™ toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.

8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq Polimeraz ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak PapilloCheck® Test Kiti ile birlikte verilmez ve ayrı olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2).

! PapilloCheck® Test Kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz ve Thermo Scientific tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (bkz. bölüm 2) valide edilmiştir. İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur.


8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu

PapilloCheck® Test Kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir: • GeneAmp® PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)• Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) • peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).

! İddia edilen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması kesinlikle şarttır.

PapilloCheck® PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 3'de özetlenmektedir.

Tablo 3: PapilloCheck® PCR'nin termal döngüleyici programı

Süre Sıcaklık °C Döngü sayısı

20 dk 37 °C 1

15 dk 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C 15

Tutun 10 °C ∞

Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız.

GeneAmp® PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını “9600”e ayarlayın ve 103 °C kapak sıcaklığını kullanın.

Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler)PapilloCheck® PCR programına girmek için Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin Dönüştürme Yöntemi aracını kullanın ve “9600 Emülasyon Modu”nu seçin. Reaksiyon hacmini 26 µl'ye ve kapak sıcaklığını 103 °C'ye ayarlayın.

peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)Isıl döngüleyici ile birlikte sağlanan ön programlı PapilloCheck® PCR programı “PapilloCheck.js” yazılımını kullanın. Genellikle program şu yoldan açılabilir. local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js.

8.2.2 Urasil-N-Glikolaz (UNG) tedavisi11

PapilloCheck® PCR MasterMix PapilloCheck® PCR sırasında amplifikasyon ürünlerine dahil edilen dUTP içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG, PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir reaksiyonda amplifiye edilmez.

Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir11.

11 PapilloCheck® ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896; 5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir.


Urasil-N-Glikolazı 1:200 PCR-sınıfı su ile seyreltin. Her PapilloCheck® PCR reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi yeniden kullanmayın.

2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın.

Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu 0,005 U/µl'dir.

! PapilloCheck® Test Kiti Thermo Scientific tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.

Bu seyreltmeden 1 µl kadarını her bir PapilloCheck® PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3, Tablo 4).

Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve PapilloCheck®hassasiyetinin azalması ile sonuçlanabileceğinden daha high-risk konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın.

Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 °C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra, UNG 95 °C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki adım PapilloCheck® PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 3). İkinci adımda (95 °C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq® Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir.

!PapilloCheck® PCR'nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7'de tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir.

8.2.3 PCR reaksiyonu kurulumu

HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PapilloCheck® PCR MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir (PCR tamponu, MgCl2, dNTP'ler, primerler, PCR kontrol şablonu).

Genel olarak, PapilloCheck® PCR kurulum prosedürü iki ayrı bölüme ayrılabilir: PapilloCheck® PCR MasterMix nihai mastermix'inin hazırlanması ve şablon olarak izole DNA eklemek için nihai PCR reaksiyonunun hazırlanması.

! PapilloCheck® Test Kiti, Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.

Nihai mastermix hazırlığı, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir.

Nihai mastermix hazırlığı (PapilloCheck® PCR MasterMix, HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 4'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın.


Çoklu numuneleri analizi etmek için nihai mastermix bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13 amplifikasyon reaksiyonu için bir nihai mastermix hazırlayın (bkz. Tablo 4). Bir çipin reaksiyonları için her zaman bir flakon PapilloCheck® PCR MasterMix kullanın.

! Hazırlanan her nihai mastermix'in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir.

2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek nihai mastermix'i iyice karıştırın.

Her bir PCR reaksiyonu için 21 μL miktarda örneği 0,2 mL, ince duvarlı PCR reaksiyon tüpüne pipetleyerek bölün.

Şablon DNA'yı nihai mastermix'in kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2).

Reaksiyon karışımının hazırlanması için her bir nihai mastermix'e 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir.

Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2).

! PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta süreyle -20 °C'de saklanmalıdır.

Tablo 4: PapilloCheck® PCR reaksiyonunun kurulumu

1 reaksiyon 13 reaksiyon(1 çip)

26 reaksiyon(2 çip)



PapilloCheck®

PCR MasterMix 19,8 µL 257,4 µL 514,8 µL 772,2 µL 1029,6 µL

HotStarTaq® DNA Polimerazı (5 U/µL) 0,2 µL 2,6 µL 5,2 µL 7,8 µL 10,4 µL

Urasil-N-Glikosilaz(1:200 seyreltme, 0,005 U/µl) 1 µL 13µL 26 µL 39 µL 52 µL

Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim (nihai mastermix)

21 µL 273 µL 546 µL 819 µL 1092 µL

Rahim boynu numunesinden DNA ekstraktı (DNA şablonu) 5 µL

Reaksiyon başına toplam hacim (nihai PCR reaksiyonu)

26 µL


8.3 Hibridizasyon ve yıkama

8.3.1 Hazırlık ve kurulum

Gerekli tüm bileşenlerin oda sıcakllığına dengelenmesi için hibridizasyon prosedürüne başlamadan en az 30 dakika önce hibridizasyon ve yıkama adımlarının hazırlıklarına başlayın.

Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözmek için bunları 30 dakika süreyle oda sıcaklığına maruz bırakın ve kullanım öncesinde iyice karıştırın.

PapilloCheck® Test Kitinin 4 ila 8 °C'de saklanması Hibridizasyon Tamponunda ve Tampon B'de SDS çökeltisi ile sonuçlanabilir. Solüsyonların oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin ve daha sonra tüpe vorteks uygulayın veya çökeltiler çözülene kadar şişeyi karıştırın.

oCheck® Hibridizasyon Odasını Hazırlayın: Hibridizasyon Odasına yeni bir nemli kağıt havlu yerleştirin ve neme doygun bir ortam oluşturmak için kapağı kapatın.

Çip üzerindeki kullanılmış hibridizasyon karışımının küçük hacminin buharlaşmasını önlemek için hibridizasyonun neme doygun bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir. Greiner Bio-One tarafından PapilloCheck® analizi için özel bir Hibridizasyon Odası sunulmaktadır (bkz. Bölüm 2).

Gereken miktarda PapilloCheck® çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında en az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında (20-25 °C) inkübe edin.

!Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu iki ucun yalnızca birinde bir mıknatıs içerir. Dörtten az PapilloCheck® çipinin paralel olarak hibridize edilmesinin gerekmesi durumunda slide tutucuyu mıknatısın karşı tarafından PapilloCheck® çipleri ile doldurmaya dikkat edin. Aksi takdirde PapilloCheck® çipleri yıkama prosedürü sırasında sıvı ile kaplanmaz.

Yıkama solüsyonları I, II ve III'ü aşağıdaki talimatlara uygun olarak hazırlayın.

Yıkama solüsyonları I, II ve III'ün hazırlanması: Yıkama solüsyonu karışımını Tablo 5te gösterildiği gibi analiz edilmekte olan PapilloCheck® çipleri

sayısı için uygun olan yıkama solüsyonları I, II ve III için hazırlayın. Yıkama solüsyonu karışımının üç eşit hacmini üç ayrı oCheck® Yıkama Teknelerine alikuotlar

halinde bölün ve yıkama solüsyonu I, II ve III olarak etiketleyin. Her bir oCheck® Yıkama Teknesi, 4 çipe kadar gerekli olan yıkama solüsyonunun doğru miktarını gösteren yerleşik bir terazi içermektedir. Tampon miktarını kontrol etmek için lütfen bu teraziyi kullanın.

Yıkama solüsyonu II'yi kullanmadan önce sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 20 dakika süreyle 50 °C'ye önceden ısıtın. Su banyosunun dolum seviyesinin yıkama solüsyonu II'nin dolum seviyesine eşit olmasını sağlayın.

Tablo 5: Yıkama solüsyonu karışımının hazırlanması

PapilloCheck® çipi sayısı

Bileşenler 1 2 3 4

Saflaştırılmış su 140 mL 280 mL 420 mL 560 mL

PapilloCheck® Tampon A 14 mL 28 mL 42 mL 56 mL

PapilloCheck® Tampon A 1,75 mL 3,5 mL 5,25 mL 7 mL

Toplam hacim 155,75 mL 311,50 mL 467,25 mL 623 mL


!Muhtemelen PapilloCheck® sonuçlarına engel olacak yıkanmış PCR ürünlerinin birikmesine yol açacağından yıkama solüsyonlarını kesinlikle yeniden kullanmayın. Her miktar tayini için yeni yıkama solüsyonu kullanın.Hazırlanan yıkama solüsyonu karışımı oda sıcaklığında bir hafta süreyle saklanabilir. SDS çökeltisi meydana gelip gelmediğini kontrol edin. Çökelti meydana gelmişse, çökelti çözülene kadar yıkama solüsyonu karışımını ısıtın ve tekrar oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra bir sonraki hibridizasyon deneyi için hazırlanın.

8.3.2 Hibridizasyon

Hibridizasyon 20 ve 25 °C arası bir ortam sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. PapilloCheck® PCR reaksiyonunun PCR ürünlerinin PapilloCheck® çipine hibridizasyonu için ana çalışma adımları Şekil 5'de açıklanmıştır.

PCR ürünlerini kullanmadan önce karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün.

! PCR ürünleri hibridizasyona kadar ≤ -20 °C'de saklanmışsa PCR ürünlerini karıştırmadan önce çözün ve daha sonra belirtilen şekilde ilerleyin.

Hibridizasyon Tamponuna kullanmadan önce vorteks uygulayın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün.

30 μL PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponunu bir 8x PCR şeridinin temiz reaksiyon tüpüne aktarın. Daha rahat olması durumunda, yeni bir PCR plakası kuyusu kullanılabilir.

5 μL PCR ürününü Hibridizasyon Tamponuna ekleyin ve birkaç defa yukarı aşağı pipetleme yaparak ya da vortekslemeyle karıştırın.

Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. 25 μl hibridizasyon karışımını, çok kanallı bir pipetin altı kanalını kullanarak her bir çip kuyucuğuna

aktarın. Hava kabarcığı oluşmasını önleyin!

8 kanallı multipipet ve 8x PCR şeridi kullanılarak altı numunenin paralel bir şekilde işlenmesi önerilir (bkz. Şekil 6). Bu kullanım etkinliğini, hızını arttırır ve böylece buharlaşma riskini azaltır. Bir seferde birden fazla slaytın işlenmesi gerekiyorsa multipipet kullanımı, doğru hibridizasyon süresinin elde edilmesi için zorunludur.

! Baloncuk oluşumundan kaçının!

Mümkün olursa bir çipin 12 kuyucuğunu hibridize edin. 12'den daha az numunenin işlenmesi durumunda kullanılmamış kuyucukları boş bırakın. İşlenmiş bir çipte kullanılmamış kuyucuklar gelecek numuneler için kullanılamaz.

! Hibridizasyon karışımının dökülmesini önlemek için çipi dikkatli bir şekilde kullanın. Dökülme numunelerin çapraz kontaminasyonuna ve hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir.

Çipi, karanlık, neme doygun bir ortamda, hazırlanmış bir Hibridizasyon Odası içinde ortam sıcaklığında (20 ila 25 °C arası) tam olarak 15 dakika süreyle inkübe edin. Hibridizasyon sırasında Hibridizasyon Odasını hareket ettirmemeye dikkat edin.

!İnkübasyon zamanını veya hibridizasyon reaksiyonunun sıcaklığını kesinlikle değiştirmeyin, bu floresan sinyal yoğunluğunun kaybolmasına veya spesifik olmayan floresanda artışa neden olabilir.

Hibridize edilen çipleri doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın.


Hibridizasyon Odasında neme doygun bir ortam hazırlayın.

Gereken miktarda PapilloCheck® çipini hazırlanan Hibridizasyon Odasında oda sıcaklığında inkübe edin (bkz. Bölüm 8.3.1).

30 µL PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponunu PCR şeridin 0,2 mL reaksiyon tüpünde 5 µL PCR ürünü ile inkübe edin. İyice karıştırın.

25 µL hibridizasyon karışımını PapilloCheck® çipinin her bir kuyucuğuna çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın.

Hibridizasyon Odasını kapatın ve PapilloCheck® çipini tam olarak 15 dakika süreyle ortam sıcaklığında inkübe edin (20 ila 25 °C arası).

Şekil 5: Hibridizasyon prosedürünün çalışma adımları


8.3.3 Yıkama ve kurutma

Greiner Bio-One tarafından tedarik edilen özel ekipman dört PapilloCheck® çipinin paralel yıkanmasını sağlar (bkz. Bölüm 2). PapilloCheck® çiplerinin işlenmesi için gerekli olan ek ekipmanlar üç adet oCheck® Yıkama Teknesi ve Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu kolundan oluşmaktadır.

Farklı çalışma adımları Şekil 6'da gösterilmektedir.

Hibridize edilen slaytları içeren manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından dikkatli bir şekilde çıkarın.

Slide'ları içeren slide tutucuyu doğrudan yıkama solüsyonu I'i içeren oCheck® Yıkama Teknesine bırakın. Manyetik tarafın ön tarafa baktığından emin olun.

oCheck® Kolunu slide tutucusuna takın ve üç yıkama adımının ilkine başlayın. Çipi oda sıcaklığında yıkama solüsyonu I içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı

hareket ettirerek yıkayın. Diziler daima yıkama solüsyonu ile kaplı bir şekilde kalmalıdır. Çipi yıkama solüsyonu II içinde 60 saniye süreyle 50 °C'de slide tutucuyu yukarı kuvvetlice hareket

ettirerek yıkayın. Çipi oda sıcaklığında yıkama solüsyonu III içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve

aşağı hareket ettirerek yıkayın. Santrifüj ile, çip yüzeyinden tüm sıvıları hemen giderin. Mikrodiziler için özel bir mikrosantrifüj

kullanılırsa 1 dakika süreyle santrifüj edin. 50 mL'lik tüpler için geçerli olan bir santrifüjün kullanılması durumunda her yıkanan PapilloCheck® çipini 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 dakika süreyle 500 x g'de santrifüj edin.

PapilloCheck® çipi artık tarama için hazırdır ve hemen taranmalıdır. oCheck® Yıkama Teknelerinin temizlenmesi için tamamlanan her yıkama ve kurutma işleminden sonra birkaç defa durulayın.


Birinci yıkama adımı Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon

Odasından dikkatli bir şekilde çıkartın. Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine

yıkama solüsyonu I ile hızlı bir şekilde bırakın oCheck® Kolunu takın PapilloCheck® çipini (çiplerini) yıkama

solüsyonu I'de oda sıcaklığında slide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 10 saniye süresince yıkayın

İkinci yıkama adımı PapilloCheck® çipini (çiplerini) yıkama

solüsyonu II'de bir su banyosunda 50 °C sıcaklıkta slide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 60 saniye süresince yıkayın

Üçüncü yıkama adımı PapilloCheck® çipini (çiplerini) yıkama

solüsyonu III'te oda sıcaklığında slide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 10 saniye süresince yıkayın

Kurutma PapilloCheck® çiplerinin yüzeyindeki tüm

sıvıları santrifüj ile hemen giderin

3 dakika500 g

1 dakikamaks. hız

veya

Şekil 6: Yıkama prosedürünün çalışma adımlarıPapilloCheck® çipinin CheckScanner™ ve CheckReport™ Yazılımı ile analizinden önce farklı yıkama prosedürleri ve kurutma prosedürü.


8.4 PapilloCheck® çipinin taranması ve değerlendirilmesi

PapilloCheck® çipini (çiplerini) CheckScanner™'e yerleştirin ve CheckReport™ Yazılımının Kullanıcı Kılavuzunda tanımlandığı gibi taramaya devam edin.

CheckScanner™ ve CheckReport™ Yazılımının kurulumu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi ve bilgisayar sistem gereksinimleri için lütfen CheckScanner™ ve CheckReport™ Yazılımının Kullanım Kılavuzuna başvurun.

CheckReport™ Yazılımını kullanarak verileri analiz ederken bilgisayarınızda kurulu olan CheckReport™ Yazılımı versiyonunun, halihazırda kullanılan PapilloCheck® kitinde belirtilen versiyonla eşleştiğinden emin olun. Versiyonlar eşleşmiyorsa CheckReport™ Yazılımını güncelleyin. Son Yazılımın versiyonu Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir:www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



33

9. SORUN GİDERME

Çip taraması sırasında aşağıdaki hata mesajlarından birinin oluşması veya PapilloCheck® analizinin spesifik çip üstü kontrollerine bağlı olarak başarısız olması durumunda aşağıda belirtildiği şekilde ilerleyin. PapilloCheck® ürününü kullanırken herhangi bir sorunuz olması veya herhangi bir güçlükle karşılaşmanız durumunda lütfen yerel Greiner Bio-One distribütörünüz ile iletişime geçin.

DNA izolasyonu gibi diğer miktar tayini adımlarında sorun giderme işlemleri için lütfen ilgili Kullanım Talimatlarına başvurun.

SORUN ve sebebi Açıklamalar ve öneriler

HATA MESAJI,,BARKOD OKUNAMADI“

Hasarlı barkod Barkodu hasar açısından kontrol edin. Uygun pencere görüldüğünde barkodu manüel olarak girin.

Çip doğru bir şekilde yüklenmedi

Çip oryantasyonunu kontrol edin ve çipi doğru oryantasyonda tarayın.

HATA MESAJI „EKSİK NOKTALAR“, BASKI KONTROLÜ BAŞARISIZ OLDU VEYA ORYANTASYON KONTROLÜ BAŞARISIZ OLDU

Çip üzerinde toz PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin.

Çip üzerine sıvı transferi sırasında hava kabarcıkları oluşumu

PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin. Hava kabarcığı oluşumunu engellemek için dikkatli bir şekilde pipetleyin.

HİBRİDİZASYON KONTROLÜ BAŞARISIZ OLDU

Hatalı yıkama solüsyonu II sıcaklığı

İkinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Yıkama solüsyonu II'nin 50 °C'ye ısıtılmasını sağlayın.

Hatalı su banyosu sıcaklığı İkinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Su banyosunun sıcaklığını kontrol edin. Su banyosunun 50 °C sıcaklığa ayarlanmasını sağlayın. Gerekirse, bir termometre kullanarak sıcaklığı onaylayın.

Hibridizasyon karışımının hatalı hazırlanması

Hibridizasyon karışımının hazırlanmasını tekrar edin ve PCR ürünlerini başka çip üzerinde hibridize edin.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



34

SORUN ve sebebi Açıklamalar ve öneriler

PCR KONTROLÜ BAŞARISIZ

PapilloCheck® PCR MasterMix'e HotStarTaq® DNA Polimerazı eklenmedi

PapilloCheck® analizini, PCR reaksiyonunun hazırlanması ile başlayarak tekrar edin.

PapilloCheck® PCR MasterMix'e uygun işlev gösteren HotStarTaq® DNA Polimerazı eklendi


PapilloCheck® PCR MasterMix'e seyreltilmemiş Urasil-N-Glikolaz eklendi


Nihai mastermix'in yetersiz karışımı

PapilloCheck® analizini PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar edin. Reaksiyon karışımını iyice karıştırmaya dikkat edin.

PCR inhibitörleri numune mevcuttur DNA izolasyonunu ve PapilloCheck® analizini tekrar edin.

Hibridizasyon, PCR ürünü eklenmeden gerçekleştirilmiştir Hibridizasyonu tekrar edin.

Nihai hibridizasyon karışımının yetersiz karışımı Hibridizasyonu tekrar edin.

Termal döngüleyicidesorunlar PapilloCheck® ile birlikte yalnızca onaylı termal döngüleyiciler kullanın.

NUMUNE KONTROLÜ BAŞARISIZ OLDU

Numune DNA'sı nihai mastermix'e eklenmedi PapilloCheck® analizini PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar edin.

DNA hazırlama başarısız oldu DNA izolasyonunu tekrar edin.

Yeterli numune materyali yokBaşarısız numune toplama. Örnek çok açık. Örneği Bölüm 8.1'deki açıklamaya uygun olarak konsantre edin ve DNA izolasyonunu veya numunetoplamayı tekrar edin.

PCR VE/VEYA NUMUNE KONTROLLERİ BAŞARISIZ OLMADI ANCAK 0 SNR DEĞERİ GÖRÜNTÜLENİYOR

Bu sonuç, CheckReport™ Yazılımının numunede tanımlanmış eşiğin üzerinde sinyali olan en az bir HPV türünü tespit etmesi durumunda geçerli olarak değerlendirilir. Numune ve/veya PCR kontrolü, PCR sırasındaki rekabet nedeniyle daha sonra floresan sinyallerinin düşük olduğunu veya olmadığını gösterebilir.

10. TEKNİK DESTEK

Greiner Bio-One ürünleri ile ilgili herhangi bir sorunuz, deneyiminiz veya zorluğunuz olursa, lütfen yerel Greiner Bio-One distribütörünüzle ya da moleküler biyoloji konusunda kapsamlı pratik ve teorik deneyim sahibi bilim insanlarının çalıştığı teknik destek departmanı ([email protected]) ile irtibata geçmekten çekinmeyin.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



35

11. PAPİLLOCHECK® PERFORMANS ÖZELLİKLERİ

11.1 PapilloCheck® Analitik Performansı

11.1.1 Analitik hassasiyet

Analitik hassasiyetin değerlendirilmesi için tespit sınırı (LoD95 = vakaların %95'inde algılanabilecek en küçük hedef DNA sayısı) PapilloCheck® tarafından hedeflenen E1 bölgesini içeren her bir algılanabilir HPV türü için referans plazmidler kullanılarak belirlenmiştir. HPV genotipine özgü plazmidlerin analizi için insan hücre hattından gelen hücreler (HEK hücreleri) de dahil olmak üzere bir taşıma ortamına alınmıştır. Her bir numuneden DNA izole edilmiş ve PapilloCheck® Kiti ile analiz edilmiştir. LoD95, 2 bağımsız dilüsyon serisi ve Probit analizi kullanılarak her bir HPV genotipi için ayrı ayrı hesaplanmıştır. Tanımlanan LoD95 , her bir HPV genotipi için üçüncü bir dilüsyon serisi ile doğrulanmıştır. Farklı HPV genotipleri için tespit limitleri Table 6. kısmında özetlenmiştir

Tablo 6: PapilloCheck® Analitik hassasiyeti

HPV Genotipi*PapilloCheck® için Tespit Limiti (LoD95)

[kopya/PCR]**PapilloCheck® için Tespit Limiti (LoD95)

[kopya/izolasyon]***

HPV 6 30 600

HPV 11 20 400

HPV 16 10 200

HPV 18 320 6400

HPV 31 50 1000

HPV 33 90 1800

HPV 35 190 3800

HPV 39 50 1000

HPV 40 20 400

HPV 42 50 1000

HPV 43 30 600

HPV 44 20 400

HPV 45 90 1800

HPV 51 20 400

HPV 52 70 1400

HPV 53 60 1200

HPV 55 20 400

HPV 56 50 1000

HPV 58 160 3200

HPV 59 290 5800

HPV 66 40 800

HPV 68 30 600

HPV 70 30 600

HPV 73 2250 45000

HPV 82 40 800

* PreservCyt™ (Hologic) içinde arka plan olarak 104 insan HEK hücresi ile HPV genotipine özgü plazmid. ** İzolasyon bölgesi başına LoD95'den hesaplanan PCR reaksiyonu başına PCR (bkz. ***)*** Greiner Bio-One'dan önerilen oCheck® DNA İzolasyon sistemi de dahil olmak üzere probit analizine dayalı LoD95



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



36

11.1.2 Analitik özgüllük – HPV türleri

Papillocheck®, HPV genotipine özgü referans plazmidlerini kullanarak analitik özgüllük ile ilgili test edilmiştir. Aşağıdaki HPV genotipleri 105 kopya/PCR reaksiyonu ile test edilmiştir:

HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85.

Aşağıdaki çapraz hibridizasyonlar tespit edilmiştir:

HPV 55, HPV 44 probunda bir sinyal verir. Sonuç olarak CheckReport™ Yazılımı, birleşik HPV 44/HPV 55 sonucunu görüntüler. HPV 13, HPV 11 probu ile çapraz reaksiyona girebilir ancak HPV 13 rahim boynu örneklerinde mevcut olmadığından yanlış bir pozitif sinyal ile sonuçlanmaz.

11.1.3 Analitik özgüllük – HPV dışı organizmalar

PapilloCheck® aşağıdaki HPV dışı organizmalar kullanılarak analizit özgüllük ile ilgili olarak test edilmiştir (1ng genomik DNA/PCR reaksiyonu):

Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans

PapilloCheck® ile belirsiz sinyal algılanmamıştır

11.2 Yinelenebilirlik (Ara Yeniden Üretilebilirlik)

Yinelenebilirlik, bir laboratuvarda farklı işlemler arasındaki performans değişikliğini ölçer. 4 numuneden test yinelenebilirliğinin değerlendirilmesi için her biri farklı bir HPV şablonu içeren insan hücresindeki numuneler (HPV 16, HPV 18, HPV 31 veya HPV 45) manuel oCheck® DNA İzolasyon Kiti kullanılarak izole edilmiş ve PapilloCheck® Kiti ile analiz edilmiştir. Her bir örnek 6 bağımsız kopya halinde 3 bağımsız süreçte analiz edilmiştir. Bu şekilde, her bir numuneden 18 kopya, 72 numune ile birlikte yinelenebilirlik değerlendirmesi için test edilmiştir. Tüm numuneler, aynı kullanıcı tarafından aynı ekipman ve kit serileri ile test edilmiştir. Buna ek olarak, açıklanan yinelenebilirlik değerlendirmesi 3 test merkezinde gerçekleştirilmiştir bu şekilde toplamda 216 analiz yapılmıştır. 3 yinelenebilirlik testinden her biri için %100 oranda uyum sağlanmıştır (bkz. Tablo 7).

Tablo 7: PapilloCheck® ile yinelenebilirlik testlerinin sonuçları

Test Merkezi Uyum

Test merkezi 1 % 100





4 °C

8 °C

60

465 060505 060



37

11.3 Yeniden Üretilebilirlik

Yeniden üretebilirlik, farklı laboratuvarlarda farklı işlemler arasındaki performans değişikliğini ölçer. 4 numuneden test yinelenebilirliğinin yeniden değerlendirilmesi için her biri farklı bir HPV şablonu içeren insan hücresindeki numuneler (HPV 16, HPV 18, HPV 31 veya HPV 45) manuel oCheck® DNA İzolasyon Kiti kullanılarak izole edilmiş ve PapilloCheck® Kiti ile analiz edilmiştir. Prosedür, 3 farklı test merkezinde paralel olarak yürütülmüştür. Her bir numune, her bir test merkezinde 6 bağımsız kopya v e 3 farklı süreçle analiz edilmiştir. Bu şekilde, her bir numuneden 18 kopya, 72 numune ile birlikte test merkezinde test edilmiştir. Her bir test merkezinde farklı ekipman (PCR döngüleyici, CheckScanner™) ve farklı kit serileri kullanılmıştır. Toplamda 216 örnek test edilmiştir. Farklı test merkezlerinin sonuçları için %100'lük uyum elde edilmiştir.

11.4 Dayanıklılık

PapilloCheck® test sisteminin dayanıklılığını değerlendirmek için aşağıdaki parametrelerin sistem değişiklikleri değerlendirilmiştir:

• Hibridizasyon sıcaklığı• Hibridizasyon süresi• Yıkama sıcaklığı

Tüm testler, 3 kopya halinde high-risk şablon konsantrasyonlar (105 kopya/HPV referans plazmidinin PCR reaksiyonu) ve tespit limitine yakın bir şablon konsantrasyonu (HPV genotipine bağlı konsantrasyon) ile gerçekleştirilmelidir. Testler, PapilloCheck® ile algılanabilir her bir HPV genotipi için gerçekleştirilmiştir. Parametre değerlerinin HPV tespitinin mümkün olduğu aralıkları Tablo 8'de özetlenmiştir.

Tablo 8: PapilloCheck® Dayanıklılığı

Parametre Aralık

Hibridizasyon sıcaklığı 18-25 °C'de inkübe edilmesiyle

Hibridizasyon süresi 13-17 dakikadan

Yıkama sıcaklığı 48-52 °C'de inkübe edilmesiyle



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



38

11.5 PapilloCheck® Klinik Performansı

PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk risk miktar tayininin klinik hassasiyet ve özgüllük açısından klinik performansını belirlemek için PapilloCheck®ve GP5+/6+-PCR EIA miktar tayini kullanılarak bir karşılaştırma çalışması gerçekleştirilmiştir12. Bu çalışma için normal sitolojili 40 yaş üzeri 1.437 kadından (ortalama yaş, 49 yaş, yaş aralığı 40 ila 60) ve histolojik olarak onaylanmış CIN3+ lezyonlarına sahip (vaka grubu) 192 kadından (ortalama yaş, 34 yaş; yaş aralığı , 30 ila 60) numuneler analiz edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm numuneler POBASCAM popülasyon tabanlı randomize kontrollü uygulama çalışmasının müdahale grubundaki kadınlardan başlangıç turu sırasında orijinal olarak toplanmıştır13.

PapilloCheck® analizi GP5+/6+-PCR-EIA ve yeni PapilloCheck®high-risk risk ile hedeflenen 14 hrHPV türü ile sınırlandıktan sonra, PapilloCheck® %95,8 ≥ CIN3 klinik hassasiyete (184/192; %95 CI 92,8-98,8) ve %96,7 ≥ CIN2 klinik özgüllüğe (%95 CI 95,7-97,7) sahip olmuştur. Bu rakamların karşılaştırıldığında sırasıyla %96,4 (185/192; 95 % CI: 93,9-98,9) ve 97,7 % (95 % CI: 96,9-98,5) olduğu görülmüştür, GP5+6+-PCR EIA için (bkz. Tablo 9 ve 10).

Tablo 9: PapilloCheck® (PapilloCheck® high-risk risk tarafından hedeflenen 14 hr HPV türü) ve GP5+/6+ PCREIA sonuç-larının karşılaştırılması kontroller ve vakalar için örneklendirilmiştir.

PapilloCheck®

(14 hrHPV türü)GP5+/6+-PCR/EIA Toplam

- + -

Kontroller -+

toplam

1.386 (%96,5)18 (%1,3)

1.404 (%97,7)

4 (%0,3)29 (%2,0)36 (%2,3)

1.390 (%96,7)47 (%3,3)

1.437Vakalar -

+toplam

4 (%2,1)3 (%1,6)7 (%3,6)

4 (%2,1)181 (%94,3)185 (%96,4)

8 (%4,2)184 (%95,8)

192

Tablo 10: PapilloCheck® klinik hassasiyeti ve özgüllüğü ve GP5+/6+-PCR-EIA (14 hr HPV türünden birinin veya daha fazlasının HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 veya 68 sonuçları).

14 hrHPV PapilloCheck® GP5+/6+

≥ CIN3 için Klinik Hassasiyet %95,8 %96,4

≥ CIN2 için Klinik Özgüllük %96,7 %97,7

12 PapilloCheck® insan papillomavirüs tespitinin popülasyon tabanlı rahim boynu taramasında GP5+/6+-PCR-enzim immünotetkiki ile karşılaştırılması. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Aralık 30.

13 Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004. 44.102 kadından elde edilen tasarım, yöntem ve temel hat verilerinde rahim boynu taramasında high-risk riskli HPV testinin uygulanması için popülasyon bazlı randomize kontrollü araştırma. Int. J. Cancer 110:94–101.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



39

PapilloCheck® miktar tayininin yeniden üretilebilirliğini klinik numuneler ile değerlenirmek için 2012 yılında Hollanda ve Almanya'da bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmada Hollanda'nın Utrecht ilinde düzenli rahim boynu sitolojisi taramasına katılan 10.000 kadından oluşan bir gruptan elde edilen rahim boynu örnekleri kullanılmıştır. Tanımlı, önceden test edilmiş 550 numune kullanılarak PapilloCheck®

laboratuvarlar arası yeniden üretilebilirlik ve laboratuvar içi uyumda sırasıyla %97,6 ve %94 değerleri elde edilmiştir. Yeniden üretilebilirlik değerlendirmesinin veri kümeleri Tablo 11 ve 12'de özetlenmiştir.

Tablo 11: Laboratuvarlar Arası Yeniden Üretilebilirlik

PapilloCheck® zaman 1 poz

PapilloCheck®

zaman 1 neg

PapilloCheck® zaman 2 poz 147 6

PapilloCheck® zaman 2 neg 7 390

Sonuçlar:Yeniden Üretilebilirlik [%]: 97,3Düşük güven sınırlaması [%] = 96,3Kappa = 0,941

Tablo 12: Laboratuvarlar Arası Uyum

PapilloCheck® zaman 1 poz

PapilloCheck®

zaman 1 neg

PapilloCheck® zaman 2 poz 123 2

PapilloCheck® zaman 2 neg 31 394

Sonuçlar:Yeniden Üretilebilirlik [%]: 94Düşük güven sınırlaması [%] = 92,1Kappa = 0,842


40

K I S A P R O T O K O L


12. PAPİLLOCHECK® KISA PROTOKOL

12.1 Oda 2: Reaksiyon karışımı PCR kurulumu

Urasil-N-Glikolazı 1:200 in PCR-sınıfı su ile seyreltin UNG seyreltmesini dikkatli bir şekilde karıştırın

PCR reaksiyonlarının gereken miktarı için nihai mastermix'i hazırlayın

1reaksiyon

13reaksiyon

(1 çip)

26reaksiyon

(2 çip)

39reaksiyon

(3 çip)

52reaksiyon

(4 çip)

PapilloCheck®

PCR MasterMix 19,8 µL 257,4 µL 514,8 µL 772,2 µL 1029,6 µL

HotStar Taq® Polimeraz (5 U/µL)

0,2 µL 2,6 µL 5,2 µL 7,8 µL 10,4 µL

Urasil-N-Glikosilaz(1:200 seyreltme, 0,005 U/µl)

1 µL 13µL 26 µL 39 µL 52 µL

Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim

21 µL 273 µL 546 µL 819 µL 1092 µL

Nihai mastermix'i dikkatli bir şekilde karıştırın

Nihai mastermix'i bölün: her PCR reaksiyonu için 21 µl reaksiyon karışımı PCR şeridinin 0,2 ml PCR reaksiyon tüpüne ekleyin.

PCR

Oda 2


41



12.2 Oda 2: PCR-DNA şablon eklentisi / PCR reaksiyonu

Her PCR reaksiyonu için 5 µL DNA şablonunu ekleyin. İyice karıştırın.

PCR reaksiyonunu hazırlanana termal döngüleyici programı ile başlatın.

Süre Sıcaklık °C Döngü sayısı

20 dk 37 °C 1

15 dk 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C 15

Tutun 10 °C

PCR

Oda 2


42



12.3 Oda 3: Hibridizasyon - Hazırlık / Hibridizasyon reaksiyonu

! Hibridizasyondan en az 30 dakika önce hazırlıklara başlayın.

Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözün ve iyice karıştırın

Analiz edilecek PapilloCheck® çipi miktarı için yıkama solüsyonu hazırlayın.

PapilloCheck® çiplerinin sayısı

Bileşenler 1 2 3 4

Distile/deiyonize su 140 mL 280 mL 420 mL 560 mL

PapilloCheck® Tampon A 14 mL 28 mL 42 mL 56 mL

PapilloCheck® Tampon B 1,75 mL 3,5 mL 5,25 mL 7 mL

Toplam hacim 155,75 mL 311,50 mL 467,25 mL 623 mL

Yıkama solüsyonu karışımını üç oCheck® Yıkama Teknesine bölün Yıkama solüsyonu II'yi 50 °C'deki su banyosunda önceden ısıtın

Analiz edilecek PapilloCheck® çiplerini oda sıcaklığında hazırlanan Hibridizasyon Odasında inkübe edin

PCR ürünlerini karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün Hibridizasyon Tamponunu karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün 30 μL PapilloCheck® Hibridizasyon Tamponunu 5 μl PCR ürünü ile karıştırın İyice karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün

25 μl hibridizasyon karışımını PapilloCheck® çipinin her bir kuyucuğuna çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın

Hava kabarcığı oluşmasını önleyin

PapilloCheck® çipini tam olarak 15 dakika süreyle ortam sıcaklığında inkübe edin (20 ila 25 °C)

Hibridizasyon ve Yıkama

Oda 3


43



12.4 Oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme

Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından çıkarın Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine yıkama solüsyonu I ile bırakın oCheck® Kolunu takın PapilloCheck® çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu I'de oda sıcaklığında

10 saniye süreliğine yıkayın

PapilloCheck® çipini (çiplerini) önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu II'de su banyosunda 50 °C'de 60 saniye süresince yıkayın

PapilloCheck® çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu III'de oda sıcaklığında 10 saniye süreliğine yıkayın

PapilloCheck® çip yüzeyindeki tüm sıvıları santrifüj ile giderin

3 dakika500 g

1 dakikamaks. hız

veya

PapilloCheck® çipini (çiplerini) CheckScanner™ ile tarayın Tarama ve analizi CheckReportTM Yazılımı Kullanıcı Kılavuzunda belirtildiği gibi

gerçekleştirin Rapor oluşturun

Hibridizasyon ve Yıkama

Oda 3

PapilloCheck - GBO · Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu4 0,5 µL - 10 µL 0,5 µL - 20...

Documents

Transcript of PapilloCheck - GBO · Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu4 0,5 µL - 10 µL 0,5 µL - 20...