1399 تابستان، 2، شماره مدوازدهسال پژوهشی محیط زیست جانوری فصلنامه علمی

145

سمی هموراژیک گلیکوپروتئین ویروس سپتی Gفیلوژنی و کلونینگ ژن بررسی تشخیص،

(VHSV) کمان آالی رنگینجدا شده از ماهی قزل(Onchorhynchus mykiss)

شیراز، ایراندانشگاه شیراز ،های آبزیان، دانشکده دامپزشکیبهداشت و بیماریگروه : امیرعلی حیدری ،

شیراز، ایراندانشگاه شیراز ،های آبزیان، دانشکده دامپزشکیبهداشت و بیماریگروه طفی اخالق:مص ،

ایرانشیراز، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز *:علی محمدی ،

العات کاربردیهای مرجع و مطمرکز ملی تشخیص، آزمایشگاه، های آبزیانتشخیص بیماریگروه : گودرزیالله معظمی ،

، ایرانتهران، سازمان دامپزشکی کشور

ایرانشیراز، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز :آزاده یکتاسرشت ،

1398 شهریورتاریخ پذیرش: 1398 خرداد تاریخ دریافت:

چکیده

ترین که مهم باشدباشد. ژنوم این ویروس شامل شش ژن میآزادماهیان می های ویروسترین بیماریدهنده ازمهمسمی خونریزی بیماری سپتی

دهنده سمی خونریزیزایی علیه این ویروس نقش دارد. هدف از این مطالعه شناسایی ویروس سپتی)گلیکوپروتئین( است و در ایمنی Gژن آن

دهنده سمی خونریزیبود. پس از تشخیص ویروس سپتی pTZ57r/t ویروس در وکتور Gکمان، مطالعه فیلوژنی و کلونینگ ژن آالی رنگینقزل

های ( منتقل گردید. از کلونیE. coli، پالسمید نوترکیب سنتزشده به باکتری پذیرا )pTZ57r/tداخل پالسمید Gوکلونیگ ژن RT-PCRروش به

باشد که در این می bp 1523سمی هموراژیک یروس سپتیو Gسفید دربردارنده وکتورنوترکیب جهت استخراج پالسمید استفاده شد. اندازه ژن

با موفقیت در Gهای حاصل از این مطالعه نشان داد که ژن و تعیین توالی اسفاده شد. بررسی PCRپژوهش جهت تایید کلونینگ از روش کلونی

منظور تولید پروتئین استفاده کرد. تورهای بیانی بهدر وک توان ازآن جهت بیان گلیکوپروتئین ویروسکلون گردیده است و می pTZ57r/tوکتور

بوده است. مطالعه حاضر Ia-2نیز نشان داد که ویروس شناسایی شده در این مطالعه متعلق به ژنوتیپ Gنتایج حاصل شده از تعیین توالی ژن

ر وکتورهای پالسمیدی انجام شده است.دهنده دسمی خونریزیویروس سپتی Gمنظورکلونینگ ژن نخستین تحقیقی است که در کشور به

کمان، کلونینگآالی رنگینقزل گلیکوپروتئین، VHS ،Gویروس کلمات کلیدی:

mohammad@shirazu.ac.ir: * پست الکترونیکی نویسنده مسئول

2020.106476AEJ./10.22034(DOI):

....سمی هموراژیکگلیکوپروتئین ویروس سپتی Gتشخیص، بررسی فیلوژنی و کلونینگ ژن و همکاران حیدری

146

مقدمه

( ازجمله VHSدهنده ویروسی )سمی خونریزیبیماری سپتی

باشد که عامل آن در خانواده رابدوویریده می OIEهای لیست بیماری

س اگتوود نیز شناخته می شود و برای نخستین قرار دارد که با نام ویرو

بار با عالئمی شامل تورم کلیه و دژنراسیون کبدی توسط

Schaeperclause ( در دانمارک از مزارع قزل1938و همکاران ) آال

پس از آن مواردی از بروز این بیماری در .رنگین کمان گزارش گردید

، Ghittinoایتالیا )(، Besse ،1955؛ Bellet ،1965هلند، فرانسه )

های وحشی چنین تلفات شدیدی در برخی جمعیت( و هم1965

Schlotfeldt) مانند ساردین و هرینگ در سواحل آمریکا مشاهده شد

و همکاران، Garver؛ Garver ،2008و Hawley؛ 1991و همکاران،

تمایل شدیدی به VHS(. ویروس 2009و همکاران، Kim؛ 2011

لیال دارد و منجر به خونریزی گسترده در سطح بدن های آندوتسلول

همراه خونریزی شدید در چشم، پوست، می شود. این ضایعات به

و همکاران، Brudeseth) شودهای داخلی دیده میماهیچه و اندام

(. انتقال ویروس از طریق افقی و تماس با دیگر ماهیان آلوده یا 2005

از طریق س به بدن ماهی احتماالًباشد. راه ورود ویروآب آلوده می

(. کیفیت پایین آب، 2005و همکاران، Skallآبشش یا پوست است )

تراکم باال، غذادهی زیاد بر دوره بیماری و شدت بیماری تاثیر دارند.

فرمیستوان به راسته سالمونیهای حساس به این ویروس میاز گونه

(Salmoniformes) ماهی و ماهی فالندر آال( و کفشک)سالمون و قزل

(.2013و همکاران، Vinay؛ 2009و همکاران، Kim) کرد ژاپنی اشاره

باشد. ژنوم این ویروس به شکل یک ژنوتیپ می 4این ویروس دارای

RNA ای به طول تک رشتهkb11 5باشد که از شش ژن )میʼ- N-P-

M-G-NV-L-3ʼ( تشکیل شده است )Vinay ،2013و همکاران .)

کند ژن سطحی را کد میباشد که آنتیمی Gین ژن ویروس، ژن ترمهم

عنوان ژن هدف برای تهیه واکسن و آنالیزهای فیلوژنی مورد و به

Thompson؛ 2005و همکاران، Einer-Jensen) گیرداستفاده قرار می

چنین در تکثیر ویروس اهمیت زیادی (. این ژن هم2011و همکاران،

ه ویروس به سلول نقش دارد که پس از اتصال، داشته و در اتصال اولی

و همکاران، Assenberg) کندو تکثیر می شده میزبان سلول وارد ویروس

با توجه به برخی از مطالعات انجام (.2012و همکاران، Purcell؛ 2010

تواند دهنده میسمی خونریزیگلیکوپروتئین ویروس سپتی Gشده،

-Lecocq) ویروس نقش داشته باشدزایی ماهی علیه این در ایمنی

Xhonneux ،؛ 1994و همکارانChico ،لذا هدف 2008و همکاران .)

از این مطاله شناسایی مولکولی ویروس و تعیین فیلوژنی آن و سپس

مطالعه حاضر است. بوده pTZ57r/tوکتور در G کلون کردن ژن

س ویرو Gژن منظورکلونینگتحقیقی است که در کشور به نخستین

دهنده در وکتورهای پالسمیدی انجام شده سمی خونریزیسپتی

است.

هامواد و روش

مشکوک کمانآالی رنگینقزل ماهی قطعه 10تعداد :گیرینمونه

یکی از مزارع پرورش از گرم، 70±2 وزنی ویروسی با میانگین به آلودگی

اورت یخ ماهی استان چهارمحال بختیاری، خریداری شد سپس در مج

به بخش آبزیان دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز منتقل شدند.

های اخذ نمونه شد. طحال و قلب ماهیان انجام قدامی، کلیه از گیرینمونه

گراد درجه سانتی -70 دمای در شده تا زمان انجام آزمایشات مولکولی

(.2016و همکاران، Ahmadivand) شدند دارینگه

ابتدا ترکیب هموژنی cDNA:و ساخت ویروس RNA استخراج

های کلیه قدامی، طحال و مغز ماهی ساخته شد. استخراجاز بافت

RNA های هموزن شده براساساز بافت گرممیلی 50 روی بر

کانادا انجام BIO Basicشرکت RNAدستورالعمل کیت استخراج

ذخیره ادگرسانتی درجه -70 دمای در شده استخراج RNA سپس، .شد

Thermoدستگاه نانودراپ ) توسط شده استخراج RNA خلوص. شد

scientific Nanodropسنتز. شد گیری( اندازه cDNA برای هر نمونه

پرایمر از استفاده با RNAمیکرولیتر 4از میکرولیتر 20 کل حجم در

forward ژنمربوط به اختصاصیG سمی سپتی گلیکوپروتئین ویروس

مربوط به شرکت cDNAکیت سنتز طبق دستورالعمل دهدهنخونریزی

TAKARA .ژاپن انجام شد

ویروس Gیص ژن خو تش منظور شناساییبه: RT-PCRآزمایش

طراحی Primer3 برنامه از استفاده با پرایمرها دهندهخونریزی سمیسپتی

در بانک اطالعاتی، oligo analyzerگردید و پس از بررسی با برنامه

blast .5 فوروارد پرایمر توالی شدندʼ-ATGGAATGGAACACTTT-3ʼ

باشد. می -3ʼ GACCATCTGACTTCTG 5ʼ-و توالی پرایمر ریورس

الگو، cDNAمیکرولیتر از G ،3منظور تکثیر ژن به PCRجهت انجام

میکرولیتر 5پیکومول، 10میکرولیتر از هر کدام پرایمرها با غلظت 1

موالر میلی 5/1لیتر مسترمیکس قرمز با غلظت میکرو 10آب مقطر و

منیزیم استفاده گردید. برنامه دستگاه ترموسایکلر با مرحله واسرشت

96چرخه 35دقیقه و با انجام 5مدت درجه به 96سازی در دمای

درجه 72ثانیه و 40مدت درجه به 7/58ثانیه، 40مدت درجه به

دقیقه در 5مدت ایی بهمدت یک دقیقه و با مرحله گسترش نهبه

PCRگراد به پایان رسید. در نهایت محصول درجه سانتی 72دمای

PCR(. سپس محصول 1)شکل الکتروفروز شد %1روی ژل آگاروز

کانادا خالص Bio Basicمورد نظر با استفاده از کیت استخراج از ژل

سازی شد و برای تعیین توالی ارسال گردید. پس از دریافت نتایج

1399 تابستان، 2، شماره مدوازدهسال پژوهشی محیط زیست جانوری فصلنامه علمی

147

های حاصل از تعیین توالی، ترسیم درخت فیلوژنی با استفاده از توالی

و به Mega 6افزار جفت باز با نرم 1523به طول تقریبی Gکامل ژن

با تکرار هزار بار Bootstrapو با آزمون Maximum likelihoodروش

(.2)شکل صورت گرفت

ازی محصول سپس از خالص :پالسمید استخراج و ژن کلونینگ

PCR مربوط به ژنG واکنش اتصال طبق دستورالعمل کیت ،TA

Cloning شرکتThermo scientific fisher انجام شد و ژنG در

3کلون شد. با توجه به دستورالعمل کیت میزان pTZ57r/tوکتور

5X Ligationمیکرولیتر از pTZ57r/t ،6میکرولیتر از پالسمید

Buffer ،2 از محصول خالص شده میکرولیترPCR ،1 میکرولیتر آنزیم

T4 DNA Ligase ط شده و آب دوبار تقطیر استریل به لوبا هم مخ

میکرولیتر رسانده شد. سپس میکروتیوب حاوی مخلوط 30حجم

داری شد. پس از گراد نگهدرجه سانتی 4ساعت در دمای 18واکنش

م، مخلوط واکنش سازی آنزیمنظور غیرفعالگذشت این مدت زمان، به

گراد قرار داده شد. در درجه سانتی 65دقیقه در دمای 15مدت به

روش شیمیایی به سلول مرحه بعد پالسمید نوترکیب سنتز شده، به

و همکاران، Li) ( منتقل شدDH5αسویه E.coliمیزبان )باکتری

های حاوی پالسمید روی محیط جامد حاوی آنتی (. باکتری2010

کشت داده شد و سپس به مدت IPTGو X-galی سیلین، بیوتیک آمپ

ساعت 24مدت گراد بهدرجه سانتی 37باتور با دمای وساعت در انک 24

ها در محیط کشت که در واقع نشان قرار داده شد. پس از رشد باکتری

های باشد، انتخاب کلونیدهنده وجود پالسمید در داخل باکتری می

باشند براساس تشکیل می Gواجد ژن حاوی پالسمید نوترکیب که

فاقد پالسمید رنگ های آبیکلونی و سفید صورت گرفت. آبی هایکلونی

را X-gal( تولیدی LacZنوترکیب هستند زیرا آنزیم بتاگاالکتوزیداز )

های سفید حاوی پالسمید کند. کلونیبه محصول آبی هیدرولیز می

به جایگاه DNAقطعه باشند زیرا با ورودمی Gنوترکیب واجد ژن

کلونینگ، توالی کد کننده آنزیم بتاگاالکتوزیداز مختل شده و باکتری

تجزیه نخواد X-galباشد و در نتیجه دیگر قادر به تولید این آنزیم نمی

و Sambrookشوند )ها به رنگ سفید نشان داده میشد و کلونی

Russell ،2001 3()شکل).

Gکلونینگ ژن بررسی

و سفید های آبیکلونی مشاهده پس از :PCRگری با کلونی غربال

عدد کلونی سفید انتخاب 10تا 5بر روی پلیت های کشت باکتری، بین

سیلین، بیوتیک آمپیصورت خطی در پلیت جدید حاوی آنتیشد و به

X-gal وIPTG ساعت در انکوباتور با دمای 24مدت کشت داده و به

شد. مقداری از کلونی با استفاده از سر سمپلر استریل یدارنگه درجه 37

با استفاده از پرایمرهای PCRالگو در واکنش عنوانبهبرداشته و

با الکتروفورز در ژل PCRاستفاده شد. نتایج کلونی Gژن اختصاصی

مورد بررسی قرار گرفت. درصد 1آگارز میکرولیتر از 30مقدار : نوترکیبتعیین توالی پالسمیدهای

پالسمید نوترکیب برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران ارسال شد.

M13تعیین توالی با استفاده از پرایمرهای عمومی رفت و برگشت

Forward وM13 Reverse ها در پالسمیدکه توالی نوکلئوتیدی آن

pTZ57r/t ،صورت دوطرفه انجام شد. پس از دریافت به وجود داشت

، با pTZ57r/t -G glycoprotein ید نوترکیبپالسمج تعیین توالی نتای

موجود در پایگاه اینترنتی blastافزار بیوانفورماتیک استفاده از نرم

NCBI توالی محصول ،PCR مربوط به ژنG سمی ویروس سپتی

های نوکلئوتیدی وجود تشابه و اختالفات با توالی نظر از دهندهخونریزی

منظور ترسیم درخت فیلوژنی بهمقایسه شدند. Gه ژندیگر مربوط ب

و تعیین نوع ژنوتیپ ویروس شناسایی شده با کد دسترسی ثبت شده

های مطالعات پیشین استفاده شد(، از توالیMH794504در بانک ژن )

( Kahns ،؛2012و همکاران Einer-Jensen ،؛2004و همکاران

Nishizawa ،شد.( استفاده 2006و همکاران

نتایجویروس Gشناسایی و تکثیر ژن G:شناسایی و فیلوژنی ژن

VHS با روشPCR منجر به تکثیر قطعه اختصاصی شد که به شکل

)شکل در ژل آگاروز یک درصد ظاهر گردید bp1523باندی در اندازه

منظور تایید نهایی قطعه مورد نظر، تعیین توالی توسط شرکت (. به1

ن انجام شد و توالی ژن مورد مطالعه با شماره دسترسی ژن فناورا

MH794504 های مربوط درصد با سایر توالی 99-100و با مشابهت

در بانک ژن ثپت گردید. درخت فیلوژنی ترسیم شده حاصل Gبه ژن

جدا شده در این مطالعه نشان داد که ایزوله Gهای کامل ژن از توالی

های ت شده در بانک ژن با شمارهانی ثبیرهای اهمراه دیگر ایزولهبه

در KP866927و KP866928 ،KP861241 ،KP866926دسترسی

ویروس Nقرار گرفتند. در این بررسی توالی ژن Ia-2گروه ژنوتیپ

VHS نوع (.2)شکل نظر گرفته شدعنوان توالی خارج گروهی دربه

درخت فیلوژنی دست آمده با توجه به نتایج حاصل از ترسیم هژنوتیپ ب

(.2 )شکل درنظر گرفته شد Ia-2نشان داده شده است، 1که در شکل

بررسی اولیه کلونینگ ژن شد طورکه ذکرهمان : Gکلونینگ ژن

G ویروسVHS های های آبی و سفید بر روی پلیتبا مشاهده کلونی

کشت باکتری انجام شد. بر این اساس با توجه توضیحات داده شده،

های حاوی پالسمید نوترکیب عنوان باکتریهای سفید رنگ بهنیکلو

های سفید رنگ، (. در ادامه بر روی کلونی3)شکل درنظر گرفته شدند

4انجام گرفت. که نتایج مربوط به آن در شکل PCRآزمایش کلونی

....سمی هموراژیکگلیکوپروتئین ویروس سپتی Gتشخیص، بررسی فیلوژنی و کلونینگ ژن و همکاران حیدری

148

، Gمنظور تایید نهایی کلونینگ ژن به نشان داده شده است. نهایتاً

اج شده تعیین توالی شدند.پالسمیدهای استخر

های سفید و آبی باکتری پذیرا: تصویر مربوط به کلونی3شکل

(E. coli)

در وکتور Gمربوط به کلونینگ ژن PCR: نتایج کلونی 4شکل

pTZ57r/t .1- مثبت شاهد -2منفی شاهد -2نردبان ژنیPCR

، 6هستند Gپالسمیدهایی که فاقد ژن PCRنتیجه -9و 5، 4

هستند. Gپالسمیدهایی که واجد ژن PCRنتیجه -8و 7

بحث

های ترین بیماریاز مهم (VHS) دهندهخونریزی سمیپتیس بیماری

ویروسی است که به لحاظ تلفات رتبه نخست بیماریزایی را در بین

Ahmadivand) کمان داردآالی رنگینعوامل عفونی در ماهی قزل سایر

آالی پرورش ماهی قزل شدت صنعتبه (. این ویروس2016 و همکاران،

قرار داده و باعث خسارات سنگین اقتصادی کمان را تحت تاثیر رنگین

درنظر صنعت این توسعه برای تهدید یک عنوانبه شده است. بنابراین

نخستین گزارش از بروز این بیماری در ایران مربوط شود.می گرفته

از گیالن بوده است و پس از آن بیماری به دیگر مناطق 2005به سال

و Haghighi) یافته استآال در کشور گسترش پرورش ماهی قزل

(. در این مطالعه ضمن 2016و همکاران، Ghorani؛ 2008همکاران،

های فیلوژنی نشان داد که ، بررسیVHSتشخیص مولکولی ویروس

نردبان ژنی -VHS :1ویروس Gمربوط به ژن PCR: نتیجه واکنش 1شکل

Gمونه مربوط به ژن ن -3نترل منفی ک-2

ویروس Gدرخت فیلوژنی ترسیم شده براساس توالی کامل ژن :2شکل

VHS

1399 تابستان، 2، شماره مدوازدهسال پژوهشی محیط زیست جانوری فصلنامه علمی

149

( متعلق به ژنوتیپ MH794504جدایه مطالعه حاضر با کد دسترسی)

Ia و زیر شاخهIa-2 باشد. مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن میG ویروس

VHS ترین جدایه مطالعه حاضر با سایر مطالعات نشان داد که بیش

Kahns) و لهستان بوده است های ویروسی آلمان، فرانسهتشابه با ایزوله

ایران و (. با توجه به تشابه ژنوتیپی که بین جدایه2012و همکاران،

های ویروسی که میزبان تمامی جدایهو این دارد وجود اروپایی کشورهای

رسد نظر میکمان بوده است، بهآالی رنگینشورهای ذکر شده، قزلک

منشاء ورود ویروس به ایران در اثر تجارت افراد با کشورهای اروپایی

منظوربه ژن ژن به معنای انتخاب و ازدیاد یک کلونینگ بوده است.

تواند مصارف مختلفی است که می DNA مولکول یک از حفظ قسمتی

تکثیر توانایی از مولکولی شناساناین روش زیستدر داشته باشد.

و Casadaban) گیرندمی بهره هاژن تکثیر برای شده کشت هایسلول

Cohen ،1980). دلیل اهمیت ژنبهG ویروسVHS کلونینگ و بیان ،

این ژن در وکتورهای مختلفی نظیر وکتورهای پروکاریوتی، یوکاریوتی

(. در مطالعه 1995و همکاران، Bearzotti) و ویروسی انجام شده است

دست آمده از هویروس ب Gحاضر، هدف شناسایی و کلون کردن ژن

توان بوده است که می pTZ57r/tاستان چهارمحال بختیاری در وکتور

واکسن DNAپروتئین، Gمنظور انجام تحقیقاتی نظیر تولید از آن به

ی ویروس استفاده کرد. الزم در تیتراسیون مولکول چنین استانداردو هم

، از شش ژن تشکیل شده VHSطورکه ذکر شد ژنوم ویروس همان

باشد. مطالعات نشان داده است که می Gها ژن ترین آنماست که مه

زایی هستند، همانند ایمنی نقش که دارای VHS هایی از ویروساپیتوپ

وی ( بر رIHNساز)رابدوویروس عامل بیماری نکروز عفونی بافت خون

و همکاران، Lecocq-Xhonneux) اندویروس واقع شده پروتئین G سطح

منظور کلون کردن و بیان (. پیش از این مطالعات مختلفی به1994

انجام گردیده است E. coliخصوص در باکتری هب VHSویروس Gژن

(Lorenzen ،مطالعات دیگر نشان داد که تولید و 1993و همکاران .)

های پروکاریوتی نظیر تولید شده در سیستم Gئین سازی پروتخالص

و تزریق پروتئین نوترکیب سنتز شده به ماهی، منجر E. coliباکتری

-Lecocq) گرددکننده در بدن ماهی میهای خنثیبادیبه تولید آنتی

Xhonneux ،در تحقیق حاضر ژن 1994و همکاران .)G ویروس

آن با استفاده cDNAلونینگ ک و دهنده شناساییسمی خونریزیسپتی

انجام شد. با استخراج پالسمید E. coliدر باکتری pTZ57r/tاز وکتور

، تایید Gدست آمده، کلونینگ ژن هنوترکیب و تعیین توالی محصول ب

های سایر ویروس محلی با جدایه Gشد و سپس توالی نوکلئوتیدی ژن

بوده که bp 1523ویروس Gکشورها مقایسه شد. توالی کدکننده ژن

های اروپا تر ذکر شد با جدایهطورکه پیشترین تشابه را همانبیش

در حشرات و دیگر VHSویروس Gداشته است. کلونینگ و بیان ژن

Acosta) های یوکاریوتی نیز انجام شده استسلول

منظور تولید به Gای که کلونینگ ژن (. در مطالعه2006و همکاران،

DNA واکسن برای VHSV ،نشان داده شد که حتی توالی انجام گرفت

تواند در بروز پاسخ اند، میپالسمیدهایی که به این منظور استفاده شده

(. 2008و همکاران، Chico) ار باشدذتاثیرگ VHSVایمنی ماهی علیه

Acosta ( نیز نشان دادند که کلونینگ و بیان ژن 2006و همکاران )

G وتی نظیر سلول های یوکاریدر سطح سلولRTG-P1 تواند منجر می

Acosta) های مجاور گرددبه القای تولید اینترفرون نوع یک در سلول

ویروس این است که Gهای ژن(. از دیگر اهمیت2006و همکاران،

های عنوان یک ادجوانت مولکولی علیه دیگر بیماریتوان از آن بهمی

( 2014و همکاران ) Martinez-Lopezمطالعه در کرد. استفاده ویروسی

عنوان یک تواند بهویروس می Gنشان داده شد که اجزای اصلی ژن

( عمل SVCادجوانت مولکولی علیه بیماری ویرمی بهاره کپورماهیان )

واکسن علیه DNAعنوان به Gکند. عالوه بر این در مواردی که از ژن

وان از تسمی هموراژیک استفاده شده است، میبیماری سپتی

Gمنظور افزایش پاسخ ایمنی ماهی علیه های مولکولی بهادجوانت

(. مطالعه حاضر 2017و همکاران، Lazaret) پروتئین استفاده کرد

، VHSنخستین تحقیقی در کشور است که ضمن تشخیص ویروس

ویروس در داخل وکتورهای پالسمیدی Gدر زمینه کلونینگ ژن

انجام گرفته است.

منابع

1. Acosta, F.; Collet, B.; Lorenzen, N. and Ellis, A.E., 2006.

Expression of the glycoprotein of viral haemorrhagic

septicaemia virus (VHSV) on the surface of the fish cell line

RTG-P1 induces type 1 interferon expression in neighbouring cells. Fish & shellfish immunol. Vol. 21, No. 3, pp: 272-278.

2. Ahmadivand, S.; Soltani, M.; Mardani, K.; Shokrpoor,

S.; Rahmati Holasoo, H.; Mokhtari, A. and Hasanzadeh,

R., 2016. Isolation and identification of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) from farmed rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) in Iran. Acta tropica. Vol. 15, No. 6,

pp: 30-36.

3. Assenberg, R.; Delmas, O.; Morin, B.; Graham, S.C.; De

Lamballerie, X.; Laubert, C. and Brandt, B.W., 2010. Genomics and structure/function studies of Rhabdoviridae

proteins involved in replication and transcription. Antiviral

Research. Vol. 87, No. 2, pp: 149-161.

4. Bearzotti, M.; Monnier, A. F.; Vende, P.; Grosclaude, J.;

De Kinkelin, P. and Benmansour, A., 1995. The

glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV):

antigenicity and role in virulence. Veterinary research. Vol. 26, No. 5, pp: 413-422.

5. Bellet, R., 1965. Viral hemorrhagic septicemia (VHS) of the rainbow trout bred in France. Annals of the New York

Academy of Sciences. Vol. 126, No. 1, pp: 461-467.

6. Besse, P., 1955. Research on the etiology of infectious anemia of trout. Bulliten de l’Academie Veterinaire de

France. Vol. 5, pp: 194-198.

7. Brudeseth, B.E.; Raynard, R.S.; King, J.A. and Evensen,

Ø., 2005. Sequential pathology after experimental infection

....سمی هموراژیکگلیکوپروتئین ویروس سپتی Gتشخیص، بررسی فیلوژنی و کلونینگ ژن و همکاران حیدری

150

with marine viral hemorrhagic septicemia virus isolates of

low and high virulence in turbot (Scophthalmus maximus L.). Veterinary Pathology Online. Vol. 42, No. 1, pp: 9-18.

8. Casadaban, M.J. and Cohen, S.N., 1980. Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia

coli. J of molecular biology. Vol. 138, No. 2, pp: 179-207.

9. Chico, V.; Ortega Villaizan, M.; Falco, A.; Tafalla, C.;

Perez, L.; Coll, J.M. and Estepa, A., 2009. The immunogenicity of viral haemorragic septicaemia rhabdovirus

(VHSV) DNA vaccines can depend on plasmid regulatory

sequences. Vaccine. Vol. 27, No. 13, pp: 1938-1948.

10. Einer Jensen, K.; Ahrens, P. and Lorenzen, N., 2005. Parallel phylogenetic analyses using the N, G or Nv gene from a fixed group of VHSV isolates reveal the same overall

genetic typing. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 67,

No. 2, pp: 39-45.

11. Garver, K.A.; Hawley, L.M.; McClure, C.A.; Schroeder,

T.; Aldous, S.; Doig, F. and Richard, J., 2011. Development and validation of a reverse transcription

quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 95,

No. 2, pp: 97-112

12. Ghittino, P., 1965. Viral hemorrhagic septicemia (VHS) in rainbow trout in Italy. Annals of the New York Academy of

Sciences. Vol. 126, No. 1, pp: 468-478.

13. Ghorani, M.; Adel, M.; Dadar, M.; Ghalyanchi

Langeroudi, A.; Kamyabi, R.; Vikram N.V. and Einer

Jensen, K., 2016. Phylogenetic analysis of the glycoprotein

gene of viral hemorrhagic septicemia virus from Iranian trout

farms points towards a common European origin. Veterinary Microbiology. Vol. 186, pp: 97-101.

14. Haghighi, K.H.A.; Bandehpour, M.; Sharifnia, Z. and

Kazemi, B., 2008. Diagnosis of viral haemorrhagic

septicaemia (VHS) in Iranian rainbow trout aquaculture by pathology & molecular techniques. European

Association of Fish Pathologists. Vol. 28, pp: 170-175.

15. Hawley, L.M. and Garver, K.A., 2008. Stability of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) in freshwater and

seawater at various temperatures. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 82, No. 3, pp: 171-178.

16. Kahns, S.; Skall, H.F.; Kaas, R.S.; Korsholm, H.; Bang,

J.B.; Jonstrup, S.P. and Olesen, N.J., 2012. European

freshwater VHSV genotype Ia isolates divide into two distinct subpopulations. Diseases of Aquatic Organisms.

Vol. 99, pp: 23–35.

17. Kim, W.S.; Kim, S.R.; Kim, D.; Kim, J.O.; Park, M.A.;

Kitamura, S.I. and Oh, M.J., 2009. An outbreak of VHSV

(viral hemorrhagic septicemia virus) infection in farmed olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea. Aquaculture.

Vol. 296, No. 1, pp: 165-168.

18. Lazarte, J.M.S.; Kim, Y.R.; Lee, J.S.; Im, S.P.; Kim,

S.W.; Jung, J.W. and Jung, T.S., 2017. Enhancement of glycoprotein-based DNA vaccine for viral hemorrhagic

septicemia virus (VHSV) via addition of the molecular

adjuvant, DDX41. Fish & shellfish immunology. Vol. 62, pp: 356-365.

19. Lecocq Xhonneux, F.; Thiry, M.; Dheur, I.; Rossius, M.;

Vanderheijden, N.; Martial, J. and De Kinkelin, P., 1994. A recombinant viral haemorrhagic septicaemia virus

glycoprotein expressed in insect cells induces protective immunity in rainbow trout. Journal of General Virology.

Vol. 75, No. 7, pp: 1579-1587.

20. Li, X.; Sui, X.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Zhao, Y.; Zhai, Y. and

Wang, Q., 2010. An improved calcium chloride method

preparation and transformation of competent cells. African Journal of Biotechnology. Vol. 9, No. 50, pp: 8549-8554.

21. Lorenzen, N.; Olesen, N.J.; Jørgensen, P.V.; Etzerodt,

M.; Holtet, T.L. and Thøgersen, H.C., 1993. Molecular

cloning and expression in Escherichia coli of the glycoprotein

gene of VHS virus, and immunization of rainbow trout with the recombinant protein. Journal of General Virology.

Vol. 74, No. 4, pp: 623-630.

22. Martinez Lopez, A.; Garcia Valtanen, P.; Ortega

Villaizan, M.; Chico, V.; Gomez Casado, E.; Coll, J.M.

and Estepa, A., 2014. VHSV G glycoprotein major

determinants implicated in triggering the host type I IFN

antiviral response as DNA vaccine molecular adjuvants. Vaccine. Vol. 32, No. 45, pp: 6012-6019.

23. Nishizawa, T.; Savaş, H.; Işıdan, H.; Üstündag, C.;

Iwamoto, H. and Yoshimizu, M., 2006. Genotyping and

pathogenicity of viral hemorrhagic septicemia virus from

free-living turbot (Psetta maxima) in a Turkish coastal area of the Black Sea. Applied and Environmental Microbiology.

Vol. 72, No. 4, pp: 2373-2378.

24. Purcell, M.K.; Laing, K.J. and Winton, J.R., 2012. Immunity to fish rhabdoviruses. Viruses. Vol. 4, No. 1, pp: 140-166.

25. Sambrook, J. and Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd eds. Cold Spring Harbor Laborator

Press. ISBN.978-087969577-4, New York. 2344 p.

26. Schaeperclause, W., 1938. Damage to the German fisheries by fish parasites and fishdiseases. Allgemeine Fischerei

Zeitung. Vol. 41, pp: :256-259.

27. Schlotfeldt, H.J.; Ahne, W.; Vestergard Jorgensen, P.E.

and Glende, W., 1991. Occurrence of viral haemorrhagic

septicaemia in turbot (Scophthalmus maximus) a natural

outbreak. Bulletin of the European Association of Fish

Pathologists (United Kingdom).

28. Skall, H.F.; Olesen, N.J. and Mellergaard, S., 2005. Prevalence of viral haemorrhagic septicaemia virus in Danish

marine fishes and its occurrence in new host species. Diseases

of Aquatic Organisms. Vol. 66, No. 2, pp: 145-151.

29. Thompson, T.M.; Batts, W.N.; Faisal, M.; Bowser, P.;

Casey, J.W.; Phillips, K. and Kurath, G., 2011. Emergence

of Viral hemorrhagic septicemia virus in the North American

Great Lakes region is associated with low viral genetic diversity. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 96, No. 1,

pp: 29-43.

30. Vinay, T.N.; Kim, Y.J.; Jung, M.H.; Kim, W.S.; Kim,

D.H. and Jung, S.J., 2013. Inactivated vaccine against viral

hemorrhagic septicemia (VHS) emulsified with squalene and aluminum hydroxide adjuvant provides long term protection

in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Vaccine. Vol. 31,

No. 41, pp: 4603-4610.