Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis ...

Departamento de Inmunología, Inmunologia, Mikrobiologia

Microbiología y Parasitología eta Parasitologia Saila

Facultad de Farmacia Farmazi Fakultatea

Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis que intervienen en reacciones de

hipersensibilidad mediada por IgE en el hospedador definitivo y en el hombre

TESIS DOCTORAL

María García Ricobaraza

Vitoria-Gasteiz, 2010

Departamento de Inmunología, Inmunologia, Mikrobiologia

Microbiología y Parasitología eta Parasitologia Saila

Facultad de Farmacia Farmazi Fakultatea

TESIS DOCTORAL

Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis que intervienen en reacciones de

hipersensibilidad mediada por IgE en el hospedador definitivo y en el hombre

Memoria presentada por:

Dña. María García Ricobaraza

para optar al grado de Doctor

Vitoria-Gasteiz, 2010

La presente Tesis Doctoral ha sido financiada mediante un Proyecto

Universidad-Empresa de la U.P.V./E.H.U. con PHADIA Spain, S.L. Para

el desarrollo de este trabajo se disfrutó de un Beca para la Formación de

Investigadores, modalidad predoctoral (AE), del Departamento de

Educación, Universidades e Investigación del Gobierno Vasco.

Quisiera aprovechar esta oportunidad para agradecer a todas las

personas que me han ayudado a llegar hasta aquí y que de alguna manera u

otra han contribuido a la elaboración de esta Tesis Doctoral:

Al Dr. Ramón Cisterna Cáncer, por haberme permitido formar parte del

Departamento que dirige.

Al Dr. Jorge Guisantes del Barco, por la dirección de esta Tesis Doctoral y la

confianza que ha depositado en mí a lo largo de estos años y su dedicación en

la elaboración de esta Tesis Doctoral.

A la Dra. Idoia Postigo Resa, por la dirección de esta Tesis Doctoral, por su

paciencia para enseñarme y por su ayuda que siempre la he tenido cuando la

he necesitado.

Al Dr. Jorge Martínez Quesada, por su asesoramiento científico, dedicación y

por hacerme entender de una forma sencilla cosas que para mí resultaban

complicadas.

A la Dra. Ester Suñén Pardo por su ayuda y colaboración desinteresada.

A Mariángel Lozoya Nieto por su ayuda inestimable a lo largo de estos años

en todos los trámites administrativos.

Al Dr. Guillermo Alberto Cardona Valencia por su buen humor, la alegría de

todos los días y su amistad.

A Toño, por realizar este camino juntos, por sus valores, su amistad y sus

chistes malos.

A “Lost” del labo, Irati, Ilargi, Ceci, Andrea “Kate”, Raúl. Quisiera daros las

gracias de verdad porque seguro que sin vuestro apoyo en los altibajos,

ánimos y consejos no estaría aquí.

A Eva por ser mi constante, siempre, en los buenos momentos y en los no tan

buenos.

A Esther, por su amistad y su apoyo tan necesario estos últimos años.

A Neka, Pilo, Helen, May, Crisan y Charo por haberme dado su amistad

cuando más lo necesitaba.

A Bless, Lina y Barredo, porque siempre están conmigo a pesar de que

estemos lejos.

A Laura, Álvaro y Ami, por formar parte de mi vida.

A mamá, por su apoyo en todo, sus consejos que siempre me los ha dado

desde el amor incondicional y porque estoy segura de que esta Tesis es una

pequeña recompensa a su sufrimiento.

A papá, por quererme como soy, sus consejos con voz “fuerte” y por su amor

siempre desinteresado.

A Nacho, por haber llegado a mi vida en el momento perfecto.

A mi madre, María Soledad

A b r e v i a t u r a s

1

1D: electroforesis unidimensional ABA-1: grupo de proteínas alergénicas de nematodo de Ascaris suum Abs: absorbancia 2D: electroforesis bidimensional ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario APS: persulfato amónico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero ATP: adenosina-5´-trifosfato BSA: seroalbúmina bovina CHAPS: 3-[(3-colaminidopropil)-dimetilamonio-propanosulfato dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato DEPC: dietilpirocarbonato DO600: densidad óptica (600nm) DTT: ditiotreitol EDTA: ácido etilendiaminotetracético EIA: enzimoinmunoensayo (Enzyme Immuno Assay) ELISA: enzimoinmunoensayo en placa de poliestireno (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) E-SL2: extracto de los productos de excreción-secreción de las larvas infectantes L2 de T. canis IAA: iodoacetamida IEF: isoelectroenfoque Kb: kilobases kV: kilovoltios

A b r e v i a t u r a s

2

L2: segundo estadio larvario infectante de T. canis LMO: Síndrome de Larva Migrans Ocular LMV: Síndrome de Larva Migrans Visceral MALDI: matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight MS: espectrometría de masas pb: pares de bases PBS: tampón salino fosfato PBS-T: tampón PBS-Tween 20 PCR: Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro PVDF: fluoruro de ponivinilideno SDS: Dodecil Sulfato de Sodio SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil Sulfato de Sodio TBA-1: grupo de proteínas alergénicas de nematodo de Toxocara canis TBE: tampón Tris-Borato-EDTA TE: tampón Tris-EDTA Temed: tetrilmetilendiamina TGF-β: Transforming Growth Factor Beta Treg: células T reguladoras Vh: voltios-hora X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

ÍNDICE

ÍNDICE

4

Abreviaturas…..………………………………………………….……….1

Índice…………………………………………………………….……….3

Índice de figuras……………………………………………………………………….9

Índice de tablas………………………………………………………………..……...12

Introducción…………………………………………………………......14

Objetivos…………………………………………………………...…....36

Materiales y Métodos………………………………………………..…...39

1. Obtención del material parasitario…………………………………………………40

1.1. Sacrificio y necropsia de los perros……………………………………………….40

1.2. Obtención de los sueros caninos………………………………………………....41

1.3. Examen parasitológico del intestino delgado……………………………………..41

1.4. Obtención de larvas infectantes (L2) de Toxocara canis mediante cultivo in

Vitro………………………………………………………………………………….42

1.5. Obtención de los productos de excreción-secreción de las larvas L2 de Toxocara

canis…………………………………………………………………………………...44

2. Caracterización Bioquímica del E-SL2 de Toxocara canis……………………………47

2.1. Determinación del contenido proteico…………………………………………...47

2.2. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis unidimensional…...……....…..49

2.2.1. Preparación de los geles y electroforesis………………………………………..50

2.2.2. Visualización del perfil proteico del E-SL2 mediante tinción Azul de

Coomassie………………………………………………………………………...….51

2.3. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis bidimensional…………….….52

ÍNDICE

5

2.3.1. Primera dimensión: Isoelectroenfoque…………………………...…….……….53

2.3.1.1. Equilibrado………………………………………………………….………..53

2.3.2. Segunda dimensión…………………………………………………..…………54

2.3.3. Visualización del perfil proteico del E-SL2 mediante tinción Azul de

Coomassie………………………………………………………………….……........55

2.3.4. Visualización del perfil proteico mediante tinción con plata……………………55

3. Caracterización Inmunoquímica…………………………………………….….…..56

3.1 Selección de sueros……………………………………………………….………56

3.1.1. Sueros caninos…………………………………………………………………56

3.1.2. Sueros humanos………………………………………………………………..56

3.2. Electrotransferencia de proteínas del E-SL2 a membranas

inmovilizantes……………………………………………………………………..….57

3.3. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE………………………………….58

3.3.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE canina…...…………58

3.3.1.1. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis

unidimensional…………………………………………………………………….…58


bidimensional…………………………………………………………………...…….59

3.3.2. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE humana……….……61


unidimensional……………………………………………………………………….61


bidimensional………………………………………………………………………....62

ÍNDICE

6

3.4. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG………………………………….63

3.4.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG canina separadas

mediante electroforesis unidimensional………………………………………………63

3.4.2. Determinación de IgG específica humana frente al E-SL2 de Toxocara canis…….64

4. Evaluación de la reactividad cruzada entre Anisakis simplex y Toxocara

canis…………………………………………………………………….……………..65

4.1. Marcado del E-SL2 con biotina……………………………………………….….66

4.2. Fluoroenzimoinnmunoensayo (FEIA)..…………………………………………..67

5. Análisis de la huella peptídica mediante secuenciación……………………………..68

6. Obtención del gen que codifica para TES-32………………………………………69

6.1. Extraccción de ARN total………………………………………………………..69

6.1.1. Preparación de la muestra………………………………………………….…...70

6.1.2. Extracción………………………………………………………………...…....70

6.2. Extraccción de ARN mensajero…………………………………………….……71

6.3. Síntesis del ADN complementario (ADNc)……………………………...……….74

6.4. Amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa del fragmento de ADN

correspondiente al gen TES-32………………………………………………….……75

6.4.1. Electroforesis en gel de agarosa…………………………………………….…..76

6.4.2. Purificación del fragmento amplificado………………………………………....78

6.5. Clonación del gen TES-32 en el vector pCR2.1…………………………………..79

6.6. Identificación de colonias recombinantes…………………..……………….….....82

6.6.1. Análisis mediante PCR…………………………………………………………82

6.6.2. Análisis mediante enzimas de restricción……………………………………….83

ÍNDICE

7

6.7. Secuenciación…………………………………………………………………….84

6.8. Almacenamiento de los clones…………………………………………………....86

Resultados……………………………………………………………….87

1. Obtención de larvas infectantes (L2) de Toxocara canis mediante cultivo in vitro…......88

2. Caracterización bioquímica del E-SL2……………………………………………...90

2.1. Análisis del perfil proteico del E-SL2 mediante electroforesis unidimensional

(1D)…………………………………………………………………………………..90

2.2. Análisis del perfil proteico mediante electroforesis bidimensional (2D)…………..92

3. Caracterización Inmunoquímica…………………………………………………....94

3.1. Resultados obtenidos en sueros caninos………………………………………….94

3.1.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE…………….……….94

3.1.1.1. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis unidimensional

(1D-Inmunodetección)……………………………………………………….94

3.1.1.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional

(2D-Inmunodetección)……………………………………………………….96

3.1.2. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG………..………….100

3.1.2.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG separadas mediante

electroforesis unidimensional (1D-Inmunodetección)………………....……..100

3.2. Resultados obtenidos en sueros humanos…………………………………….....103

3.2.1. Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE…………………….…………103

3.2.1.1. Inmunodetección de proteínas del E-SL2 separadas mediante electroforesis

unidimensional (1D-Inmunodetección)………………………………...…....103

ÍNDICE

8

3.2.1.2. Inmunodetección de proteínas separadas mediante electroforesis bidimensional

(2D-Inmunodetección)………………………………………………....……104

3.2.2. Medida y evaluación de proteínas fijadoras de IgG……………………...……..108

3.2.2.1. Determinación de IgG específica humana frente al E-SL2 de Toxocara canis....108

4. Evaluación de la reactividad cruzada entre Anisakis simplex y Toxocara canis……..…110

5. Obtención del gen que codifica para TES-32…………………………………..…110

5.1. Extracción de ARN total y Síntesis de ADNc………………………………...…110

5.2. Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa del fragmento de

ADN correspondiente al gen TES-32…………………………………...…...111

5.3. Clonación en el vector pCR2.1………………………………………………….111

5.4. Identificación de colonias recombinantes……………………………………….112

5.4.1. Análisis mediante PCR………………………………………………………...112

5.4.2. Comprobación por análisis mediante enzimas de restricción……………….….113

5.5. Secuenciación…………………………………………………………………...115

Discusión………………………………………………………………123

Conclusiones……………………………………………………...……149

Bibliografía……………………………………………………………..152

Anexo 1: medios de cultivo y tampones……………………………………………..169

Í N D I C E D E F I G U R A S

9

Figura 1. Adultos Toxocara canis……………………………………………………....15

Figura 2. Cavidad oral de T. canis (izquierda) y morfología de las aletas cervicales

(derecha)……………………………………………………………………………...16

Figura 3. Huevo embrionado de T. canis……………………………………………..17

Figura 4. Larva L2 de T. canis………………………………………...……………...17

Figura 5. Anatomía de la larva infectante de T. canis…………………………………18

Figura 6. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador

definitivo………………………………………………………………….………….20

Figura 7. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador

aberrante…………………………………………………………………………......23

Figura 8. Proceso de recogida del E-SL2 y mantenimiento del

cultivo………………………………………………………………………...……...46

Figura 9. Proceso de eclosión de huevos de T. canis…………….……………………89

Figura 10. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis en gel de poliacrilamida al 12,5%. M:

marcador; E: extracto de los productos de excreción-secreción de larvas L2 de T.

canis…………………………………………………………………………………..90

Figura 11. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante 2D y teñido con azul de

Coomassie. M: marcador; pI: punto isoeléctrico.……………………………...……...92

Figura 12. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante 2D y teñido con tinción de

plata. M: marcador; pI: punto isoeléctrico…………………………………………… 92

Figura 13. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2 de

T.canis. M: marcador; Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis; Calles

21-25: sueros de perros sanos y libres de helmintos…………………………………..94


10

Figura 14. 2D-Inmunodetección de alérgenos del extracto E-SL2 de T.canis utilizando la

mezcla de los 20 sueros de perros con toxocarosis…………………………………..96

Figura 15. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al

alérgeno identificado como TES-32………………………………………………...98

Figura 16. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al

alérgeno identificado como TES-70.........................................................................99

Figura 17. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG del extracto E-SL2 de

T.canis. M: marcador; Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y

confirmados por necropsia; Calles 21-25: sueros de perros sanos libres de

helmintos…………………………………………………………………………....100


T.canis. M: marcador; Calles 1-11: sueros de pacientes con toxocarosis Calle 12: mezcla

de sueros negativos………………………………………………………………….103


T.canis……………..………………………………………………………...………104

Figura 20. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI de la lectina tipo C TES-

32………………………………………………………………………….………..106

Figura 21. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI de la lectina tipo C TES-

70..........................................................................................................................107

Figura 22. Visualización en gel de agarosa al 1% del fragmento amplificado. M:

marcador HyperLadder IV; Calle 1: ADN T. canis; Calle 2: control reacción; Calle 3:

control negativo……………………………………………………………………..111


11

Figura 23. Comprobación mediante PCR de la ligación del inserto al vector pCR 2.1 en

gel de agarosa al 1%. M1: marcador HyperLadder I; M2: marcador HyperLadder IV; Calle

1-8: ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas al azar; Calle 9: control de

reacción; Calle 10: control negativo…………………………………………………112

Figura 24. Comprobación de la inserción del gen TES-32 en el vector pCR 2.1

mediante digestión con enzima de restricción EcoR I en gel de agarosa al 0,8%. M1:

marcador HyperLadder I; M2: marcador HyperLadder IV; Calle 1-8:ADN plasmídico de 8

colonias recombinantes elegidas al azar..……….……………………………………114

Figura 25. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF041023.1……..116

Figura 26. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AB009305.2….….118

Figura 27. Árbol de distancias evolutivas de la secuencia TES-32 clonada en nuestro

laboratorio con las secuencias de la lectinas tipo C Tc-ctl-4 y la secuencia

Smp_scaff016249…………………………………………………………......…….120

Figura 28. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF126830.1……..121

Figura 29. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia

FN373540.1………………………………………………………………………....121

Í N D I C E D E T A B L A S

12

Tabla 1. Relación de proteínas antigénicas nativas y recombinantes utilizadas para el

diagnóstico de la toxocarosis humana………………………………………………...28

Tabla 2. Alérgenos de nematodos incluidos en la nomenclatura oficial de alérgenos....28

Tabla 3. Pesos moleculares de las proteínas fijadoras de IgE del extracto E-SL2. S1-

S20: sueros caninos parasitados sólo por T. canis……………………………………...95

Tabla 4. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos

MASCOT de los componentes 1 y 2……………………………………………...….97

Tabla 5. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32)………..…..98

Tabla 6. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)………...….99

Tabla 7. Masas moleculares del perfil antigénico de las proteínas fijadoras de IgG del

extracto E-SL2. S1-S20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados

por necropsia………………………………………………………………...…..….101


MASCOT de los dos grupos de alérgenos identificados…………………………..…105

Tabla 9.Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32)…………...106

Tabla 10. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)………….107

Tabla 11. Características demográficas y clínicas de la población con anticuerpos frente

al E-SL2 de T. canis……………………………...……………………………..…....108

Tabla 12. Valores de IgE específica obtenidos mediante FEIA con un pool de 11

sueros de pacientes diagnosticados de toxocariosis…………………………………..110

Tabla 13. Resultado de la búsqueda en la base de datos BLAST…………………….115

Tabla 14. Resultado del alineamiento de secuencias de diferentes helmintos que

presentaban alguna similitud con nuestra secuencia del TES-32………….………….119

Í N D I C E D E T A B L A S

13

Tabla 15. Subfamilias de lectinas alergénicas………………………………………..146

INTRODUCCIÓN

I N T R O D U C C I Ó N

15

Toxocara canis es un nematodo parásito de cánidos y félidos que puede

infectar a un amplio rango de mamíferos incluido el hombre (Glickman y

Schantz, 1981; Lewis y Maizels, 1993). Según la clasificación de Adamson

(1987) Toxocara canis es un helminto rhabditoide perteneciente a la familia de

los ascáridos. Dentro de la familia Ascarididae conforma un único género, el

género Toxocara.

Aunque han sido descritas once especies de Toxocara (Warren, 1970) sólo

dos, T. canis (Werner, 1782) y T. cati (Schrank, 1788) son reconocidas como

agentes causantes de

enfermedad en el hombre

(Nagakura y col., 1990). Los

adultos del género Toxocara

parasitan la parte superior del

tracto intestinal de sus

hospedadores definitivos. Son

relativamente grandes, de

color blanquecino y con una

cutícula que posee finas

estriaciones transversales

(Figura 1).

Figura 1. Adultos Toxocara canis

http://cal.vet.upenn.edu/projects/merialsp/nems_msp/nm_1sp.htm


16

Las hembras de T. canis tienen una longitud entre 6 a 18 cm y los machos

miden entre 4 y 10 cm. En la parte anterior destaca la cavidad oral formada

por tres labios (Figura 2) sin interlabios. Lateralmente se perciben dos aletas

cervicales que miden 2,5 x 0,2 mm con forma de punta de lanza, importante

para la identificación taxonómica y diferenciación con otras especies y

géneros. Poseen un ventrículo posterior en la base del esófago y carecen de

ciegos intestinales. El extremo posterior es romo en las hembras y digitiforme

en los machos, con dos espículas desarrolladas.

Figura 2. Cavidad oral de T. canis (izquierda) y morfología de las aletas cervicales (derecha)

http://www.asthrografic.com http://stopwormsdead.co.uk


17

Los huevos de T. canis (Figura 3) son

subesféricos, oscuros, de color marrón, de

superficie irregular y de un tamaño entre

75-90 µm. Se distingue una membrana

externa gruesa y rugosa y una membrana

interna lisa, no siempre visible. En el

interior, se aprecia que el embrión ocupa

casi la totalidad del espacio interno. Estos

huevos son eliminados junto con las heces del hospedador definitivo al medio

externo, donde embrionan y pueden permanecer viables hasta más de un año

(Glickman y Shantz, 1981).

Al igual que otros nematodos, T.

canis atraviesa diferentes estadios de

desarrollo desde huevo hasta adulto,

pasando por 4 estadios larvarios (L1,

L2, L3, L4). La fase infectante de este

nematodo es el segundo estadio larvario

o L2 (Figura 4) que permanece dentro del huevo, después de la primera muda,

hasta su ingestión por un futuro hospedador. La eclosión de la L2 se produce

Figura 3. Huevo embrionado de T. canis

http://helios.bto.ed.ac.uk

Figura 4. Larva L2 de T. canis

http://helios.bto.ed.ac.uk


18

en el estómago del hospedador definitivo debido a la acción química de los

jugos gástricos.

Las larvas L2, ya eclosionadas, miden 400 µm de largo por 20 µm de

ancho. Desde el punto de vista morfológico, es de destacar su sistema

secretor. Se trata de un sistema compuesto por dos columnas laterales que

convergen y se abren en la superficie anterior de la larva, a través de un único

conducto de secreción (Figura 5). En la región anterior de la larva, el esófago

está bien definido y está adherido a una larga glándula esofágica dorsal. En la

zona posterior, el vestigio del tracto intestinal es no funcional y está cerrado.

Figura 5. Anatomía de la larva infectante de T. canis

Page y col. (1992)


19

En el interior del conducto de secreción existen unos canalículos

centrales que se desarrollan a las 24 horas de la eclosión, al tiempo en que el

antígeno excretor-secretor del segundo estadio larvario (E-SL2) se expresa por

primera vez (Maizels y col., 1987; Kennedy y col., 1987).

Estudios de inmunofluorescencia realizados con anticuerpos anti-T. canis

(Hogarth-Scott, 1966) han confirmado que las zonas de mayor expresión de

este antígeno son las columnas celulares de secreción así como el orificio

bucal y el poro secretor.

El ciclo biológico de este parásito en el hospedador definitivo (Figura 6),

se inicia cuando las hembras fecundadas de T. canis depositan huevos sin

segmentar en el intestino delgado del perro y éstos son eliminados con las

heces al medio externo. Bajo condiciones óptimas de humedad, temperatura y

tensión de oxígeno, los huevos embrionan llegando en 2-5 semanas al estadio

de larva infectante (L2) pudiendo permanecer viables hasta ser ingeridos por

un futuro hospedador (Glickman y Shantz, 1981).

Una vez ingeridos los huevos embrionados pasan al estómago, donde la

cubierta externa se rompe debido a la acción de los ácidos gástricos. Las larvas

infectantes eclosionan penetrando en la mucosa intestinal y pasan a la

circulación sanguínea para iniciar una larga migración intraorgánica. A las 24-

48 horas llegan al hígado por vía portal, continúan hacia los pulmones


20

pasando por las venas hepática y cava posterior hasta llegar a la cavidad

derecha del corazón y la arteria pulmonar. Durante esta migración, algunas

larvas quedan retenidas en los tejidos a causa de reacciones inflamatorias

tisulares.

Figura 6. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador definitivo

http://www.balgownievet.com

Tras llegar a los pulmones, pueden seguir dos rutas de migración en

función de la edad del perro parasitado. En cachorros menores de seis

semanas se produce una migración traqueodigestiva. Las L2 atraviesan los

alvéolos y ascienden por el árbol bronquial para ser deglutidas con las


21

secreciones traqueobronquiales y así llegan al aparato digestivo. El desarrollo

de las larvas continúa en el estómago y finaliza en el intestino, realizando una

nueva muda y alcanzando el estado adulto a las 3-5 semanas.

En perros de más de seis semanas es más frecuente una migración

somática. En este caso, las L2 no pasan a la luz alveolar sino que a través del

torrente sanguíneo son distribuidas por el organismo invadiendo diferentes

órganos como pulmones, hígado, riñones, útero, glándulas mamarias, etc. En

este punto las larvas pueden quedar retenidas en los tejidos durante meses e

incluso años sin ningún desarrollo. Este fenómeno es conocido como

hipobiosis (Sprent, 1952).

Estas larvas en estado hipobiótico se pueden reactivar en el tercer

trimestre de embarazo. Pueden migrar hacia la placenta produciéndose la

infección transplacental de los cachorros gestantes y también hacia las

glándulas mamarias pasando al calostro dando lugar a una infección postnatal

(Burke y Robertson, 1985). Esto supone que las hembras son el principal

reservorio de infección de T. canis al reactivarse las larvas con cada nueva

camada, por eso, la mayoría de los perros recién nacidos están parasitados por

T. canis (Maizels y Loukas, 2001).

La capacidad de supervivencia de las larvas L2 de T. canis se pone de

manifiesto al existir casos en los que se han encontrado larvas latentes en


22

tejidos del hospedador definitivo hasta nueve años después de una infección

(Beaver, 1962; Beaver, 1966).

En cultivos in vitro, las larvas L2 se mantienen viables durante un máximo

de 18 meses (de Savigny, 1975). Si bien en este periodo no hay desarrollo

morfológico, sí hay una elevada actividad física y metabólica que depende de

un aporte regular de glucosa y aminoácidos (Maizels y Loukas, 2001).

T. canis sólo alcanza el estadio adulto en el hospedador definitivo, pero

existe un amplio rango de mamíferos, incluido el hombre, susceptibles de ser

infectados por la ingestión de huevos embrionados.

En el hombre (Figura 7) el ciclo comienza con la ingestión accidental de

huevos que se pueden encontrar en el suelo de los parques públicos, en

vegetales contaminados por heces de perro, o puede adquirirse por la

ingestión de carne mal cocinada de hospedadores paraténicos como pollo

(Nagakura y col., 1990), conejo (Stürchler y col., 1990), hígado de pato

(Hoffmeister y col., 2007) y cordero (Salem y Schantz, 1992). Como

consecuencia, se produce la migración somática que da lugar al desarrollo del

Síndrome de Larva Migrans (Magnaval y col., 2001).


23

Figura 7. Esquema del ciclo biológico de T. canis en el hospedador aberrante

Tradicionalmente se describen dos formas de toxocarosis dependiendo

de la localización de las larvas en los tejidos del hospedador aberrante que se

denominan Síndrome de Larva Migrans Ocular (LMO) y Síndrome de Larva

Migrans Visceral (LMV).

Síndrome de Larva Migrans Ocular (LMO) (Wilder, 1950).

Los pacientes suelen ser niños y adultos jóvenes que presentan una

pérdida de visión, acompañada a veces por estrabismo cuya duración puede

ser de días o semanas. En el examen del fondo ocular se pueden observar:

endoftalmitis granulomatosa, uveítis y granulomas retinianos, papilitis o masas

2. Ingestión accidental de huevos e inicio de la infección.

3. Los huevos eclosionan en el intestino delgado y penetran en la pared intestinal.

4. Las larvas migran a todos los órganos por el torrente sanguíneo.

PATOLOGÍA

1. Diseminación de huevos de T. canis por el hospedador definitivo.


24

inflamatorias en el vítreo periférico. La consecuencia más grave de la infección

es la invasión de la retina que puede derivar en ceguera.

La infección ocular puede ser también subclínica y solamente detectada

en un control rutinario de los ojos. En estos pacientes no se suele encontrar

eosinofilia.

Síndrome de Larva Migrans Visceral (LMV) (Beaver y col., 1952)

Los pacientes suelen ser niños de entre 2 y 7 años con un historial de

geofagia y contacto estrecho con mascotas. Los síntomas asociados a la

migración hepática y pulmonar de las larvas son: dolor abdominal, pérdida de

apetito, fiebre, tos, asma y hepatomegalia con una marcada eosinofilia,

leucocitosis e hipergammaglobulinemia. La localización e intensidad de los

síntomas depende de la cantidad de larvas, el establecimiento de las mismas y

de la respuesta inmunitaria del hospedador. Los casos de LMV con

condiciones clínicas severas son poco comunes y las posibles consecuencias

de una prolongada eosinofilia son la fibrosis pulmonar (Phan y Kunkel, 1992)

y la miocarditis eosinofílica (Abe y col., 2002).

En las últimas dos décadas se han descrito otras formas clínicas de

toxocarosis que se citan a continuación:


25

Toxocarosis común (Glickman y col., 1987)

Se presenta con astenia crónica asociada con desórdenes digestivos y

manifestaciones alérgicas (hipereosinofilia moderada e incremento de la IgE

total). Algunas veces estos síntomas pueden estar acompañados de

manifestaciones dérmicas como prurito, eczema y urticaria.

Toxocarosis subclínica o encubierta (Taylor y col., 1988)

En este caso las manifestaciones clínicas son poco específicas y de poca

gravedad como: fiebre, anorexia, tos, dolor abdominal, dolor de cabeza,

insomnio, vómitos, letargia, trastornos del sueño y del comportamiento,

faringitis, neumonía, linfadenitis cervical y hepatomegalia. No suele haber

eosinofilia marcada pero sí un elevado título de anticuerpos anti-Toxocara. Es

la forma más frecuente de toxocarosis humana aunque en la mayoría de los

casos suele quedar sin diagnosticar (Magnaval y col., 2001).

Toxocarosis neurológica (Beautyman y Woolf, 1951)

Puede afectar tanto al Sistema Nervioso Central (SNC) como al Sistema

Nervioso Periférico (SNP). Entre las manifestaciones neurológicas en el SNC

se encuentran la meningitis, encefalitis y mielitis eosinofílicas, vasculitis

cerebral, neuritis óptica y epilepsia. Sólo hay 50 casos en los que se ha

relacionado la toxocarosis con el SNC y se ha visto que no discrimina ni por

edad ni por sexo.


26

En cuanto al SNP, las manifestaciones son raras y comprende

radiculitis, afección de los nervios craneales y afección del músculo esquelético

(Finsterer y Auer, 2007).

ANTÍGENOS DE TOXOCARA CANIS

La mayoría de las investigaciones sobre la biología molecular de T. canis

se ha centrado en las proteínas excretoras-secretoras del estadio infectante L2

de este parásito (Despommier, 2003). Estas proteínas han demostrado ser de

gran utilidad en el diagnóstico inmunológico de los Síndromes de LMV y

LMO (Despommier, 2003). En relación con su función, se cree que estas

proteínas están implicadas en la evasión de la respuesta inmunitaria del

hospedador por parte del parásito (Despommier, 2003) idea que se refuerza al

tener en cuenta que este grupo de proteínas de excreción-secreción está

constituido en su mayor parte por una familia de al menos 6 mucinas con un

elevado poder antigénico (Doedens y col., 2001). Las larvas L2 alteran

periódicamente estas mucinas (Badley y col., 1987) que recubren la superficie

larvaria (Page y col., 1992) con la intención de desviar la acción de la respuesta

inmunológica del hospedador (Maizels y Holland, 1998).

Otro grupo de proteínas descritas en el conjunto de los productos de

excreción-secreción son las lectinas tipo C (Maizels y Loukas, 2001). Se trata

de una familia de proteínas que unen carbohidratos, desde simples


27

monosacáridos hasta complejos glicoconjugados, de una manera dependiente

de Ca2+ (Weis y col., 1998). En general, las lectinas están implicadas en la

activación del sistema inmunológico tanto en vertebrados como en

invertebrados, lo que sugiere que estas proteínas pueden intervenir en la

relación parásito-hospedador, sobre todo en la evasión del sistema

inmunológico (Loukas y Maizels, 2000).

De todos los antígenos identificados e individualizados de Toxocara

(Tabla 1) sólo el grupo de poliproteínas TBA-1 (Yahiro y col., 1998; Kennedy,

2000) ha sido asociado al término alérgeno por su similitud estructural con el

grupo ABA-1 descrito en Ascaris spp. (Xia y col., 2000). Se trata de un grupo

de polipéptidos capaces de unir lípidos. En el momento inicial de su síntesis

son secretados en forma de grandes polímeros y a medida que son excretados,

son digeridos en pequeños polipéptidos con un peso aproximado de 15 kDa

(Despommier, 2003). Estas pequeñas subunidades son las que parecen inducir

la respuesta alérgica en un amplio número de hospedadores (Despommier,

2003).

Sin embargo, aunque TBA-1 es estructuralmente similar a ABA-1,

actualmente se desconoce su relevancia tanto diagnóstica como clínica en los

procesos de hipersensibilidad mediada por IgE (Yahiro y col., 1998).


28

Tabla 1. Relación de antígenos nativos y recombinantes de Toxocara canis Antígenos Nativos Maizels y col., (1984)

Antígenos Recombinantes Maizels y Loukas, (2001); Yahiro y col.,

(1998) Excreción-Secreción

Superficie Larvaria

MM (kDa) MM (kDa) MM (kDa) Características 26 Proteína de unión a

fosfatidiletanolamina 32 32 32 Lectina tipo C

(dependiente de calcio) 45 Lectina (no confirmado) 55 Componentes

intermedios 55 Lectina

70 70 Lectina tipo C 120 120 120 Mucina 400 400 Análogo de proteoglicanos 15 Poliproteína TBA-1

Por otra parte tan sólo diez antígenos de nematodos forman parte de la

lista oficial de alérgenos (www.allergen.org); de los cuales no hay ninguno que

se asocie al género Toxocara como fuente alergénica (Tabla 2).

Tabla 2. Alérgenos de nematodos incluidos en la nomenclatura oficial de alérgenos Anisakis simplex Ani s 1 24 kDa Ani s 2 Paramiosina 97 kDa Ani s 3 Tropomiosina 41 kDa Ani s 4 Cisteína inhibidora de proteasa 9 kDa Ani s 5 Familia de proteínas SXP/RAL-2 15 kDa Ani s 6 Serina inhibidora de proteasa Ani s 7 139 kDa Ani s 8 Familia de proteínas SXP/RAL-2 Ani s 9 Familia de proteínas SXP/RAL-2 Ascaris suum Asc s 1 10 kDa


29

Por tanto, desde el punto de vista alergológico en el momento actual no

existen datos que permitan definir alérgenos relevantes que posibiliten abordar

reacciones de hipersensibilidad asociada a la presencia de Toxocara.

HIPERSENSIBILIDAD Y HELMINTOS

La hipersensibilidad mediada por IgE es conocida también como

hipersensibilidad tipo I, hipersensibilidad inmediata o alergia (Meeusen, 1999).

La alergia ocurre normalmente en individuos atópicos que presentan una

predisposición genética a padecer enfermedades alérgicas como asma, rinitis

alérgica y dermatitis atópica (Petrov y Fireman, 2006). Estos individuos

presentan niveles elevados de inmunoglobulina E junto con una reactividad

aumentada en las pruebas cutáneas con extractos alergénicos (Petrov y

Fireman, 2006).

Como consecuencia de la interacción de los alérgenos con el sistema

inmunológico, las células T estimulan la producción de citoquinas IL4, IL5,

IL9 e IL13. Estas citoquinas interactúan con sus receptores para estimular la

producción de IgE y aumentar el número de eosinófilos, mastocitos y

basófilos, desencadenando una reacción inflamatoria de tipo alérgico en el

tejido afectado (Meeusen, 1999).


30

Esta fuerte respuesta inmunológica tipo Th2 es también característica en

las infecciones producidas por helmintos parásitos (Erb, 2007), siendo el sello

distintivo de estas infecciones la gran cantidad de IgE detectada en suero

(Erb, 2007).

En las dos últimas décadas, las cifras de prevalencia de la atopia se han

incrementado muy significativamente, siendo los países industrializados los

que parecen sufrir de manera especial dicho incremento (Romagnani, 2004)

que, por otra parte, no se ha observado de forma evidente en los países en

vías de desarrollo (Ndiaye y Bousquet, 2004). Para explicar este hecho, se ha

desarrollado la “Teoría de la Higiene” (Strachan, 1996) cuya hipótesis sugiere

que la mejora de la higiene, el aumento de las vacunas y el uso de antibióticos

durante la primera infancia, altera el sistema inmunológico de tal manera que

responde inadecuadamente a los alérgenos ambientales. Es decir, hay un

desequilibrio entre la respuesta inmunológica Th1, desencadenada típicamente

frente al ataque de bacterias y virus, y la respuesta Th2 implicada en las

infecciones helmínticas y la alergia (Elston, 2006).

Este hecho ha llevado a los investigadores a interesarse cada vez más en

el posible papel modulador que ejercen las parasitosis sobre la expresión

clínica de alergia en todas sus formas: asma, rinitis, conjuntivitis, etc. (von

Mutius y col., 2006).


31

Para explicar cómo los helmintos pueden alterar las reacciones alérgicas,

se han postulado en los últimos años dos teorías principales: 1) la “Hipótesis

del bloqueo de IgE” y 2) la “Teoría de las células reguladoras (Treg)”. La

primera propone que la IgE no específica inducida por el parásito puede

proteger al hospedador de la reacción alérgica, al ocupar los lugares de unión

de IgE en mastocitos y basófilos, inhibiendo de esta manera la unión a estas

células de la IgE específica inducida por los alérgenos (Erb, 2007).

En el segundo caso, “Teoría de las células reguladoras”, se propone que

estas células pueden actuar como mediadores principales en la interacción

inmunológica entre la infección y la alergia (Maizels, 2005).

En apoyo a la primera teoría está el hecho de que los efectos protectores

de las infecciones helmínticas sobre las reacciones alérgicas se han asociado

con altos niveles séricos de IgE policlonal (Lynch y col., 1987; Lynch y col.,

1993). La inducción de la producción de IgE policlonal por el helminto podría

proteger al parásito de los mecanismos de defensa del hospedador, inhibiendo

la unión a los mastocitos o basófilos de la IgE específica producida contra el

parásito (Erb, 2007). Esto también explicaría, por qué los helmintos inducen

una producción masiva de IgE no específica en primer lugar y por qué los

humanos infectados con helmintos rara vez desarrollan reacciones

anafilácticas en comparación con los individuos atópicos (Erb, 2007).


32

Sin embargo, los estudios realizados por Mitre y col. (2005) en

poblaciones con altos índices de parasitosis indican que en las infecciones por

helmintos y en particular las infecciones por filarias, la relación entre la IgE

policlonal inducida por el parásito y la IgE específica producida frente a

alérgenos no alcanza los niveles necesarios para inhibir la unión de la IgE

específica al receptor de alta afinidad FcεRI y suprimir la degranulación de

mastocitos y basófilos inducida por los alérgenos. De la misma forma, Cooper

y col. (2008) afirman que no existe una evidencia consistente que indique que

la IgE sea el mecanismo efector primario en la protección inmunológica frente

a la infección por helmintos, aunque podría estar involucrada de alguna

manera.

Aunque las respuestas Th2 son las predominantes durante una infección

por helmintos, éstos también inducen fuertes respuestas reguladoras, una de

las más importantes es la inducción de células T Foxp3+ CD4+ ó también

denominadas células T reguladoras (Treg) (Wilson y col., 2005).

Esta teoría, últimamente la más aceptada, sugiere que la IL-10 y/o el

TGF-β que secretan las células presentadoras de antígeno o las células Treg en

respuesta a las infecciones crónicas por helmintos, interfieren directamente

con los mecanismos efectores de la alergia mediante la inhibición de la


33

degranulación de los mastocitos o inhibiendo la proliferación de células Th2

(Yazdanbakhsh y col., 2002; Maizels, 2005).

Dentro de las relaciones parásito-hospedador los helmintos han

desarrollado a lo largo de su co-evolución con el hospedador, métodos

moleculares muy sofisticados de evasión del sistema inmunológico (Maizels y

col., 2005). En concreto, las larvas infectantes L2 de T. canis son capaces de

excretar-secretar una serie de macromoléculas que parecen ser los candidatos

perfectos como mediadores de la evasión del sistema inmunitario (Maizels y

Loukas, 2001). Entre los antígenos excretados-secretados por T. canis, la

proteína TES-32, expresada en la epicutícula de la larva infectante es la más

abundante (Page y col., 1992). Esta proteína comparte secuencia y similitud

con la estructura de las lectinas tipo C dependientes de calcio de los

mamíferos, por lo que también se denomina CTL-1 (Loukas y col., 1999).

El dominio C-terminal de TES-32 es semejante a las lectinas relacionadas

con el sistema inmunitario del hospedador, como el receptor de unión de

manosa al macrófago, la E-selectina y la proteína A de unión a macrófagos

(Loukas y col., 1999). Aunque se ha especulado con el papel

inmunomodulador de estas lectinas, su probable interacción con el sistema

inmunitario del hospedador es hipotética (Loukas y Maizels, 2000).


34

Actualmente se sabe que muchas proteínas alergénicas tienen homólogos

en los parásitos metazoos, y parece ser que lo que hace que algunas proteínas

sean alérgenos reside en la larga co-evolución entre estos parásitos y los

hospedadores vertebrados (Fitzsimmons y Dunne, 2009).

Los alérgenos se han definido como antígenos no parasitarios capaces de

estimular reacciones de hipersensibilidad tipo I en individuos atópicos

(Fitzsimmons y Dunne, 2009), pero existe un número muy limitado de

moléculas que sean capaces de convertirse en antígenos fijadores de IgE.

Según Fitzsimmons y Dunne (2009), el término "inmunógenos parasitarios de

metazoos" definiría los antígenos IgE de parásitos metazoos que son capaces

de producir respuestas de hipersensibilidad tipo I. La identificación de estas

proteínas y su comparación con las familias de alérgenos existentes,

proporcionaría información adicional sobre la estructura de los epitopos que

actúan de diana para la IgE, así quizá podríamos entender por qué ciertas

proteínas vegetales son alérgenos (Fitzsimmons y Dunne, 2009).

A la vista de todos estos datos, podemos afirmar que la naturaleza de las

proteínas y su pertenencia a una determinada familia de proteínas

(http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/) es una de las claves para el

estudio de la respuesta mediada por IgE. Sólo determinadas familias de

proteínas parece que pueden estimular la respuesta IgE frente a parásitos y


35

desencadenar la respuesta alérgica mediada por IgE. En este sentido, el

modelo de infección por Toxocara nos podría permitir estudiar qué proteínas

estarían asociadas a ambos fenómenos. El estudio de las respuestas mediadas

por IgE en hospedadores definitivos e intermediarios nos permitirían conocer

la naturaleza de las proteínas implicadas en el fenómeno alérgico y su posible

relación con otros alérgenos procedentes de fuentes no helmínticas.

Dada la escasez de datos que existen sobre la respuesta IgE frente a la

parasitación por Toxocara y los alérgenos que la inducen, en este trabajo se

propuso investigar los posibles alérgenos de T. canis, enfocando el estudio en

los productos de excreción-secreción larvarios.

Por otra parte y dado que los productos de excreción de las larvas de

tipo 2 intervienen de forma decisiva en las relaciones parasitarias tanto del

hospedador definitivo (perro) como del hospedador intermediario (hombre),

se planteó estudiar las respuestas mediadas por IgE y por IgG en ambos

hospedadores para evaluar qué antígenos/alérgenos pudieran intervenir en el

desarrollo de las mismas.

OBJETIVOS

O B J E T I V O S

37

La mayoría de las investigaciones sobre biología molecular de T. canis se

han centrado en las proteínas excretoras-secretoras del estadio infectante L2

(E-SL2) de este parásito (Despommier, 2003). Desde el punto de vista

inmunológico, no existen datos que nos permitan definir antígenos relevantes

de Toxocara canis asociados a reacciones de hipersensibilidad mediada por IgE.

Aunque el grupo de poliproteínas alergénicas de nematodo (NPA) de Toxocara

canis (TBA-1) está asociado al término alérgeno -dada su similitud al grupo

ABA-1 de Ascaris- no se ha demostrado que induzca una respuesta

inmunológica mediada por IgE (Yahiro y col., 1998).

Asimismo, se conoce que entre las proteínas E-SL2 de T. canis, la

proteína TES-32 es la más abundantemente secretada y la más estudiada tanto

a nivel molecular como bioquímico, pero hasta el momento no se ha

determinado su capacidad como proteína fijadora de IgE. Lo mismo sucede

con otras proteínas de E-S de Toxocara canis.

Por los antecedentes expuestos anteriormente y partiendo de la hipótesis

de que las proteínas E-SL2 de T. canis pudieran ser proteínas alergénicas, será

objetivo de este estudio identificar las proteínas E-SL2 fijadoras de IgE en el

hospedador intermediario y en el hospedador definitivo. Para ello se estudiará

una población de perros naturalmente infectada por T. canis así como una

población humana infectada y sensibilizada a dicho parásito. Esto nos

O B J E T I V O S

38

permitirá identificar los alérgenos relevantes en dichos productos de

excreción-secreción larvarios.

Este objetivo general se abordará planteando los siguientes objetivos

parciales:

1. Obtener las proteínas E-SL2 a partir del cultivo de larvas de Toxocara

canis.

2. Realizar la caracterización bioquímica de las proteínas E-SL2 de

Toxocara canis.

3. Realizar la caracterización inmunoquímica e identificación de las

proteínas E-SL2 de T. canis que estimulan la producción de anticuerpos

IgG/IgE en una población de perros naturalmente infectados por T. canis.

4. Realizar la caracterización inmunoquímica e identificación de

proteínas E-SL2 de T. canis que estimulan la producción de anticuerpos IgE en

una población de pacientes diagnosticados de toxocarosis.

5. Obtener genes que codifican para las proteínas de E-SL2 de Toxocara

canis y que inducen la producción de IgE.

MATERIALES Y MÉTODOS

M A T E R I A L E S Y M É T O D O S

40

1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL PARASITARIO

Los ejemplares adultos de Toxocara canis se obtuvieron a partir del análisis

del contenido intestinal de 430 perros procedentes del Centro de Protección

Animal de Armentia (Vitoria) y del Centro de Acogida de Animales de

Logroño (La Rioja), sacrificados de acuerdo con la normativa legal.

1.1. SACRIFICIO Y NECROPSIA DE LOS PERROS

A cada animal se le administró inicialmente como preanestésico, maleato

de acepromazina (Calmo Neosan, SmithKline Beecham) por vía

intramuscular, a la dosis recomendada de 0,5 ml/10 kg de peso.

A continuación, se tomó una muestra de sangre a partir de la vena

cefálica y por la misma se administró tiopental sódico (Pentothal Sódico.

Laboratorios Abbott), a una dosis de 4 mg/kg de peso, para anestesiar

completamente al animal. Por último, se administró por vía intramuscular

cloruro de suxametonio (Anectine Wellcome) como agente letal, a una dosis

de 50 mg/ml.

La extracción del intestino delgado se realizó tras una incisión abdominal

media, ligadura del extremo superior del intestino a nivel del píloro y ligadura

del extremo inferior a nivel de la unión íleo-cecal. Cada intestino fue

almacenado y correctamente etiquetado para su posterior estudio en el

laboratorio.


41

1.2. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS CANINOS

Las muestras de sangre obtenidas de cada animal fueron centrifugadas en

el laboratorio durante 20 minutos a 5.000 r.p.m. para la obtención del suero.

Estos sueros fueron correctamente identificados y almacenados a -40°C para

su uso posterior.

1.3. EXAMEN PARASITOLÓGICO DEL INTESTINO DELGADO

El examen parasitológico se llevó a cabo mediante el análisis

macroscópico del contenido intestinal, de acuerdo a los procedimientos

recomendados (Eckert y col., 1981).

Se realizó la disección longitudinal del intestino y se procedió a la

recogida de los adultos encontrados de Toxocara canis y otros helmintos

enteroparásitos que se mantuvieron en PBS con una mezcla de antibióticos al

1% (PBS+antibióticos 1%), constituidos por 10.000 unidades de penicilina, 10

mg de estreptomicina, 25 µg de anfotericina B/ml (Sigma). La limpieza e

identificación de los helmintos enteroparásitos se llevó a cabo bajo lupa con

ayuda de agujas enmangadas, eliminando cualquier resto de microvellosidad

intestinal que pudiera haber quedado adherida al parásito.

Tras el examen parasitológico, los diferentes helmintos hallados en cada


42

animal fueron identificados para su uso posterior. Al mismo tiempo, se realizó

una base de datos en la que se incluyeron los datos de parasitación junto con

la identificación del suero procedente de cada animal.

1.4. OBTENCIÓN DE LARVAS INFECTANTES (L2) DE

TOXOCARA CANIS MEDIANTE CULTIVO IN VITRO

DESOVE IN VITRO DE HEMBRAS DE TOXOCARA CANIS E INDUCCIÓN DE LA ECLOSIÓN

DE LAS LARVAS

Los parásitos adultos, aislados a partir del intestino delgado de los perros

e identificados como T. canis, fueron lavados exhaustivamente en

PBS+antibióticos 1%. Cada hembra se depositó en un frasco de cultivo

celular conteniendo 5 ml de PBS más la mezcla de antibióticos al 1%. Cada

frasco se incubó en cámara de cultivo celular durante 24 horas, a una

temperatura de 37°C, con una atmósfera del 5% de CO2 y en oscuridad.

Durante este periodo de incubación se produjo el desove de las hembras

y se examinó la fertilidad de los huevos mediante observación microscópica.

A continuación las hembras se retiraron de cada frasco de cultivo y se

congelaron en una solución que contenía PBS, PMSF y EDTA a -40°C.

Posteriormente se añadió a cada frasco de cultivo donde desovaron las

hembras 5 ml de hipoclorito sódico (lejía comercial) al 6,6% en agua estéril

(medio de mantenimiento) y se incubaron entre 28 y 30 días a 27°C, con luz


43

permanente y con una humedad relativa del 80% en un incubador Sanyo

Incubator MIR-153.

Medio de Mantenimiento

PBS+antibióticos 1%

Hipoclorito sódico 6,6%

El desarrollo de los embriones hasta el estadio de larva infectante L2, fue

monitorizado diariamente mediante la observación bajo microscopio óptico

invertido.

Todo el procedimiento se llevó a cabo en campana de flujo laminar

vertical y en condiciones de esterilidad.

Los cultivos se dejaron reposar en el interior de la campana de flujo

laminar durante una hora para precipitar los huevos. Se retiraron 7 ml por

frasco del medio de mantenimiento y se añadieron 10 ml del medio de

eclosión.

Medio de Eclosión

Solución Hipoclorito Sódico (lejía comercial)/NaOH 2%

Medio de Cultivo

Medio RPMI 1640 (Sigma)

Solución antibiótica-antimicótica 100X: 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de

estreptomicina, 100 µg/ml de anfotericina B (Sigma)

Glucosa 10X (Panreac)

Nistatina 100X (Sigma)


44

Posteriormente, se incubaron durante 30 minutos a temperatura

ambiente con agitación esporádica, y continua observación al microscopio

para detectar la degradación de las cubiertas proteica y lipídica del huevo. Una

vez eliminadas las cubiertas, los cultivos se centrifugaron a 2.500 r.p.m

durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar la eclosión de las

larvas. A continuación, se retiró el sobrenadante y se añadieron 20 ml de

medio RPMI precalentado a 37°C y antibióticos al 1% para realizar un primer

lavado. Esta operación de centrifugado y lavado se repitió 3 veces más, hasta

conseguir la completa limpieza y eclosión de la mayoría de las larvas. Retirado

el sobrenadante del último centrifugado, se recogió el precipitado y se

depositó en un nuevo frasco de cultivo celular conteniendo 10 ml de medio

de cultivo fresco y precalentado a 37°C. Se incubó durante toda la noche a

37°C y en agitación (200 r.p.m.) para asegurar que todas las larvas quedaran

libres en el medio.

1.5. OBTENCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE EXCRECIÓN–

SECRECIÓN DE LAS LARVAS L2 DE TOXOCARA CANIS

El extracto de los productos de excreción-secreción de las larvas L2 (E-

SL2) de Toxocara canis fue obtenido siguiendo el método previamente descrito

por de Savigny (1975), en el medio de cultivo antes detallado.


45

Todo el procedimiento se llevó a cabo en campana de flujo laminar

vertical y en condiciones de esterilidad.

Los cultivos larvarios se dejaron reposar en el interior de la campana, en

posición vertical durante 1 hora para que las larvas se depositaran en el fondo

del frasco de cultivo celular.

Cada tres días se recogieron 7 ml de medio de cada tubo de cultivo, que

contenía los productos de excreción-secreción de las larvas L2. El volumen

recogido se depositó en un tubo estéril de 50 ml para su posterior

procesamiento.

El volumen de medio de cultivo recogido se repuso añadiendo 10 ml de

medio RPMI precalentado a 37°C, filtrado a través de un filtro de 0,22 µm

diámetro de poro. Posteriormente, se añadieron 100 µl de la mezcla de

antibióticos, 240 µl de nistatina y 1 ml de glucosa por cada 10 ml de medio de

cultivo. Todo el proceso de recogida y reposición del medio de cultivo se

muestra en la Figura 8.


46

Figura 8. Proceso de recogida del E-SL2 y mantenimiento del cultivo

a) Reposo de los cultivos

b) Recogida del medio conteniendo los

E-SL2

c) Reposición del medio de cultivo

d) Adición de antibióticos, nistatina y glucosa

El medio de cultivo recogido durante 16 meses se procesó en volúmenes

de 500 ml que se filtraron utilizando membranas de nitrocelulosa de 0,22 µm

de diámetro de poro (Millipore).

Después del filtrado, el volumen recogido se dializó frente a agua

destilada en una relación 1:20, mediante membrana de diálisis con un punto de

corte de 7000 daltons (Medicell International Ltd). El volumen obtenido se

almacenó a -40°C para su posterior liofilización.


47

El producto liofilizado fue considerado el extracto de excreción-

secreción larvario (E-SL2).

2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DEL E-SL2 DE

TOXOCARA CANIS

2.1. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO

La determinación del contenido proteico del extracto se efectuó

utilizando el método del Ácido bicinconínico, basado en la técnica

originalmente propuesta por Lowry y col. (1951).

Se elaboró una curva patrón con diluciones seriadas a la mitad y por

duplicado de seroalbúmina bovina (Sigma) en tampón PBS. El rango de

concentraciones abarcó desde 1 mg/ml a 0,125 mg/ml.

Reactivos

Reactivo A: Ácido bicinconínico (Sigma)

Reactivo B: Sulfato de Cobre (II) pentahidratado al 4% (Sigma)

Reactivo C: mezclar Reactivo A y Reactivo B en una relación 50:1

El extracto liofilizado se preparó de la misma manera que la curva

patrón, abarcando el mismo rango de concentraciones.


48

Se distribuyeron 200 µl por pocillo de reactivo C en placas de

poliestireno MaxiSorp™ (Nunc™).

Posteriormente se añadieron 30 µl/pocillo de cada una de las diluciones

preparadas con anterioridad. Las muestras, incluida la curva patrón, se

distribuyeron por filas, en orden decreciente y por duplicado. También se

incluyó un pocillo conteniendo 30 µl de PBS que actuó como control.

Cada placa se incubó durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda.

Transcurrido el periodo de incubación, la lectura de los resultados se

realizó en un lector de placas de ELISA Multiskan® Bichromatic (Labsystems) a

una longitud de onda de 560 nm.

Los valores que se obtienen para cada muestra por duplicado, permiten

la obtención de un valor medio de absorbancia que se representa de forma

gráfica frente a la concentración de proteína. La linealidad que se produce con

los puntos de la curva patrón, permite elaborar una recta de regresión en la

que se integran los valores medios de absorbancia obtenidos para cada

muestra problema. De esta forma se calcula la concentración de proteína que

contiene cada extracto. El resultado se expresa como porcentaje de proteína

por peso de extracto.


49

2.2. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE

ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL

La separación de las proteínas contenidas en el extracto se realizó

mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil

Sulfato de Sodio (SDS-PAGE), en condiciones reductoras y con un sistema

discontinuo, según el método de Laemmli (1970).

Tampón de Muestra Tampón de Electroforesis (pH 8.7-8.8)

Tris-HCl pH 6,8 62,5 mM Tris base 0,025 M

Glicerol 10% Glicina 0,19 M

Azul de bromofenol 0,0125% SDS 1%

SDS 2%

2-β-mercaptoetanol 5%

La muestra se preparó mezclando el extracto liofilizado con el tampón

de muestra a una concentración de 4 mg de proteína del extracto liofilizado

por ml de tampón.

Se hirvió durante 5 minutos para provocar la reducción de los puentes

disulfuro y tras su enfriamiento, los restos insolubles se eliminaron por

centrifugación durante 5 minutos a 10.000 r.p.m. Como patrón de pesos

moleculares se utilizó el marcador preteñido Precision Plus Protein Dual Color

Standards (Bio-Rad).


50

Tanto la muestra como el patrón se almacenaron a -20°C hasta su

utilización.

2.2.1. PREPARACIÓN DE LOS GELES Y ELECTROFORESIS

La separación de los componentes proteicos del E-SL2 se realizó en gel

de poliacrilamida al 12,5%. Las cantidades necesarias así como los

componentes utilizados fueron los siguientes:

Gel separador 4%

Solución Acrilamida/Bis-Acrilamida 40% 29:1 (Bio Rad) 3,1 ml

Agua destilada 4,3 ml

Tris-HCl 1,5M pH 8,8 2,5 ml

SDS 10% 100 µl Persulfato amónico (Bio-Rad) 75 µl

Temed (Sigma) 20µl

Gel separador 12,5%

Solución Acrilamida/Bis-Acrilamida 40% 29:1 (Bio 1 ml

Agua destilada 6,4 ml

Tris-HCl 0,5M pH 8,8 2,5 ml

SDS 10% 100 µl Persulfato amónico (Bio-Rad) 75 µl

Temed (Sigma) 20µl


51

La electroforesis se llevó a cabo a diferente amperaje según el

procedimiento descrito por Del Águila y col. (1988). Se aplicó un amperaje de

25mA en el gel apilador y de 30mA en el gel separador

La duración de la electroforesis fue de 10 minutos hasta que el frente

penetró en el gel separador y de 50 minutos hasta que la proteína de 25 kDa

del marcador de peso molecular alcanzó el frente del gel.

2.2.2. VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE TINCIÓN AZUL DE

COOMASSIE

Los geles se sumergieron en solución colorante durante 1 hora a

temperatura ambiente y en agitación. Transcurrido este tiempo, el exceso de

colorante se eliminó sumergiendo los geles en solución decolorante.

Solución Colorante Solución Decolorante

Coomassie R-250 1 g Metanol 400 ml

Solución decolorante 1 L Ácido acético 100ml

Agua destilada 500ml

Se retiró la solución decolorante y los geles se mantuvieron en agua

destilada hasta su digitalización y posterior evaluación mediante el programa

informático Quantity One (Bio-Rad).


52

2.3. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTÉICO MEDIANTE

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

La electroforesis bidimensional (2D-electroforesis) permite obtener una

mejor resolución de los componentes proteicos de un extracto, debido a que

las proteínas se separan según dos parámetros: el punto isoeléctrico (pI) y el

peso molecular. Se abordó la separación de proteínas del extracto de los

productos de excreción-secreción de las larvas L2 por 2D en un rango de pH

de 3-10.

Tampón de Solubilización

Urea 8M

Chaps 4%

Anfolitos pH 3-10 al 0,2%

Azul de bromofenol al 0,0002%

Ditiotreitol (DTT) 50mM

Agua ultrapura

Tampón de Equilibrado

Urea 6M

SDS 20%

Tris HCl 1,5M pH 8,8

Glicerol 50%

Agua ultrapura


53

2.3.1. PRIMERA DIMENSIÓN: ISOELECTROENFOQUE

La primera dimensión se realizó en tiras de geles con un gradiente de pH

inmovilizado de 3 a 10 y de 7 cm de longitud (Bio-Rad). La muestra se

preparó en tampón de solubilización a una concentración de 300 µg de

proteína por ml de tampón y se dispuso en la bandeja de isoelectroenfoque en

un volumen final de 250 µl por tira de gel utilizada. Tras una hora de

incubación con la muestra, las tiras se cubrieron con aceite mineral y la

bandeja se conectó a la unidad de isoelectroenfoque Protean IEF Cell (Bio-

Rad). Las condiciones del isoelectroenfoque fueron las siguientes:

Etapa Voltios Voltios/hora

S1 250

S2 4.000

S3 4.000-20.000

S4 500

2.3.1.1. EQUILIBRADO

Antes de realizar la segunda dimensión es necesario solubilizar las

proteínas separadas por su punto isoeléctrico en tampones conteniendo SDS.

Tampón de Equilibrado I Tampón de Equilibrado II

Urea 6 M Urea 6 M

Tris-HCl pH 8,8 0,05M Tris-HCl pH 8,8 0,05 M

SDS 2% SDS 2%

Glicerol 20% Glicerol 20%

DTT 2% Iodoacetamida 2,5%


54

Para ello, cada tira se incubó durante diez minutos en agitación fuerte,

primero en tampón de equilibrado I conteniendo ditiotreitol (DTT) al 2%,

consiguiendo así reducir los grupos sulfidrilo de las proteínas; después, se

realizó una segunda incubación de diez minutos en tampón de equilibrado II

conteniendo iodoacetamida (IAA) al 2,5% para alquilizar los grupos sulfidrilo,

permitiendo así que las proteínas se separen únicamente por su peso

molecular en la segunda dimensión.

2.3.2. SEGUNDA DIMENSIÓN

La segunda dimensión separa las proteínas por su peso molecular

mediante geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE). Las

soluciones y reactivos utilizados en su preparación así como el proceso de

electroforesis, se llevó a cabo tal y como se explica en el apartado 2.2.1. de

este capítulo.

La tira de isoelectroenfoque ya equilibrada se colocó sobre el gel

separador con un porcentaje de acrilamida del 12,5%. Para mantener el

contacto entre geles, sobre la tira se añadieron 100 µl de agarosa al 0,1% en

tampón de electroforesis. En un pocillo a parte se incluyó el marcador de

pesos moleculares Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-Rad).

La electroforesis se llevó a cabo a 90 V durante 110 minutos utilizando el

sistema Mini PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad).


55

2.3.3 VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE TINCIÓN AZUL DE

COOMASSIE

Los geles se sumergieron en solución colorante durante 1 hora a

temperatura ambiente y en agitación. Transcurrido este tiempo, el exceso de

colorante se eliminó sumergiendo los geles en solución decolorante.

Se retiró la solución decolorante y los geles se mantuvieron en agua

destilada hasta su digitalización y posterior evaluación mediante el programa

informático PD Quest (Bio-Rad).

2.3.4. VISUALIZACIÓN DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE TINCIÓN CON PLATA

Para realizar esta tinción se utilizaron los reactivos Silver Stain Plus (Bio-

Rad). Las siguientes soluciones fueron preparadas en un volumen de 50 ml

acorde a las dimensiones del gel.

Solución Fijadora Solución Reveladora

Metanol 50% Solución complejo de plata 5%

Ácido acético 10% Solución reductora 5%

Concentrado fijador 5% Reactivo desarrollo 5%

Agua destilada ultrapura 35% Reactivo acelerador 50%

Agua destilada ultrapura 35%

Los geles se fijaron manteniéndolos durante 20 minutos en Solución

fijadora a temperatura ambiente y en agitación suave. A continuación se

lavaron dos veces con agua destilada ultrapura durante 10 minutos.


56

Posteriormente, el gel se introdujo en la Solución de revelado de 10 a 30

minutos en agitación, controlando permanentemente el proceso de revelado.

La reacción se paró con ácido acético al 7% una vez visualizadas las proteínas.

3. CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA

3.1. SELECCIÓN DE SUEROS

3.1.1. SUEROS CANINOS

A partir de la seroteca del Laboratorio de Parasitología, se seleccionaron

20 sueros de perros infectados naturalmente por Toxocara canis y

diagnosticados por necropsia.

Como sueros control se emplearon 5 sueros de perros sanos y libres de

helmintos procedentes de los Laboratorios Charles River (Charles River

Laboratory Inc.) y certificados por la compañía.

3.1.2. SUEROS HUMANOS

Para la identificación de los posibles alérgenos presentes en el extracto de

excreción-secreción de L2 de T. canis se seleccionaron 11 sueros de pacientes

diagnosticados de toxocarosis mediante enzimoinmunoensayo (EIA Toxocara

canis IgG. Test-Line, Clinical Diagnostics) y procedentes de la seroteca

conservada en el Laboratorio de Parasitología.


57

3.2. ELECTROTRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 A

MEMBRANAS INMOVILIZANTES

Las proteínas del E-SL2 separadas por electroforesis unidimensional y

bidimensional fueron electrotransferidas a membranas inmovilizantes de

fluoruro de polivinilideno (PVDF) Immun-Blot ® (Bio-Rad). La

electrotransferencia se realizó en un sistema horizontal semi seco, según el

método descrito por Towbin (1979).

Tampón de Transferencia

Glicerina 39 mM

Tris HCl 48 mM

SDS 0,0375%

Metanol 20%

Agua destilada ultra pura hasta 1 L

Antes de realizar la electrotransferencia se cambió la hidrofobicidad de la

membrana sumergiéndola unos segundos en metanol, dos minutos en agua

destilada y dos minutos en tampón de transferencia.

Sobre la placa del ánodo se colocó papel Extra Thick Blot (Bio-Rad)

impregnado en el tampón de transferencia.

La membrana se cortó a la misma medida que la superficie del gel a

transferir y se colocó encima del papel. Seguidamente se colocó el gel y

encima de éste otro papel Extra Thick Blot embebido en el tampón de


58

transferencia. Se cubrió todo con la placa-electrodo cátodo y se aplicó un

amperaje constante de 0,24 mA durante 20 minutos.

3.3. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE

3.3.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE CANINA

3.3.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS

UNIDIMENSIONAL

Tampón de Bloqueo (TBS-leche)

Leche desnatada en polvo 88g

Tris (hidroximetil) aminometano 6,05g

NaCl 11,70g

Agua destilada ultrapura Ajustar a 1 L

Una vez transferidas las proteínas, la membrana se saturó mediante

incubación en tampón de bloqueo durante 1 hora en agitación y temperatura

ambiente. Tras realizar 3 lavados de 10 minutos cada uno con TBS, la

membrana se cortó en tiras que se incubaron individualmente con los 25

sueros de perros seleccionados para este estudio a una dilución 1:100 en TBS-

leche. La incubación se realizó durante toda la noche a 4 °C y en agitación. A

continuación, y después de lavar las tiras por tres veces con TBS durante 10

minutos, se añadió a cada una 1 ml de inmunoglobulina G anti-IgE de perro

producidas en ratón (ICN), a una dilución 1:30 en tampón de bloqueo.

Después de 3 lavados con TBS, se añadió como conjugado inmunoglobulinas


59

anti-IgG de ratón unidas a peroxidasa (Sigma) a una dilución 1:100 en tampón

de bloqueo. La incubación con cada uno de los anticuerpos fue de 1 hora a

temperatura ambiente y en agitación suave. Para eliminar el conjugado no

fijado, se realizaron tres lavados de 10 minutos con TBS.

Como substrato de la reacción se utilizó 4-Cloro-1-Naftol (Bio-Rad) al

0,3% disuelto en metanol más peróxido de hidrógeno al 0,01%.

La membrana se incubó con la solución de revelado en reposo,

oscuridad y temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se lavó con

agua y se dejó secar para su posterior evaluación mediante el programa


3.3.1.2 INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 SEPARADAS MEDIANTE

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Tampón de Bloqueo (TBS-Tween 20) 0,1%

Tris 6,05g

NaCl 11,70g

Tween 20 1 ml

Agua destilada ultrapura Ajustar a 1 L


incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1% durante 1 hora en

agitación y a temperatura ambiente.


60

Tras realizar 3 lavados de 10 minutos con TBS-T 20 al 0,1%, la

membrana se incubó con una mezcla de los 20 sueros de perros seleccionados

para este estudio a una dilución 1:5 en tampón de bloqueo durante toda la

noche a 4°C y en agitación suave.

Tras la incubación, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con tampón

TBS-T 20 al 0,1% en agitación fuerte y a temperatura ambiente. Tras los

lavados, la membrana se incubó con anticuerpos anti-IgE canina unida a

peroxidasa (GenTex, Inc.) a una dilución 1:2000 en tampón TBS-T 20 al 0,1%

durante 1 hora en agitación y a temperatura ambiente.

Para eliminar el conjugado no fijado, se realizaron 3 lavados de 10

minutos con TBS- T 20 al 0,1% y un cuarto lavado sólo con TBS.

Para la detección de proteínas fijadoras de IgE se procedió al revelado

por quimioluminiscencia utilizando el sistema ECL-Plus Western Blotting

detection System (GE Healthcare).

Reactivos

Solución A: Tampón Tris

Solución B: Solución Acridan en Dioxano y Etanol

Solución de detección: mezclar Solución A y Solución B en una relación 40:1

Una vez retirado el exceso de tampón TBS de las membranas se

colocaron en un pliego de papel plástico transparente SaranWrap™. A


61

continuación, la membrana fue cubierta en toda su superficie con 1 ml de

solución de detección y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura

ambiente y en oscuridad.

Tras la incubación, se retiró el exceso de reactivo y se procedió a su

visualización mediante el sistema ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados

quedaron almacenados como archivo fotográfico para su posterior evaluación

mediante el programa informático PD Quest (Bio-Rad).

3.3.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE HUMANA


UNIDIMENSIONAL


incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1 % durante 1 hora en

agitación y temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se cortó en

tiras que se incubaron individualmente con 500 µl de los 11 sueros de

pacientes seleccionados sin diluir y se incubaron durante toda la noche a 4 °C

y en agitación. Tras la incubación con los sueros, los anticuerpos no fijados se

eliminaron mediante 3 lavados de 10 minutos con tampón TBS-T 20 al 0,1%

en agitación fuerte y a temperatura ambiente.

Como anticuerpo secundario se utilizaron inmunoglobulinas anti-IgE

humanas producidas en conejo y unidas a peroxidada (DAKO A/S) a una

dilución 1:10.000 en TBS-T 20 al 0,1%. La incubación con este anticuerpo fue


62

de 1 hora en agitación suave y a temperatura ambiente. Tras la incubación, se

realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno con TBS-T al 0,1% y un

último lavado con TBS

La detección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgE se realizó mediante

quimioluminiscencia, tal y como se indica en el apartado 3.3.1.2. de este

capítulo.

Posteriormente se procedió a su visualización mediante el sistema

sistema ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados quedaron almacenados

como archivo fotográfico para su posterior evaluación mediante el programa



BIDIMENSIONAL

Tras la transferencia de las proteínas, la membrana se saturó mediante

incubación en tampón de bloqueo TBS-T 20 al 0,1 % durante 1 hora en

agitación y temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se incubó con

una mezcla de los 11 sueros de pacientes seleccionados durante toda la noche

a 4°C y en agitación. Tras la incubación con los sueros, los anticuerpos no

fijados se eliminaron mediante 3 lavados de 10 minutos con tampón TBS-T

20 al 0,1% en agitación fuerte y a temperatura ambiente.

Como anticuerpo secundario se utilizaron inmunoglobulinas anti-IgE

humanas producidas en conejo y unidas a peroxidada (DAKO A/S) a una


63

dilución 1:10.000 en TBS-T 20 al 0,1%. La incubación con el anticuerpo

secundario fue de 1 hora en agitación suave y a temperatura ambiente. Tras la

incubación, se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno con TBS-T al

0,1% y un último lavado con TBS.

La detección de proteínas fijadoras de IgE se realizó mediante

quimioluminiscencia, tal y como se indica en el apartado 3.3.1.2. de este

capítulo.

Posteriormente se procedió a su visualización mediante el sistema

ChemiDoc™XRS (Bio-Rad). Los resultados quedaron almacenados como

archivo fotográfico para su posterior evaluación mediante el programa

informático PD Quest (Bio-Rad).

3.4. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgG

3.4.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG CANINA

SEPARADAS MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL

La detección de proteínas del E-SL2 fijadoras de IgG canina y separadas

mediante electroforesis unidimensional se llevó a cabo tal y como se indica en

el apartado 3.3.1.1. de este capítulo. Como anticuerpo secundario se utilizaron

inmunoglobulinas anti-IgG caninas unidas a peroxidada (Sigma) a una

dilución 1:500 en tampón TBS- leche.


64

Como substrato de la reacción se utilizó 4-Cloro-1-Naftol (Bio-Rad) al

0,3% disuelto en metanol más peróxido de hidrógeno al 0,01%.

Los resultados se evaluaron posteriormente mediante el programa


3.4.2. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA HUMANA FRENTE AL E-SL2 DE TOXOCARA

CANIS

Se determinó la IgG específica de 655 sueros de pacientes de una

población infantil procedente de la seroteca del Laboratorio frente a los

antígenos de excreción-secreción de larvas L2 de T. canis mediante

enzimoinmunoensayo (EIA Toxocara canis IgG. Test-Line, Clinical

Diagnostics).

Como población control se seleccionaron 310 sueros de donantes sanos

adultos procedentes de una población general.

El procedimiento fue realizado siguiendo las instrucciones del fabricante.

Como controles del ensayo y para determinar la positividad o negatividad de

un suero, en cada placa se dispusieron un blanco cuya absorbancia fue

siempre menor de 0,15, tal y como indica el control de calidad del ensayo; un

control negativo, cuyos valores de absorbancia fueron siempre menores o

iguales a 0,25; un control que determina el valor del punto de corte con


65

absorbancias entre 0,25 y 0,8 y por último un control positivo cuya

absorbancia fue siempre superior a 0,8.

La interpretación de los resultados se realizó en base a los valores de

absorbancia que se obtuvieron para cada suero y que fueron utilizados para

calcular el índice de positividad.

El índice de positividad (IP) viene determinado por la siguiente fórmula:

IP= Absorbancia de cada muestra/ Absorbancia media del punto de

corte

En función de este cálculo los resultados se interpretaron de la siguiente

manera:

Índice de Positividad Interpretación

Valores menores de 0,9 Negativo

Valores entre 0,9-1,1 Indeterminado

Valores mayores de 1,1 Positivo

4. EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA

ENTRE TOXOCARA CANIS Y ANISAKIS SIMPLEX

Para la evaluación de la reactividad cruzada entre A. simplex y T. canis se

utilizó una mezcla de 11 sueros de pacientes diagnosticados de toxocarosis y

seleccionados tal y como se indica en el apartado 3.1.2. de este capítulo.


66

La determinación de IgE específica se realizó mediante

fluoroenzimoinmunoensayo (FEIA), utilizando como fase sólida dos

extractos: 1) el extracto E-SL2 marcado con biotina acoplado a discos de

celulosa activados con estreptavidina y conjugados (Streptavidin

ImmunoCAP™); y 2) el extracto comercial de Anisakis simplex (Ref.: 14-4475-

01 Phadia) y se analizaron automáticamente en un analizador de

fluoroenzimoinmunoensayo UNICAP® 100 (Phadia).

4.1. MARCADO DEL E-SL2 CON BIOTINA

Para el marcado del E-SL2 con biotina se utilizó el sistema Biotin Labellin

Kit (Roche).

Reactivos

Solución de Bloqueo

PBS

Biotin-7-NHS (D-Biotinoil-Ácido ε aminocapróico-N hidroxisuccinimida)

Dimetilsulfóxido (DMSO)

Columnas de Sephadex G25

El extracto alergénico con un contenido del 40% de proteína, dializado y

liofilizado, se disolvió en 1 ml de tampón fosfato salino (PBS), a una

concentración final de 0,4 mg de proteína por ml.

Se diluyó 1 vial de 5 mg de la solución Biotin-7-NHS en 250µl de

DMSO agitando varias veces con vórtex. Posteriormente, se añadió el


67

volumen necesario de esta dilución a la solución del extracto alergénico en

PBS para una relación molar final 1:5 extracto-biotina y se incubó durante 2

horas a temperatura ambiente y con agitación suave.

La biotina no fijada a las proteínas, se separó mediante cromatografía de

exclusión a través de una columna de Shephadex® G-25. Para ello, la columna

fue lavada con 30 ml de PBS y bloqueada con 5 ml de solución de bloqueo.

A continuación, el extracto marcado con biotina fue añadido a la

columna y lavado con 2,5 ml de PBS. Para la elución de las proteínas

marcadas, se añadieron 3,5 ml de PBS a la columna y se recogieron alícuotas

de 0,5 ml. Para cada alícuota recogida se determinó la absorbancia a una

longitud de onda de 280 nm en un espectrofotómetro SmartSpec™ 3000 (Bio

Rad). Los viales con valores de absorbancia entre 0,9 y 1,0 fueron mezclados y

almacenados a -20ºC para su utilización.

4.2. FLUOROENZIMOINMUNOENSAYO (FEIA)

Para la determinación de IgE específica se siguió el protocolo

normalizado del uso del Streptavidin ImmunoCAP™ en UniCAP 100®

(Phadia). Brevemente, los Streptavidin ImmunoCAP™ previamente lavados,

fueron incubados con 50 µl del extracto biotinilado durante 1 h a 37ºC. Tras

el proceso de incubación la determinación de IgE específica fue realizada de

forma automatizada por el sistema.


68

Como anticuerpo secundario se utilizaron anticuerpos monoclonales

anti-IgE humana conjugados a β-galactosidasa, producidos en ratón (Phadia).

Como sustrato para el revelado del análisis se utilizó 4-metil-umbeliferil-

β-D-galactosidasa al 0,01% y la reacción fue parada con carbonato sódico al

4%.

La lectura de los resultados se realizó automáticamente por el analizador.

Los datos fueron almacenados en la aplicación UDM (Phadia) para su análisis

posterior. Se utilizaron como valores de referencia los suministrados por la

casa comercial Phadia.

5. ANÁLISIS DE LA HUELLA PEPTÍDICA MEDIANTE

SECUENCIACIÓN

Las proteínas del E-SL2 identificadas como fijadoras de IgE canina y

humana fueron enviadas para su secuenciación a la Unidad de Proteómica de

la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares del

Instituto Carlos III (Madrid). La secuenciación e identificación de cada una de

ellas se realizó mediante espectrometría de masas utilizando un sistema

MALDI-TOF/TOF-MS/MS y posterior búsqueda en las bases de datos

mediante el sistema Mascot.


69

6. OBTENCIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA TES-32

6.1. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL

La extracción del ARN total fue realizada mediante el sistema de

aislamiento en kit RNA Isolation Kit (Stratagene). Este sistema utiliza tiocianato

de guanidina (Chomczynski y Sacchi, 1987) como desnaturalizante de

proteínas, inactivando RNasas y protegiendo al RNA de la degradación. Para

la extracción de ARN total de larvas el protocolo se adaptó a la extracción de

ARN total en células crecidas en suspensión, utilizando 2 ml de medio de

cultivo que contenía 4000 larvas como material de partida.

Reactivos para la extracción de ARN total mediante RNA Isolation Kit (Stratagene)

Agua DEPC

Tampón Tris HCl 5 M pH 7.5

Solución desnaturalizante: Isotiocianato de guanidina 4M, Citrato sódico 0,02 M, Sarcosil 0,5%

Acetato sódico 2 M pH 4.0

Cloroformo: Isoamilalcohol

Isopropanol

Fenol equilibrado pH 5.3-5.7 con ácido succínico 0,1M

Β-Mercaptoetanol 14,4 M

Etanol 100% (en agua DEPC)

Etanol 70% (en agua DEPC)


70

6.1.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La solución de homogeneización fue preparada añadiendo 100 µl de β-

mercaptoetanol a 14 ml de solución desnaturalizante.

A continuación, se recogieron 2 ml de medio de cultivo, conteniendo un

promedio de 4000 L2 que fueron centrifugados a 13.000 r.p.m. durante 3

minutos. Una vez retirado el sobrenadante, se añadieron 5 ml de solución de

homogeneización al precipitado. La mezcla fue homogeneizada hasta su

rotura total en un homogeneizador manual con la ayuda de un émbolo.

Esta suspensión se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente y

fue transferida a un tubo de centrífuga de 15 ml.

6.1.2. EXTRACCIÓN

A la muestra en suspensión se le añadieron 0,5 ml de acetato sódico 2 M

(pH 4,0) y 5 ml de fenol (pH: 5,3-5,7) que fueron mezclados por inversión.

A continuación, se añadió 1 ml de cloroformo-isoamilalcohol y se agitó

vigorosamente con vórtex durante 10 segundos.

Tras 15 minutos de incubación en hielo, la muestra fue centrifugada a

13.000 r.p.m. durante 20 minutos y a una temperatura de 4°C, de tal forma

que se separó la fase acuosa, en la parte superior, de la fenólica, zona inferior.


71

La fase acuosa conteniendo el ácido nucléico fue transferida a un nuevo

tubo al que se añadió un volumen igual al recogido de isopropanol y se

mezcló por inversión. Posteriormente se dejó precipitando a -20°C durante

toda la noche.

Tras la precipitación, la muestra se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 20

minutos y a 4°C. El precipitado obtenido (ARN) se disolvió en 1,5 ml de

solución de homogeneización. A esta solución se le añadió el mismo volumen

de isopropanol, se mezcló y se incubó durante 1 hora a -20°C .

Tras un nuevo paso de centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 10

minutos a 4°C, el precipitado se lavó con etanol al 70%, se dejó secar y se

resuspendió en 500 µl de agua DEPC.

6.2. EXTRACCIÓN DE ARN MENSAJERO

Una vez obtenido el ARN total de las larvas, se extrajo el ARN

mensajero (ARNm) mediante el sistema de extracción en kit QuickPrep™ Micro

mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences) que combina la capacidad

disruptiva y protectora del tiocianato de guanidina con la selectividad de una

cromatografía de afinidad utilizando una columna de oligo (dT) celulosa para

aislar el ARN poliadenilado.


72

Reactivos para la extracción de ARN mensajero mRNA Purification Kit (Stratagene)

Columnas de Oligo (dT) celulosa: suspendidas en tampón de almacenamiento

conteniendo 0,15% de Biocida Kathon™ CG/1CP

Tampón de Extracción: Solución acuosa tamponada conteniendo tiocianato de

guanidina y N-lauril sarcosina

Tampón de alto contenido en sales: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,5 M

Tampón de bajo contenido en sales: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,1 M

Tampón de elución: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA

Tampón de muestra: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 3 M NaCl

Glicógeno: 5-10 mg de glicógeno en agua DEPC

Solución de Acetato Potásico 2,5 M (pH 5,0)

A 200 µl de ARN total obtenido mediante el sistema de aislamiento en

kit RNA Isolation Kit (Stratagene) se le añadieron 0,4 ml de tampón de

extracción. La muestra se diluyó añadiendo 0,8 ml de tampón de elución. A su

vez, 0,5 ml del tampón de elución se dejaron incubando a 65°C hasta su

posterior utilización.

La resina de oligo (dT) se resuspendió y se tomó una alícuota de 1 ml. A

continuación, la muestra y el oligo (dT) se centrifugaron a 13.000 r.p.m.

durante 1 minuto y a temperatura ambiente.

Se eliminó el sobrenadante del tubo que contenía el oligo (dT) y se le

añadió 1 ml del sobrenadante de la muestra. Se agitó durante 3 minutos hasta

conseguir una suspensión.


73

Posteriormente, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se

eliminó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en 1 ml de tampón de

alto contenido en sales.

Se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se eliminó el

sobrenadante. El lavado con el tampón de alto contenido en sales se repitió 4

veces más. El precipitado obtenido tras la última centrifugación se

resuspendió en 1 ml de tampón de bajo contenido en sales. Se centrifugó a

13.000 r.p.m. durante 10 segundos y se eliminó el sobrenadante. El lavado con

el tampón de bajo contenido en sales se repitió una vez más.

La resina obtenida se resuspendió en 300 µl de tampón de bajo

contenido en sales y esa suspensión se transfirió a una columna colocada en

un tubo de 1,5 ml.

Se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 segundos y se descartó el eluído.

Este proceso se repitió utilizando 500 µl del tampón de bajo contenido en

sales teniendo cuidado de no tocar la resina.

Se colocó la columna en un nuevo tubo y se añadieron 200 µl de tampón

de elución previamente calentado a 65°C y se centrifugó a 13.000 r.p.m.

durante 5 segundos.


74

Se recogió el eluído que contenía el ARN mensajero y se precipitó

durante toda la noche a -80°C añadiendo 1/40 parte de glicógeno, 1/10 parte

de acetato potásico 2 M y 2 volúmenes de etanol al 100% preenfriado.

Tras la precipitación, el ARNm se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 1

hora a 4°C. Se retiró el sobrenadante, el precipitado se lavó con etanol al 70%

y se dejó secar a temperatura ambiente.

Finalmente el ARNm se resuspendió en 20 µl de agua DEPC.

6.3. SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO (ADNc)

La síntesis del ADNc se realizó utilizando el sistema en kit cDNA

Synthesis Kit (Bioline) a partir de 100 ng de ARNm obtenido mediante el

sistema de aislamiento en kit QuickPrep™ Micro mRNA Purification Kit

(Amersham Biosciences) y utilizando los siguientes reactivos:

La muestra se incubó durante 10 minutos a 65°C. A continuación, se

enfrió durante 2 minutos en hielo.

Reactivos

Oligo (dT)18 1 µl

10 mM dNTPs 1 µl

ARNm 100ng

Agua DEPC hasta 10 µl


75

La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo con los siguientes

reactivos:

Reactivos

Tampón 5X RT 4 µl

Inhibidor de RNAsas 1 µl

Transcriptasa Reversa (200 U/ µl) 0,25 µl

Agua DEPC hasta 10 µl

Diez microlitros de esta reacción se añadieron a la muestra del ARN con

el Oligo(dT)18 y se incubó a 42°C durante 1 hora. Posteriormente la

transcriptasa inversa se inactivó a 70°C durante 15 minutos.

6.4. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE

LA POLIMERASA DEL FRAGMENTO DE ADN

CORRESPONDIENTE AL GEN TES-32

La amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se

realizó a partir del ADNc obtenido mediante el sistema en kit cDNA Synthesis

Kit (Bioline).

Se diseñaron dos cebadores tomando como referencia la secuencia del

gen TES-32 (GenBank AF041023.1) y usando el programa OligoPerfect™

Designer de Invitrogen. La secuencia de oligonucleótidos de los cebadores

empleados para la reacción fue la siguiente:


76

TES-32F, 5´-GAATTCACGAGCCAACAACCACACA-3´

TES-32R, 5´-GGATCCAGCAGGAAACGAAGACGC-3´

La reacción de amplificación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:

Reactivos

MgCl (Applied Biosystems) 2mM

GenAmp PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) 1x

dNTPs (Bioline) 800µM

Iniciadores (Invitrogen) 0,5 µM

AmpliTaq® Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) 1U

Agua (libre DNasas, RNasas) hasta 50µl

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador 2720 Thermal

Cycle (Applied Biosystem) con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C

durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 52 °C

durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y un paso de extensión final a

72°C durante 7 minutos.

6.4.1. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

El ADN de la secuencia amplificada se separó electroforéticamente en

un gel de agarosa al 1%.

Eco R I

Bam h I


77

Reactivos

Tampón TAE 50x (National Diagnostics) 1x

Tampón de carga 5x (Sigma) 1x

Agarosa (Pronadisa) 1%

Bromuro de Etidio 10 mg/ml (Sigma) 2 µg/ml

El gel se preparó disolviendo agarosa al 1% en tampón TAE, por

calentamiento hasta ebullición en un microondas. Se enfrió hasta 50°C y se

añadió el bromuro de etidio.

La solución se dispensó sobre un molde al que se colocó previamente un

peine para formar los pocillos y así poder depositar las muestras. Se dejó

solidificar por enfriamiento. El gel fue finalmente introducido en una cubeta

horizontal Mini-Sub® Cell (Bio-Rad) y cubierto con tampón TAE.

Se cargaron 10 µl de la muestra de ADN amplificado y 2 µl de tampón

de carga. Como patrón de pesos moleculares se utilizó el HyperLadder I

(Bioline).

La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 90 V hasta que el

azul de bromofenol alcanzó la mitad del gel.

El resultado se visualizó utilizando el sistema ChemiDoc™XRS (Bio-

Rad).


78

6.4.2. PURIFICACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO

El producto de PCR obtenido se purificó con el kit High Pure PCR

Product Purification Kit (Roche).

Reactivos

Tampón de Unión (3M Tiocianato de guanidina, 10mM Tris-HCl, 5% de Etanol, pH 6,6)

Tampón de Lavado (20mM NaCl, 2mM Tris-HCl pH 7,5, 90% de Etanol)

Tampón de Elución (10mM Tris-HCl pH 8,5)

Tras la amplificación por PCR, se ajustó el volumen de la muestra a 100

µl y se añadieron 500 µl de tampón de unión.

A continuación, se insertó una columna de purificación en un tubo

colector y se transfirió la muestra anteriormente preparada. Se centrifugó

durante 1 minuto a 13.000 r.p.m. a una temperatura de 22°C.

A continuación, se eliminó el eluído, se añadieron a la columna 500 µl de

tampón de lavado y se centrifugó 1 minuto a 13.000 r.p.m.

Tras la centrifugación se volvió a eliminar el eluído, se añadieron 200 µl

de tampón de lavado y se centrifugó 1 minuto a 13.000 r.p.m.

Posteriormente se eliminó el eluído, se añadieron 50 µl de tampón de

elución y se volvió a centrifugar durante 1 minuto a 13.000 r.p.m.

El ADN purificado se centrifugó durante 3 minutos a 13.000 r.p.m. para

eliminar las posibles fibras de cristal que pudiera haber en el eluído final.


79

El producto de PCR purificado se cuantificó mediante el

espectofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific) y se almacenó a

-20°C en tampón de elución para su posterior utilización.

6.5. CLONACIÓN DEL GEN TES-32 EN EL VECTOR pCR2.1

El producto de PCR purificado se ligó al vector de clonación TA

Cloning® Kit (Invitrogen). La Taq polimerasa añade al producto de PCR una

deoxiadenosina en el extremo 3´, que junto a la deoxitimidina que lleva

incorporada el vector pCR 2.1 en el extremo 3´, asegura la ligación del

producto de PCR y el vector.

Se utilizaron 50 ng de vector y 9 ng del producto de PCR. La reacción de

ligación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:

Reactivos

Producto de PCR 1 µl

Buffer de Ligación 10x 1 µl

Vector pCR®2.1 (25ng/µl) 2 µl

Agua hasta 9 µl

T4 ADN ligasa (4 unidades) 1 µl

La reacción se incubó durante toda la noche a 14 °C.

Se utilizaron 10 µl de producto de ligación para transformar 200 µl de

células competentes E. coli TOP 10 F´. Para realizar la identificación de

colonias recombinantes (blancas) se añadió IPTG y X-Gal a las placas. El


80

color blanco de la colonia indica que el gen TES-32 se insertó en el vector en

el sitio correcto, es decir, interrumpiendo el gen lacZ e inactivando la enzima

β-galactosidasa. De este modo, al no ser hidrolizado el sustrato cromogénico

X-Gal, no se produce coloración azul de las colonias.

Para ello se mantuvo esta mezcla de células-producto de ligación en

hielo durante 45 minutos. Posteriormente, se sometió a un choque térmico a

42°C durante 2 minutos y se introdujo nuevamente en hielo. Se añadieron 800

µl de medio SOC atemperado y se incubó durante 1 hora a 37°C con

agitación.

Para la selección de las células transformadas se sembraron 200 µl en

placas de agar LB suplementado con kanamicina (50µg/ml) y X-Gal y se

incubaron durante toda la noche a 37°C.

De la población crecida se seleccionaron 8 colonias blancas (color

correspondiente a los clones que contienen el plásmido recombinante) y se

sembraron en 4 ml de caldo LB suplementado con kanamicina a una

concentración de 50µg/ml. Se incubaron durante toda la noche a 37°C en

agitación (250 r.p.m.) en un incubador (Sanyo Orbital Incubator).

Tras la incubación se procedió a realizar la extracción de ADN

plasmídico por el método de lisis alcalina descrito por Birnboim y Doly

(1979).


81

Reactivos

Solución de Lisis I (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)

Solución NaOH-SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS, agua destilada)

Solución de Lisis III (5 M Acetato Potásico, Ácido acético glacial, agua destilada)

Tampón TE-RNasa (50 µl de TE y 0,5 µl de RNAsa a 1mg/ml)

Se recogieron las células crecidas durante toda la noche en caldo LB

suplementado con kanamicina a 37°C en agitación (250 r.p.m.) y se

centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 3 minutos a temperatura ambiente.

El precipitado se resuspendió en 200 µl de Solución de Lisis I y se dejó

incubando 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron

400 µl de Solución NaOH-SDS, se mezcló con movimiento de muñeca y se

dejó 5 minutos incubando en hielo. Tras la incubación, se añadieron 300 µl de

Solución de Lisis III, se mezcló de forma similar y se dejó incubando en hielo

durante 15 minutos.

Posteriormente, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a

temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a otro tubo de centrífuga.

Se añadió un volumen de fenol-cloroformo, se agitó con vórtex durante

2 minutos y se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a temperatura

ambiente.


82

Al sobrenadante se le añadieron 2 volúmenes de etanol al 100%

previamente enfriado, se mezcló con movimiento de muñeca y se incubó a -

20ºC durante 30 minutos.

Tras la precipitación, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 20 minutos a

temperatura ambiente y el precipitado se lavó con 500 µl de etanol al 70%

previamente enfriado. El precipitado se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 5

minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar durante 15 minutos

a 37°C.

Finalmente el precipitado se resuspendió en 40 µl de tampón TE-RNasa

durante toda la noche a 4°C.

6.6. IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES

6.6.1. ANÁLISIS MEDIANTE PCR

Cada una de las colonias seleccionadas fue diluída en 7,5 µl de agua

ultrapura que sirvió como ADN molde. La reacción de PCR se llevó a cabo

con los mismos cebadores diseñados tomando como referencia la secuencia

del gen TES-32 (GenBank AF041023.1).

La reacción de amplificación se llevó a cabo con los siguientes reactivos:


83

Reactivos

MgCl (Applied Biosystems) 2mM

GenAmp PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) 1x

dNTPs (Bioline) 800µM

Iniciadores (Invitrogen) 0,5 µM

AmpliTaq® Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) 1U

Agua (libre DNasas, RNAsas) hasta 50µl

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador 2720 Thermal

Cycle (Applied Biosystem), con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C

durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 52 °C

durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y un paso de extensión final a

72°C durante 7 minutos.

6.6.2. ANÁLISIS MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

El análisis mediante enzimas de restricción se utiliza como proceso de

confirmación de las colonias positivas. Para ello el ADN plasmídico fue

digerido con el enzima de restricción EcoR I (Takara). La digestión se llevó a

cabo durante 1 hora a 37°C, utilizando los siguientes reactivos:

Reactivos

Tampón H 10X (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 M NaCl) 1X

Enzima EcoR I 50U 1U

ADN plasmídico 1 µg

Agua (libre DNAsas, RNAsas) hasta 20 µl

Finalmente el enzima se inactivó a 70°C durante 15 minutos.


84

6.7. SECUENCIACIÓN

EL ADN clonado se purificó mediante el sistema de purificación de

ADN plasmídico en kit High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche).

Reactivos

Tampón de Suspensión (50 mM Tris-HCl y 10 mM EDTA pH 8,0)

RNAsa A (0,1 mg/ml)

Tampón de Lisis (0,2 M NaOH y 1% SDS)

Tampón de Unión (4M Hidroclorido de guanidina y 0,5 M de acetato potásico pH 4,2)

Tampón de Lavado (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl pH 7,5, 80% Etanol)

Tampón de Elución (10 mM Tris-HCl pH 8,5)

Para ello se preparó un cultivo de 4 ml en caldo LB suplementado con

kanamicina (50µg/ml) a partir de una colonia recombinante, analizada por

PCR y confirmada por digestión con el enzima de restricción EcoR I, y se

creció durante toda la noche a 37°C en agitación (250 r.p.m.).

Las bacterias se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 3 minutos a

temperatura ambiente y se retiró el sobrenadante. A continuación, se

añadieron 250 µl de tampón de suspensión más RNAsa y se agitó hasta

resuspender toda la suspensión celular.

Una vez resuspendida, se añadieron 250 µl de tampón de lisis, se mezcló

por inversión y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.


85

Posteriormente se añadieron 350 µl de tampón de unión previamente

enfriado en hielo, se mezcló por inversión y se dejó incubar durante 5 minutos

en hielo. A continuación, se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos.

Se insertó una columna de purificación en un tubo colector y se

transfirió la muestra. Se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima

(13.000 r.p.m.) a una temperatura de 22 °C.

Se eliminó el eluído, se añadieron a la columna 700 µl de tampón de

lavado y se centrifugó 1 minuto a velocidad máxima.

De nuevo se eliminó el eluído y se centrifugó 1 minuto a velocidad

máxima para eliminar todo el tampón de lavado. Se retiró el eluído, se

añadieron 100 µl de agua destilada ultrapura y se centrifugó 1 minuto a

velocidad máxima.

El ADN plasmídico purificado se centrifugó durante 3 minutos a

velocidad máxima para eliminar las posibles fibras de cristal que pudiera haber

en el eluído final.

Para la identificación del inserto clonado en el vector pCR 2.1 por

secuenciación de ADN, las muestras se cuantificaron mediante el

espectofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific) y fueron enviadas

al Servicio de Secuenciación de Sistemas Genómicos S. L. (Valencia).


86

6.8. ALMACENAMIENTO DE LOS CLONES

Una vez comprobado que el gen clonado era TES-32, se preparó un

stock bacteriano en glicerol. Para ello se inocularon 10 ml de caldo LB

suplementado con kanamicina (50µg/ml) con una colonia positiva. Se incubó

durante toda la noche a 37°C y con agitación (250 r.p.m.). Posteriormente se

añadió 4,5 ml de medio glicerol-líquido al cultivo, se mezcló bien y se alicuotó

en tubos de 1 ml. El stock en glicerol de las bacterias con el inserto se

almacenó a -80ºC.

RESULTADOS

R E S U L T A D O S

88

1. OBTENCIÓN DE LARVAS INFECTANTES (L2) DE

TOXOCARA CANIS MEDIANTE CULTIVO IN VITRO

Las hembras fecundadas de T. canis, obtenidas del intestino delgado del

hospedador definitivo, desovaron a las 24 horas de su incubación a 37 °C.

El desarrollo in vitro de larvas infectantes de T. canis se produjo en un

periodo máximo de 31 días, en unas condiciones de 27°C de temperatura y

una humedad relativa del 80%. El periodo de supervivencia de las larvas fue

de 16 meses con una mortalidad del 20%. Eclosionaron 2000 larvas

infectantes por ml de medio de cultivo.

Las imágenes del proceso de eclosión de los huevos de T. canis se

muestran en la Figura 9.

R E S U L T A D O S

89

Figura 9. Proceso de eclosión de huevos de T. canis

a) Ruptura de la cubierta proteica

b) Ruptura de las cubiertas proteica y lipídica

c) Larva eclosionando

d) Larvas libres en medio de cultivo

R E S U L T A D O S

90

2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS

PRODUCTOS DE EXCRECIÓN-SECRECIÓN DE LAS

LARVAS L2 (E-SL2)

La concentración de proteínas totales del E-SL2, obtenida mediante la

técnica del ácido bicinconínico, fue del 40% (mg proteína/100 mg de extracto

liofilizado).

2.1. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO DEL E-SL2 MEDIANTE

ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D)

Los resultados obtenidos del perfil proteico en gel de acrilamida al 12,5%

se muestran en la Figura 10.

Figura 10. Perfil proteico del E-SL2 de T.

canis en gel de poliacrilamida al 12,5%.

M: marcador de masa molecular. E: extracto

de los productos de excreción-secreción de

larvas L2 de T. canis

kDa M E

250- 150- 100- 75-

50

37-

25-

37

50

73-77

30-35

R E S U L T A D O S

91

El E-SL2 analizado en gel de poliacrilamida al 12,5% mostró un perfil

proteico constituido por 8 componentes de naturaleza proteica con masas

moleculares entre 25 y 77 kDa. Dentro de este rango, destacan dos bandas de

37 y 50 kDa y otros dos grupos de componentes de 30-35 y 73-77 kDa que se

tiñeron con más intensidad.

Para una mejor resolución de estos componentes proteicos se abordó la

separación mediante 2D-electroforesis cuyos resultados se muestran a

continuación.

R E S U L T A D O S

92

2.2. ANÁLISIS DEL PERFIL PROTEICO MEDIANTE

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D)

Los resultados obtenidos del perfil proteico mediante 2D se muestran

en las Figuras 11 y 12.

Figura 11. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis

mediante 2D y teñido con azul de Coomassie

M: marcador de masa molecular

pI: punto isoeléctrico

Figura 12. Perfil proteico del E-SL2 de T. canis

mediante 2D y teñido con tinción de plata


pI: punto isoeléctrico

M 3 pI 10 M 3 pI 10

Como puede observarse en las Figuras 11 y 12, en la 2D-electroforesis

realizada con el E-SL2 se identificaron 40 proteínas distribuidas en un rango

de pH de 5,3 a 9,8 y con masas moleculares entre los 30 y 100 kDa.

kDa

75

50

37

25

kDa

75

50

37

25

R E S U L T A D O S

93

Los patrones que se revelan con las dos tinciones son distintos. En el

perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción con azul de

Coomassie (Figura 11) aparecen tres componentes de masa molecular 100

kDa y pI entre 9,3 y 9,6 que no se observan en la tinción de plata. Así mismo,

en el perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción de plata

(Figura 12) aparece un componente de 50 kDa y pI 7 y una serie de

componentes con masa molecular de 75 kDa y en el rango de pI de 5,3 a 9,8,

que no se observan en la tinción con azul de Coomassie.

Sin embargo, tanto en el perfil proteico resultante de la 2D-

electroforesis y tinción con azul de Coomassie (Figura 11) como en la tinción

de plata (Figura 12), destacan dos grupos de componentes: un grupo entre los

30 y 37 kDa y pI entre 5,5 y 9,8; y otro grupo de componentes proteicos entre

los 65 y los 75 kDa y con un pI entre 5,3 y 9,8.

R E S U L T A D O S

94

3. CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA

3.1. RESULTADOS OBTENIDOS CON SUEROS CANINOS

3.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgE

3.1.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE SEPARADAS MEDIANTE

ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)

Los resultados de la 1D-Inmunodetección se muestran en la Figura 13.

Figura 13. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 de T.canis


Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis; calles 21-25: sueros de perros sanos

y libres de helmintos

kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

150

75

50

37

25

En la Tabla 3 se muestran las masas moleculares de cada antígeno tras

realizar el análisis de imagen con el programa informático Quantity One (Bio-

Rad).

R E S U L T A D O S

95

Tabla 3. Masas moleculares de las proteínas fijadoras de IgE del E-

SL2. S1-S20: sueros caninos parasitados sólo por T. canis

S1 >200 200 140 120 110 80 75

S2 >200 200 140 120 110 80 75

S3

S4 >200 140 120 95 80 75

S5 >200 95 80 75

S6 >200 140 120 95 80 75 42

S7 >200 140 120 110 95 80 75 35 32

S8

S9 >200 120 110 95 80 75 50 35 32

S10 >200 120 110 95 80 75

S11 >200 200 120 110 95 80 75 70

S12 >200 200 120 110 95 80 75 70

S13 >200 200

S14 200 120 110 95 80 75 70

S15 200 120 110 95 80

S16 200 120 110 95 80 75

S17 >200 200 120 110 95 80 75

S18 >200 200 120 110 95 80 75 70

S19 >200 200 120 110 95 80 75 70

S20 >200 200

Los diferentes sueros mostraron un perfil antigénico con 13

componentes de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. El 80% de los

sueros reconocieron el componente proteico con MM de 80 kDa. Tanto el

grupo de componentes con MM >200 kDa como los componentes de 120 y

75 kDa fueron reconocidos por el 75% de los sueros de la muestra. El

componente con MM de 95 kDa fue reconocido por el 70% de los sueros de

este estudio. El componente con MM de 110 kDa fue reconocido por el 65%

R E S U L T A D O S

96

de los sueros de perros naturalmente infectados por T.canis. El 25% de los

sueros de este estudio reconocieron el componente con MM de 70 kDa.

En la zona de bajo peso molecular, los componentes de 50 y 42 kDa

fueron reconocidos por el 5% de los sueros de perros naturalmente infectados

por T. canis y el 10% de estos sueros reconocieron los componentes con MM

de 35 y 32 kDa.

Los sueros utilizados como controles no reconocieron ningún antígeno

capaz de fijar IgE en el E-SL2.


ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-Inmunodetección)

En la Figura 14 se muestran los resultados de la 2D-Inmunodetección

del E-SL2, para el rango de isoelectroenfoque de pH 3-10, utilizando la

mezcla de los 20 sueros caninos de toxocarosis. Las flechas indican las

proteínas que fueron enviadas a secuenciar.

Figura 14. 2D-Inmunodetección de alérgenos del E-SL2 de T.canis utilizando la mezcla de

los 20 sueros de perros de toxocarosis

kDa

75

50

37

25

M 3 pI 10

1

2

R E S U L T A D O S

97

El análisis reveló 20 proteínas alergénicas con masas moleculares entre

los 32 y los 75 kDa con un rango amplio de pI (3-10). Podemos distinguir dos

zonas de inmunorreacción, una de 30-40 kDa y pI entre 3 y 10; y otra zona

entre los 50-75 kDa y pI entre 5 y 10.

Se secuenciaron los componentes 1 (32 kDa y pI 7,3) y 2 (50 kDa y pI

6,3) (Figura 14).

Los resultados de la secuenciación obtenidos mediante análisis de la

huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT se muestran en la

Tabla 4.

Tabla 4. Resultados del análisis de huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT de

los componentes 1 y 2

MUESTRA Nº Descripción de Proteína Identificada Mm (Da) pI Identidad

1 gi|2773355 Lectina tipo C TES-32 Toxocara canis 24519 8,1 16%

2 gi|4838459 Lectina tipo C o TES-70 Toxocara canis 31621 5,67 6%

El componente 1 mostró una identidad del 16% con la Lectina tipo C

TES-32 de T.canis y el componente 2 mostró una identidad del 6% con la

Lectina tipo C TES-70 de T. canis. En las Figuras 15 y 16 se muestran los

espectros de fragmentación y los resultados de la búsqueda en la base de datos

MASCOT (Tabla 5 y 6) correspondientes a las proteínas identificadas como

TES-32 (Figura 15) y TES-70 (Figura 16).

R E S U L T A D O S

98

Figura 15. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al alérgeno

identificado como TES-32.

Tabla 5. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-32).

Nombre de la muestra MUESTRA 1

pM/pI observados 32 kDa/7,3

pM/pI teóricos 24.5 kDa/8,13

Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C de excreción secreción TES-32 T.canis

Secuencia identificada ACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWC TQTGSR

Porcentaje de cobertura 16%

Puntuación total 172

Valor esperado 3.30E-11

Resultado mediante el sistema NCBI gi|2773355

R E S U L T A D O S

99

Figura 16. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente al alérgeno

identificado como TES-70.


Nombre de la muestra MUESTRA 1

pM/pI observados 50 kDa/6,3


Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C Tc-ctl-4 TES-70 T. canis

Secuencia identificada GVQTYWLGLNR NPQG FICK

Porcentaje de cobertura 6%




R E S U L T A D O S

100

3.1.2. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG

3.1.2.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS DEL E-SL2 FIJADORAS DE IgG SEPARADAS

MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)

En la Figura 17 se muestra el perfil antigénico del E-SL2.

Figura 17. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgG del E-SL2 de T.canis.

M: marcador de masa molecular.

Calles 1-20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados por necropsia; Calles

21-25: sueros de perros sanos libres de helmintos.

kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

En la Tabla 7 se muestran las masas moleculares correspondientes a los

antígenos detectados.

200

75

50

37

25

R E S U L T A D O S

101

Tabla 7. Masas moleculares del perfil antigénico de las proteínas fijadoras de IgG del E-

SL2. S1-S20: sueros de perros parasitados sólo por T. canis y confirmados por necropsia.

S1 >200 200 140 120 110 95 80

S2 >200 200 140 120 100 95 80 55 42 37 35 32

S3 >200 140 120 110 95 80 55 42 35 32

S4 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 42 37 35 32

S5 >200 200 140 120 110 95 80 35

S6 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S7 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S8

S9 >200 200 140 120 95 80 55 37 35 32

S10 >200 200 140 120 110 95 80 37 35 32

S11 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S12 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S13 37 35

S14 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S15 >200 200 55 50 42

S16 >200 200

S17 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S18 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S19 >200 200 140 120 110 95 80 70 55 50 42 37 35 32

S20 200 95 80

Los diferentes sueros mostraron un perfil antigénico con 14

componentes de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. El grupo de

componentes con MM > 200 kDa fueron reconocidos por el 85% de los

sueros empleados en este estudio. Los componentes con MM de 80 y 95 kDa

fueron reconocidos por el 80% de los sueros de perros naturalmente

infectados por T. canis. Tres de estos antígenos con MM de 35, 120 y 140 kDa,

R E S U L T A D O S

102

fueron reconocidos por el 75% de los sueros de perros naturalmente

infectados por T. canis. El componente de 110 kDa fue reconocido por el 70%

de los sueros de este estudio. El 65% de los sueros caninos reconocieron los

componentes con MM de 32, 37 y 55 kDa. El componente con MM de 42

kDa fue reconocido por el 60% de los sueros de perros naturalmente

infectados por T. canis. Tanto el componente de 50 kDa como el de 70 kDa

fueron reconocidos por el 45% de los sueros caninos empleados en este

estudio.

Ningún suero control reconoció antígenos del extracto.

R E S U L T A D O S

103

3.2. RESULTADOS OBTENIDOS EN SUEROS HUMANOS

3.2.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE

3.2.1.1. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgE DEL E-SL2 SEPARADAS

MEDIANTE ELECTROFORESIS UNIDIMENSIONAL (1D-Inmunodetección)

En la Figura 18 se muestra la 1D-Inmunodetección de proteínas

fijadoras de IgE del E-SL2 con los 11 sueros de pacientes pediátricos

seropositivos asintomáticos.

Figura 18. 1D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de

IgE del E-SL2 de T.canis.

M: marcador de masa molecular.

Calles 1-11: sueros de pacientes pediátricos seropositivos;

Calle 12: mezcla de sueros negativos.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

kDa

100

75

50

37

25

R E S U L T A D O S

104

Los resultados muestran 8 proteínas capaces de fijar IgE con masas

moleculares de 25, 27, 32, 35, 40, 45, 75 y 100 kDa. Entre ellas, la proteína de

35 kDa fue reconocida por el 90% de los sueros de pacientes.

La mezcla de sueros negativos no reconoció ningún antígeno del E-SL2.


ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D-Inmunodetección)

En la Figura 19 se muestran los resultados obtenidos mediante 2D-

Inmunodetección utilizando la mezcla de los 11 sueros de individuos

seropositivos.

Figura 19. 2D-Inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 de T.canis

Se detectaron 17 alérgenos con pesos moleculares entre los 32 y los 100

kDa y pI entre 3 y 9.

GRUPO 2

GRUPO 1

R E S U L T A D O S

105

Para facilitar la interpretación de los resultados obtenidos mediante

análisis de la huella peptídica y búsqueda en la base de datos MASCOT de los

17 componentes identificados, las proteínas alergénicas detectadas se

dividieron en dos grupos.

En el grupo 1 (Figura 19), diez de los componentes mostraron identidad

peptídica (entre 10-28%) con la proteína TES-32 de T. canis. En el grupo 2

(Figura 19), tres de los componentes fueron identificados como TES-70 (entre

3-6% de identidad peptídica). Cuatro de las proteínas alergénicas enviadas a

secuenciar no pudieron ser identificadas.

En la Tabla 8 se muestran los resultados del análisis de huella peptídica y

búsqueda en la base de datos MASCOT para los dos grupos de alérgenos

identificados.


MASCOT de los dos grupos de alérgenos identificados.

MUESTRA Nº Descripción de la proteína Mm pI Identidad

GRUPO 1 gi|2773355 Lectina tipo C TES-32 Toxocara canis 24519 8,13 10-28%

GRUPO 2 gi|4838459 Tc-ctl-4 Lectina tipo C o TES-70 31621 5,67 3-6%

En las Figuras 20 y 21 se muestran los espectros de fragmentación y los

resultados de la búsqueda en la base de datos MASCOT (Tabla 9 y 10)

correspondientes a las proteínas identificadas como TES-32 (Figura 20) y

TES-70 (Figura 21).

R E S U L T A D O S

106

Figura 20. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente a los alérgenos

identificados como TES-32.


Nombre de la muestra GRUPO 1

pM/pI observados 32 kDa/3-9


Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C de excreción secreción TES-32 T.canis

Secuencia identificada ACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSR. YWIGVNR

Porcentaje de cobertura 10-28%




R E S U L T A D O S

107

Figura 21. Espectro de fragmentación peptídica por MALDI correspondiente a los alérgenos

identificados como TES-70

Tabla 10. Resultados de la búsqueda en la base de datos Mascot (TES-70)

Nombre de la muestra GRUPO 2

pM/pI observados 50-70 kDa/5-6,6


Descripción de la proteína identificada Lectina tipo C Tc-ctl-4 TES-70 T. canis

Secuencia identificada GVQTYWLGLNR. NPQGFICK

Porcentaje de cobertura 3-6%




R E S U L T A D O S

108

3.2.2. MEDIDA Y EVALUACIÓN DE PROTEÍNAS FIJADORAS DE IgG

3.2.2.1. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA HUMANA FRENTE AL E-SL2 DE

TOXOCARA CANIS MEDIANTE ENZIMOINMUNOENSAYO

Los resultados de la prueba de ELISA IgG (EIA Toxocara canis IgG.

Test-Line, Clinical Diagnostics) de los 655 sueros de una población infantil

revelaron una prevalencia de toxocarosis de 0,017.

Los sueros de los 11 pacientes seropositivos fueron utilizados en la

detección mediante 1D-Inmunodetección de alérgenos del E-SL2 de T. canis.

En la Tabla 11 se indican los resultados obtenidos junto a otros datos de

interés.

Tabla 11. Características demográficas y clínicas de la población con anticuerpos frente al

E-SL2 de T. canis

MUESTRA EDAD ATOPIAA EOSINOFILIAB ECPC sIgED sIgGE

1 > 5 Sí Normal No realizada + +

2 > 5 Sí Normal 18 + +

3 > 5 No Aumentada 11 + +

4 > 5 Sí Aumentada 6 + +

5 > 5 Sí No realizada 37 + +

6 < 5 No Normal 29 + +

7 < 5 No Aumentada 200 + +

8 < 5 No Normal 32 + +

9 < 5 No Aumentada 15 + +

10 < 5 Sí Aumentada 32 + +

11 < 5 Sí Aumentada 31 + +

R E S U L T A D O S

109

A. Valoración de la atopia mediante Phadiatop y fx 5 (Phadia). Los resultados positivos se

refieren a la positividad de cualquiera de las dos pruebas y los negativos a la negatividad de

ambas.

B. Se consideran valores elevados cuando exceden de 500 eosinófilos/mm3.

C. Se consideran valores positivos los situados por encima de 29 mcg/l (87% percentil)

D. IgE específica mediante SDS-PAGE Inmunotransferencia con E-SL2.

E. IgG específica mediante ELISA frente a T. canis.

R E S U L T A D O S

110

4. EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA

ENTRE ANISAKIS SIMPLEX Y TOXOCARA CANIS

Los resultados obtenidos de la determinación de IgE específica mediante

fluoroenzimoinmunoensayo (FEIA) para evaluar la reactividad cruzada entre

A. simplex y T. canis se muestran en la Tabla 12. Se consideraron valores

positivos los superiores a 0,1 kU/L.

Tabla 12. Valores de IgE específica obtenidos mediante FEIA con un pool de 11 sueros de

pacientes diagnosticados de toxocariosis

IgE específica T. canis 4,7 kU/L

IgE específica A. simplex 0,49 kU/L

La respuesta IgE del pool de sueros de pacientes diagnosticados de

toxocariosis frente al E-SL2 fue claramente positivo. Asimismo este pool de

sueros de pacientes, que no poseen ningún indicio clínico sugestivo de

anisakidosis, origina una respuesta ligeramente positiva al extracto completo

de Anisakis simplex.

5. OBTENCIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA TES-32

5.1. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Y SÍNTESIS DE ADN c

A partir de 0,2 ml de L2 se obtuvieron 7,5 µg/µl de ARN total. De éstos,

2 µg fueron utilizados en la síntesis de ADNc.

R E S U L T A D O S

111

5.2. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE

LA POLIMERASA (PCR) DEL FRAGMENTO DE ADN

CORRESPONDIENTE AL GEN TES-32

Los resultados de la amplificación (Figura 22) mostraron un único

fragmento de ADN con un tamaño de 700 pb.

Figura 22. Visualización en gel de agarosa al 1% del fragmento

amplificado

M: marcador HyperLadder IV

Calle 1: ADN T. canis; Calle 2: control reacción; Calle 3: control

negativo

M 1 2 3

5.3. CLONACIÓN EN EL VECTOR pCR2.1

El porcentaje de colonias recombinantes obtenidas fue del 86%.

1000- 900- 800- 700- 600- 500- 400- 300-

200-

100-

R E S U L T A D O S

112

5.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS COLONIAS RECOMBINANTES

5.4.1. ANÁLISIS MEDIANTE PCR

La Figura 23 muestra el resultado de la amplificación mediante PCR de 8

colonias recombinantes seleccionadas al azar.

Figura 23. Comprobación mediante PCR de la ligación del inserto al vector pCR 2.1

en gel de agarosa al 1%

M1: marcador HyperLadder I

M2: marcador HyperLadder IV

Calle 1-8: ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas al azar; Calle 9:

control de reacción; Calle 10: control negativo

M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Se observó que las 8 colonias elegidas al azar habían incorporado el

inserto de 700 pb.

800

1500

5000

R E S U L T A D O S

113

5.4.2. COMPROBACIÓN POR ANÁLISIS MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

A su vez se comprobó el tamaño del inserto mediante digestión con el

enzima EcoR I. El vector de clonación pCR 2.1 tiene una secuencia EcoR I a

ambos lados del sitio de clonación, permitiendo la liberación del inserto

clonado.

Tras la separación electroforética de los productos de restricción se

esperó obtener dos fragmentos, uno de 3931 pb correspondiente al vector de

clonación pCR2.1 y otro de 700 pb correspondiente al inserto. Como se

puede observar en la Figura 24, las colonias 1, 4, 5 y 7 habían incorporado el

inserto de 700 pb.

R E S U L T A D O S

114

Figura 24. Comprobación de la inserción del gen TES-32 en el

vector pCR 2.1 mediante digestión con enzima de restricción

EcoR I en gel de agarosa al 0,8%

M1: marcador HyperLadder I

M2: marcador HyperLadder IV

Calle 1-8:ADN plasmídico de 8 colonias recombinantes elegidas

al azar

M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8

Se realizó un stock de las colonias que habían incorporado el inserto de

700 pb para su conservación y posterior utilización.

800

1500

5000

R E S U L T A D O S

115

5.5. SECUENCIACIÓN

Los resultados de la secuenciación obtenidos mediante la búsqueda en la

base de datos BLAST se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13. Resultado de la búsqueda en la base de datos BLAST

Nº Acceso Descripción Alineamiento

con la secuencia

Identificación

Máxima

AF041023.1 Toxocara canis TES-32 Lectina tipo C 98% 98%

La secuencia comparte 689 pb y presenta un alineamiento del 98% con

la secuencia de la Lectina tipo C TES-32 de Toxocara canis descrita por Loukas

y col. (1999), difiriendo en tan sólo 9 nucleótidos.

En la Figura 25 se muestra el alineamiento de la secuencia clonada con la

secuencia AF041023.1.

R E S U L T A D O S

116

Figura 25. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF041023.1

1 TCGTCGTTTTGTTATGNCTCCACCTGTCCGCCACTAATGCTTGCGCCACCAACAATGACT 60 39 ................T............A....A......................... 98 61 GTGGTATTTTCCAAGTGTGCGTTAACAACGTCTGCGTTGCCAATAACCAAGGATGCAATC 120 99 ............................................................ 158 121 CGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCCTCCACCGGCAG 180 159 ............................................................ 218 181 CCACTACAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACGTGTCTGCCCACCCAATT 240 219 .............................................C.............. 278 241 AGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGGACGCTTCCTTTTCAACC 300 279 G........................................................... 338 301 AAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTGGTTCGACCAGTCGACTG 360 339 .........................T.................................. 398 361 TAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGCTCTCGGTCGTGGAGTAA 420 399 ............................................G.T............. 458 421 CCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGTGTTTACGAATGGAAGTC 480 459 ....A....................................................... 518 481 CAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATGCTGTGGTTCCAACGTCA 540 519 ............................................................ 578 541 CGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGATGATGCCCCATGCGGAA 600 579 ............................................................ 638 601 GTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAAGAGACCTCTCTAGATTCAATGCCTGC 660 639 ............................................................ 698 661 TGCGCTGATGGCGTCTTCGTTTCCTGCTG 689

699 ............................. 727

R E S U L T A D O S

117

Así mismo, se realizó un alineamiento mediante BLAST y mediante la

base de datos de www.nematode.net, con genes de diferentes especies de

helmintos (Toxascaris leonina, Toxocara cati, Ascaris suum, Anisakis simplex,

Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Necator americanus, Schistosoma mansoni,

Schistosoma japonicum, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Trichuris

trichiura, Caenorhabditis elegans y Taenia saginata) para ver el grado de similitud

existente entre la secuencia TES-32 clonada en el laboratorio, a partir de ahora

se denominará TES-32 C, y las secuencias de genes descritos de dichos

parásitos.

Mediante BLAST se llevaron a cabo dos tipos de alineamiento, uno

para secuencias muy similares y otro alineamiento para secuencias con alguna

similitud.

El alineamiento de secuencias mediante BLAST de genes de dichos

helmintos que fuesen muy similares a nuestra secuencia, mostró que TES-32

C presentaba una homología del 91% con la secuencia de la proteína del

proteoglicano del core de Toxocara canis (AB009305.2) descrita por Yamasaki y

col. (2000)(Figura 26).

R E S U L T A D O S

118

Figura 26. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AB009305.2.

1 TCGTCGTTTTGTTATGNCTCCACCTGTCCGCCACTAATGCTTGCGCCACCAACAATGACT 60 36 ................T........C........C......................... 95 61 GTGGTATTTTCCAAGTGTGCGTTAACAACGTCTGCGTTGCCAATAACCAAGGATGCAATC 120 96 ............................................................ 155 121 CGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCCTCCACCGGCAG 180 156 ...........C................................................ 215 181 CCACTACAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACGTGTCTGCCCACCCAATT 240 216 .............................................C.............. 275 241 AGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGGACGCTTCCTTTTCAACC 300 276 G........................................................... 335 301 AAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTGGTTCGACCAGTCGACTG 360 336 .........................T.................................. 395 361 TAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGCTCTCGGTCGTGGAGTAA 420 396 ............................................................ 455 421 CCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGTGTTTACGAATGGAAGTC 480 456 ............................................................ 515 481 CAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATGCTGTGGTTCCAACGTCA 540 516 ............................................................ 575 541 CGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGATGATGCCCCATGCGGAA 600 576 ............................................................ 635 601 GTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAAGAGACCTCTCTAGATTCAATGCCTGC 660 636 ...........................................................- 694 661 TGCGCTGATGGCGTCTTCGTTTCCTGCTG 689 695 .......................... 720

R E S U L T A D O S

119

Por otro lado, el alineamiento de secuencias de genes de diferentes

especies de helmintos que presentasen algún tipo de similitud con nuestra

secuencia se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14. Resultado del alineamiento de secuencias de diferentes helmintos que presentaban alguna

similitud con nuestra secuencia del TES-32

Nº Acceso Descripción Alineamiento con la secuencia

Identificación Máxima

AF126830.1 Tc-ctl-4 Lectina tipo C o TES-70 73% 69%

NW003037474.1 Smp_scaff016249 de S. mansoni1 3% 95%

XM002570961.1 Proteína hipotética (Smp_191120) S. mansoni1 3% 95%

FN357436.1 Smp_scaff000145 de Schistosoma mansoni1 4% 83%

FN373540.1 Smp_scaff016249 de Schistosoma mansoni 3% 95%

AY814075.1 SJCHGC09458 Schistosoma japonicum1 3% 88%

U88310.1 Cósmido C24G7 Caenorhabditis elegans1 3% 91%

Se realizó un árbol de distancias evolutivas del alineamiento de las

secuencias con alguna similitud con la secuencia TES-32 clonada en nuestro

laboratorio (Figura 27). Sólo se pudieron incluir las secuencias con número de

acceso AF126830.1 y FN373540.1, ya que las otras secuencias no se solapan

suficientemente con la secuencia clonada para formar el árbol.

R E S U L T A D O S

120

Figura 27. Árbol de distancias evolutivas de la secuencia TES-32 clonada en nuestro

laboratorio con las secuencias de la lectinas tipo C Tc-ctl-4 y la secuencia Smp_scaff016249

Lectina tipo C de T.canis

Schistosoma mansoni Smp_scaff016249

Secuencia TES-32 clonada en nuestro laboratorio

R E S U L T A D O S

121

En las Figuras 28 y 29 se muestra el alineamiento de nuestra secuencia

clonada con las secuencias AF126830.1 (Figura 28) y FN373540.1 (Figura 29).

Figura 28. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia AF126830.1.

129 AGGATGCAATCCGCCTTGTGTGGCTCCGCAGGTTTGCGTTGCACCAATGTGTGTCGCCCC 188 345 ............T..A....CA..AAAT...........G..T..G.AC..C...C.GG. 404 189 TCC---ACCGGCAGCC--ACTA-CAACTGCAGCTCCAGGCGTTACAACTACAAGACCACG 242 405 A..CAT....C..C..GC..A.T....CA..A..G.GCCT.CA.....GCG.GC.....C 464 243 TGTCTGCCCACCCAATTAGACGCCGTTCAACAACAATTGCTATATCGCCTCTCTACCTGG 302 465 .TCT..........G..G.T.........G.GGTC....T..CTA..TGG..G.---... 521 303 ACGCTTCCTTTTCAACCAAGCTAGCGACTGGTGTACACAGACCGGCTCAAGAGTTGTGTG 362 522 .TCG.................CTCA........C..G......AA.......CC...C.. 581 363 GTTCGACCAGTCGACTGTAGGAAACTTCGGCAGCGAACTGAACTTCGTCAACAGTTTCGC 422 582 ......T.....A.AC.....T.CA......GC...G..CT.T...A.....GT.C.... 641 423 TCTCGGTCGTGGAGTAACCAGGTACTGGATAGGAGTGAACAGACAGTTCGGCCAGTGGGT 482 642 .GCTTC......T...CAA.CT......C.C..GC.C.....G.....T.....A..... 701 483 GTTTACGAATGGAAGTCCAGTGATATTTTCGAACTGGAGGCCTAGTCAACCGGACGGATG 542 702 C.GG..A..C..C.....GT.......C...........AGGG...G....A........ 761 543 CTGTGGTTCCAACGTCACGTGTGCGTTCGTTAATTACGCGAACTTCCTCGGCCAATGGGA 602 762 T.....CGG.........T..C...C.T..C..C.....C...CC.T.T..A..G..... 821 603 TGATGCCCCATGCGGAAGTTTGTTTACGACTCCACAAGGCTTCGTATGCAA 653 822 .......GG......C.ACA.C.GG.GA.A...T.....T...A....... 872

Figura 29. Alineamiento de la secuencia clonada con la secuencia FN373540.1.

393 CAGCGAACTGAACTTCGTCAAC 414 1885 ..............C....... 1864

R E S U L T A D O S

122

De todas las secuencias de helmintos comparadas mediante BLAST

con la secuencia TES-32 C, sólo se encuentra un 98% de homología con la

secuencia TES-32 descrita por Loukas y col. (1999), un 91% de homología

con la secuencia del proteoglicano del core de T. canis descrita por Yamasaki y

col. (2000) y una alta homología (72%) con la secuencia correspondiente a la

lectina tipo C Tc-ctl-4 ó TES-70 para el TES-70 (Loukas y col., 2000)

No se encuentran homologías relevantes con otras proteínas de

helmintos ya descritas.

En el alineamiento mediante la base de datos Washington University

Parasitic Nematode EST Sequencing Project (www.nematode.net) de la secuencia

TES-32 C con las de los genes de diferentes especies de helmintos, tampoco

se encontraron homologías relevantes con otras secuencias de helmintos

descritas en esa base de datos.

DISCUSIÓN

D I S C U S I Ó N

124

Las infecciones por nematodos y otros helmintos están frecuentemente

asociadas con eosinofilia y altos niveles de IgE, hechos que también son

característicos de pacientes con reacciones de hipersensibilidad tipo I o

hipersensibilidad mediada por IgE frente a determinados antígenos (Meeusen,

1999).

Es bien conocido que los helmintos poseen un elevado número de

componentes que son capaces de modular la respuesta inmunitaria frente a la

infección (Falcone y col., 2004; Maizels y col., 2004), de los que un número

relevante pueden mostrarse como antígenos capaces de intervenir en el

desarrollo de esa respuesta inmunitaria. De este panel de antígenos, algunos

pueden comportarse como alérgenos, es decir, fijadores de IgE (Sereda y col.,

2008).

De los diferentes estadios de T. canis que a lo largo de su ciclo biológico

interactúan con el hospedador definitivo (Cordero del Campillo y Rojo-

Vázquez, 1999), es el estadio de larva infectante L2 el que es capaz de infectar

también a hospedadores aberrantes, incluido el hombre, pudiendo dar lugar al

desarrollo del Síndrome de Larva Migrans (Magnaval y col., 2001; Despomier,

2003).

Además, las larvas infectantes L2 de T. canis son capaces de excretar-

secretar una serie de componentes que pueden estar relacionados con la

D I S C U S I Ó N

125

modulación de la respuesta inmunitaria e incluso pueden estar implicados en

los mecanismos de evasión de la misma (Maizels y Loukas, 2001).

Por estas dos circunstancias, los productos de excreción-secreción

larvarios se han elegido para estudiar la respuesta inmunitaria mediada por IgE

que T. canis induce tanto en el hospedador definitivo como en el hospedador

intermediario aberrante (hombre).

Desde hace unos años, la caracterización de antígenos de T. canis se ha

enfocado fundamentalmente desde el punto de vista molecular, en estudios de

inmuno-evasión y diagnóstico de la toxocarosis (Maizels y Loukas, 2001;

Yamasaky y col., 2000), pero desde el punto de vista inmunológico no hay

datos que permitan definir alérgenos relevantes de T. canis asociados a

respuestas Th2 (asociadas también a hipersensibilidad tipo I).

Al respecto, aunque el grupo de proteínas alergénicas de nematodo

(NPA) de Toxocara canis (TBA-1) está asociado al término alérgeno, dada su

similitud al grupo ABA-1 de Ascaris, hasta la fecha no se ha demostrado que

dichas proteínas induzcan una respuesta inmunológica mediada por IgE

(Yahiro y col., 1998).

En este trabajo, como una primera aproximación a la identificación de

posibles alérgenos de Toxocara, se realizó un estudio en una población de

perros naturalmente infectada por este nematodo.

D I S C U S I Ó N

126

Como se sabe, la infección natural por T. canis es común en diferentes

poblaciones caninas de todo el mundo (Rubel y col., 2003). En Europa, estos

datos son más elevados, destacando la elevada prevalencia (82,6%) en

ciudades como Dublín (O'Lorcain, 1994) con datos cercanos al 33% en países

como Polonia (Luty, 2001) e Italia (Habluetzel y col., 2003). En España, los

datos de prevalencia van desde el 4,5% en una población de perros de Badajoz

(Pérez-Martín y col., 1992) y del 5,6% en Álava (Benito y col., 2003) hasta el

33% en Salamanca (Conde-García y col., 1989).

Hasta la realización del presente estudio, los ensayos realizados en el

hospedador definitivo estaban basados en la respuesta inmunológica del perro

mediante la determinación de los niveles de IgG utilizando la técnica de

ELISA (Deplazes y col., 1995; Rubel y col., 2003), pero no existían estudios de

determinación de los niveles de IgE en perros infectados naturalmente por T.

canis.

En 1975 de Savigny publicó que las larvas L2 de T. canis se pueden

mantener in vitro durante largos periodos de tiempo, a fin de obtener sus

productos de excreción-secreción.

En nuestro laboratorio hemos conseguido mantener in vitro las larvas

infectantes basándonos en éste y otros métodos descritos por diferentes

autores. En primer lugar, se consiguió reducir el tiempo de embrionamiento

D I S C U S I Ó N

127

de los huevos de 38 días a un mínimo de 28, manteniendo los cultivos en

presencia de luz, según describen Del Águila y col. (1988), a una temperatura

constante de 27°C y con una humedad relativa del 80% (Cordero del Campillo

y Rojo-Vázquez, 1999).

El método de eclosión utilizado fue similar al descrito por Del Águila y

col. (1988), pero la incubación con tampón carbonato/bicarbonato se

sustituyó por una incubación de 30 minutos en la mezcla de hipoclorito

sódico/NaOH 2%, permitiendo una supervivencia mayor de las larvas. Se

incluyeron varios lavados mediante centrifugación y se introdujo un paso final

de incubación a 37 °C y en agitación, que permitió la eclosión del 100% de los

huevos.

El mantenimiento in vitro de las larvas L2 se realizó según el método

desarrollado por de Savigny (1975) con modificaciones. Esta metodología

permitió la obtención de los productos de excreción-secreción larvarios con

un rendimiento en proteínas del 40%.

La obtención del E-SL2 permitió realizar la caracterización bioquímica e

inmunoquímica de sus componentes proteicos frente a sueros de perros

naturalmente infectados por T. canis y sueros humanos de pacientes

diagnosticados de toxocarosis.

D I S C U S I Ó N

128

El resultado del perfil proteico del E-SL2 de T. canis mediante

electroforesis unidimensional fue similar al descrito por Maizels y col. (1984)

que mostraba componentes proteicos entre los 32 y los 400 kDa. El perfil que

se ha caracterizado está constituido por 8 componentes de naturaleza proteica

con masas moleculares entre 25 y 77 kDa. Dentro de este rango, destacan dos

bandas de 37 y 50 kDa y otros dos grupos de componentes de 30-35 y 73-77

kDa que se tiñeron con más intensidad indicando que son los componentes

más abundantes en este extracto.

Para una mejor resolución de estos componentes proteicos se abordó la

separación mediante 2D-electroforesis, obteniendo así un perfil proteico en el

que observamos 40 proteínas distribuidas en un rango de pH de 5,3 a 9,8 y

con masas moleculares entre los 30 y 100 kDa. El número de componentes

observados fue mayor al descrito por Page y col. (1991) que detectaron 30

proteínas mediante electroforesis bidimensional.

Los patrones que se revelan con las dos tinciones utilizadas en la

electroforesis bidimensional son distintos.

En el perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción con

azul de Coomassie aparecen tres componentes de masa molecular 100 kDa y

pI entre 9,3 y 9,6 que no se observan en la tinción de plata. Así mismo, en el

perfil proteico resultante de la 2D-electroforesis y tinción de plata aparece un

D I S C U S I Ó N

129

componente de 50 kDa y pI 7 y una serie de componentes con masa

molecular de 75 kDa y en el rango de pI de 5,3 a 9,8, que no se observan en la

tinción con azul de Coomassie.

La detección de un mayor número de componentes en la 2D-

electroforesis y tinción de plata se debe a la mayor sensibilidad de esta última

tinción, dado que con la tinción con azul de Coomassie el límite de detección

es de 40 ng de proteína por punto, con la tinción de plata se pueden detectar 1

ng de proteína por punto. Esto podría explicar el mayor numero de

componentes de naturaleza proteica detectados en la 2D-electroforesis y

tinción con plata.

Sin embargo, independientemente de la tinción utilizada, destacan dos

grupos de componentes: un grupo entre los 30 y 37 kDa y pI entre 5,5 y 9,8; y

otro grupo de componentes proteicos entre los 65 y los 75 kDa y con un pI

entre 5,3 y 9,8.

Estos resultados obtenidos mediante la electroforesis tanto

unidimensional como bidimensional indican que los productos de excreción-

secreción a partir de cultivos in vitro de larvas L2 de Toxocara contienen los

principales componentes proteicos (32 kDa y otro alrededor de los 75 kDa)

descritos en la literatura por otros autores (Maizels y col., 1984) y que se han

utilizado para propuestas diagnósticas.

D I S C U S I Ó N

130

Como se ha comentado anteriormente, hasta la fecha no existían

estudios sobre la respuesta inmunitaria mediada por IgE que las L2 podrían

inducir en el hospedador definitivo, por lo que la caracterización

inmunoquímica del E-SL2 en una población de perros naturalmente

infectados por T. canis aporta datos inéditos sobre la naturaleza de las

proteínas que inducen la síntesis de IgE y por consiguiente del mayor

conocimiento sobre la relación parásito-hospedador.

Así, se ha comprobado que los productos de excreción-secreción

larvarios son capaces de inducir en los perros una respuesta humoral mediada

por IgE.

En la inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE, separadas

mediante 1D-Inmunodetección, se detectaron 13 componentes diferentes con

un rango de masas moleculares entre los 32 y 200 kDa. Siete de estos

componentes, con masas moleculares de 75, 80, 95, 110, 120 kDa y dos

componentes de más de 200 kDa, fueron reconocidos por el 65-80% de los

sueros de perros naturalmente infectados por T. canis. En el rango de baja

masa molecular, entre los 32 y los 50 kDa, entre el 5 y el 10% de los 20 sueros

reconocieron proteínas capaces de unir IgE. Los componentes fijadores de

IgE que se revelaron en más del 50% (75, 80, 95, 110, 120 kDa y dos

D I S C U S I Ó N

131

componentes de más de 200kDa) de los sueros de perros naturalmente

infectados por T. canis se pueden considerar alérgenos mayores.

La inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE canina con la mezcla

de los 20 sueros de perros naturalmente infectados por T. canis y separadas

mediante 2D, reveló 20 componentes inmunoreactivos capaces de fijar IgE

con un rango de pesos moleculares entre los 32 y los 75 kDa. Los resultados

del análisis de la huella peptídica identificaron dos alérgenos correspondientes:

uno con la lectina tipo C TES-32 y otro, con la lectina tipo C Tc-ctl-4/TES-70

de Toxocara canis, dos de las proteínas más abundantemente secretadas por las

larvas de T. canis (Page y col., 1992; Maizels y Loukas, 2001) pero no

identificadas como alérgenos hasta este estudio.

Los patrones alergénicos resultantes de la 1D-inmunodetección y la 2D-

inmunodetección con sueros de perros naturalmente infectados por T. canis

son distintos. Si bien en la 1D-inmunodetección tan sólo en tres de los 20

sueros estudiados el antígeno de 32 kDa fue capaz de fijar IgE, en la 2D-

inmunodetección, el pool de esos mismos 20 sueros permitió identificar

principalmente diferentes isoformas de esta proteína. Esta diferencia puede

ser debida a la técnica utilizada a la hora de abordar tanto la electroforesis

como la inmunodetección. Mientras que la 1D-electroforesis desnaturaliza los

componentes del E-SL2 y los separa sólo por su masa molecular, la 2D-

D I S C U S I Ó N

132

electroforesis consigue una mejor separación de los componentes proteicos

puesto que los separa primero por su pI y después por su masa molecular,

siendo por lo tanto una técnica más resolutiva para separar mezclas complejas

de proteínas.

En cuanto a la inmunodetección hay que tener en cuenta que el revelado

por quimioluminiscencia es una metodología mucho más sensible que el

revelado colorimétrico por 4-Cloro-1-Naftol.

Por tanto y a la vista de nuestros resultados, se propone utilizar la 2D-

inmunodetección y revelado por quimioluminiscencia como técnica más

apropiada en la identificación de alérgenos por su mayor capacidad de

resolución analítica.

Los alérgenos identificados en este estudio son lectinas de tipo C que

coinciden con los antígenos descritos por Maizels y col. (1984) y Maizels y

Loukas (2001) quienes proponen que dichas proteínas pueden ser marcadores

diagnósticos de la infección por Toxocara. (Magnaval y col., 1991; Maizels y

Loukas, 2000; Smith y col., 2009). Como hemos comprobado, estas proteínas

son fijadoras de IgE por el hospedador definitivo, aunque se necesitan

estudios complementarios para poder definir estos alérgenos como “alérgenos

mayores” del perro. Las limitaciones de la SDS-PAGE-IgE

inmunotransferencia observadas en este estudio no permitieron estudiar el

D I S C U S I Ó N

133

porcentaje de animales que individualmente respondieron específicamente a

este alérgeno por lo que la obtención individualizada de esta proteína es

relevante para la realización de dicho objetivo.

La respuesta Th2 mediada por IgE parece tener una relación directa con

los mecanismos de defensa natural del hospedador definitivo frente a la

invasión parasitaria por helmintos (Hagan y col., 1991) y además, reforzaría la

cada vez más evidente teoría de que dicha respuesta inmunitaria ha

evolucionado en los hospedadores vertebrados para limitar la carga de

parásitos metazoos (Fitzsimmons y Dunne, 2009).

Cabe señalar que no habiéndose encontrado otros helmintos en el

intestino de los perros estudiados y que los sueros de perros libres de

helmintos utilizados como control negativo no reconocieron ninguna proteína

en el E-SL2, se puede deducir que los alérgenos identificados en este estudio

son específicos y podrían ser utilizados para el diagnóstico rutinario de la

toxocarosis en el hospedador definitivo.

Por otro lado, en el presente estudio la inmunodetección de proteínas

fijadoras de IgG canina separadas mediante 1D mostró un perfil de 14

proteínas capaces de fijar IgG. Doce de estos componentes, con masas

moleculares de 32, 35, 37, 42, 55, 80, 95, 110, 120, 140, y dos componentes

con masa molecular mayor de 200 kDa, fueron reconocidos por el 60%-80%

D I S C U S I Ó N

134

de los sueros de perros naturalmente infectados por T. canis, por lo que

podrían ser considerados, en su definición clásica, como antígenos mayores de

las L2 de T. canis.

Hasta el momento y que se haya comprobado, no existen estudios

previos en la literatura que describan patrones de componentes capaces de

fijar tanto IgE como IgG en los sueros de perros, haciendo difícil comparar

nuestros resultados con otros ya existentes.

Se sabe que existen dos hechos dominantes en las infecciones

helmínticas: uno, son de larga duración y tienden a cronificarse, permitiendo a

los parásitos de lenta maduración el acceso a los órganos diana y su

reproducción; y dos, son eficientes inductores de respuestas Th2

(Yazdanbahsah y col., 2001).

La verificación de respuesta específica a estas lectinas mediada tanto por

IgG como por IgE indican que la población estudiada ha estado expuesta de

forma prolongada a la infección por larvas de T. canis y que éstas intervienen

en las respuestas Th2.

Cuando se compara la respuesta IgG/IgE del E-SL2 en cánidos, se

identifica una respuesta homogénea frente a siete componentes con masas

moleculares de 80, 95, 110, 120, 140 kDa y dos componentes con masas

D I S C U S I Ó N

135

moleculares mayores de 200 kDa, que son identificados por el 70% de los

sueros de perros naturalmente infectados por T. canis.

Este hecho nos hace considerar que: primero, estos componentes son

antígenos mayores en su definición clásica ya que son reconocidos por el 70%

de los sueros caninos naturalmente infectados por T. canis y, segundo, que los

componentes del E-SL2 son capaces de inducir respuesta IgG y respuesta

IgE, confirmando, tal y como Schultz y Halliwell (1985) sugirieron, que la IgE

podría reforzar la respuesta del hospedador definitivo frente a antígenos

parasitarios.

Una vez constatado que los perros presentan una respuesta inmunitaria

humoral IgE frente al extracto E-SL2 además de una respuesta IgG, el

siguiente propósito de nuestro estudio fue caracterizar los posibles alérgenos

en una población de pacientes (hospedador intermediario aberrante)

diagnosticados de toxocarosis asintomática.

La inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE del E-SL2 con 11

sueros de pacientes diagnosticados de toxocarosis, mostró 8 alérgenos

diferentes de 25, 27, 32, 35, 40, 45, 75 y 100 kDa, en el que cabe destacar la

proteína de 35 kDa que fue reconocida por el 90% de los sueros de pacientes

de este estudio. La mezcla de sueros negativos no reconoció ningún antígeno

D I S C U S I Ó N

136

fijador de IgE del E-SL2, por lo que se puede deducir que la respuesta es

debida a los antígenos capaces de fijar IgE de Toxocara canis.

Este perfil de proteínas fue similar a los perfiles de proteínas fijadoras de

IgG mencionados en la literatura. Al respecto, señalar que Speiser y Gottstein

(1984) detectaron entre 10 y 14 componentes fijadores de IgG; Maizels y col.

(1984) describieron 5 componentes principales (32, 55, 70, 120 y 400 kDa); y

Magnaval y col. (1991) describieron 7 proteínas de excreción-secreción

fijadoras de IgG de 24, 28, 30, 35, 132, 147 y 200 kDa con 10 sueros de

pacientes diagnosticados de toxocarosis.

Sin duda alguna, y aunque el patrón de alérgenos de T. canis y antígenos

fijadores de IgG descritos en la literatura sean parecidos, la combinación de

técnicas que revelan la respuesta IgE con la combinación de técnicas que

revelan la respuesta IgG, ofrece más información inmunopatológica de la

infección por Toxocara en el hospedador intermediario aberrante y

probablemente esta combinación de técnicas también se podría aplicar en el

hospedador definitivo.

Magnaval y col. (1991) afirman que los antígenos de menor peso

molecular, entre los 24 y los 35 kDa, son los más específicos para el

diagnóstico de la toxocarosis humana sin describir cúal es la naturaleza de

estos antígenos. Es muy probable que el antígeno de 35 kDa descrito por

D I S C U S I Ó N

137

Magnaval y col. (1991) se corresponda con la lectina tipo C TES-32

identificada por Loukas y col. (1999). Nuestros resultados muestran que este

antígeno de 35 kDa también induce una respuesta IgE en el hombre y además

en este estudio se ha identificado como lectina de tipo C TES-32. El hecho de

que TES-32 pueda inducir una respuesta Th2 mediada por IgE y dado que

filogenéticamente tampoco se han encontrado secuencias similares a esta

lectina en otros helmintos, corroboraría la especificidad de TES-32 que

propusieron Magnaval y col. (1991).

En relación con lo antedicho, algunos autores indican que la detección

de IgE específica frente a los antígenos de excreción-secreción de T. canis,

junto con la determinación de la proteína catiónica eosinofílica (ECP) son

marcadores de infección activa en la toxocarosis humana (Genchi y col., 1988;

Magnaval y col., 2001). Según esto, 6 de los 11 pacientes seropositivos frente

al antígeno E-S de Toxocara podrían corresponder a formas activas de

toxocarosis, aunque en ninguno de ellos se pudieron demostrar indicios de

dicha actividad manifiesta (asintomáticos o toxocarosis encubierta).

Además, los 11 sueros de pacientes estudiados también mostraron una

respuesta IgG/IgE frente a las proteínas E-SL2 de T. canis. Hasta la fecha

existen pocos trabajos que estudien la respuesta inmunológica humoral en el

hospedador intermediario frente a la infección por larvas de Toxocara

D I S C U S I Ó N

138

analizando al mismo tiempo anticuerpos de las clases IgE e IgG (Genchi y

col., 1988; Magnaval y col., 2002; Guisantes y col., 2007). Esta respuesta

IgE/IgG sugiere, al igual que en el hospedador definitivo, una respuesta

conjunta frente a la infección en la que la IgE podría reforzar la respuesta del

hospedador intermediario frente a los antígenos de E-SL2 de Toxocara canis.

Por otra parte, se sabe que en la infección por Toxocara la coexistencia de

IgG e IgE específicas pueden competir por los mismos antígenos del E-SL2,

pudiéndose producir un enmascaramiento de la presencia de los anticuerpos

IgE por inhibición competitiva con los de la clase IgG que están en

concentraciones muy superiores (Genchi y col., 1988). Por tanto y desde el

punto de vista serológico la determinación de anticuerpos frente al E-SL2

pertenecientes a ambos isotipos aportaría un valor añadido al diagnóstico de

esta parasitosis, lo que apoyaría los resultados obtenidos por Magnaval y col.

(2002).

Como hemos comentado anteriormente, varios autores hablan de la

especificidad que los componentes de 24-35 kDa del E-SL2 confieren a las

técnicas para diagnóstico de la toxocarosis (Magnaval y col. 1991; Smith y col,

2009). Asimismo, estudios realizados por diferentes autores (Magnaval y col

1991, Park y col, 2000, Nunes y col, 1999, Lynch y col 1988) indican que

existe reactividad cruzada entre los componentes de alto peso molecular del

D I S C U S I Ó N

139

E-SL2 (>32 kDa) con anticuerpos de helmintos relacionados

filogenéticamente (Ascaridida, Filarioidea, Strongyloididae) y no tanta

reactividad cruzada con otros helmintos menos relacionados

filogenéticamente: Taeniidae, Trematoda, Cestoda (Ishida y col, 2003).

En la actualidad la reactividad cruzada, término difícil de definir, se

considera un término inmunológico que expresa la homología entre antígenos

diferentes y este concepto se puede asociar a los conceptos bioquímicos entre

homología de genes de expresión y homología entre secuencias de proteínas

(Ferreira y col., 2004).

Se acepta actualmente que aquellas proteínas o genes que codifican

proteínas que tienen un porcentaje de homología superior al 70% sean

antígenos que generan reactividad cruzada entre ellos (Ferreira y col., 2004).

En este sentido no se conocen estudios de reactividad cruzada de TES-

32 con otros antígenos individualizados de helmintos. Tanto la secuencia

obtenida por Loukas y col (1999) como la nuestra -que codifican para TES-

32- se ha podido demostrar en el presente trabajo que no se parecen a

estructuras descritas para otros helmintos, por lo que asumimos que el TES-

32 puede constituir un antígeno/alérgeno específico de Toxocara canis.

Conjuntamente con los estudios de otros autores hemos visto que sueros

reactivos a Toxocara de pacientes que no poseen ningún indicio clínico

D I S C U S I Ó N

140

sugestivo de anisakidosis, originan reacciones cruzadas débiles a extractos

alergénicos de Anisakis. Anadón y col. (2010) hablan de la especificidad de

alérgenos relevantes de Anisakis, Ani s 1 y Ani s 7, que son alérgenos

específicos de larvas y no encuentran homología con ninguna secuencia

descrita. Por lo cual, la reacción cruzada que se ha encontrado en este estudio

se puede deber a componentes de Anisakis no descritos y con alguna

homología con TES-32 o con otros componentes del E-SL2 que no sean

TES-32. Tanto nosotros como otros autores (Anadón y col., 2010) parecen

indicar que la reactividad cruzada entre Anisakis y Toxocara, dos especies del

grupo de los ascáridos, se debería más a componentes distintos a TES-32,

Anis 1 y Ani s 7

En cuanto a la caracterización inmunoquímica de proteínas fijadoras de

IgE humana separadas mediante 2D, nuestros resultados muestran un patrón

de hasta 17 componentes alergénicos, 13 de los cuales fueron identificados

mediante el análisis de la huella peptídica como diferentes isoformas de dos

lectinas de Toxocara canis: la lectina tipo C TES-32 y la lectina tipo C Tc-CTL-4

ó TES-70.

Algunos de los componentes enviados a secuenciar no pudieron ser

identificados. En la actualidad se está intentando obtener más información de

esos componentes.

D I S C U S I Ó N

141

Si comparamos los antígenos que intervienen en la respuesta Th2 que T.

canis induce tanto en el hospedador definitivo como en el hombre,

encontramos dos patrones distintos según la técnica empleada para separar los

mismos. Mientras que en la inmunodetección de proteínas fijadoras de IgE,

separadas mediante electroforesis unidimensional, con los sueros caninos se

detectaron componentes de bajo peso molecular (15-30) en un bajo

porcentaje de sueros, en la inmunodetección con los sueros de pacientes

diagnosticados de toxocarosis los componentes de bajo peso molecular fueron

reconocidos por la gran mayoría de los sueros de pacientes de este estudio,

con patrones similares a los ya descritos por otros autores (Maizels y col.,

1984; Magnaval y col, 1991).

Sin embargo, cuando comparamos los patrones resultantes de la 2D-

inmunodetección en el hospedador definitivo y en el hombre, podemos

afirmar que la respuesta IgE frente a T. canis es muy similar. En ambas

inmunodetecciones se identificaron los mismos alérgenos correspondientes

uno con la lectina tipo C TES-32 y otro, con la lectina tipo C Tc-ctl-4/TES-70

de Toxocara canis.

Las lectinas tipo C, identificadas en nuestro estudio como alérgenos de

T. canis, son una de las 7 familias que posee la superfamilia de C type lectin-like

superfamily. Son proteínas que unen carbohidratos de una manera Ca2+

D I S C U S I Ó N

142

dependiente y podrían jugar un papel importante en la evasión de la respuesta

inmunitaria e intervenir en el reconocimiento y establecimiento del parásito en

los tejidos del hospedador (Loukas y Maizels, 2000)

Muchas de estas lectinas tipo C son receptores celulares de superficie

con un papel pivotante en la activación del sistema inmunitario de los

vertebrados (Weiss y col., 1998). Sus funciones serían la defensa frente a

patógenos, tráfico celular, regulación inmunitaria y la prevención de la

autoinmunidad (Cambi y Figdor, 2003). TES-32 es la primera lectina tipo C

descrita en un parásito helminto (Loukas y col., 1999) y además es la más

secretada por T. canis siendo su ARNm es el más expresado de todos,

representando el 6% de todos los transcritos (Loukas y Maizels, 2000).

Recientemente se ha observado que TES-32 contiene un dominio N-terminal

rico en cisteína y un dominio C-terminal lectina tipo C que presenta

similitudes tanto en la secuencia como en la estructura con las lectinas tipo C

relacionadas con el sistema inmunitario del hombre (Loukas y Maizels, 2000),

siendo considerada como una de las principales proteínas que utiliza el

parásito para modular el sistema inmunitario del hospedador (Loukas y col.,

1999).

D I S C U S I Ó N

143

Además, TES-32 ha sido localizada en la epicutícula de larvas de T. canis

y se postula que su ruta de secrección es transcuticular, aunque el mecanismo

involucrado no se conoce (Loukas y Maizels, 2000).

Nuestros resultados demuestran que TES-32 puede ser considerada

como la principal proteína fijadora de IgE (alérgeno) de Toxocara canis, en

sujetos con toxocarosis asintomática o encubierta.

Los otros componentes alergénicos identificados mediante el análisis de

huella peptídica tanto en el hospedador definitivo como en el hombre, se

correspondieron con la lectina tipo C Tc-CTL-4 ó TES-70.

TES-70 es otra de las glicoproteínas más abundantemente secretadas por

T. canis (Maizels y Loukas, 2001) y como lectina es capaz de unirse de una

manera Ca2+ dependiente a la superficie de células endoteliales de mamífero.

Esto sugiere que los glicanos del hospedador implicados en la inmunidad, son

ligandos para estas lectinas de T. canis (Loukas y Maizels, 2000).

En relación con su función, se ha sugerido que los organismos

patógenos utilizan selectivamente lectinas para modular la respuesta Th de sus

hospedadores (Loukas y Maizels, 2000). En el caso de Toxocara se ha

demostrado que los productos de excreción-secreción larvarios contienen

antígenos que estimulan respuestas Th2 (Del Prete y col., 1991; Allen y

MacDonald, 1998). De estos antígenos se cree que las lectinas tipo C podrían

D I S C U S I Ó N

144

ser las principales candidatas a producir este tipo de modulaciones en la

respuesta inmunitaria el hospedador (Loukas y Maizels, 2000) y por tanto,

cruciales en la evasión de dicha respuesta (Loukas y Maizels, 2000).

Se considera que las respuestas Th2, en las que intervienen la IgE y las

respuestas efectoras asociadas también a los fenómenos de hipersensibilidad,

forman parte de la respuesta protectora frente a parásitos metazoos

(Fitzsimmons y Dunne, 2009). En estos casos el hospedador inicia una

respuesta Th2 característica, aumentando la producción de IgE así como el

reclutamiento, proliferación y activación de eosinófilos y mastocitos

(Perrigoue y col. 2008).

Por su parte, los parásitos son capaces de diseñar estrategias altamente

sofisticadas, que a lo largo de su evolución han sido adoptadas por ellos con

eficacia y que han tenido como objetivo la evasión de la respuesta inmunitaria

desarrollada por los hospedadores haciendo que el establecimiento de los

parásitos sea más eficaz. Dichas estrategias son de muy diversa índole y van

desde la variación antigénica hasta el mimetismo molecular (Yazdanbakhsh y

Sacks, 2010).

Por otra parte, en este estudio se ha podido demostrar que los

hospedadores, tanto definitivo como intermediario, reconocen esas moléculas

D I S C U S I Ó N

145

(TES-32 y TES-70) y son capaces de responder frente a las mismas con

respuestas Th2 mediadas por IgE.

Pero, ¿qué pasa cuando el hospedador presenta hipersensibilidad tipo I o

hipersensibilidad mediada por IgE frente a determinados antígenos sin estar

presente el parásito? Los antígenos serían el punto de unión clave entre las

respuestas mediadas por IgE frente a parásitos y las respuestas alérgicas dónde

no está presente el parásito.

En la actualidad se acepta cada vez más que lo que hace que una proteína

se defina como un alérgeno es que dicha proteína se pueda incluir en una de

las familias de proteínas que se saben incluyen a los alérgenos, y que dichas

proteínas tengan sus homólogas en aquellas de origen parasitario que tienen la

capacidad de originar respuestas Th2 con intervención de la IgE (Fitzsimmons

y Dunne, 2009, Radauer y col., 2008).

Por tanto la actividad alergénica está asociada/restringida a aquellas

proteínas que estructuralmente estarían relacionadas con un limitado número

de proteínas parasitarias que estimulan la respuesta Th2, considerada como la

respuesta natural de los hospedadores mamíferos frente a parásitos

principalmente helmintos.

En la base de datos Allfam (Radauer y col., 2008) que agrupa las

proteínas alergénicas por familias, parece que sólo determinadas familias de

D I S C U S I Ó N

146

proteínas pueden estimular la respuesta IgE frente a parásitos y desencadenar

la respuesta alérgica mediada por IgE (Fitzsimmons y Dunne, 2009).

Dentro de estas familias alergénicas encontramos 4 subfamilias de

lectinas alergénicas (Tabla 15) de origen no helmíntico, principalmente de

plantas.

Tabla 15. Subfamilias de lectinas alergénicas

Nº Acceso Nombre Nº de alérgenos

AF034 Lectina Leguminosa 4

AF039 Proteína inactivadora de ribosoma 8

AF043 Dominio como Heveína 11

AF078 Dominio Peritrofin-A de unión a Quitina 4

Dada la naturaleza de lectinas de los dos alérgenos de Toxocara canis

(TES-32 y TES-70) identificados en una población de pacientes con

toxocarosis asintomática y dado que existen proteínas dentro de la familia de

las lectinas que son capaces de estimular la respuesta alérgica mediada por

IgE, se debería incluir en esta base de datos una nueva subfamilia, las lectinas

tipo C con dos nuevos alérgenos, TES-32 y TES-70.

D I S C U S I Ó N

147

Según Fitzsimmons y Dune (2009) la alergia podría tener un origen

parasitario y podemos suponer por tanto que estas lectinas parasitarias que

nosotros hemos descrito como alérgenos de Toxocara canis podrían formar

parte del origen de las respuestas alérgicas a sustancias que contienen lectinas

y que no se incluyen en los grupos de parásitos.

Es de suponer que existe alguna relación entre las respuestas IgE

mediadas a lectinas de T. canis y las lectinas procedentes de fuentes alergénicas

no helmínticas y en este sentido, sería de gran interés un estudio más

pormenorizado de estas glicoproteínas tanto a nivel inmunoalergológico como

a nivel bioquímico-estructural.

Por otra parte, la tecnología del ADN recombinante nos ha permitido

obtener y clonar el gen que codifica para la proteína alergénica TES-32. El

alineamiento realizado en nuestro estudio de la secuencia del gen que codifica

para TES-32 con otros genes de nematodos en distintas bases de datos:

BLAST y Washington University Parasitic Nematode EST Sequencing Project

(Wylie y col., 2004) nos aporta datos interesantes. Existe una homología del

98% de nuestra secuencia con la secuencia descrita por Loukas y col. (1999) y

una homología del 91% de nuestra secuencia con la secuencia descrita por

Yamashaki, (2000) y es muy probable que estas tres proteínas sean la misma

dado el porcentaje de homología existente. También se ha comprobado que

D I S C U S I Ó N

148

existe una alta homología (70%) entre TES 32 y TES-70. De cualquier

manera, el hecho de que TES-32 y TES-70 pertenezcan a la misma familia de

proteínas y que su porcentaje de homología sea del 70%, sugiere que entre

estas dos proteínas exista un elevado nivel de reactividad cruzada.

No se han encontrado homologías relevantes con otros genes de

nematodos, lo que no implica que existan lectinas alergénicas en parásitos

diferentes a T. canis y que por tanto puedan tener una implicación importante

en el desarrollo de la respuesta alérgica.

Por otro lado, el mantenimiento de este gen en un sistema microbiano

implica su posible expresión como proteína recombinante, lo cual

proporcionaría una fuente constante de obtención de esta proteína

individualizada, que podría ser una herramienta estándar para futuros estudios.

Asimismo, nos permitiría conocer si esta proteína juega un papel importante

en otras formas clínicas como, por ejemplo, en la urticaria asociada a Toxocara

o en formas clínicas activas.

CONCLUSIONES

C O N C L U S I O N E S

150

1. Se describen por primera vez patrones de componentes proteicos en el

E-SL2 de Toxocara canis capaces de inducir una respuesta mediada por

isotipos tanto de la clase IgG como IgE en el hospedador definitivo.

2. Dichos componentes tienen masas moleculares de 80, 95, 110, 120, 140

y 200 kDa.

3. Los componentes del E-SL2 con masas moleculares de 80, 95, 110,

120, 140 y 200 kDa son reconocidos por el 70% de la población canina

estudiada y pueden ser considerados como antígenos/alérgenos

mayores.

4. T. canis induce una respuesta mediada por isotipos tanto de la clase IgG

como IgE en el hombre.

5. Las lectinas de tipo C TES 32 y TES 70 reaccionan de forma específica

con anticuerpos de la clase IgE tanto en el hospedador definitivo como

en el hombre.

6. La lectina de tipo C TES 32 se puede considerar como alérgeno mayor

de Toxocara canis dado que reacciona con más del 55 % de los sueros

estudiados, y se propone introducirlo en la nomenclatura de alérgenos

como Tox c 1.

C O N C L U S I O N E S

151

7. La ausencia de descripciones de genes homólogos en otras especies de

helmintos (BLAST y Washington University Parasitic Nematode EST

Sequencing Project) refuerza la especificidad de especie de esta proteína.

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ANEXO 1

A N E X O 1 : M e d i o s d e c u l t i v o y t a m p o n e s

170

Caldo LB

Formula (g/l de agua destilada)

NaCl 10g

Triptona 10g

Extracto de Levadura 5g

Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro y ajustar el pH a

7.0 con 5N NaOH.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Agar LB


NaCl 10g

Triptona 10g


Agar bacteriológico 20g


7.0 con 5N NaOH.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dispensar en placas

de Petri estériles.


171

Caldo LB con Suplementos

Preparar 1 litro de caldo LB y añadir los siguientes suplementos

esterilizados por filtración:


1 M MgSO4 10 ml

2 M Maltosa 3 ml


7.0 con 5N NaOH.


Agar NZY


NaCl 5g

MgSO4 . 7H2O 2 g


Casaminoácidos 10g

Agar bacteriológico 15g


7.5 con NaOH.


172

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dispensar en placas

de Petri estériles.

Caldo NZY


NaCl 5g

MgSO4 . 7H2O 2 g


Casaminoácidos 10g


7.5 con NaOH.


Agar Top NZY

Preparar 1 litro de caldo NZY y añadir agarosa al 0.7% (p/v).



173

Medio SOC


Extracto de Levadura 0.5%

Triptona 2 %

NaCl 10mM

KCl 2,5mM

MgCl2 10mM

MgSO4 10mM

Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Añadir glucosa 20 mM después de autoclavar, y esterilizar mediante filtro

de 0,2µm

Tampón SM


NaCl 5.8g

MgSO4 . 7H2O 2 g

1 M Tris-HCl (pH 7.5) 50 ml

Gelatina 2% (p/v) 5 ml

Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 litro.


174

Tampón TE

Tampón STE 10X


1 M NaCl

200 mM Tris-HCl (pH 7.5)

100 mM EDTA

Tampón de carga 2X


Glicerol 200 µl

Azul de bromofenol saturado 46 µl

5 M NaOH 5 µl

Agua destilada ultrapura 750 µl

Formula

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA (pH 8.0)

Toxocara canis es un nematodo parásito de cánidos y félidos que puede

infectar a un amplio rango de mamíferos incluido el hombre (Glickman y

Schantz, 1981; Lewis y Maizels,

1993). Según la clasificación de

Adamson (1987), Toxocara canis es

un nematodo rhabditoide

perteneciente a la familia de los

ascáridos. Dentro de la familia

Ascarididae conforma un único

género, el género Toxocara.

Aunque han sido descritas once especies de Toxocara (Warren G,

1970), sólo dos, T. canis (Werner, 1782) y T. cati (Schrank, 1788), son

reconocidas como agentes causantes de enfermedad en el hombre

(Nagakura y col., 1990).

Obtención y caracterización de antígenos de Toxocara canis ...

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