INFORME FINAL DEL PROYECTO SIP-20070559

Obtención de un banco de germoplasma vivo de hongos

micorrízicos arbusculares (HMAs) nativos de Sinaloa y pruebas de

protección biológica contra patógenos de la raíz en tomate y frijol.

Período Enero a Diciembre 2007

Director del proyecto: Dr. Ignacio E. Maldonado Mendoza

Colaboradora en el proyecto: Dra. Melina López Meyer

Proyecto parte del programa SIP: “Optimización de tecnología para la produccion de hongos micorricicos para uso como bioestimulantes en

cultivos agrícolas”

INSTITUCIÓN: CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa

Departamento Agropecuario

RESUMEN Los hongos micorrízicos arbusculares son organismos capaces de formar asociaciones simbióticas con la mayoría de las plantas terrestres. El establecimiento de la simbiosis otorga beneficios para la planta. El que ha sido estudiado con más detalle es el beneficio nutricional ya que el hongo provee a la planta de importantes nutrientes principalmente fósforo. Además, se ha reportado que algunas especies de hongos micorrízicos pueden tener un efecto bioprotector principalmente contra patógenos de raíz en algunas especies vegetales. Sin embargo, dicho efecto bioprotector depende de la especie de hongo y la especie vegetal que estén interaccionando. Pocos son los ejemplos en los que las especies de hongos óptimas hayan sido definidas para determinadas especies vegetales, incluyendo especies cultivables. El proyecto forma parte de un programa establecido como área prioritaria derivado de los trabajos de la Red de Biotecnología el cual conjunta proyectos del CBG, CIIDIR-Oaxaca y CIIDIR-Michoacán y plantea generar un banco de germoplasma vivo de HMAs nativos de los suelos de Sinaloa. En el proyecto se propuso purificar cada especie obtenida empleando la técnica de cultivos monospóricos la cual garantiza la pureza del cultivo. En el present estudio se ha estandarizado ya la metodología para la obtención de cultivos monospóricos en caja Petri y se manipularon esporas provenientes de campo para obtener cultivos monospóricos, los resultados preliminares son alentadores pero se requiere de al menos dos ciclos de esporulación en maceta para asegurar el éxito del establecimiento de los hongos en cultivo. Este trabajo se concluirá en el siguiente ciclo de propagación. Se obtuvieron nueve consorcios de HMA provenientes de rizosferas de diferentes plantas encontradas en una zona de reserva y propagadas en tomate como planta trampa. Se estandarizó de la miama manera la metodología para realizar bioensayos de protección en maceta en tomate y en frijol contra diversos fitopatógenos y se demostró un efecto protector de la micorriza arbuscular contra diversos patógenos radicales y foliares.

INTRODUCCION Los hongos micorrízicos arbusculares (HMAs) pertenecen al Phylum Glomeromycota (Schüβler et al., 2001) y han estado en asociación con las raíces de plantas por cerca de 450 millones de años (Remy et al., 1994). Los HMAs son abundantes en suelos de la mayoría de los ecosistemas y forman asociaciones con gran parte de las especies de plantas terrestres (aproximadamente con el 80% de ellas), incluyendo angiospermas, gimnospermas, pteridofitas y algunas briofitas (Cordier et al., 1998). La simbiosis micorrízica arbuscular se lleva a cabo cuando esporas de HMAs presentes en el suelo germinan en respuesta a compuestos secretados por las raíces vegetales. La hifa producida durante la germinación forma una estructura de anclaje en las células de la epidermis conocida como apresorio. Por medio de éste, la hifa penetra y comienza a crecer de manera intercelular hasta llegar a las células del tejido cortical donde las hifas penetran de manera

no disruptiva formando invaginaciones conocidas como arbúsculos. El hongo también desarrolla hifas externas de manera extensiva en el suelo las cuales juegan un papel muy importante en la simbiosis utilizándose para la adquisición de nutrientes del suelo, la colonización de raíces adicionales, y la producción de esporas (Harrison, 1999). La simbiosis micorrízica arbuscular puede tener una importancia vital en plantas creciendo en suelos en donde la disponibilidad de fósforo es muy baja ó limitante. Bajo estas condiciones la simbiosis con los HMAs pueden tener un efecto positivo considerable en el crecimiento vegetal comparado con plantas creciendo sin esta asociación. Aún cuando el hongo colabora con la nutrición de la planta suministrándole fósforo y otros nutrientes captados del suelo, esta asociación no es indispensable para que una planta sobreviva. Sin embargo, el establecimiento de esta simbiosis si es indispensable para el hongo ya que es un organismo biotrófico obligado.

Además de los efectos a nivel de captación de nutrientes estos organismos pueden tener un efecto bio-protector contra patógenos vegetales de origen fúngico, nemátodos, y hasta fitoplasmas en especies de cultivo como el jitomate (Lingua et al., 2002; Pozo et al., 2002; Talavera et al., 2001).

En el esquema del manejo integral de cultivos se le ha dado poca atención al efecto de las interacciones planta-microbio, en particular a la simbiosis micorrízica arbuscular. La utilización de micorrizas arbusculares comerciales se ha popularizado en años recientes en los esquemas de manejo integral de cultivos en Sinaloa, especialmente el uso de productos de marcas comerciales como Bu-Rize (Buckman), y los productos de PHC. Los productos Bu-Rize contienen G. intraradices y los productos de PHC (i.e. Nursery Mix) contienen una mezcla de Entrophospora columbiana, G. intraradices, G. etunicatum y G. clarum. Uno de los problemas clave con estos productos es que son organismos provenientes de otras regiones geográficas que pudieran no comportarse adecuadamente bajo las condiciones del campo sinaloense, y que requieren de validación antes de usarse. Productos como el Bu-Rize que únicamente contienen una cepa de hongos pudieran no ser efectivos u óptimos para colonizar una determinada especie vegetal. En el caso de mezclas de hongos como en el producto Nursery Mix (PHC) los efectos de cada uno de los hongos pudieran ser antagónicos y causar la falta de respuesta ante un reto determinado. Esto se encuentra bien documentado con otras especies como es el caso del chile en donde se ha demostrado que el efecto sobre crecimiento y bioprotección a Fusarium en jitomate es especie-específico y distintas especies de HMAs pueden dar resultado opuestos (Garmendia et al., 2004). Estos productos en muchos casos no contienen únicamente HMAs, sino también otros microorganismos tales como bacterias lo cual complica el análisis de su efecto a nivel agrícola. Un problema adicional en el uso de estos inoculantes comerciales es la introducción de microorganismos no endémicos que pudiera ejercer nuevas presiones de selección en la microbiota del suelo desplazando algunas especies de microorganismos y alterando el balance entre las diversas poblaciones de organismos presentes en el suelo.

Para que estos microorganismos sean utilizados como una tecnología en el manejo integral de diferentes cultivos es deseable el empleo de especies nativas de HMAs, ya que estos han pasado por un proceso de selección y adaptación a la región y probablemente hayan co-evolucionado con

organismos patógenos presentes en la zona (van der Heijden, 1998). De esto se deriva la importancia tanto de caracterizar los HMAs en Sinaloa, como también de identificar, purificar, caracterizar y propagar organismos nativos de la región. Esto nos permitiría contar con una herramienta para pruebas agronómicas en cultivos comerciales empleando material de referencia endémico.

En el CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa se tiene experiencia en el empleo de micorrizas en campo pero a la fecha todos los experimentos que se han realizado han sido con organismos que no son nativos de la región. Trabajo realizado por mi grupo en Guasave, Sinaloa del 2000 al 2003 nos permitió identificar al menos tres géneros de Glomerales: Glomus, Scutellospora y Gigaspora en suelos conservados del área natural protegida de La Uva, en el Ejido la Cofradía (Maldonado-Mendoza et al., en preparación). En este trabajo, reportamos los conteos de esporas en la rizósfera de suelos de tipo aluvión y barrial (los dos tipos más comunes de suelo en esta región) tomados en 75 distintos puntos de muestreo distribuidos en el municipio (0 a 7,850 esporas por cada 100 g de suelo). Se identificaron empleando tanto características morfológicas (a nivel género) como por taxonomía molecular, cuatro especies G. versiforme, G. intraradices, G. mossae y G. fragilistratum (Martínez-Álvarez, 2002; Moreno-Herrera, 2003).

Desafortunadamente, se carecía de un banco de germoplasma vivo, por lo que en el presente trabajo se tomaron muestras del área natural protegida de la Uva (regresando a sitios previamente muestreados y georeferenciados) para realizar los aislamientos y trabajos de propagación de esporas en plantas trampa y posteriormente a partir de estos suelos se obtuvieron las esporas para la obtención de cultivos monospóricos para disponer de cultivos puros de HMAs nativos que puedan ser usados posteriormente en pruebas como agentes de biocontrol contra enfermedades del tomate y del frijol. En este rubro se llevaron a cabo algunas pruebas preliminares empleando un HMA en cultivo monoxénico en el laboratorio para demostrar el aumento en bioprotección a enfermedades en tomate y frijol. Objetivo general Obtener un banco de germoplasma de hongos micorrízicos arbusculares nativos de suelos de Sinaloa y realizar el análisis a nivel bioensayo de su posible efecto bioprotector sobre enfermedades causadas por patógenos de la raíz (Fusarium oxysporum f. sp. radicis/lycopersici (forl) y Rhizoctonia solani) en tomate y en frijol respectivamente. Objetivo específicos

1. Aislar, identificar y purificar especies de HMAs nativos de Sinaloa para su futuro uso en esquemas de manejo integral de cultivos.

2. Realizar bioensayos a nivel maceta para probar el efecto protector de los HMAs nativos contra Fusarium oxysporum f. sp. radicis en tomate y Rhizoctonia solani en asociación con frijol.

MATERIALES Y METODOS: Sitio de muestreo El presente estudio se realizó con muestras de suelos de la Zona de preservación ecológica de centro de población “La Uva” Ejido la Cofradía, Guasave, Sinaloa. El área comprende una superficie de 17.9 hectáreas. Ubicadas a orillas de la margen izquierda del Río Sinaloa, con las coordenadas geográficas 25° 29’ 42” de latitud Norte y 108° 27’ 12” de longitud oeste. Se tomaron muestras de suelo y de raíz de plantas de 6 puntos de muestreo dentro de esta zona. Recolección de material para obtención de esporas puras Las muestras de suelo se colectaron de 0 a 20 cm. de profundidad de la superficie del suelo tomando un kilogramo de suelo y se depositaron en bolsas etiquetadas con las coordenadas del sitio de muestreo, la planta que estaba en el sitio y el número de muestra, la planta colectada se colocó en maceta para evitar la deshidratación de la raíz estas muestras se llevaron al laboratorio para su posterior análisis. Las esporas presentes en el suelo se aislaron mediante el método de tamizado en húmedo (Brundrett et al., 1996), de cada muestra se tomaron submuestras de 20 g de suelo y se colocaron en agua en una relación 3:1 (v/p) durante 30 min. Posteriormente, se pasaron sucesivamente a través de tres mallas de diferentes tamaños de poro: 250, 100 y 50 µm respectivamente.

El material captado en cada una de las mallas se colocó en un vaso de precipitado. Se tomaron alícuotas de 2 a 3 ml de volumen de muestra y se colocaron en tubos de polipropileno de 15 ml para centrífuga. Se llenaron los tubos a un volúmen de 10 ml con agua destilada y se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min. Se descartó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió en 10 mL de una solución de sacarosa al 50%. Se centrifugó de nuevo a 2000 rpm durante 1 min, el sobrenadante que resultó se filtró a través de una malla de nylon con tamaño de poro de 25 µm. El material retenido en la malla se lavó con abundante agua destilada para eliminar el exceso de sacarosa.

Las esporas colectadas se observaron en un estereoscopio y se separaron por morfotipo (color, forma, tamaño) de manera manual empleando un pincel fino. Las esporas que se utilizaron para los cultivos monospóricos presentaban características esenciales de esporas viables tales como ser brillante, con contenido citoplasmático, completa y sin daños físicos aparentes, con apariencia de estar sana y viva. Posteriormente las esporas se colocaron en tubos Eppendorf de 1.5 ml con agua destilada y se almacenaron a 4˚C hasta el momento de ser utilizadas. Montaje de la metodología general para la obtención de cultivos monospóricos Una vez aisladas las esporas nativas de suelos de Sinaloa se empleó una técnica para obtener cultivos monospóricos empleando una planta trampa. La planta trampa se colocó en una caja Petri a los 3 días de germinación y se le colocó una espora en la punta de la radícula. La caja se rotuló con los datos y se incubó en un cuarto de cultivo con un ciclo 16/8 h día/noche, de 25/20°C.

Las plantas se regaron regularmente (diariamente) con 1 ml de una dilución (1/2) de una solución nutritiva de Hoagland con 20 µM de fosfatos, después de una semana de colocar la espora.

Durante la fase experimental se trabajó con diferentes plantas cultivadas y silvestres para encontrar la planta que mejores resultados produjo, dándoles condiciones diferentes de esterilización tanto de la semilla como de la espora del hongo.

Se montaron experimentos de cultivos monospóricos con cinco especies de plantas, sorgo (Sorghum vulgare), pasto Sudán (Sorghum sudanense), cebollina (Allium schoenoprasum), tomate (Lycopersicum esculentum variedad Missouri) y bledo (Amaranthus spp). Cada una de las especies se trabajó por separado y se le brindaron condiciones diferentes de esterilización y de montaje para ubicar la metodología con mayor éxito. Montaje de cultivos monospóricos con sorgo (Sorghum vulgare) como fotobionte Las semillas de sorgo fueron esterilizadas colocándolas en un tubo Falcon con una solución al 0.05 % de Tween-20 y se agitaron por 10 minutos. Se les retiró y se les agregó de nuevo la solución de Tween-20 al 0.05% agitándolo por diez minutos. Se eliminó la solución de Tween-20 y se le agregó 20% de cloralex (1.2% de cloro activo de concentración final) en la solución de Tween-20 al 0.05% y se agitaron las semillas en esta solución por 25 minutos. Se desechó el cloralex y se lavaron las semillas 5 veces con abundante agua destilada estéril.

Las semillas se pusieron a germinar en arena de sílica estéril (la arena se lava tres veces con agua corriente y una vez con agua destilada, se deposita en bolsas de plástico y se esterilizó por 20 minutos a 121˚C tres veces dejándola reposar 24 horas entre cada esterilización) en macetas de unicel (no. 14) y se dejaron germinar por tres días para ser montadas en las cajas Petri con dos orificios: uno para la planta y otro para regar el monospórico.

Las esporas separadas de las muestras se sometieron a un proceso superficial de esterilización con antibióticos para esto se separaron las esporas por morfotipos con la ayuda de un pincel y se colocaron en mini tamices elaborados con un tubo Eppendorf y con mallas de 53 micras, el tubo Eppendorf se cortó de la parte basal y se le pegó un círculo pequeño de malla, aquí se depositaron las esporas para ser esterilizadas.

Para la esterilización se colocaron las esporas en cloramina T (2 g/100ml esterilizado por filtración) por 10 minutos, esto se repitió nuevamente. Se removió la cloramina T y se adicionó una solución de antibiótico para la cual se mezcló: 0.1 g de sulfato de estreptomicina y 0.05 g de sulfato de gentamicina, se preparó la solución en 10 ml de agua estéril y se pasó por un filtro de 0.22 µm para esterilizar por filtración dejando reposar por 10 minutos, esta se le adicionó y se dejó por 10 minutos a 4°C. Se repitió dos veces más y se dejó por una semana a 4°C, se removió la solución de antibiótico y se repitió todo el proceso terminando con un lavado de las esporas con agua destilada estéril.

Una vez obtenidas las esporas estériles y las semillas de sorgo germinadas, se prosiguió a montar los cultivos monospóricos tomando una caja

Petri llena de arena de sílica estéril y se le hizo un canal con una pinza desde la perforación de la caja hacia el centro y se le depositó la plántula cuidando de no maltratar la raíz.

Con la ayuda de un estereoscopio se depositó una espora esterilizada previamente y se le colocó a un tercio de distancia del largo de la radícula, en la zona de elongación, se tapó la caja Petri y se rotuló con la información del sitio de muestreo y la fecha del montaje. Se cubrieron las cajas con un disco de papel cartoncillo negro para cubrir las raíces. Estos cultivos monospóricos se mantuvieron a 25°C con un fotoperíodo 16/8 h de luz/oscuridad. Los monospóricos se regaron cada semana con una solución nutritiva de Hoagland´s. Montaje de cultivos monospóricos con pasto sudán (Sorghum sudanense) como fotobionte Para el montaje de cultivos monospóricos se utilizó como planta hospedera el pasto sudán. Se empleó la misma metodología que con el sorgo, pero para el montaje se utilizó arena de silica de Ottawa. Esta se esterilizó siguiendo el mismo protocolo de esterilizado 3 veces a 121°C por 20 minutos. Se cambió de arena ya que esta presenta mejores características de manejo y mayor limpieza además de que los granos de la arena son más homogéneos y se puede trabajar el cultivo monospórico con mayor facilidad.

Se mantuvieron a 25 °C en fotoperíodo de 16/8 horas luz/oscuridad cubriendo el estante con una malla protectora. Los monospóricos se regaron cada semana con una solución nutritiva de Hoagland. Montaje de cultivos monospóricos con cebollina (Allium schoenoprasum) como fotobionte Las semillas de cebollina se esterilizaron en etanol al 70% por 2 minutos, se retiró éste y se dejó reposar en hipoclorito al 1% (10 ml) con 2 gotas de Tween-20 por 20 minutos. Posteriormente se lavaron con agua destilada estéril 5 veces por 5 minutos y se sembraron directo en la caja Petri tres de estas semillas por caja que contenía arena estéril para evitar lastimar la plántula cuando se pasa a la caja, para este hospedero se le hizo un cambio a la caja Petri ya que solo se le hizo una perforación a la caja en la base y la tapa (ver figura 11) con un bisturí caliente, las semillas de cebollina se depositaron justo debajo de la perforación para que la plántula emergiera por el orificio de la caja. Montaje de cultivos monospóricos con tomate (Lycopersicon esculentum var. Missouri) como fotobionte En tomate, la germinación se realizó en charolas estériles con una capa de algodón estéril humedecido con agua destilada y las semillas se depositaron sobre este con la ayuda de unas pinzas flameadas para evitar cualquier contaminación, las semillas se colocaron a 0.5 cm de distancia una de otra para permitir la germinación. Éstas se esterilizaron previamente en etanol al 70% por 2 minutos, se retiró este y se dejaron reposar en hipoclorito al 1% (10 ml) con 2 gotas de Tween-20 por 20 minutos. Posteriormente se lavaron con agua destilada estéril 5 veces por 5 minutos, la charola se cubrió con plástico adherente para evitar contaminación. La arena se esterilizó siguiendo otro

protocolo en el cual se lava la arena tres veces con agua corriente y dos veces con agua destilada, se esteriliza a una temperatura de 121°C por una hora dos veces dejando reposar la arena 24 horas antes de la segunda esterilizada.

El transplante se realizó sobre una mesa previamente esterilizada con etanol al 70%, el material tal como las pinzas y el bisturí se pusieron en alcohol al 96% flameándolos cada vez que se utilizaron. Una vez que las semillas germinaron se inoculó la espora realizando un pequeño canal en la caja desde la perforación de la caja hacia el centro con un bisturí estéril y se le depositó la plántula cuidando de no maltratar la raíz con las pinzas de disección y bajo el estereoscopio se inoculó la raíz con la espora nativa en la punta de la radícula. Esto se realizó con la ayuda de un pincel fino con el mayor cuidado de no estresar la plántula, la caja se cerró y se rotuló con los datos de la muestra, se depositaron en cajas de aluminio manteniéndolas en posición vertical y se llevaron a un cuarto de cultivo con temperatura controlada de 25°C con fotoperíodo de 16/8 horas luz/oscuridad. Los cultivos se regaron con una solución nutritiva de Hoagland hasta saturar el sustrato una vez por semana. Montaje de cultivos monospóricos con bledo (Amaranthus spp) como fotobionte Para el montaje de monospóricos en bledo fue necesario colectar las semillas de campo observando que las semillas estuvieran maduras (café oscuro), se trasladaron al laboratorio y se esterilizaron en etanol al 70% por 2 minutos, se retiró éste y se dejaron reposar en hipoclorito al 1% (10 ml) con 2 gotas de Tween-20 por 20 minutos posteriormente se lavaron con agua destilada estéril 5 veces por 5 minutos. La arena se esterilizó siguiendo otro protocolo esterilizando a 121°C por una hora 2 veces y dejando un período de reposo de 24 horas antes de utilizarse y entre cada esterilización. El proceso de germinación fue el mismo que para tomate con charolas estériles y el montaje fue realizado empleando la misma metodología. Preparaciones permanentes de material biológico tinción de raíces Las plantas colectadas en el sitio de muestreo fueron llevadas al laboratorio y teñidas utilizando el método de azul de tripano para el cual se tomaron muestras de las raíces de plantas colectadas en la reserva ecológica de La Uva y se lavaron para quitar el exceso de tierra, se pusieron en etanol al 50% por una hora para fijar el tejido, se enjuagaron con agua y posteriormente fueron colocadas en un vaso de precipitado chico con KOH al 20% por 3 días para clarificar el tejido, se enjuagaron con agua destilada 3 veces y se les agregó HCl al 1% por una hora y se repitió el lavado con agua destilada 3 veces para teñirlas con azul de tripano al 0.05% por 2 horas o toda la noche, se decantó este último y se le agregó el lactoglicerol para desechar el exceso de colorante y se elaboraron preparaciones permanentes en portaobjetos con muestras de 50 segmentos de raíces de 1.5 cm. de largo y se acomodaron en un portaobjetos para ubicar las estructuras y observarlas, ayudando esto a la identificación de las estructuras y la ubicación de la colonización micorrízica.

Preparaciones semipermanentes de esporas De las esporas separadas por el método de tamizado en húmedo (Brundrett et al., 1996) mencionado anteriormente se tomaron las esporas representativas de cada punto de muestreo y se elaboraron laminillas semipermanentes con reactivo de Melzer y polivinilo-lacto-glicerol PVLG (anexo 2) para ser observadas al microscopio. Pruebas de bioprotección de HMA contra FOL en plantas de tomate Para estas pruebas se utilizó el hongo micorrízico Glomus intraradices, los controles y tratamientos que se utilizaron fueron los siguientes:

CONTROLES TRATAMIENTOS – FOL – MYC + FOL + MYC + FOL – MYC – FOL + MYC

– FOL + fosfato completo (200 µM) + FOL + fosfato completo (200 µM) Para cada grupo se utilizaron 10 repeticiones. El aislamiento de esporas

de Glomus intraradices se obtuvo a partir de placas petri con medio M, la metodología que se siguió fue la siguiente:

Se tomó el medio sólido de una placa con raíces inoculadas con Glomus intraradices, éste se paso a un vaso de precipitado y se le agregó citrato de sodio (10 mM pH 6.0) hasta cubrir el medio y raíces.

Se molió todo hasta no observar grumos. El licuado se pasó a través de una malla de 250 µm de diámetro de poro con ayuda de un embudo a un vaso de precipitado. Los restos obtenidos en malla se eliminaron ya que estos eran solo raíces e hifas (antes se examinó al estereoscopio para confirmar que éstas no contenían esporas).

El contenido del vaso de precipitado se hace pasar a través de una malla de 50 µM de diámetro de poro. El resultado del filtrado que quedó atrapado en la malla contenía las esporas, éstas se almacenaron en un tubo Falcon con 15 ml de agua destilada. Antes se lavaron tres veces con agua destilada, y el ultimo lavado se guardó (tratamiento control MOCK)

Del recuperado de esporas se tomaron 3 alícuotas de 50 µL, se observaron al estereoscopio y se calculó un promedio para conocer el total de esporas aisladas.

Inoculación de Glomus intraradices La inoculación y transplante se realizó en 20 plántulas de tomate variedad Missouri con una edad de 8 días post-germinación, se utilizó como sustrato arena y vermiculita 3:1 estéril. Cada plántula se inoculó con 600 esporas de Glomus intraradices. 40 plántulas más se inocularon con el tratamiento control MOCK. La primera semana de riego se realizó para las 60 macetas con agua destilada estéril. Después, los riegos se hicieron con solución nutritiva de Hoagland´s con una concentración de fosfato de 20 y 200 µM (para fosfato bajo y completo respectivamente). La inoculación de FOL se realiza cuando las

plantas inoculadas con Glomus intraradices se hayan colonizado, por lo que se tienen que esperar un mínimo de cuatro semanas para tomar una maceta y hacer tinción de raíces con azul de tripano para comprobar que se han colonizado. RESULTADOS Descripción de los morfotipos de HMAs encontrados en suelos de la Uva De los seis puntos de muestreo elegidos de la zona de “La Uva” se encontraron diez morfotipos de esporas aisladas de suelos, y se ubicaron diferentes estructuras internas en las raíces colectadas y teñidas con azul de tripano.

Las poblaciones de micorrizas presentes en estos puntos de muestreo se enlistan en la tabla 1: se encontraron dos morfotipos en la rizósfera de zacate Cynodon dactylon, dos morfotipos en bledo Amaranthus sp, dos en malva, cuatro en toloache Datura sp. y no se encontró ninguno en zacate estrella Cynodon Plectostachyus ni en la planta saca manteca.

Tabla 1. Descripción de las morfoespecies encontradas en los distintos puntos de muestreo.

MUESTRA

MORFOTIPO

CARACTERISTICAS

Morfotipo 1

Espora café oscuro, dos capas de la espora son visibles totalmente y La capa más externa tiende a engrosarse. Este morfotipo es muy frecuente en la zona de muestreo.

ZACATE Cynodon dactylon Posición latitud 25˚29’13.7” N 108˚27’55.6” O

Morfotipo 2

Espora de color amarillo muy claro, de 60µm aproximadamente, poco frecuente en la muestra.

Morfotipo 3 Esporas abundantes, de 100 µm, de color oscuro, sus capas no son observables.

Bledo Amaranthus sp. Posición latitud 25˚29’19” N 108˚27’45.0” O

Morfotipo 4

Esporas muy pequeñas y abundantes en las muestras con características similares al morfotipo 3 pero de un tamaño aproximado de 53 µm

Zacate estrella Cynodon Plectostachyus Posición latitud 25˚29’15.9” N 108˚27’55.0” O

No se encontraron esporas en suelo, solo se encontró una raíz colonizada.

Morfotipo 5 Esporas café marrón mayores de 100 µm con presencia de un tubo hifal delgado e incoloro, esporas poco abundantes.

Malva Posición latitud 25˚29’ 04.8” N 108˚28’03.9” O

Morfotipo 6

Esporas amarillo claro mayores de 100 µm, con un tubo hifal bien definido, presenta dos capas de la pared laminadas. Muy abundantes en las muestras.

Morfotipo 7

Esporas café muy oscuro con un tubo hifal bien definido de 100 µm aproximadamente, se presentaron escasos ejemplares en las muestras.

Toloache Datura sp Posición latitud . 25˚29’ 01.7” N 108˚28’07.7” O

Morfotipo 8

Esporas de color amarillo fuerte de tamaño de 150 µm con pared bi-laminada. Muy abundantes en los suelos colectados.

Morfotipo 9

Coloración naranja obscuro presencia de contenido citoplasmático muy visible. De tamaño mayor de 100 µm. de este morfotipo solo se encontraron pocos ejemplares.

Morfotipo 10

Esporas poco abundantes muy pequeñas de 60µM o menos. Hialinas.

Saca manteca Posición latitud 25˚29’ 00.8” N 108˚28’05.2” O

No se encontró ningún morfotipo de esporas.

De las muestras de suelo se seleccionaron los morfotipos más abundantes de esporas analizadas en base a su morfología, tamaño y color para su posterior análisis microscópico. Las muestras utilizadas corresponden a los morfotipos 1, 3, 6 y 8. Debido a la poca calidad de las esporas encontradas en las muestras de campo no se puede llegar a una identificación taxonómica clara ya que las características de las esporas de campo no es homogénea, sugerimos que en particular esto pueda ser debido a las diferentes etapas de maduración que se encuentran presentes en los diferentes morfotipos.

Se identificaron morfológicamente especies pertenecientes a dos géneros distintos: Scutellospora, y Gigaspora. Para ello, se tomaron en cuenta algunas de las principales características físicas de las esporas como el color, el número de capas en la pared y el tipo de unión a la hifa. Las esporas pertenecientes al género Scutellospora, (Figura 3) presentan una hifa de sostén bulbosa y la espora muestra dos grupos de capas de pared. La superficie de todas las paredes internas flexibles es lisa. Las pertenecientes al genero Gigaspora tienen como característica que las capas externas y laminadas de las esporas tienen superficies lisas y presentan una hifa de sostén bulbosa y un grupo único de capas en la pared (Figura 1 y 2).

Figura 1. (A, B) Esporas identificadas morfológicamente como pertenecientes al genero Gigaspora, muestran las capas externas laminadas y la hifa tubular.

Figura 2. Espora que muestra la pared laminada el grupo único de capas en la pared de la espora característico en las especies del género Gigaspora, con una hifa de sostén bulbosa.

Figura 3. Esporas pertenecientes al genero Scutellospora, mostrando las capas laminadas de su pared (A), y la hifa bulbosa de sostén (B). Resultado de las tinciones Después de la tinción de las raíces se encontró colonización micorrízica en cuatro de las plantas muestreadas de campo observándose estructuras internas típicas de las micorrizas arbusculares tales como vesículas intercelulares de diferentes tamaños y formas y arbúsculos del tipo parís. Estructuras intraradicales de HMA encontradas en toloache En Toloache (Datura sp.) se observaron vesículas de tipo ovoides y arbúsculos tipo París (Figura 4).

Figura 4. Estructuras internas de HMA encontradas en el sistema radical de toloache se muestran vesículas creciendo de manera intraradical (A y B), la hifa conectora a la vesícula (B) y arbúsculos de tipo París (A). Estructuras intraradicales de HMA encontradas en malva La raíz de malva fue una de las muestras que mayor colonización presentó y en ella se encontraron estructuras micorrízicas internas tales como arbúsculos tipo Paris y vesículas internas redondas (Figura 5).

Figura 5. Estructuras internas de HMA encontradas en raíces de una planta malvácea en suelos de la Uva. A y B) arbúsculos tipo París en raíz de malva, c) vesícula en Malvácea redonda conectada a la hifa. Estructuras intraradicales de HMA encontradas en saca manteca En la planta de nombre común saca manteca se encontraron solo arbúsculos tipo París, se puede observar las hifas conectoras entre los arbúsculos (Figura 6).

Figura 6. Arbúsculos tipo París encontrados en la planta saca manteca.

Estructuras intraradicales de HMA encontradas en zacate estrella En las raíces de zacate estrella se encontraron estructuras diferentes a las presentadas en las otras plantas pues solo se identificaron esporas intraradicales con sus correspondientes hifas sustentoras (figura 7).

Figura 7. Esporas intraradicales presentes en la planta de zacate estrella. Cultivos monospóricos Montaje en sorgo Se montaron 100 cultivos monospóricos utilizando la especie sorgo (Figura 8), desafortunadamente todos presentaron problemas de contaminación con hongos fitopatógenos debido a una contaminación que inició en la testa de las semillas, estrangulando la base del tallo de las plantas.

Figura 8. Montaje de una espora con la ayuda de un pincel fino, en plántula de sorgo. Montaje en pasto sudán Las semillas de pasto sudán presentaron buena germinación ya que esta planta se caracteriza por ser precoz, el montaje de los monospóricos se realizó de forma normal sin presencia de problemas hasta el segundo riego cuando la planta tenía dos semanas de germinada (figura 9), se observó la presencia de hongos descartándose los monospóricos.

Figura 9. Cultivos monospóricos con pasto Sudán como fotobionte. Montaje en cebollina Las semillas de cebollina presentaron problemas tanto de germinación como de contaminación con hongos fitopatógenos, con este hospedero no se logró llegar al montaje de monospóricos ya que la contaminación se dio a nivel de semillas. El hongo que atacó a esta especie difería morfológicamente del que atacó a las otras especies. Otra observación importante que cabe señalar es que las semillas tienen un tamaño muy pequeño así que se dificulta su manejo.

Montaje en tomate El tomate demostró ser el cultivo más resistente a la contaminación y el de mejor manejo para el montaje de las unidades propagadoras ya que la semilla tiene un buen tamaño y posee una raíz gruesa que permite depositar sin dificultad la espora de HMA (figura 10). Se establecieron 120 monospóricos con este hospedero obteniéndose hasta el momento un 60% de cultivos en proceso de colonización (figura 11, 12 y 13). El principal problema que se da en los cultivos monospóricos es el mantenimiento de estos, cada unidad de propagación debe ser observada al estereoscopio y muchas veces este manejo afecta la integridad de la planta tales como condiciones de luz que reciba la raíz (Figura 13), otro punto importante es el momento del riego, (figura 12) debe tenerse mucho cuidado al momento de regarlas ya que la espora puede ser arrastrada con la solución nutritiva es por eso que se opto por trabajar con pipetas Pasteur y regarlas en posición horizontal.

Figura 10. Semilla de tomate recién inoculada con una espora de hongo micorrízico arbuscular.

Figura 11. Monospóricos en el estante con luz controlada.

Figura 12. Riego de un monospórico con solución nutritiva de Hoagland.

Figura 13. Plantas de tomate inoculadas con micorrizas, confinadas en un recipiente para evitar la infiltración de luz a la raíz. Montaje en bledo El bledo mostró una rápida germinación permitiendo trabajar en un lapso de tiempo corto, ya que la germinación se dio a las 24 horas (Figura 14) sin embargo las semillas son demasiado pequeñas y la radícula es muy frágil. Se montaron monospóricos pero no se obtuvieron buenos resultados ya que la testa de la semillas no se desprendía ocasionando problemas de hongos. El crecimiento de la planta se detuvo a la primera semana del montaje de los monospóricos quedando en etapa de plántula.

Figura 14. Espora y plántula de bledo inoculada con micorrizas.

Micorrización de plantas de tomate variedad Missouri con suelo de campo nativo del Norte de Sinaloa Las muestras de suelo colectadas en la zona de preservación ecológica de centro de población “La Uva” fueron analizadas por el método de tamizado húmedo para confirmar si éste contenía esporas.

Una vez hecha la confirmación se procedió a realizar los cultivos trampa. En total se colocaron nueve macetas con suelo de campo más un testigo (sin suelo de campo solo arena estéril) (Figura 15).

Para cada maceta se sembraron cinco semillas de tomate variedad Missouri esterilizadas superficialmente, de éstas se obtuvo una germinación del 60 al 80%, es decir en la mayoría de los cultivos trampa se desarrollaron de 3 a 4 plantas de tomate variedad Missouri.

Figura 15. Cultivo trampa de la muestra de zacate Cynidon con tres plántulas de tomate.

Cinco meses después de colocar los cultivos trampa se realizaron tinciones a las raíces de estas macetas con azul de tripano. Éstas se observaron al microscopio y se obtuvieron los siguientes resultados en cuanto a la eficiencia de colonización como se muestran en la tabla 2.

No. de muestra

Muestra Eficiencia de colonización

1 La uva 92.66 % 2 Pasto 70.61 % 3 Zacate Cynodon 89.42 % 4 Golondrina 58.23 % 5 Malva 17.89 % 6 Toloache 86.39 % 7 Toloache 40.81 % 8 Zacate 80.22 % 9 Saca manteca 14.63 % % de colonización

general

61.20% Tabla 2. Eficiencia de colonización del sistema radical de tomate var. Missouri con inóculo originario de suelos de la Uva en el primer experimento de propagación cinco meses después de inoculación.

Identificación molecular de HMAs En este proyecto se montó la metodología para identificar molecularmente a los HMAs empleando un grupo de pares de iniciadores (primers) reportado recientemente (Tabla 3): Grupo identificado Par de primers Tamaño de banda Glomus grupo A (G. intraradices/G. mosseae)

GLOM1310/ITS4 1012 pb

Glomus grupo B (G. etunicatum/G. claroideum)

LETC1670/ITS4 676 pb

Gigasporaceae (Gigaspora) ITS1F/GIGA 5.8R 305 pb Gigasporaceae (Scutellospora) ITS1F/GIGA 5.8R 305 pb Acaulosporaceae sensu stricto (Acaulospora/Entrophospora)

ACAU1660/ITS4 645 pb

Paraglomus y Archaespora (A. gerdemanii/A. trapei/G. ocultum/G. brasilianum)

ARCH1311/ITS4 1,052 pb

Tabla 3. Primers empleados para identificar los diferentes grupos taxonómicos de HMA.

Se utilizaron diferentes metodologías de extracción que variaron desde utilizar DNAzol para la extracción del ADN genómico fúngico empleando de 1 hasta 20 esporas, pedazos de 0.5 cm de raíz, romper una espora con aguja seguido con congelación en nitrógeno líquido inmediata. Los resultados más consistentes fueron los que se obtuvieron con el reactivo del DNAzol. La Figura 20 muestra los resultados obtenidos en una de las muestras de la Uva # 5 que fue la muestra con la que se estandarizó el protocolo. Las muestras señaladas como 1 y 4 (Figura 16 D) correspondientes a 1 y 2 son dos muestras una de ellas proveniente de la Uva (Uva #5) y se muestran los resultados con un grupo de primers distinto que amplifica el DNA de otros géneros de Glomerales (Figura 16E). El protocolo nos sugiere que muestras ya sea provenientes de raíces o con al menos 20 esporas son ideales para realizar la amplificación por PCR empleando los diferentes primers y que esta amplificación puede hacerse de manera específica. En estos momentos los productos de PCr obtenidos empleando este protocolo han sido ya clonados y se encuennetran listos para ser secuenciados y corroborar la amplificación de ADN de origen glomeral de las muestras empleadas. Esta metodología se empleará para caracterizar las diferentes especies presentes en los nueve cultivos en forma de consorcio y en los cultivos monospóricos para su identificación molecular.

Figura 16. Amplificación por PCR de una de las muestras de la Uva empleando primers específicos que detectan a los géneros Entrophospora y Acaulospora. Bioensayos en maceta de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) como patógenos de tomate La inoculación de FOL se llevó a cabo en plántulas con 21 días de post-germinación, presentaron una longitud promedio de 4.3 cm de tallo y 7.1 cm de raíz. Se inocularon un total de 45 plántulas de tomate Missouri: para cada raza se utilizaron tres aislados y por cada aislado se realizaron cinco repeticiones, más cinco testigos:

Raza 1 Raza 2 Raza 3 R1C1 R2C2 R3C2

R1C2 R2C3 R3C5 (a) R1C3 R2C5 R3C5 (b)

Veinte días después de la inoculación se registraron las primeras 2

plántulas dañadas por Fusarium (Figura 17) del aislado R3C5 (b).

Figura 17. En la figura A se aprecia la planta completa, observando una marchitez severa en tejido foliar. En la figura B se observa un acercamiento del sistema radicular evidenciando el oscurecimiento de la raíz principal.

Hasta el momento las únicas muestras que están atacando severamente

a la plantas de tomate variedad Missouri son las tres muestras de la raza tres. A continuación se muestra una fotografía donde se observan las plantas de tomate Missouri con mes y medio de haber sido inoculadas FOL. Los daños en la muestra R3C2 aparecieron más tarde con respecto a la muestra R3C5 (Figura 18). La figura 18 muestra el efecto del aislado más agresivo de FOL.

Figura 18. Testigo contra las muestras R3C5 a, b y c. Los síntomas en estas plantas son más severos, la mayoría presentan un nivel de severidad clase 4 y 5, pero aún es posible ver algunas en el nivel 2 y 3. Pruebas preliminares en tomate y frijol de bioprotección con micorrizas En el presente trabajo se planteó trabajar con dos fitopatógenos Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani. Sin embargo, durante el presente trabajo se ha trabajado en caracterizar diferentes aislados de estos fitopatógenos y no pudieron tenerse bien caracterizados para realizar los bioensayos de protección por lo que se optó trabajar con otros dos fitopatógenos. A la fecha se preparan los ensayos con aislados de Fusarium oxysporum f. sp lycopersici (FOL) para evaluarse. Otro problema con el que nos enfrentamos fue la falta de suficiente inóculo nativo para montar el experimento por lo que se decidió emplear el material fúngico con el que se contaba en el laboratorio ya que la obtención de los cultivos es muy lenta. Se empleó en vez de los consorcios una cepa de Glomus intraradices en cultivo axénico en la línea DC-1 de raíces transformadas de tomate creciendo en esterilidad. Este es un sistema el cual fue desarrollado desde 1988 y debido a que contábamos con suficiente inóculo estéril de éste replanteamos el objetivo y empleamos este hongo para montar dos experimentos de bioprotección a patógenos. Los sistemas analizados fueron Tomate cv. Microtom enfrentado al patógeno Xanthomonas campestris y frijol variedad A114 enfrentado al patógeno Sclerotinia sclerotiorum. Un patógeno bacteriano y uno fúngico. En la tabla siguiente se presentan los resultados preliminares como porcentaje de daño causado por el patógeno, midiendo lesiones provocadas en hoja por estos patógenos en ensayos de

hojas desprendidas en frijol y en planta completa en tomate. Estas pruebas l sugieren que las posibilidades de control de patógenos empleando HMAs no se limita a patógenos del suelo sino que debe existir una respuesta sistémica de inducción de mecanismos de defensa a patógenos generalizada en una planta colonizada. Sistema estudiado Tratamiento Tiempo de

inoculación Porcentaje de daño

tomate/Xanthomonas campestris micorrizada 10 días 35% No-micorrizada 10 días 100% frijol/Sclerotinia sclerotiorum micorrizada 60 horas 40% No-micorrizada 60 horas 100% DISCUSION En cuanto a la identificación de la variedad poblacional de hongos micorrízicos arbusculares ésta es una tarea difícil ya que las esporas provenientes de campo son muy difíciles de estudiar de acuerdo a sus características morfológicas, en el presente trabajo no se pudieron considerar algunas características importantes como el tipo de germinación y de formación de las esporas, ya que se trabajó con esporas extraídas directamente de suelo. En un principio se consideró el empleo de cultivos trampa pero por lo tardado de este procedimiento decidió iniciarse los cultivos pero aún no se encuentran listos para darles seguimiento (este proceso tarda entre uno a dos años para poder pasar el cultivo por dos o tres cultivos trampa y períodos de esporulación).

Otro punto importante que debe mencionarse es la tinción de las raíces para conocer las estructuras y el porcentaje de colonización, esto fue difícil ya que en las muestras directas de campo no se colecta por completo todo el tejido radicular pues la compactación del suelo impidió separar las raíces secundarias y delgadas, estas últimas son las que se utilizan para una mejor visualización de la tinción por lo tanto no se obtuvo muestras de raíces colonizadas de todos las plantas colectadas. Sin embargo, en el presente trabajo pudimos observar tejido radical colonizado y reportamos los resultados correspondientes en cuatro especies diferentes de plantas.

En cuanto al montaje de cultivos monospóricos es muy importante trabajar en las condiciones de asepsia y con material estéril, en cuanto a la semilla que se utilizará en el montaje debe conocerse bien su origen y los tratamientos que este haya tenido, además de hacer pruebas preliminares de germinación.

Los cultivos deben tener un buen cuidado en la etapa de propagación, su manejo debe ser cuidadoso y con monitoreo exploratorios no destructivos. El establecimiento de la metodología fue exitoso y el método descrito en la presente tesis dará pie a futuros trabajos para la obtención de cultivos puros de HMA nativos de Sinaloa.

Se estandarizó la metodología para la identificación molecular de HMAs la cual se está aplicando a la caracterización más detallada de cada uno d elos componentes de los consorcios de HMAs. La muestra Uva # 5 proveniente de

la rizosfera de toloache presentó amplificación en una muestra de raíz colonizada con HMAs que el organismo el cual está colonizando es probablemente de la familia Acaulosporaceae, los datos que se obtendrán en la secuenciación de este producto de PCR amplificado en nuestras muestras nos corroorarán que la metodología implementada es la adecuada para la caracterización molecular de estos organismos en nuestras muestras.

Los datos preliminares de un experimento de bioprotección muestra que G. intraradices es capaz de aumentar la resistencia al daño ocasionado en el sistema tomate/Xanthomonas campestris y frijol/Sclerotinia sclerotiorum. Este experimento preliminar ha llevado a una caracterización más detallada de la respuesta de bioprotección en estos sistemas y esperamos aplicarlo a los sistema spropuestos previamente de patógenos de suelo Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici (FORL) y f. sp lycopersici (FOL) que atacan al tomate. Proyecto al cual se le dará continuidad en un proyecto recientemente aprobado por el CECyT Sinaloa.

Estos experimentos a pesar de haber sido hechos en maceta y empleando una especie proveniente de un cultivo monoxénico estéril señala que el potencial de incremento en la resistencia puede ser importante para la resistencia a determinadas enfermedades en plantas usando estos organismos para bioprotección. La caracterización sistemática de los consorcios de HMAs que tenemos actualmente en propagación deberá conducirnos a obtener de manera más fácil los cultivos puros de los componentes del consorcio, a su caracterización a nivel molecular y a su probable utilización para incrementar en sistemas planta hospedera: micobionte específicos la resistencia a ciertas enfermedades no solo de l suelo sino de parte aérea de una planta. CONCLUSIONES

• Se aislaron 10 morfotipos diferentes de esporas nativas de la reserva ecológica “La Uva”. Siendo los morfotipos 1, 3, 6 y 8 los más abundantes.

• Cuatro muestras de raíz se encontraron colonizadas por los HMA presentando estructuras internas tales como vesículas, arbúsculos e hifas y esporas intraradicales.

• Se obtuvo con éxito una metodología adecuada para el montaje de cultivos monospóricos utilizando al tomate Lycopersicon esculentum var. Missouri como fotobionte.

• Se cuenta con cultivos monospóricos que están en etapa de crecimiento, estos representan una fuente de inóculo para futuros estudios y para generar un banco de germoplasma vivo de HMA regional.

• La propagación en tomate variedad Missouri de consorcios de HMAs de suelos de la UVA se encuentra actualmente en una segunda etapa de propagación. Estas se emplearán para pasar a una siguiente etapa de almácigo de 2 x 2 m para contar con suficiente inóculo de este consorcio para pruebas agrícolas en futuros proyectos.

• Se estandarizó una metodología para identificar HMAs en muestras de raíces y a partir de esporas purificada de la rizosfera en muestras provenientes de campo de la zona de preservación ecológica La Uva.

• Los datos preliminares con los experimentos de bioprotección señalan la importancia del empleo de HMAs para aumentar la capacidad de resistencia a enfermedades en plantas y quizás conociendo este mecanismo podamos desencadenar respuestas sistémicas de protección a patógenos.

IMPACTO

1. Disponer de un material nativo de HMA que pueda ser empleado como inóculo es una herramienta clave dado el potencial que tienen estos microorganismos para ser empleados como biofertilizantes y biopesticidas

2. Los datos preliminares en cuanto a la posible protección que brindan los HMA contra patógenos tanto de raíz como foliares tendrá incidencia directa al ser empleados estos organismos en algunos cultivos agrícolas para aumentar la resistencia de los cultivos a patógenos causantes de enfermedades de importancia regional. Esto se traduce en cultivos más sanos y resistentes, una disminución en el empleo de pesticidas con los consecuentes beneficios ecológicos y de salud, y una mayor productividad en el campo sinaloense que se traduce en una mayor derrama económica regional.

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