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日本毒性学会学術年会 In vitro S12-5 ヒト肝細胞ス …Day14, 50mM Cell-able (Lot 228)...
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第３９回 日本毒性学会学術年会 シンポジウム１２ 「In vitro毒性試験法の探索毒性試験への展開」 S12-5 ヒト肝細胞スフェロイド培養法を用いた in vitro 代謝・毒性評価 ○太田 之弘 1,6 ，王鞍 孝子 2,6 ，長井 大地 3,6 ，岩井 久和 4,6 ，片木 淳 5,6 1 中外製薬株式会社， 2 丸石製薬株式会社， 3 日本化薬株式会社， 4 株式会社三和化学研究所， 5 小野薬品工業株式会社， 6 安全性評価研究会 スフェロイド分科会
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第３９回 日本毒性学会学術年会 シンポジウム１２ 「In vitro毒性試験法の探索毒性試験への展開」
S12-5
ヒト肝細胞スフェロイド培養法を用いた in vitro 代謝・毒性評価
○太田 之弘1,6，王鞍 孝子2,6，長井 大地3,6，岩井 久和4,6，片木 淳5,6
1中外製薬株式会社，2丸石製薬株式会社，3日本化薬株式会社， 4株式会社三和化学研究所，5小野薬品工業株式会社，
6安全性評価研究会 スフェロイド分科会
背景
医薬品の開発において化合物及びその代謝物のin vitro肝毒
性評価が，肝細胞や組織等を用いた種々の方法により試みられてきた．
しかし，従来法では代謝能を長期間維持することが難しく，より生体に近い機能が維持された肝細胞培養系による毒性評価法の確立が望まれてきた．
また，ヒト-動物種差およびIVIVCの問題をクリアできるin vitro評価系が望まれていた．
近年，より生体に近い培養デバイスとして三次元培養基材が開発されIn vitro代謝毒性評価での使用が可能となってきた．
目的
肝細胞の長期培養が可能で，より生体に近い機能維持が可能といわれている三次元（スフェロイド）培養法の有用性について『代謝および毒性』の側面からヒト肝細胞を用い多施設で検討した．
・従来法で困難であった代謝物の検出系の構築
・長期暴露時に発現する肝毒性の評価系の構築
をめざし実施した.
使用したプレート
【Cell-able】 フィーダー細胞と共培養した場合，より安定したスフェロイド形成が可能
肝細胞のみでスフェロイドを形成することが可能
Method
細胞接着領域
細胞非接着領域
肝細胞スフェロイド
【Micro Sphere Array】
培養条件
プレート
Cell-able Micro Sphere Array
(96well プレート） (48well プレート)
トランスパレント STEMバイオメソッド
ヒト凍結肝細胞
Lot 228 （ 日本ベクトン・ディッキンソン : BD ）
Lot Hu8110 （ 日本チャールス・リバー : CR ）
2 x 104 cells/well 5.7 x 104 cells/well
フィーダー細胞
3T3-Swiss albino
JCRB9019 (Lot 04052005) ー
8 x 103 cells/well 肝細胞と1:1播種
培地
RM101培地（トランスパレント） Williams’E 培地
1%FBS添加、フェノールレッド不含 10%FBS添加、フェノールレッド不含
100 μ L/well 400 μ L/well
Method
長期間の細胞維持 スフェロイド培養における細胞形態の推移
【Cell-able】 Lot Hu8110（フィーダー細胞有り）
Result
肝細胞播種直後 (Day -4) 播種１日後 (Day -3) 暴露開始後 (Day 7)
Day 14 Day 21
スフェロイド形成後，約1ヶ月まで
の培養が可能であり，培養期間中のスフェロイド形態は安定して維持されていた．
施設間でハンドリングの差が生じにくい系であると感触を受けた.
長期間の細胞維持：スフェロイド培養におけるAlbumin分泌量及び細胞形態の経時的推移
0
500
1000
1500
0 3 6 9 12 15 18 21
Alb
um
in s
ec
reti
on
(ng
/da
y/w
ell) Lot: 228
Lot: Hu8110
【Cell-able】
Experimental period (day)
0
50
100
150
200
250
0 3 6 9 12 15 18 21
Alb
um
in s
ec
reti
on
(ng
/da
y/w
ell) Lot: 228
Lot: Hu8110
【Micro Sphere Array (MSA)】
Experimental period (day)
2 7 14 21
Experimental period (day) Experimental period (day)
2 7 14 21
肝特異機能の一つであるAlbumin産生は，肝細胞ロット間差あるいは培養日数毎の増減はあるものの，培養期間を通じて維持されていることが確認された．
(Lot 228) (Lot 228)
Result
代謝物予測に関する検討
MSA
（Feeder細胞の有/無で評価） Day -7 ：Feederなし：肝細胞を播種
Co-culture ：Feeder細胞と肝
細胞を１：１で播種
肝細胞数 5.7×104 cells/well
(48 well plate)
←Day 0 ←Day 2
←Day 7 各時点で化合物を曝露し，48時間（2日）もしくは168時間（7日）の ←Day 14 代謝反応性を評価. ( 化合物暴露濃度は 10μmol/L ) ←Day 21
培養上清をアセトニトリルにより除蛋白後、LC/MS/MSで分析内標（IS）に対するresponseを求めた． 代謝活性の指標として基質減尐率を算出．（対照wellのresponseを100%とした時の減尐率） （対照wellはFeeder 細胞のみ（Feeder-freeの系では培地のみ）に化合物を暴露）
＜実験スケジュール＞
培地交換 → （3回/週）
Method
Cell-able
（肝細胞2Lot間で評価） Day -5 ：Feeder細胞を播種
Day -2 ：肝細胞を播種
肝細胞数 2×104 cells/well
(96 well plate)
0
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30
40
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0
0.2
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0.6
0.8
1
Day 0 Day 2 Day 7 Day 14 Day 21
基質減尐率（％）
Re
spo
nse
Lot BD
0
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0
0.1
0.2
0.3
0.4
Day 0 Day 2 Day 7 Day 14 Day 21
基質減尐率（％）
Re
spo
nse
Lot CR
Acetanimophen sulfate Acetanimophen glucuronide 基質減尐率
肝細胞 2Lot（BD及びCR）間の代謝能比較
Acetaminophenの48時間反応 (Cell-able)
用いた２つのロットの凍結ヒト肝細胞では、代謝の相違は質的な差は小さく、量的な差が認められた．
基質の反応率（基質減尐率）からみた代謝活性はほぼ試験期間中28日間持続していた．
MSA（Feeder-free）についてもCell-able,と同等に活性を維持していた．
Acetaminophen
0
20
40
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80
100
0
1
2
3
4
Day 0 Day 2 Day 7 Day 14 Day 21
基質減尐率（％）
Re
spo
nse
反応時間：48時間
0
20
40
60
80
100
0
1
2
3
4
Day 0 Day 2 Day 7 Day 14 Day 21
基質減尐率（％）
Res
po
nse
反応時間：168時間
Demethyl desipramine Desipramine Hydroxy desipramine Imipramine-N-oxide Imipramine-N-glucuronide Desipramine-2-O-glucuronide Hydroxy imipramine glucuronide2 Hydroxy imipramine glucuronide1 基質減尐率
反応時間による代謝能の推移の比較 Imipramineの代謝能 (Cell-able, Lot BD)
Imipramine
緑色系及の棒グラフは抱合体 茶色系の棒グラフは第１相代謝物
Cell-able とMSAの培養系における各代謝物の検出結果（全培養期間）
化合物名の下段は主代謝酵素を示す
＊保持時間の異なる位置異性体
臨床で認められるグルクロン酸抱合及び硫酸抱合の第2相代謝物の検出が可能であった．
MSAではCo-cultureの方がFeeder-freeの場合よりも代謝物産生能が高かった．
LamotorigineとSulbtamol の代謝物は、 in vitro試験において検
出困難と報告されていたが、本検討のspheroid培養（Cell-able)では検出可能であった．
実施施設内訳
Cell-able 5施設 (A, B, C, D, E)
MSA 1施設 (E)
Result
Lamotorigine （左）及びSalbutamol （右）の代謝物のLC/MS/MS分析 (Cell-able)
Lamotorigine, Salbutamol
Lamotorigine 256.0>109.0(ES+)
3.62×105
Lamotorigine-N-glucronide 432.0>256.0(ES+)
8.84×104
Salbutamol 240.1>148.0 (ES+)
7.29×106
Salbutamol-4-O-sulfate 320.0>240.0 (ES+)
5.26×103
＜分析条件（共通）＞ LC条件： UPLC 逆相系 リニアグラジエント MS条件： ESI MRMモード I.S.： デキストロルファン酒石酸
肝毒性評価予測に関する検討
Day -9 -7 -5 -2-1 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21
共通作業
Cell-able
Micro SphereArray
肝細胞播種フィーダー細胞播種 培地交換
曝露，サンプル採取（逸脱酵素，Albumin）
Day -9 -7 -5 -2-1 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21
共通作業
Cell-able
Micro SphereArray
肝細胞播種フィーダー細胞播種 培地交換
曝露，サンプル採取（逸脱酵素，Albumin）
培地交換 フィーダー細胞播種 肝細胞播種
暴露，サンプル採取 （ 逸脱酵素，Albumin ）
測定項目： AST, ALT, LDH, γ -GTP, Albumin
化合物暴露と試料採取 (3W)
Method
＜実験スケジュール＞
0
2
4
6
8
10
12
14
0 7 14 21(day)
Cu
mu
lati
ve A
ST
lea
ka
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(mIU
/well
)
0
5
10
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20
25
0 7 14 21(day)
Cum
ula
tive A
ST
lea
kage(m
IU/w
ell)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 7 14 21(day)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 7 14 21(day)
Alb
um
in s
ecreti
on
(μg
)
両lotのスフェロイドとも高用量で早期からAlbumin産生量の低下がみられ，投与の延長により低用量でも同様の変化がみられた．
Lot 228は最高用量でASTの増加がみられたが，その他の項目では明らかな逸脱酵素の増加はみられなかった．
一方lot Hu8110ではAST以外にもALTやLDHの増加がみられ，その変化は用量依存的であった．
Cell-able (Lot 228) Cell-able (Lot Hu8110)
Cu
mu
lati
ve A
ST
leak
age
(mIU
/wel
l)
Cu
mu
lati
ve a
lbu
min
se
cret
ion
(m
g)
Cu
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ve A
ST
leak
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(m
IU/w
ell)
Cu
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lati
ve a
lbu
min
se
cret
ion
(m
g)
Acetaminophen
0 mol/L 250 mol/L 500mol/L 1000mol/L 2000mol/L 4000mol/L
0 mol/L0 mol/L mol/L250250 mol/L 500mol/L500 mol/L 1000mol/L1000 mol/L 2000mol/L2000 mol/L 4000mol/L
0 mol/L0 mol/L 250 mol/L250 mol/L 500 mol/L500 mol/L 1000 mol/L1000 mol/L 2000 mol/L2000 mol/L 4000 mol/L4000 mol/L
0 mol/L0 mol/L0 mol/L0 mol/L mol/L250250250250 mol/L 500 mol/L500 mol/L500 mol/L500 mol/L 1000 mol/L1000 mol/L 2000 mol/L2000 mol/L2000 mol/L2000 mol/L 4000 mol/L4000 mol/L
0 mol/L0 mol/L 250 mol/L250 mol/L 500mol/L500mol/L 1000mol/L1000mol/L 2000mol/L2000mol/L 4000mol/L4000mol/L
0 mol/L0 mol/L0 mol/L0 mol/L mol/L250250250250 mol/L 500mol/L500 mol/L500mol/L500 mol/L 1000mol/L1000 mol/L 2000mol/L2000 mol/L2000mol/L2000 mol/L 4000mol/L4000mol/L
0 mol/L0 mol/L 250 mol/L250 mol/L 500 mol/L500 mol/L 1000 mol/L1000 mol/L 2000 mol/L2000 mol/L 4000 mol/L4000 mol/L
0 mol/L0 mol/L0 mol/L0 mol/L mol/L250250250250 mol/L 500 mol/L500 mol/L500 mol/L500 mol/L 1000 mol/L1000 mol/L 2000 mol/L2000 mol/L2000 mol/L2000 mol/L 4000 mol/L4000 mol/L
Albumin Albumin
AST AST
Cell-able Hepatocyte Lot No.228
Day7_Control Day7_4000uM
Day21_Control Day21_250uM
Cell-able (Lot 228) Day7, Control Day7, 4000uM
Day21, Control Day21, 250uM
Cell-able (Lot 228) MSA (Lot 228)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 7 14 21(day)
Alb
um
in s
ecreti
on
(μg
)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
0 7 14 21(day)
Alb
um
in s
ecreti
on
(μg
)
0
10
20
30
40
50
0 7 14 21(day)
Cu
mu
lati
ve A
ST
lea
ka
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(mIU
/well
)
0
1
2
3
4
5
6
0 7 14 21(day)
Cu
mu
lati
ve A
LT
lea
ka
ge
(mIU
/well
)
0
1
2
3
4
5
0 7 14 21(day)
Cum
ula
tive A
LT
leakage
(mIU
/well)
0
1
2
3
4
5
0 7 14 21(day)
Cum
ula
tive A
LT
leakage
(mIU
/well)
Cell-ableにおいて100umol/Lでは曝露初期よりAlbumin産生能の低下がみられ，5日目には殆ど産生能は見られなかった．
100umol/Lに続き，50umol/L，30umol/Lの順に，濃度依存的な時間の遅延を伴い，Albumin産生能低下と，AST，ALTの上昇が見られた．
これらの変化はMSAにおいても同様の推移を示した．
Imipramine
Cu
mu
lati
ve
AS
T
leak
age
(mIU
/wel
l)
Cu
mu
lati
ve
AL
T
leak
age
(mIU
/wel
l)
Cu
mu
lati
ve
alb
um
in
secr
etio
n (
g)
Cu
mu
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ve
alb
um
in
secr
etio
n (
g)
Cu
mu
lati
ve
AS
T
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(mIU
/wel
l)
Cu
mu
lati
ve
AL
T
leak
age
(mIU
/wel
l)
0 mol/L 3 mol/L 10 mol/L 30 mol/L 50 mol/L 100 mol/L
0mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L 10 mol/L 30mol/L 50mol/L 100 mol/L
0 mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L 10 mol/L10 mol/L 30 mol/L30 mol/L 50 mol/L50 mol/L 100 mol/L100 mol/L
0 mol/L0 mol/L0 mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L3 mol/L3 mol/L 10 mol/L10 mol/L 30 mol/L30 mol/L 50 mol/L50 mol/L 100 mol/L100 mol/L
0 mol/L 3 mol/L 10 mol/L 30 mol/L 50 mol/L 100 mol/L
0mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L 10 mol/L 30mol/L 50mol/L 100 mol/L
0 mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L 10 mol/L10 mol/L 30 mol/L30 mol/L 50 mol/L50 mol/L 100 mol/L100 mol/L
0 mol/L0 mol/L0 mol/L0 mol/L 3 mol/L3 mol/L3 mol/L3 mol/L 10 mol/L10 mol/L 30 mol/L30 mol/L 50 mol/L50 mol/L 100 mol/L100 mol/L
Albumin Albumin
AST AST ALT ALT
MSA (Lot 228)
Day7, Control
Day7, 100mM
Day14, Control
Day14, 50mM
Cell-able (Lot 228) Day7, Control
Day7, 100mM
Day14, Control
Day14, 30mM
培養液中のASTの漏出 （Lot Hu8110） Fialuridine
Day2 Day5 Day12 Day16
Control
(DMSO 0.5%)
Fialuridine
100μmol/L
Day9
ヒト肝細胞スフェロイドの形態変化 （Lot Hu8110 ） Day19
Day7までFialuridineによる変化は認められなかったが，Day9以降, AST量増加および形態変化が，Fialuridineの臨床Cmax 1μmol/Lより濃度に応じて認められた．なお， Lot 228も同様の結果であった．
まとめ • 今回の検討において，ヒト肝細胞スフェロイド培養法は従来法では困難であった代謝物検出や肝毒性評価を可能とするポテンシャルを有していることを示唆する結果が得られた.
• 長期間の細胞維持が可能となり初めて検出可能な評価系として有用性が認められた. • 第２相代謝生成物の検出，経時的な代謝物生成の追跡 • 長期培養で発現する毒性評価 ，etc.
• 代謝・毒性を総合的に評価可能なIn vitro試験系の構築が可能となる.
• ハンドリングが容易で，施設間差が比較的尐なく， 「In vitro 代謝・毒性試験法」として１つの試験法の確立も考えられた.
Result
アドバイザー
小島 肇 （国立医薬品食品衛生研究所）
絵野沢 伸 （国立成育医療センター）
荻原 琢男 （高崎健康福祉大・薬）
本発表にあたり、ご助言、ご指導頂きました 安全性評価研究会 スフェロイド分科会の会員各位に感謝申し上げます
旭化成ファーマ株式会社 小平 輝朊 小野薬品工業株式会社 片木 淳, 松本 範人 株式会社大塚製薬工場 金田 信也, 吉岡 祐一郎 エーザイ株式会社 柿木 基治, 大辻 摩希子 日本化薬株式会社 長井 大地 DSファーマバイオメディカル株式会社 上田 忠佳
丸石製薬株式会社 王鞍 孝子 株式会社三和化学研究所 岩井 久和, 井上 由紀子, 高橋 直希 財団法人食品農医薬品安全性評価センター 田中 翔 株式会社イナリサーチ 小枝 暁子 株式会社住化分析センター 長尾 卓也, 楠元 久美子 中外製薬株式会社 太田 之弘
日本ベクトン・ディッキンソン株式会社（実施時） 和田 一輝 日本チャールス・リバー株式会社 内藤 一史 株式会社トランスパレント 城村 友子, 小関 恵美子, 池谷 武志 STEMバイオメソッド株式会社 八尋 寛司, 田村 朊子
（順不同，敬称略）
安全性評価研究会 スフェロイド分科会 参加会員
Acknowledgment
ご静聴ありがとうございました.
安全性評価研究会 スフェロイド分科会
