Olivares ppgctiaufrrj
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Processos microbianos Processos microbianos como insumos biológicos como insumos biológicos
para a agricultura para a agricultura sustentávelsustentável
Fabio L. Fabio L. OlivaresOlivares & & Luciano P. Luciano P. CanellasCanellas
Núcleo Núcleo de Desenvolvimento de Insumos Biológicos para de Desenvolvimento de Insumos Biológicos para a Agricultura (NUDIBA/UENF).a Agricultura (NUDIBA/UENF).
Teoria populacional malthusiana (Thomas Malthus: 1766 -1834)
An Essay on the Principle of Population (1798))
Revolução verde (Ciclo de inovações tecnológicas para a agricultura)
Norman Ernest Borlaug, Nobel Paz 1970
Síntese de Haber-Bosch (amoníaco)
N2 (g) + 3 H2 (g) 2 NH3 (g) + energia
É uma reação catalisada com o ferro, sob as condições de 250 atmosferas de pressão e uma temperatura de 450 °C.
Para a produção da amônia, o nitrogênio é obtido do ar atmosférico, e o hidrogénio como resultado da reação entre a água e o gás natural:CH (g) + H O (g) → CO (g)+ 3 H (g)
Aparelho de laboratório utilizado por Fritz Haber para sintetizar a amônia em 1909.
Fotografia tirada em julho de 2009 no Museu Judaico de Berlim. Nobel, 1918
reação entre a água e o gás natural:CH4 (g) + H2O (g) → CO (g)+ 3 H2 (g)
N –demanda
Custos (Eficiência uso)
Aplicação:
Cada 100 unid:
< 50 unid –plantaDestinosImpac. Ecológicos
Desafios para Agricultura Mundial
• Demandas para alta produção de alimentos sob uma perspectivaambiental e economicamente sustentável;
• INCT-FBN (Segurança alimentar para os próximos 50 anos) requeravanços tecnológicos comparáveis a revolução verde;
• Mudanças climáticas globais x Impactos da agricultura
• Inovação científica e tecnológica para produção baseada em novosmodelos;
• Incremento da participação de insumos biológicos.
•• ““A construção de modelos de produção sustentávelé colocada como marco central para agricultura doséculo XXI, nesta direção microrganismos, seusprocessos e produtos são os elementos essenciaispara mudança dos paradigmas de produçãoagrícola e os ingredientes mais preciosos do “boomtecnológico” que esta por vir”.agrícola e os ingredientes mais preciosos do “boomtecnológico” que esta por vir”.
Processos Microbianos
Biofertilizante Bioestimulante BiocontroleBioproteção
BiofármacosBiofertilizante Bioestimulante BiocontroleBioproteção (abióticos)
Biofármacos
Estratégias para melhor aproveitamento de microrganismo Estratégias para melhor aproveitamento de microrganismo a favor da produção vegetala favor da produção vegetal
Promoção do Crescimento
Vegetal
Ativação de comunidades
microbianas nativas pelo manejo solo-planta-ambiente
Inoculação de microrganismos
selecionados
Biotecnologia de Biotecnologia de InoculantesInoculantes
PLANTA
Propostas baseadas na combinação de:Propostas baseadas na combinação de:((a)a) Bactérias promotoras do crescimento vegetal; Bactérias promotoras do crescimento vegetal; ((b)b) Matéria orgânica e suas subMatéria orgânica e suas sub--frações ;frações ;
PROCESSOSMICROBIANOS
MATÉRIAORGÂNICA
•• InoculantesInoculantes•• Substratos para plantasSubstratos para plantas•• BiofertilizantesBiofertilizantes•• BioestimulantesBioestimulantes•• Fertilizantes organominerais Fertilizantes organominerais
10,00 C-labile added
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
15 20 25 30 35 40 45Lo
g10
nº
cells
/g
so
ilSOM (g/m3)
BiofertilizanteBiofertilizante: Uso combinado de ácidos : Uso combinado de ácidos húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.
Humic Acid Diazotrophic bacteria
BiofertilizanteBiofertilizante: Uso combinado de ácidos : Uso combinado de ácidos húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.húmicos e bactérias diazotróficas endofíticas.
Estudos BásicosEstudos Básicos
• Traditional view: Macropolymer (10-
500 KDa). “Monomers” (linear and
ramified chain assembled by covalent
bounds)
Humic acid: background
• Piccolo (2002) pointed that HS are more appropriated described as
Supramolecular self-association of small heterogeneous molecules stabilized by
weak bounds that can be disrupted adding small amount of organic acid.
CH3COOH
• Humic aggregate can be disrupted and its components released
in nanometric scale, which constitute the bases for ratio structure
and biological activity.
Root exudates Root exudates disassemble the disassemble the
Ácidos OrgânicosÁcidos Orgânicosdisassemble the disassemble the
apparent complicated apparent complicated structure of HA structure of HA
Estimulação da HEstimulação da H++--ATPase ATPase da membrama plasmática da membrama plasmática (Marcador bioquímico da bioestimulação) (Marcador bioquímico da bioestimulação)
b
ab ab
a
0
2
4
6
8
10
12
Control AHfp Bacteria AHfp+bacteria
treatments
µm
ol
of
Pi
(mg
of
ptn
)-1(m
in)-1
•• ChangesChanges atat rootrootarchitecturearchitecture
•• UptakeUptake ofof nutrientsnutrients
•• WaterWater contentscontents
*Média ± erro padrão da média; médias seguidas de letras diferentes na coluna são estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey (p<0,05).
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
44 ±4,6 (B)28 ±15,1 (B)0,0297 ±0,0024(A)957(A)0,096(AB)269 ± 14 (A)264 ±11 (A)Bac.+AHtf
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
118 ±6,1(A)58 ±2,73 (A) 0,0245 ±0,0027(B)823(AB)0,101(A)179 ± 09(B)220 ± 23 (B)Bactéria
15 ±8,5 (B)16 ±2,17 (B)0,0182 ±0,0016(C)607(B)0,060(B)100 ± 10 (C)100 ± 09 (C)*Controle
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes emergidas
Sítios de mitose
Massa seca da raizComprinentoespecífico
Área específica
Comprimento radicular
Área radicularTratamento
*Média ± erro padrão da média; médias seguidas de letras diferentes na coluna são estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey (p<0,05).
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
44 ±4,6 (B)28 ±15,1 (B)0,0297 ±0,0024(A)957(A)0,096(AB)269 ± 14 (A)264 ±11 (A)Bac.+AHtf
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
118 ±6,1(A)58 ±2,73 (A) 0,0245 ±0,0027(B)823(AB)0,101(A)179 ± 09(B)220 ± 23 (B)Bactéria
15 ±8,5 (B)16 ±2,17 (B)0,0182 ±0,0016(C)607(B)0,060(B)100 ± 10 (C)100 ± 09 (C)*Controle
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes emergidas
Sítios de mitose
Massa seca da raizComprinentoespecífico
Área específica
Comprimento radicular
Área radicularTratamento
*Média ± erro padrão da média; médias seguidas de letras diferentes na coluna são estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey (p<0,05).
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
44 ±4,6 (B)28 ±15,1 (B)0,0297 ±0,0024(A)957(A)0,096(AB)269 ± 14 (A)264 ±11 (A)Bac.+AHtf
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
118 ±6,1(A)58 ±2,73 (A) 0,0245 ±0,0027(B)823(AB)0,101(A)179 ± 09(B)220 ± 23 (B)Bactéria
15 ±8,5 (B)16 ±2,17 (B)0,0182 ±0,0016(C)607(B)0,060(B)100 ± 10 (C)100 ± 09 (C)*Controle
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes emergidas
Sítios de mitose
Massa seca da raizComprinentoespecífico
Área específica
Comprimento radicular
Área radicularTratamento
*Média ± erro padrão da média; médias seguidas de letras diferentes na coluna são estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey (p<0,05).
10101010101010n
16,46**8,73*8,53*6,50*4,50*15,62**39,71**F
34,234,227,230,834,730,218,3CV (%)
44 ±4,6 (B)28 ±15,1 (B)0,0297 ±0,0024(A)957(A)0,096(AB)269 ± 14 (A)264 ±11 (A)Bac.+AHtf
107 ±4,3 (A)40 ±18,8 (AB)0,0336 ±0,0021(A)568(B)0,084(AB)189 ± 12(B)261 ± 12 (A)ÁHtf
118 ±6,1(A)58 ±2,73 (A) 0,0245 ±0,0027(B)823(AB)0,101(A)179 ± 09(B)220 ± 23 (B)Bactéria
15 ±8,5 (B)16 ±2,17 (B)0,0182 ±0,0016(C)607(B)0,060(B)100 ± 10 (C)100 ± 09 (C)*Controle
-----no-----------no-----gm.g-1m2.g-1--------------%--------------
Raízes emergidas
Sítios de mitose
Massa seca da raizComprinentoespecífico
Área específica
Comprimento radicular
Área radicularTratamento
Crescimento ÁcidoCrescimento Ácido
Auxinas
Poliaminas
Outros Transportadores
Alterações anatômicas sobre o sistema radicular Alterações anatômicas sobre o sistema radicular
Ácidos Húmicos Sim Não
Fonte de C �
Fonte de N �
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 7 14 21 28
Dias após a inoculação
Lo
g c
élu
las.g
so
lo-1
0 4 40 400
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 7 14 21 28
Dias após a inoculação
Lo
g c
élu
las.g
so
lo-1
0 4 40 400
Após 4 semanas
H. seropedicaeH. seropedicae AHAH
Inibição da FBN* �
* Contents higher than 400 mg AH. l-1
SobrevivênciaSobrevivência no solo no solo
A aplicação de ácidos húmicos aumenta a população microbiana associada a planta
Zea mays (n = 16)
• 84%
•População nativa
Outras culturas
•Tomate, maracuja, mamão, cana-de-
• Incremento Populacional;
• Estabelecimento >
• Atividade > ?
AHv vermicompost; AHf filter AHv vermicompost; AHf filter cake, HAi: inceptsol; HAo: oxisol; Hal: cake, HAi: inceptsol; HAo: oxisol; Hal: litosol.litosol.
•Tomate, maracuja, mamão, cana-de-açúcar
• Abacaxi (exceção)
Evidencias microscópicas
•SEM
•Epifluorescence linked with Gfp
• Persistência > ?
• Resposta amplificada
• Depende da fonte
BACTERIABACTERIA BACTERIA + HABACTERIA + HA
C applied insolution (mg)
% C removed solution (root)
4 10040 100120 88200 71400 69
Ácidos Húmicos como indutores de biofilmes
Células Isoladas
Agregados microbianos Biofilmes microbianos
72 h6 h
6 h
Estabelecimento endofítico aumentadoEstabelecimento endofítico aumentado
Infecção atravês de Infecção atravês de raízesraízes
WAYS OF INFECTION WAYS OF INFECTION
How Humic acid modulate How Humic acid modulate pplantlant--bacteria interaction ?bacteria interaction ?
CH
EMO
TAX
YS
CH
EMO
TAX
YS ATTACHMENTATTACHMENT
(SINGLE CELL WITH (SINGLE CELL WITH APOLAR ATTACHMENT)APOLAR ATTACHMENT)
Canellas et al., 2008
Canellas & Olivares, 2014
Increase efflux of C-sources in
rhizosphereIncrease points of
lateral root numbers
WAYS OF INFECTION WAYS OF INFECTION
ENDOPHYTIC COLONISATIONENDOPHYTIC COLONISATION
((AGREGATES TO AGREGATES TO BIOFILM)BIOFILM)
Canellas et al., 2008
Enhanced Establishmen
t of Endophyticpopulation
Increase attachment byHA sorption in cell wall and
bacteria
Chemotaxis & Rhizosphere
establishment
Root attachment: single cell to biofilm structure
Root Infection
(endophytic access)
Tissue Colonisation (apoplastic
compartment)
Successful (?) Endophytic
Interaction
Predominant Events
• Favorece agregação na superfície das raízes.• Quando pulverizado na parte aérea exerce
Daniele Frade -IC
na parte aérea exerce efeito protetor.
•UV•Dessecação
BiofertilizanteBiofertilizante: Uso combinado de ácidos : Uso combinado de ácidos húmicos e bactérias diazotróficas húmicos e bactérias diazotróficas
endofíticasendofíticas..Aplicações
Uso combinado de AH e bactérias diazotróficasem mudas micropropagadas de cana-de-
açúcar.
Casa de vegetaçãoCasa de vegetação
In In vitrovitroCampoCampo
Fase de Aclimatação das mudas Fase de Aclimatação das mudas micropropagadasmicropropagadas em viveiro em viveiro
Controle Bactéria AH Uso combinado BacAH
Controle
Bactéria+AH
Experimentos de campo: plantas micropropagadas Experimentos de campo: plantas micropropagadas inoculadasinoculadas
Contro
l
BACAH32
% 10
% n.s.
control
AH0
20
40
60
80
100
BRIX FIBRA POL PCC PUR
Características agroindustriais (g/Kg)
Produção de colomos (Mg/ha)
A BC
Transplante das mudas micropropagadas para o campo experimental
A
D
B C
E
D E
D E
Figura 12. Visão parcial do ensaio de campo: pesagem do vermicomposto (A), distribuição do vermicomposto nas linhas deplantio (B), mudas micropropagadas (C), plantio no campo (D), plantas micropropagadas após 10 meses do plantio (E).
CONTROLE INOCULADO
Produção de Sacarose (kg/m2)
CB
AB A
0
50
100
150
200
Produção de Sacarose (kg/m2)
Série1 145 167 186 194
Controle Bacteria AH BACAH
150
200
250
300
36,89A
31,64AB
29,21B 28,73
B
TCH TPH
0
50
100
150
BACAHBAC
ControlAH
221,15A 183,31
AB179,46
B 168,54B
Tukey 5%Mg/ha23 -30%
Produção de grãos milho (Mg /ha)
B
AAB
AB
b
a
b
a
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Controle Bac AH Bac + AH
Tukey 5%
Kg
ha
-1
Com N Sem N
Efeito da época de aplicação foliar dos tratamentos: i) ácidos húmicos extraídosde vermicomposto (20 mg C L-1); ii) bactérias diazotróficas; iii) ácidos húmicos +de vermicomposto (20 mg C L ); ii) bactérias diazotróficas; iii) ácidos húmicos +bactérias e iv) controle, sobre a produtividade do milho DKB 789.
ÉPOCAº Produtividade agrícola média
Mg ha-1
8 folhas 3474 A
4 + 8 folhas 3447 A
4 folhas 2941 B
CV (%) 19,87
F 10,28*
N 16
DMS 328
médias seguidas por letras diferentes nas colunas são estatisticamente diferentes pelo teste Tukey (P<0,01);
ºaplicação foliar realizada com equipamento costal pressurizado.1composição do inoculo bacteriano: Herbaspirilum seropedicae estirpe HIII 206
Vermicomposto como veículo Vermicomposto como veículo microbianomicrobiano
Vermicomposto/ácidos húmicos Vermicomposto/ácidos húmicos (bioestimulação)(bioestimulação)
• Caracterização molecular dos compostos orgânicos presentes nos VC foirealizada com a técnica da pirólise off-line acoplada à espectrometria demassas;• Foram identificados mais de 300 compostos principalmente os derivados deligninas, de carboidratos, de proteínas, ácidos e alcoóis graxos, compostosterpênicos e hidrocarbonetos;
Dariellys Balmori, DSc
terpênicos e hidrocarbonetos;• O conhecimento da composição molecular da matéria orgânica estabilizadapela vermicompostagem é fundamental para o aprimoramento dessesprocessos biotecnológicos.
Vermicomposto/ácidos Vermicomposto/ácidos húmicos (bioestimulação)húmicos (bioestimulação)
Dariellys Balmori, DSc
• Compostos nitrogenados• Compostos derivados de ligninas• Ésteres metílicos de ácidos graxo• Alcoóis e epóxidos• Compostos terpênicos• Hidrocarbonetos • 900 compostos identificados
Enriquecimento biológico de vermicomposto estabilizado
• Culturáveis e não culturáveis
• Fases de maturação
• Combinação de resíduos
• Seleção, compatibilidade
Enriquecimento biológico de vermicomposto estabilizado
Microrganismo Alóctone
• Azotobacter chrococcum
• Azospirillum lipoferum
• Incremento de N & P;
• Incremento de P na presença de rocha;• Azospirillum lipoferum
• Pseudomonas striata
• 0,2% (m/m)
presença de rocha;
• P-nativo & P-adicionado;
• Incremento populacional
Fortificação de composto &
vermicomposto
Vermicompostocomo veículo microbiano
EEnriquecimento Biológico nriquecimento Biológico de Substratosde Substratos
Enriquecimento Biológico de Substratos Enriquecimento Biológico de Substratos --PressupostosPressupostos
Ativação Biológica de Substratos Agrícolas(Processos microbianos: FBN vida-
livre, solubilização de rochas, compostos bioativos)
Microrganismos Matéria Orgânica e condicionantes abióticos
Fonte de Carbono (lábil ou recalcitrante?) Ativação seletiva de grupos microbianos
introduzidos bioativos)
Bioaumentação (Inoculação de
microrganismos)
Introduzir quem no substrato ?
Empirismo?
Cooperação Metabólica e Sucessão Microbiana...
Imposição de Vantagens seletivas• Biorreatores (FBN, rocha fosfatada...)• Indutores de Biofilme• Substâncias Húmicas
Construção de nichos microbianos (sobrevivência, atividade e competitividade)
Enriquecimento Biológico de Substratos Enriquecimento Biológico de Substratos –– Desenho OperacionalDesenho Operacional
Quem ?
Fungos Actinobactérias
Bactérias
Enriquecimento Biológico de Substratos Enriquecimento Biológico de Substratos –– Desenho Operacional Desenho Operacional (continuação)(continuação)Bioprospecção com base na composição do substrato e biorreatores
Composto e VermicompostoSerrapilheira: Ciclagem
Rizosfera/Rizoplano Planta-específico
Enriquecimento Biológico de Substratos Enriquecimento Biológico de Substratos –– Desenho Operacional Desenho Operacional (continuação)(continuação)Passos para seleção de combinações – in vitro
Características Promoção do Crescimento Vegetal: isolados e em combinação: sinergias de atividade
Enriquecimento Biológico de Substratos Enriquecimento Biológico de Substratos –– Desenho Operacional Desenho Operacional (continuação)(continuação)Estudos de compatibilidade microbiana
4
5
6
7
Log1
0 U
FC/m
L
b b
Fungos compatíveis: Taxa de sobrevivência, aumento da atividade? Maximização da PCV pela bactéria?
0
1
2
3
Controle Isolado 467 Isolado 476
Log1
0 U
FC/m
L
Inoculantes microbianos mistos Inoculantes microbianos mistos –– bactériabactéria--plantaplanta
HIFA FÚNGICA
4
5
6
7
8
9
log1
0 c
ell/
g fo
lha
Sobrevivencia de H.seropedicae em folhas de milho
Inoculantes microbianos mistos Inoculantes microbianos mistos –– bactériabactéria--plantaplanta
100
120
140
160
180
200n
mo
les/
fras
co/h
Atividade Diazotrófica da bactéria
1 7 14 21 28 56
Bac 8,2 5,4 4,2 3,4 2,2 0
Bac+Fungo 8,2 6,8 5,8 5 3,2 2,5
0
1
2
3
4
log1
0 c
ell/
g fo
lha
0
20
40
60
80
100
24 48 60 72
n m
ole
s/fr
asco
/h
Horas
B B+FAguiar, DSc Thesis
Jucimara Anunciação –
MSc/DSc
Actinobactérias degradam ácidos húmicos e suportam populações de bactérias diazotróficas:
Biomacromoléculas poliméricas (amido, celulose) e Supramoléculas (matéria orgânica estabilizada)
• Streptomyces estirpes AC1, AC4 e AC5 são capazes de utilizer ácidos húmicos como fonte exclusive de carbono;
• Non-limited to specific molecules ;
• Biodegradation of aromatic , sulfonated , polysaccharides and carboxylic domains.
100 100116
206
Conteudo de N e P (%) em vermicomposto maturado
VC VC+BAC
100 100
N P
Tomate Industrial: Enriquecimento de Substrato/Spray Foliar VCi Vci+FA
C+FAC
Plantlets and tomato fruit yields (70% increase)
�+ 55 22 27397198
www.nudiba.com.br