2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,214121 Falsos conteosyfalsos resultadosenanalizadores de hematologa : una revisin . Parte II: clulas blancas, clulas rojas , hemoglobina, indice clulas rojasyreticulocitos M. ZANDECKI, F. GENEVIEVE,J. GERARD, A.GODON Haematology Laboratory, University Hospital of Angers, Angers, France Correspondence: M. Zandecki, Haematology Labor- atory, University Hospital of Angers, 4, rue Larrey, 49000 Angers, France. Tel.: +33 241 35 53 53; Fax: +33 2 41 35 55 99; E-mail: mazandecki@chu-angers.fr doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00871.x Received 30 January 2006; accepted for publication 30 July 2006 Keywords Haematology analysers, automated count, cell blood count, spurious count, white blood cells, haemo- globin, red blood cells, mean cell volume RESUMENLos analizadores en hematologa proporcionan resultados rpidos y precisos en la mayora de las situaciones .Si nembar go,falsos resultados ,relacionados ya sea con las plaquetas (parteI de este informe ) u otros parmetros en el conteo de las clulas sanguneas(CBC) se pueden observar en varios casos . Glbulos blancos falsamente bajos se pueden observar debido a la aglutinacin por la presencia de cido etilendiaminotetractico (EDTA).Crioglobulinas, lipidos, globulos rojos lo insuficientemente lisados(RBC), eritroblastosy agregacin plaquetaria sonsi t uaci onescomunesquei ncr ement anelr ecuent odeWBC.En la mayora de estos casos un marcajey/oun anormalWBC diferencial grfico alertara al operador. Muchas situaciones nos llevarana una medicin anormal de hemoglobin o conteo de RBC,incluyendolipidos, aglutininas, crioglobulinas y elevados conteo deWBC . El volumen cellular medio(MCV) puedetambin estar sujeta a unadeterminacin falsa, a causa de aglutininas, el exceso de glucosa o sales y consideraciones tecnolgicas. A su vez, la anormalidad relacionada con un parmetro medido dar lugar a ndices RBC calculados anormales: celular hemo- globina contenidos (MCHC) es, sin duda los ndices de glbulos rojos ms importantes a considerar significante, ya que es tan importante como marcas generados por los analizadores hematolgicos (HA) para alertar al usuario a un resultado falso. En muchas circunstancias, varios de los parmetros medidos de CBC pueden ser alterados, y el descubrimiento de un cambio falso en un parmetro significa con frecuencia que la validez de otros parmetros debe ser considerado. Marcas sensibles ahora permitir la identificacin de varios conteos falsos, pero slo los ms sofisticados HA tienen marcajeptimo y ms sencilla , especialmente los que no tienen un diagrama de dispersin diferencial WBC, no poseen la misma sensibilidad para la deteccin de resultados anmalos. Los reticulocitos se integran ahora en el CBC en muchas HA, y varias situaciones pueden dar lugar a recuentos anormales. I NTERNATI ONALJOURNALOF LABORATORYHEMATOLOGY 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 22 M. ZANDECKI ETAL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS I NTRODUCTI ON Muchos analizadores de hematologa (HA) que enumera WBC generar un diagrama de dispersin diferencial de WBC, que es la base para el diferencial WBC automatizado.Tales diagramas de dispersin de WBC tambin son fundamentales para la generacin de indicadores o alarmas, detectando que el recuento de glbulos blancos (y el diferencial WBC) es posiblemente errnea y dar alguna informacin sobre el posible origen de la anomala. Como se mencion en la primera parte de este informe, el diagrama de dispersin diferencial de WBC tambin es de impor- tancia crucial identificar anomalas del conteo deplaquetas (PLT) ,PLT siendo los grumos el ejemplo ms obvio. El conteo de glbulos rojos (RBC) , hemoglobina (Hb) y (rojo) el volumen cellular medio(MCV) son otros parmetros medidos por HA, que tambin estn sujetas a los valores falsos en varias situaciones Los indices de clulas rojas (Wintrobe) aparte de MCV y del hematocrito (hematocrito; Hct) se calculan por lo general a partir de estos parmetros medidos, y en la mayora de circunstancias con estos parametros erroneos medidos directamente RBC generarna su vezindices erroneos RBC calculados. Estos ndices pueden ser utilizados como un indicador para los recuentos anormales. Los reticulocitos se pueden considerar ahora como una parte de la CBC, y muchos HA han integrado los recuentos de reticulocitos en virtud de un mtodo totalmente automatizado. CLULAS SANGUNEAS BLANCAS Para el anlisis de clulas sanguneas, cada partcula de tamao grande (mayor que el tamao de un PLT) que no se destruye por agentes hemolticos ser identificado como un de WBC en la mayora de HA. Despus de enumeracin, y de acuerdo con el tipo, la impedancia con baja y alta frecuencia electromagntica o corriente directa, de dispersin de luz lser (en uno o en varios ngulos), o intensidad de la tincin de peroxidasa que son usada, ya sea individualmente o en conjunto, para generar un cinco -, seis o incluso siete partes del diferencial(para una revisin, ver Bain & Bates, 2001). No est en el alcance de este informe para estudiar cmo se clasifican los distintos de WBC pero se debe tener en cuenta que los diagramas de dispersin generado por el HA para mostrar el diferencial de WBC debe estar completamente entendido por los operadores (Bain y Bates, 2001). En muchos casos, los diagramas de dispersin de WBC permiten la deteccin de anomalas relacionadas con recuentos falsos y / o ayuda para explicarlos. Como regla general, los instrumentos que no generan diagramas de dispersin de WBC diferenciales sern ms propensos a pasar por alto varios puntos ficticios. Recuento falsamente bajosWBC Agregados de polimorfonucleares neutrfilos Neutrfilos polimorfonucleares (PMN) agregados pueden ser observados en muestras de sangre extradas en EDTA. La incidencia es baja, pero ciertamente subestimado, correspondiente a 2/65 000 recuentos completos de sangre en EE.UU. (Epstein y Kruskal, 1988), 1/9500 en Italia (Bizzaro, 1993), 1/7500 en Francia (Lessive et al., 2000 ). Muestras anomalas tanto en hombre como mujeres.Aunque ninguna patologa o ninguna enfermedad especfica se asocia con la agrupacin de los PMN, enfermedades hepaticas en un contexto inflamatoria aguda o crnica o circunstancias asociadas con la generacin de aglutininas fras han sido reportados en muchos casos.El fenmeno puede o noseruna disminucin transitoria .Puede sermoderada o clnicamente significativa, lo que conduce a veces a sospechar agranulocitosis y para no generar investigaciones innecesarias (aspiracin de mdula sea o biopsia) o terapia. No hay relacin entre el fenmeno descrito aqu, que es unaanomala pura in vitro relacionada con el muestreo con anticoagulanteEDTA , y la anomala in vivo que ocurre en enfermedades tales como el sndrome de dificultad respiratoria del adulto o leucostasis, en el que PMN tienden a agregarse, como consecuencia de las M. ZANDECKI ET AL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS23 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 interacciones de membrana con complemento. El mecanismo que lleva a la aglutinacin no se aclara totalmente. Siempre es un fenmeno in vitro, principalmente dependiente de EDTA, aunque la aglutinacin despus del uso de citrato de sodio o heparina como anticoagulantes Tambin se ha informado en algunos casos. Usando experimentos de transferencia, ya sea plasma de los pacientes afectados en contacto conWBC de pacientes normales o plasma normal en contacto con PMN de los pacientes afectados, la anomala ha demostrado estar relacionada con un componente de plasma, y la incubacin de plasma con un anti-IgM anticuerpo o con ditiotreitol suprimidodisminuyeron cuantitativamente la agregacin de PMN.El uso de citometra de flujo, ha encontrado IgM en la superficie PMN en un paciente. Algunos autores han informado de que el tamao de los agregados fue mayor a baja temperatura y que desapareci a 37 C. Varios otros autores informaron que la aglutinacin de glbulos blancos en sangre anticoagulada con EDTA no se corrigi por el calentamiento de la muestra de sangre , al menos en algunos casos, lo que minimiza la implicacin de un aglutinina fra en la gnesis de los clusters. Se propuso un alto nivel de expresin de la integrina (CD18 CD11b-) en la membrana PMN estar relacionado con la generacin de grumos PMN. Diagramas de dispersin diferencial de globules blancos(utilizando el tamao y la complejidad o el tamao y peroxidasa contenidos) puede demostrar anomalas, pero hay que tener en cuenta que los agregados ms grandes se pasan por alto, y slo el ms pequeo activarn indicadoresEl tipo de impedancia de HA, la anomala se sospecha cuando los acontecimientos estn presentes por encima de la zona de los PMN (parte superior del grfico de WBC), o cuando es difcil separar las clases de WBC (Galifi et al., 1993), y los indicadores ms frecuentes generado utilizando tales HA son 'granulocitos inmaduros "o" clulas de la banda "(Lippi et al., 1994). El Bayer-Technicon HA, los cmulos ms pequeos pueden aparecer como una banda de puntos en la parte superior derecha del diagrama de dispersin diferencial de WBC: como estos agregados contienen muchos PMN que se presentan como partculas ricas en peroxidasa, y se genera una alarma correspondiente a elevado contenido peroxidasa . .En Algunas HA, el anlisis de los ncleos de WBC se realiza en un canal dedicado despus de la utilizacin de una solucin drstica para asegurar la lisis de las membranas de WBC: nmero de ncleos libres se utiliza como un control para el recuento de WBC. Discrepancia entre el recuento obtenido de WBC de ese canal y que se observa desde el canal de fluorescencia o peroxidasa . Agregados de clulas blancas de la sangre se destruyen despus de la lisis de las membranas drstica de WBC (Galifi et al., 1993). Pelculas de sangre pueden mostrar pequeos (hasta cinco clulas), moderada (hasta 50 clulas) o grandes (> 100 clulas) racimos de PMN (Figura 1). Examen morfolgico cuidadosa de estos agregados muestra que unos pocos linfocitos o monocitos pueden ser a veces atrapadas dentro de los agregados (Hillyer, Knopf y Berkman, 1990). Granulocitos inmaduros (mielocitos, metamielocitos) y clulas de la banda no se reportan con frecuencia como parte de las clulas agrupadas, y se propuso que los agregados pueden desarrollarse alrededor de mielocitos, mientras PMN solo fall a agruparse (Deol, Hernndez y Pierre, 1995). Agregados de PMN estn desprovistos de PLT, en contraste con los agregados de PLT-PMN (discutidos en la parte I). Eventualmente, como la agregacin de PMN en presencia de EDTA conduce a una reduccin en su nmero, HA puede generar indicadores correspondientes a los diferenciales falsamente anormales de WBC, por ejemplo, falsa agranulocitosiso linfocitosis . Se propusieron anticoagulantes caseros para superar la aglutinacin (Schinella, Kodikara y Curci, 1995). Como se mencion anteriormente, el calentamiento de la muestra a 37 C puede reducir tanto el tamao y el nmero de grupos en algunos casos, pero completa desaparicin est lejos de ser un hallazgo consistente, y que el mtodo no se puede proponer para superar la anomala. Pinchazo en el dedo y la dilucin inmediata de la muestra de sangre impide la aglutinacin.24 M. ZANDECKI ETAL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 La agregacin de WBC distinta de polimorfos en presencia de EDTA Las agrupaciones de linfocitos normales (no malignas) fueron reportados en un paciente con infeccin del tracto urinario, en un paciente con un linfoma de clulas B sin la participacin torrente sanguneo, en un paciente con ulceras por presin, y en otro con leucemia mielomonoctica crnica . Tambin se informagregacin de linfocitos que ocurre en pacientes con leucemia linfoctica crnica, de manera espontnea cuando el recuento de linfocitos son extremadamente altos (> 400 109 / l; O'Flaherty, Kreutzer & Ward, 1978), o no (Bizzaro y Piazza, 1991). Se observaron agregados de tres a 50 clulas de linfoma en dos casos de linfoma esplnico con linfocitos velloso (slvl; Juneja et al., 1992; Imbing et al., 1995) y en un caso de linfoma no Hodgkin simulando slvl (Shelton & Frank , 2000). En estas situaciones, los agregados ms grandes se pasan por alto por la HA y recuento de glbulos blancos es falsamente, pero de forma variable baja. Los agregados ms pequeos pueden perturbar diferencial WBC y pueden o nogenerar un indicador, dependiendo del tipo de HA utilizado (Shelton & Frank, 2000).En todos los casos reportados hasta el momento EDTA fue implicado, aunque tambin se observaron pequeos grupos de clulas en muestras extradas heparinizados como controles (Deol, Hernndez y Pierre, 1996) y citrato de sodio no cambi sensiblemente la tendencia de agrupamiento de los linfocitos en algn caso (Shelton & Frank, 2000). Pinchazo en el dedoy la dilucin inmediata de sangre parece la mejor manera de evitar los agregados (Lessive et al., 2001). El calentamiento a (37 C) se informo para reducir la formacin de grumos o bien en parte (Shelton & Frank, 2000) pero no tuvo ningn efecto significativo sobre el tamao de grumos (Lessive et al., 2001). A medida que el nmero de casos reportados es bajo, slo hiptesis sobre el mecanismo (s) que lleva a la aglutinacin de linfocitos han sido propuestos, que implican a varias molculas como la adrenalina (epinefrina), cido araquidnico, o leucotrieno B4 (Villa et al, 1984;. Shelton & Frank, 2000En un caso se inform agregados que implican a todas las clases de leucocitos, en un paciente con antecedentes de larga data de abuso de alcohol y la cirrosis alcohlica (Savage, 1989). Naturaleza y cantidad del anticoagulante Una disminucin en el recuento de leucocitos no relacionado con la aglutinacin se inform en situaciones correspondientes a las muestras que contienen exceso de K3-EDTA (pero no K2-EDTA) anticoagulante, como resultado deuna muestra insuficiente de sangre despus de la puncin venosa (Goossens, Van Duppen y Verwilghen, 1991). Recuentos falsamente altos de leucocitos Agregados de plaquetas y grandes plaquetas Pseudo leucocitosis puede ser secundaria a grupos PLT lo suficientemente grandes como para simular tamao de leucocitos.Todo HA moderna que analizar las subpoblaciones de leucocitos detectar esta anomala: grumos PLT se localizan como un rea en forma de cohete de puntos en la esquina inferior izquierda del diagrama de dispersin diferencial WBC, y un indicador correspondiente a la incapacidad para discriminar entre las categoras WBC, a saber, los linfocitos, se genera (vase la Figura 2, parte I).Varios autores han informado de que HA sin WBC diagramas de dispersin diferenciales son incapaces de detectar esta anomala . Algunos PLT muy grande puede encontrarse en trastornos mieloproliferativo y mielodisplsicos, cuyo tamao y volumen puede llegar a las de WBC y que pueden ser enumerados como WBC: indicadores se generan habitualmente, que mencionan la presencia de partculas patolgicas que no puede ser clasificado como WBC (normalmente 'PLT gigante', o 'agregados' PLT, dependiendo de la HA). Glbulos rojos nucleados (NRBC) Ellos se pueden encontrar en la corriente sangunea en condiciones fisiolgicas (recin nacidos) y en circunstancias patolgicas, y en ocasiones pueden ser mucho ms numerosos que WBC. Uso de HA, estos NRBC estn en contacto con agentes de lisis que destruyen su membrana, dejando libre de ncleos, siendo este ltimo responsable de las anomalas. Ncleos NRBC libres son generalmente partculas 36 g/dl)correspondingtoanerrone- ouslyhighHbhasbeenreportedforpatientswith severeconstitutionalor acquiredhypertryglyceridemia (Gagneetal.,1977;Mayan etal.,1996),andforpatientsreceivingintravenous administrationoffat emulsions (Nosanchuck, Roark & Wanser,1974;Shah,Patel&Rao,1975;Nicholls,1975,1977;Creer&Ladenson,1983;Artiss&Zak, 1987;Sandberg,Sonstabo&Christensen,1989;Cantero,Conejo& Jimenez,1996).Afterthestudyofvarioustypesof hyperlipoproteinemias, it was observed that erroneous HbandMCHC>36 g/dlwereobservedinpatients withatleast20g/loftriglycerids,correspondingto type I and part of type V hyperlipoproteinemias (rich inchylomicrons)butnottotypeIVhyperlipoprote- inemias (rich in very low density lipoproteins;Gagne et al., 1977). Samples taken after a meal may at times demonstratesuperimposablespuriousHbmeasure- ment.EventhemostrecentHAaresensitiveto hyperlipemia,althoughtoavariableextent,asfor example Abbott Cell Dyn 4000 that is defined asgiv- ing true Hb values for up to 13 and 9 g/l of triglycerid andcholesterollevels,respectively(M.C.Chrieten, personalcommunication).Althoughexcessoflipids usually spuriously increases Hb, a spurious fall ofHb was also reported once (Savage, 1989). Similar tothe presence of cold agglutinins, anomaly related to lipids is suspected when MCHC is >36 g/dl, or when WBC scattergrams demonstrate high number of particlesof low to moderate size (Figure 6). For laser-beamHA that measure Hb level within each RBC and generate the so-called measured MCHC or CHCM, a differ- ence between the CHCM and the calculated MCHC is observed.Variousmethodshavebeenproposedto obviatetheabnormalityontherelevantsample, including isovolumetrical replacement of hyperlipemic plasma with isoosmotic diluent, or ether extractionof lipids. As previously mentioned, such methods may in turn lead to erroneous PLT and WBC counts. High WBC counts Whitebloodcellmayinduceexcessiveturbidityand disturbHbmeasurementiftheirnumberissufficiently high.Thereisnoclear-cutthresholdforWBCcounts associatedwithspuriouslyelevatedHb,butonemust becarefulwithallsampleswithWBCcountover50 or 100 109/l (Cornbleet, 1983;Sandberg,Sonstabo &Christensen,1989),althoughsomeHAdefine thresholdat250109/lorevenseemtobefully insensitive to WBC count because of entire WBClysis performedbeforeHbmeasurement(Sysmex).Asfor lipiddisturbance,CHCMdeterminedonsomeHA may help to find the true Hb value (McVeigh, Faim& vander Weyden,1989). However, RBCcount maybe alsodisturbedbyhighWBCcounts(seelater),and onemustpayattentiontothelimitsin recalculating M. ZANDECKI ET AL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS29 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 RBCindices,andapackedcellvolume(centrifuged Hct) should beconsidered. Immunoglobulins They have beenreportedtointerferewitha number ofclinicallaboratorytests(cf.,seeRoberts,Fontenot &Lehman,2000).FalseelevationofHbmeasurement byautomatedmethodswasobservedforseveral patientswithWaldenstromsmacroglobulinemia and monoclonalIgM,orwithmultiplemyelomaand monoclonal IgA or IgG (Wallis & Ford, 1987;McMul- lin,Wilkin&Elder,1995;Robertsetal.,2000).This anomalyisrelatedtohighlevelsofIgthatinteract withreagentsofthelysissolution.ForIgM,thisphe- nomenonhasbeenrelatedtotheamountofmono- mericcomponentwithinthecirculatingparaprotein (Goodricketal.,1993).HA employingHbconversion tocyanmethaemoglobinseemtobemoreaffected thanothers,becauseofadditionofsurfactantsfor cyanide-freemethods.RedbloodcellcountandMCV areunaffectedinthissituationbut,asHbisoveresti- mated,MCHCusuallyexceeds36g/dl.Inorderto obtainmoreaccurateresultsinthisinstance,itwas proposed to determine plasma Hb after centrifugation ofthesample(whichgivesturbiditybecauseofthe paraprotein)andtowithdrawitfromHbofthewhole blood (Roberts et al., 2000). For Sysmexinstruments, itseemsthatifthesampleishalfdilutedbytheoper- atorbeforeanalysisontheHA,thephenomenondoes notoccur(Robertsetal.,2000).Forlaser-beamHA thatdeterminethemeasuredMCHC(CHCM)aclear- cutdifferencewiththecalculated MCHCgeneratesan alarm,andaccurateHbfromthesamplemaybe obtained from measuredMCHC. Cryoglobulins SpuriousHbvalueshavebeenreportedinsome instances,andseveralmechanismsareproposedto explaintheseabnormalfindings.Insomecasesspuri- ouslyhighHbvalueswererelatedtoamechanism similartothatdescribedaboveforimmunoglobulins (Taftetal.,1973;Cornbleet,1983)ortothedistur- banceoflighttransmittance,whereasinothercasesa slightdecreaseofbothHbmeasurementandRBC count was related to a flow anomaly (Taftet al.,1973; Bremmelgaard &Nygard, 1991; Fohlen-Walteret al., 2002). However, spurious Hb measurement is far from being a consistent finding in the presence of cryoglob- ulins (Fohlen-Walter et al., 2002). Haemolysis Hb free within plasma is measured together withthat from the RBC, butitsamountrangesfrom10to 40 mg/l in normal conditions and does not affect total Hbmeasurement.However,insituationsrelatedto major intravascular haemolysis,includingchemicals, mechanicalhaemolysisassociatedwithheartvalves, and haemolytic anaemias associated with blood trans- fusion,freeplasmaHbmaybeelevatedenoughto affect total Hb measurement. MCHC may be >36 g/dl. CentrifugedHctshowsapinkorredplasmatinge, namely if free plasma Hb is >200 mg/l, and is, in some instances,theonlyreliableRBCparameter.Some laser-beamHAdirectlydetermineHbwithineach RBC, the Cellular Haemoglobin Concentration Mean (CHCM),whichallowstheaccurateHbvaluetobe calculated. A short time lapse betweenvenepuncture and analysis is of crucial importance becausehaemo- lysismaycontinueinvitro,leadingtoaspurious decrease of RBC count and total Hb with aspurious increase of free plasma Hb. Chemical structure of haemoglobin and bilirubin Inphysiologicalsituations, Hbis more or lesscoupled tooxygenortocarbon-di-oxideand,accordingto whichmoleculeiscoupledtoHb,thepeakofoptimal lightabsorbancediffersslightly.Theadditionof several reagents leave Hb free from coupledmolecules andchangesitintoonestablemolecule(cyanmethae- moglobinisanexample),thelatterdemonstratinga narrowpeakoflightabsorbance,whichallowsaccu- ratedeterminationofHbconcentration.However, highamountsofcarbonmonoxidecoupledtoHb maynotbefullytransformed,andinsuchsituations aspuriouslyhighHbconcentrationisreported (Cornbleet,1983;Vinatier&Flandrin,1993).Incon- trast,sulfhaemoglobininhighamounthasbeen reportedasloweringHbmeasurement(Cornbleet, 1983).Bilirubin:althoughonemustpayattentionto veryhighamountsofbilirubinwithintheplasma, mostHAdonotpresentlydemonstrateanyinterfer- encewithbilirubin,atleastforconcentrationsup to 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 30 M. ZANDECKI ETAL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS 250 mg/l. Above theses values, however, attentionis needed. Spurious RBC counts andredcell parameters Accordingtothetechnologyused,spuriousresults mayormaynotbeobservedusingsomeHA,and someknowledgeaboutthemethodsanalysingblood parametersisnecessary.OnimpedancetypeHAan aliquotofthebloodsampleisdilutedisoosmotically andthenumberandheightofelectricpulsesgener- atedbytheelectricalresistanceofRBCthatpass throughasmallorificeallowthedeterminationof boththeRBCcountandtheMCV.Usinglaser-beam methods,scatteringatleastattwoanglesallowsthe determinationofRBCcountandMCV.Inorderto improve accuracy, pretreatment of RBC with aspecific reagentthatchangesthemisovolumetricallyfromdis- coid to a sphere is performed on some HA. Settingdis- criminationthresholdsisanimportantconsideration: discriminating the smallest RBC from the largestPLT isattimesachallenge,alreadydiscussed(partI).On thecontrary,eveninextremepathologicalsituations, MCVdoesnotexceed150160fland,asthereisno particleabovethatsizeinthebloodstreaminhealth orindisease,HAdonotanalyseanyparticleabove 200300 fl in volume. SpuriouslyelevatedRBCcounts High WBC counts MostHA enumerate RBC and WBC togetherwithin thesamechannel(s),andtheRBCcountreportedis the sum of both RBC and WBC counts. In physiologi- cal conditions, it is not of any importance, as it corres- pondstooverestimateRBCcountby0.1%(ifwe consider a WBC count of 5 109/l and a RBCcount of51012/l).However,highWBCcounts (>100 109/l) may lead to a significant change inthe RBC count, particularly if the patient is also anaemic (Bain&Bates,2001).Moreover,inthelatter instances the MCV reported corresponds to the mean volumeofRBCandofWBCfromthesampleand may be spurious, variably according to the nature and thenumberofWBCfromtherelevantsample.So, high WBC counts may induce several abnormalfind- ings,includingHb(discussedabove),RBCcount, MCV,andsubsequentlyleadtoabnormalcalculated MCHC (discussed later). Giant platelets High number of giant PLT may lead to spuriouslylow PLTcount(seepart1)but,astheyareenumeratedas RBC, they may also affect RBC count in a waysimilar tothatforWBC;however,RBCcountisusuallyonly slightlyaffectedinthisinstance(Cornbleet,1983; Bain & Bates, 2001). SpuriouslydecreasedRBCcounts Coldagglutinins ColdagglutininsaggregateRBCwhenthetemperature islowerthan37C.Unsurprisingly,peculiaranomal- ies of RBC parameters in the presence of coldaggluti- ninswerereportedfirstoncountersactingatroom temperature(Hattersleyetal.,1971;Petrucci,Duanne &Chapman,1971; Bessman&Banks,1980).Accord- ingtotheHA,theupperthresholdthatmayconsider particlesasRBCintotheRBCchannel(s)islocated between200 and300fl. So,only particlescorrespond- ingeithertoisolatedRBCortosmallRBCclumps (twoorthreeRBC),areanalysed,whereaslargeRBC clumpsarefullyneglectedbytheHA.Thisleadsto spuriouslylowRBCcountsandtoabnormallyhigh MCV (each small RBC clump is considered as one sin- gleparticle).Haematocrit(RBC MCV)iserroneous andspuriouslylow,contrastingwithHbthatismeas- uredafterRBClysisandisunaffectedbyagglutinins. As a rule, the MCHC is spurious, usually >36 g/dl.The peculiar association of low RBC count, high MCVand MCHC>36g/dlisalmostpathognomonicofthecold inducedartifactoninstrumentsthatworkatlaborat- orytemperature,andnotinfrequentlyhelpstodiag- nosethecoldagglutinininthepatientanalysed (Petrucci,Duanne&Chapman,1971).HAworking withreagentsattemperaturesnear37Carenotfully insensitivetocoldagglutinins,however,butchanges are less obvious and may remain undiscovered in some instances(Solanki&Blackburn,1985).HAthatmea- sure directly the amount of Hb within each RBC (mea- suredMCHC,orCHCM)usuallyshowdiscrepancy betweenthemeasuredMCHCandthecalculatedone. Whatever the HA used, the common finding is that Hb 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 M. ZANDECKI ET AL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS31 value is unaffected and that anomalies disappear when the sample is warmed at 37 C and analysed promptly afterwards.Amplificationoftheanomaliesafterthe sample has been cooled at 4 C for 1 or 2 h reinforces the diagnosis. As viscosity of the sample may be high, leadingtoinaccurateaspiration,analarmmaybe generatedonsomeHA(insufficientsampling,or related).Co-existenceofRBCagglutinationwith EDTA-dependant thrombocytopenia was reportedbut antibodiesdirectedagainstRBCandthosedirected against PLT differed (Bizzaro & Fiorin, 1999). Warmautoimmunehaemolytic anaemia Insomeinstanceswarmautoantibodieswerealso reportedasinducingRBCagglutination,leadingto spurious MCV and RBC count, in a situation superim- posable to that observed for cold agglutinins, butnot reversible by warming (Weiss & Bessman, 1984). Very small RBC and discrimination withPLT Asdiscussedinpart1,PLTcountsmaybedisturbed bymicrocyticcells,namelyifRBCvolumeis250300mg/l)MCH Haemoglobin: spuriousdecrease Coagulation within the sampleAll parameters Overfilling vaccumtubeAllparameters Veinipuncture near a dripMCV (glucose drip) Sulfhaemoglobin MCV Cold agglutinins, warm agglutinins: MCH, RBC, PLT High WBC counts: RBC Hyperglycemia: MCH K2 EDTA in excess: MCH Hyper- or hyponatremia: or MCH or Technology: impedance without hydrodynamic focusing (MCV in hypochromicanaemias) MCH MCH > 36 g/dl (not related to spurious counts in some disorders: spherocytosis, xerocytosis, abnormal Hb: see text) Cold agglutinins, warmagglutininsRBC, MCV LipidsWBC, Hb ImmunoglobulinsHb In vivo and in vitrohaemolysisHbaltered, Hct Carboxyhaemoglobin (>1020%) Bilirubin (>300 mg/l, at timesless) Immunosuppressive drugs (see also spuriously high Hb, spuriously lowMCV) MCH 35 mmol/lmayoverestimateMCVupto 50fl(Holt,DeWandler&Arvan,1982;Planas,Van Voolen&Kelly,1985;VanDuijnhoven&Treskes, 1996;Figure 7).IncreasedMCVleadstoanincrease inthecalculatedHctandtoaspuriouslylowMCHC. CHCMmeasuredonsomeHAisalsoaltered.CBC demonstratingmacrocytichypochromiamaybecon- sidered first as related to hyperglycemicsample. Considerations related to the anticoagulant TheuseofeitherK2-orK3-EDTAsaltdoesnot induce any difference in the CBC, in optimalcondi- tionsofsampling.However,whenconcentrationof anticoagulantisincreased,becauseofinsufficient volumeofblooddrawnaftervenepuncture(or in Figure7.Venepuncture performed near a glucose infusion. Blood sample from that patient was diluted (Hb low) and excess of glucose led to a swelling of RBC: MCV was spuriously high and in turn MCHC spuriously low.Sam- pledrawncorrectlybythenextmorningshowednormalvalues(notransfusionhadbeenperformed).RBChisto- gram on diluted sample (left) and on new sample (right; Beckman Coulter STKSII). 2007 The Authors Journal compilation 2007 Blackwell Publishing Ltd, Int. Jnl. Lab. Hem. 2007, 29,2141 M. ZANDECKI ET AL.SPURIOUS COUNTS ON HAEMATOLOGY ANALYSERS35 neonates), some changesmaybeobserved.Decrease ofcentrifugedHctresultingfromshrinkingofRBC wasreportedinconditionsrelatedmainlytoexcessof K3salt(Goossens,VanDuppen&Verwilghen,1991; Hinchliffe,Bellamy&Lilleyman,1992),incontrast withdataobtainedonHA:noinfluenceofK3-EDTA concentration was observed on MCV, whileK2-EDTA athighconcentrationsresultedinaslightincrease inMCV,andsuchphenomenoncouldbeobserved usingseveraldifferentHA(Goossens,VanDuppen& Verwilghen,1991). Hyper- and hypo-natremia MacrocyticandhypochromicRBCchangeswere observedonbloodsamplesinconditionsrelatedto hypernatremia,whereashyponatremiagenerateda tendency towards microcytic and hyperchromicRBC (Cornbleet, 1983). Such situations were alsoreported in animals (Boisvert, Tvedten & Scott, 1999).Hyper- and hypo-natremia are both situations alsoreported asleadingtospuriouscentrifugedHct(Cornbleet, 1983). Storage of the sample and MCV EDTA used as anticoagulant allows the accurate deter- mination of the CBC up to 24 h after the sample has beendrawn.However,afterthattime,MCVmay increase, namely if the sample is stored at roomtem- perature.Thiscoupledwithlowhaemoglobincould cause the operator to suspect that a slightly microcytic anaemia is normocytic and that a normocytic could be mistaken for a macrocytic anaemia (Cohle, Saleem& Makkaoui, 1981). Mean cell haemoglobin content(MCHC) Measuredparametersallowthecalculationofmean cell haemoglobin of individual RBC [MCHas expressed in pg Hb (g/l)/RBC (1012/l)] andMCHC [MCHCing/dlHb(g/l)100/MCV(fl) RBC (1012/l)]. Some HA measure Hb concentration directly withinRBC,namedcellularHbconcentrationmean (CHCM): discordant values (usually differenceover 1.5 g/dl) between MCHC and CHCM allow inmany instances the detection of anomalies related to one of the measured RBC parameters. MCHC>36g/dlisinfrequentonmostimpedance- typeHA,whereasitmaybeoccasionallyobservedon laser-beamHA,inseveralconstitutivedisordersin whichRBCaredehydrated,includinghereditary spherocytosis,varioushaemoglobindisorders(CC,SC, Cbthal),andsomerareRBCdisorders(xerocytosis). Someacquiredconditionsmimicconstitutiveones, namelyacquiredimmunehaemolyticanaemias causedbywarmagglutinins,inwhichRBCcoated withwarmantibodiesmaytransformgraduallyinto spheres in vivoorinvitro aftervenepuncture, leading tomoreorlessdehydratedandspherisedcells.Many situationscorrespondingtoabnormallyhighHbval- ues,and/orabnormallylowRBC,and/orspuriously lowMCV,alsoleadtoincreaseMCHC(seethecorres- pondingparagraphsandTable1).Althoughthemech- anismisunknown,someimmunosuppressivedrugs mayslightlyincreaseMCHC,usuallynotabove 37.5 g/dl (Cornbleet 1983). MCHC