ODBORNÁ PRAXE
description
Transcript of ODBORNÁ PRAXE
ODBORNÁ PRAXE
Zuzana KAUEROVÁ
4. r. biochemie
2004/2005
A) ÚVOD
1. POPIS LABORATOŘÍ
• Soukromé imunoanalytické a mikrobiologické laboratoře RNDr. Čecháček s. r. o. , Bratislavská 2, 604 70 Brno
• Oddělení: mikrobiologické, sérologické a imunoanalytické laboratoře
2. ČINNOST LABORATOŘÍ
Sérologie a imunoanalýza
• Imunokomplexní reakce – ELISA, EIA, RIA, KFR, aglutinace, hemaglutinace, precipitace, Western Blott
• PCR s elektroforetickou detekcí
• Detektory fotometrické, fluorimetrické, luminometrické, radioaktivní
Mikrobiologie
Gynekologické materiály, hemokultury, moč, stolice, punktát, rány, sputum, výtěry, vyšetření sterility, mykologie.
B) SÉROLOGIE
1. STANOVENÍ ANTI – HAV (IgM) V LIDSKÉM SÉRU METODOU ELISA
- kvalitativní detekce protilátek (Ab) IgM in vitro proti viru hepatitidy A, indikace akutní infekce od staré
- ELISA – enzymová imunoanalýza, princip dvojitého sendviče (firma Murex), detekce fotometricky
1.1 POSTUP PŘI PRÁCI
• 100x naředění vzorku (1 ml konjugátu + 10 μl vzorku)
• Pipetáž do stripu po 100 μl
NEG.
NEG.
POZ.
79910 - VZ
79910 - VZ
• Inkubace 60 minut při teplotě 37 °C
• Promytí jamek 5x na automatické promývačce
• Přidat po 100 μl konjugátu, 60 minut inkubace
• Přidat stejné množství substrátového roztoku, inkubace 30 minut => barevná změna na modrozelenou
• Zastavení reakce 1M kyselinou sírovou, proměření ve spektrofotometru
1.2 VÝSLEDKY
• řazeno dle pořadí ve stripu, poslední tři hodnoty bez vzorku
• naměřené absorbance:
JAMKY STRIP 1
A 0,092
B 0,104
C 1,340
D 0,087
E 0,102
F 0,036
G 0,033
H 0,030
1.3 VYHODNOCENÍ
• Výpočet hodnot absorbance negativních kontrol:
A = (0,092 + 0,104) : 2 = 0,098
• CUT OFF rovno součtu průměru absorbance neg. Kontrol a hodnoty 0,2:
X = 0,2 + 0,098 = 0,298
• hodnoty naměřené u pacienta: 0,087 ; 0,102;
• Naměřené hodnoty pacienta jsou srovnatelné s negativními kontrolami – VZOREK Č. 79910 BYL
NEGATIVNÍ• diagnostická senzitivita Murex anti – HAV (IgM) testu
se odhaduje na 98,8 % s intervalem spolehlivosti 96,4 – 99,68 %.
2. STANOVENÍ DNA CYTOMEGALOVIRU (CMV) in vitro V MOČI NEBO SÉRU
• Indikace onemocnění způsobeného napadením organizmu CMV (herpetické viry)
• Stanovení především u těhotných (poškození plodu)
• Metoda PCR – Polymere Chain Reaction – enzymatická syntéza sekvencí DNA za využití syntetických oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární s hledanou cílovou sekvencí na obou vláknech DNA
• Identifikace DNA gelovou elektroforézou
2.1 POSTUP PŘI PRÁCI
a) Separace soupravou Chemagen Biopolymer – Technologie CMV (Elisabeth Farmacon s. r. o.) extrakcí na magnetických partikulích
• Lýza buněk, denaturace nepotřebných bílkovin enzymem proteázou
• Navázání DNA na magnetické partikule, odstranění denaturovaných bílkovin a vazba DNA na eluční pufr (principem změna pH a tím i afinity) => uvolnění DNA
b) Vlastní PCR
• Aplikace specifického primeru v tzv. amplifikaci – dvoufázový cyklus teplot 94 °- 60 °- 72 °C v thermocykleru:
94 °C – denaturace (rozdvojení) vlákna DNA 60 °C – zmnožení sekvencí DNA aktivací primeru 72 °C – aktivace termostabilní DNA – polymerázy,
která doplní komplementární dvojice dvoušroubovice
c) Imunoelektroforéza
• Nalití agarózového gelu s malým množstvím barevného indikátoru (ethidiumbromid, viditelný pod UV – zářením, koncentrace 2,5 μl/50 ml), po zchladnutí vytvořit zářezy.
• Umístění markerů do zářezů, dále vzorky a pozitivní a negativní kontroly. Spustí se zdroj napětí => elektroendoosmóza, difúze vzorků.
• Po 45 minutách vyhodnocení.
2.2 VYHODNOCENÍ
Poloha vzorků na elektroforeogramu se ve všech případech blíží negativním kontrolám, všechny vzorky jsou
NEGATIVNÍ
C) MIKROBIOLOGIE
1. ANALÝZA VÝTĚRU Z KRKU
• Odběr při podezření na infekční onemocnění horních cest dýchacích – tonzilitidách a akutních zánětech hrtanu
• akutní tonzilitidy – rhinoviry, koronaviry, adenoviry, EB – viry, coxsackviry
• akutní záněty hltanu – Streptococcus pyogenes, Str. pneumoniae, Haemophillus influenzae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitis
1.1 MATERIÁL
• Výtěr z krku pacienta (6 – ti leté dítě, podezření na akutní tonzilitidu)
• Půdy: Krevní agar (KA) Endův agar (EA) NaCl – agar (NaCl) Miller – Hüntenova půda (MHA)
1.2 ZPRACOVÁNÍ
• Vyočkování tamponu se vzorkem na KA, EA a NaCl (křížová metoda)
• Inkubace 24 hodin při teplotě 37 °
• Analýza primokultury:=> šedobílé drobné kolonie, satelitní růst – podezření na
rod Haemophillus bělavé mukózní kolonie, β – hemolýza (neúplná) –
podezření na rod Staphylococcus Nažloutlé kolonie s hemolýzou α – podezření na rod
Streptococcus
• znovu pomnožit na KA s druhem Staphylococcus aureus, vložit disky se streptomycinem (S) a bacitracinem (BAC), inkubace 24 h při 37 °C
• Analýza pomnožené kultury: Stafylokok neurčeného druhu silná β – hemolýza ,
kolem BAC zóna inhibice Kolem zlatého stafylokoku růst velkého množství rodu
Haemophillus, malé, tužší bílé kolonie Streptokok α hemolýza, zóna inhibice kolem disku s S
1.3 VYHODNOCENÍ
a) Identifikace druhu Streptococcus
• testy na polysacharidovou substanci C pomocí latexové aglutinace
• pozitivní reakce nastala u typu A => druh Streptococcus pyogenes
b) Identifikace druhu Staphylococcus
• test na katalázu a latexová aglutinace k průkazu plazmakoagulázy
• test na katalázu silně pozitivní, plazmakoaguláza pozitivní => druh Staphylococcus aureus
c) Identifikace druhu Haemophillus
• Naočkování kolonie na MHA, vložit disky s faktory V, X a VX; inkubace 24 h při 37 °C
• Po inkubaci na agaru růst kolonií kolem faktoru VX a X => druh Haemophillus influenzae
Z testů plyne, že pacient je nakažen těmito mikroorganizmy: Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Haemophillus influenazae
Doporučuje se antibiotiková léčba.
2. ANALÝZA GYNEKOLOGICKÉHO POŠEVNÍHO VÝTĚRU
• nejčastěji výtěry z pochvy, cervix, plodová voda, sperma, gynekologické rány, stěry z glans penis, mateřské mléko apod.
• vyšetření při podezření na zánětlivá onemocnění pochvy, způsobená kvasinkami, gardnerelami, mykoplazmaty atd.
2.1 MATERIÁLY
• Gynekologický materiál – v tomto případě výtěr z pochvy
• Půdy: Krevní agar (KA) Krevní agar s amikacinem (KA – A) Krevní agar s vysokým procentem soli (NaCl) Endův agar (EA) Selektivní půda pro rod Gardnerella (GAR) Dvě půdy na mykoplazmata
2.2 ZPRACOVÁNÍ
• Nátěr, tzv. „MOP“, barvený dle Gramma a Giemsy
V obou preparátech pouze rod Lactobacillus – přirozená mikroflóra
- geometrické tvary, tzv. „döderleiny“
• Analýza kolonií na půdách:
KA – A: drobné bílé kolonie s rozsáhlou hemolýzou – rod Lactobacillus
EA: žádné kolonie (nepřítomnost enterokoků) NaCl: žádné kolonie (nepřítomnost Streptococcus
agalactiae) GAR: žádné kolonie Test na mykoplazmata: ani po 48 hodinách žádná
barevná změna - negativní
2.3 VYHODNOCENÍ
• VÝTĚR FYZIOLOGICKÝ, BEZ ZNÁMEK PATOGENITY.