-1-

การวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีน cinnamyl-alcoholdehydrogenase (CAD) ในยางพันธุเพื่อเนื้อไม 1

Quantitative Gene Expression of Cinnamyl-Alcoholdehydrogenase (CAD) in Wood Timber Rubber Trees

กุหลาบ คงทอง ประสาน สืบสุข

กลุมวิจยัเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร สํานักวิจยัพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ3

--------------------------------------------------------

บทคัดยอ

จากการนําลําดับเบสของยีน CAD (cinnamyl-alcoholdehydrogenase) ซ่ึงเปนยีนที่มบีทบาทเกี่ยวของกับกระบวนการสังเคราะหลิกนนิในพืชจากฐานขอมูล GenBank ของ Eucalyptus globul, Populus tremuloid, P.deltoides, Eucalyptus salign, Populus balsamife, Saccharum officin, Fragaria x ananas และ M.sativa มาหาลําดับเบสสวนที่เหมือนกันโดยใชวิธีการเปรียบเทียบ Multiple Alignment พบลําดับเบสที่เหมือนกนัและใชเปน primer สามารถเพิ่มปริมาณชิ้นสวนของยีนจาก cDNA ในยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50ได เมื่อนําไปหาลําดับเบสพบวาชิ้นดเีอ็นเอมีขนาด 542 bp. และเมื่อเปรียบเทียบกบัลําดับเบสของชิ้นสวนยีนกบัยีน CAD ในพืชชนิดอื่นๆ พบลําดับเบสสวนที่เหมือนกัน มากที่สุดกับ Eucalyptus salign โดยมีคา Identity 49.7%ทําการออกแบบ LUX primer โดยใชลําดับการเรียงตัวของดีเอ็นเอที่ไดไปตรวจสอบความจําเพาะ พบวา primer ที่ไดสามารถเพิ่มปริมาณชิ้นสวนของยีนจากยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 ไดเพียงแถบเดยีว ซ่ึงมีขนาดเทากับ 96 bp. และ primer ดังกลาวสามารถใชตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของชิ้นสวนยีนที่โคลนไดในใบของยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 ดวยเทคนิค Quantitative Real-Time RT-PCR ----------------------------------------------- 1 การทดลองภายใตโครงการวิจัยโครงการวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อการปรับปรุงพันธุยางใหมีเนือ้ไมสูง รหัสโครงการวิจยั 05-01-47-0303

-2-

คํานํา ยางพารามีช่ือทางพฤกษศาสตรวา Hevea brasiliensis เปนไมยนืตนจดัอยูในตระกูล Euphorbiaceae มีถ่ินกําเนิดอยูใกลลุมแมน้ําอเมซอน ประเทศบราซิล (สถาบันวิจยัยาง,2538) สําหรับประเทศไทยยางพาราถือเปนพืชเศรษฐกิจที่สําคัญและทํารายไดใหเกษตรกรเปนจํานวนมาก ตนยางพาราใหผลผลิตที่สําคัญคือน้ํายางซึ่งเปนวัตถุดิบที่สําคัญในการผลิตสินคาอุตสาหกรรมประเภทผลิตภัณฑจากยางพาราเชน ยางรถยนต ถุงมือยาง พื้นรองเทา ยางรัดของ ฯลฯ เมื่อตนยางพาราหมดอายใุนการใหน้ํายาง กจ็ะถูกตัดโคนเพื่อไปใชประโยชนตางๆ และไดมีการใชประโยชนจากไมยางพาราทดแทนไมจากปาธรรมชาติมากขึ้น ไมยางพารามคีวามสําคัญทางเศรษฐกิจมากขึ้นเรื่อยๆ มกีารใชไมยางพาราเพื่อการแปรรูปเปนผลิตภัณฑอุตสาหกรรมตางๆ มีการคิดคนและพัฒนาวิธีการแปรสภาพไมยางใหมีความคงทน สวยงามมาขึ้นทําใหสามารถนําไปทําผลิตภัณฑไดหลากหลาย เปนที่ยอมรับของตลาดทั้งในและตางประเทศเชนในอตุสาหกรรมเฟอรนิเจอรไมยางพารา ไดมีการพัฒนารูปแบบและสงออกจําหนายในตางประเทศมากขึ้น จนมียอดการสงออกในป 2543 มีมูลคาไมต่ํากวา 22,000 ลานบาท (สรรพกิจ,2544)และในป 2544 มีมูลคาการสงออกผลิตภัณฑไมยาง 55,758 ลานบาท เพิ่มจากป 43 รอยละ 35.4 ในอนาคตความตองการผลิตภัณฑจากไมยางยังคงสูงขึ้นเรื่อยๆ อาจสงผลใหปริมาณไมไมเพียงพอกับความตองการ (สถาบันวิจยัยาง, 2545) จึงมคีวามจําเปนตองมีมาตรการรองรบัความตองการใชไมยางที่เพิ่มขึ้นในอนาคต กรมวิชาการเกษตรเล็งเห็นความสําคัญจึงไดมีเปาหมายในการปรับปรุงพันธุยางใหมีผลผลิตเนื้อไมเพิ่มจาก 45 ลูกบาศกเมตร/ไร เปน 60 ลูกบาศกเมตร/ไร ซ่ึงอาจทําไดโดยการปรับปรุงพันธุยางแบบปกติรวมกับการใชเทคนิคทางดานเทคโนโลยีชีวภาพ ที่ผานมาสถาบันวิจยัยางไดเร่ิมดําเนนิการปรับปรุงพันธุยางเพื่อเนื้อไม ดวยวิธีการผสม และคัดเลอืกพันธุโดยดจูากลกัษณะทางฟโนไทปแตยังไมไดใชยีนเปนตัวคัดเลือกพนัธุเพื่อเนื้อไม ปจจุบันเทคโนโลยีชีวภาพไดพัฒนาไปอยางรวดเร็วมาก และมีการนํามาประยุกตใชในการปรับปรุงพันธุพืชหลายชนิด สําหรับในยางพาราเทคโนโลยีชีวภาพสามารถนํามาใชเพิ่มผลผลิตเนื้อไมไดโดย การชักนําใหยางเกิดการกลายพันธุใหมีเนือ้ไมสูง รวมทั้งการคนหา ทดสอบและวเิคราะหยีนทีเ่กีย่วของกับเนื้อไมยาง ที่สามารถใชเปนโมเลกุลเครื่องหมายสําหรับปรับปรุงพันธุยางใหมเีนื้อไมสูง และเพิ่มประสิทธิภาพในการปรับปรงุพันธุใหรวดเร็ว แมนยํา โดยคัดเลือกพันธุจากยีนที่มีลักษณะจําเพาะในระดับพันธุกรรม ในตนยางที่มีอัตราการเจริญเติบโตสูง การพัฒนาของระบบทอลําเลียงมีประสิทธิภาพ และกระบวนการสังเคราะหลิกนินเกิดขึน้อยางเต็ม ซ่ึงเปนปจจัยที่สงเสรมิใหยางมีผลผลิตเนื้อไมสูงและคุณภาพด ี

-3-

มูลคาของไมในอุตสาหกรรมปาไม ไมเพยีงแตขึ้นอยูกับคุณสมบัติทางฟสิกส และทางเคมีของเนื้อไม ยังขึน้อยูกับเสนใยของเนื้อไมซ่ึงมีสวนประกอบหลักคือ Cellulose และ Lignin โดย Cellulose เปนสวนประกอบที่มีความสําคัญในอุตสาหกรรมไมเนือ้ออนและกระดาษ สวน Lignin เปนสวนประกอบที่ทําใหเนื้อไมแข็งและเปนสวนประกอบทีสํ่าคัญของ Cell wall ทําใหลําตนแข็งแรง (Chabannes et.al.,2001; Jones et.al.,2001) รวมทั้งกันน้ําใน Cell wall และ สามารถลําเลียงน้ําและสารละลายผานระบบทอลําเลียง นอกจากนี้ยังมีบทบาทสําคัญในการปองกันพืชจากเชื้อสาเหตุโรคพืช ซ่ึงในไมที่มีคณุคาทางเศรษฐกิจยังมีขอมูลเกี่ยวกับการควบคุมลักษณะทางพันธุกรรมในการเกิดเนือ้ไมนอยมาก (Baucher et.al.,1998) ไดมีการศึกษากระบวนการสงัเคราะห Lignin พบวามวีิถีการสังเคราะหจากphenylalanine ไปเปน Ligninmonomer ซ่ึงเปนที่รูจักกนัทั่วไป Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) ควบคุมการสังเคราะหให Ligninmonomer เร่ิมจากการเปลี่ยน phenelalanine ไปเปน cinnamic acid และเปลี่ยนเปน alcohol ตามลําดับ ถากิจกรรมของเอ็นไซมเหลานี้มีการแสดงออกเต็มทีท่ําใหไดลิกนนิที่มีคุณภาพสูง แตถาเอ็นไซมถูกยับยั้งโดยวธีิการตัดตอทางพันธุกรรม อาจมีผลในควบคุมการสรางลิกนินใน Cell wall การเปรียบเทยีบการสังเคราะห cellulose และ lignin จึงเปนจุดที่นาสนใจ ที่สามารถใชเปนแนวทางในการคนหายนีที่เกี่ยวของกับการสรางเนื้อไม (Meyer et.a.,1996; Pear et.al.,1996; Turner and Somerville,1997; Zhong et.a.,1997)

จากการศึกษาในยาสูบพบวายาสูบที่ไดจากการตัดตอสารพันธุกรรมดวย antisense ของยีน CAD จะมีผลใหกิจกรรมของยีน CAD ลดลง 20-55% (Takabe et.al.,1995) อัตราสวนของ cinnamaldehydes/cinnamylalcohol ในยาสบูที่มี antisense CAD จะเพิ่มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับตนปกติ การวิเคราะหการแสดงออกของยีนเพื่อการคนหายนี มีบทบาทสําคัญมากในการศึกษาหนาที่ของยนี ที่ผานมาสามารถวิเคราะหการแสดงออกของยีนโดยใชเทคนิค Northern blotting, RNA dot blotting และ RT-PCR และใชเทคนิค differential display ในการการคนหายนีที่แสดงออกแตกตางกันระหวาง 2 ตัวอยาง แตไมสามารถศึกษาการแสดงออกของยีนในเชงิปริมาณ ได ปจจุบันมีเทคนิค Real-Time PCR ซ่ึงเปนเทคนิคที่สามารถศึกษาการแสดงออกของยีนในเชิงปริมาณ มีความแมนยําและมีประสิทธิภาพสูง การทดลองครั้งนี้มีวัตถุประสงคเพื่อโคลนชิ้นสวนของยนี CAD จากยางพารา พรอมทั้งหาลําดับเบส และใชออกแบบ primer ที่เหมาะสมสําหรับการวิเคราะหการแสดงออกของยีน CAD ในยางพาราดวยเทคนิค Quantitative Real-Time RT-PCR ทั้งนี้เพื่อนําไปใชในการศึกษาการแสดงออกของยีนในยางพาราพันธุตางๆ สําหรับเปนขอมูลในการคัดเลือกพันธุในขั้นตอนการปรับปรุงพันธุยาง

-4-

วิธีดําเนินการ อุปกรณ ยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 และพันธุอ่ืนๆ เครื่องมือและสารเคมีสําหรับการโคลนยีน เครื่องมือและสารเคมีสําหรับวิเคราะหลําดับสารพันธุกรรม โปรแกรมสําหรับวิเคราะหลําดับเบสและออกแบบ primer เครื่องมือและสารเคมีสําหรับวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีน วิธีการทดลอง การโคลนชิ้นสวนของยนี CAD จากยางพารา

การออกแบบ primer เพื่อเพิม่ปริมาณสวนของยีน CAD จากยางพาราและการเตรียมพันธุยางเพื่อใชในการทดลองเขาฐานขอมูล NCBI Sequence GeneBankเพื่อคนหายนี CAD ที่มีรายงานในพืชชนิดอื่นๆ จากนั้น นําลําดับเบสที่ไดมาวิเคราะหหาสวนที่เหมือนกนัโดยใชโปรแกรม ClustalW Multiple Alignment ที่ทํางานบนชุดโปรแกรม BioEdit นําลําดับเบสสวนที่เหมือนกนัใชออกแบบ primer สําหรับเพิ่มปริมาณสวนของยีน CAD จากยางพาราตนยางพาราที่ใชในการทดลองไดมาจาการนํากิ่งตายางพนัธุฉะเชิงเทรา 50 ไปติดลงบนตนตอที่ไดจากการเพาะเมล็ด แลวนําไปปลูกจนเจริญเติบโตเปนยางชําถุง จากนั้นนําไปปลูกลงถุงขนาดใหญจนมีขนาด 3-4 ฉัตร ข้ันตอนนี้ดําเนินการโดยศูนยวจิัยยางฉะเชิงเทรา ต.ลาดกระทิง อ. สนามชัยเขต จ. ฉะเชิงเทรา สกัด RNA จากยางพารา

ทําการตัดชิ้นสวนลําตน กานใบ และ แผนใบ ของยางพาราใหเปนชิน้ขนาดเล็กโดยใชใบมดีผาตัด แลวบดรวมกันดวยไนโตรเจนเหลวจนละเอียดเปนผง จากนัน้นําไปแยกสกดั RNA โดยใชสารเคมีและปฏิบัติตามวิธี Concert Plant RNA Reagent (Invitrogen life technology) การตรวจสอบปริมาณ ความบริสุทธ์ิ และแถบ RNAท่ีสกัดได

หาความบริสุทธิ์และความเขมขนของ RNAที่สกัดไดโดยนําไปวดัคาการดูดกลืนแสงที่มีความยาวชวงคลื่น 260 และ 280 นาโนเมตร ดวยเครื่อง spectrophotometer จากนั้นทําการตรวจสอบแถบ RNA โดยนาํ RNA ที่สกัดได ไปแยกดวย1.5% Agarose gel electrophoresis และยอมดวย GelStar แลวนําเจลไปตรวจดูแถบ RNA พรอมบันทึกภาพโดยใชเครื่อง UV Transilluminators การสังเคราะห cDNA จาก Total RNA

กําจัดดีเอ็นเอที่อาจจะปะปนอยูใน Total RNA กอนที่จะสังเคราะห cDNA โดยยอยดวย DNase I Amplification Grade (Invitrogen life technology) และทาํการสังเคราะหสาย cDNAของยางพาราโดย

-5-

ใช SuperScrip III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen life technology) ดวยTotal RNA ปริมาณ 1 µg และ primer Oligo(dT)20 การเพิ่มปริมาณสวนของยีน CAD และการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอ

ใช cDNA ที่สังเคราะหไดจากจากพาราเปนดีเอ็นเอตนแบบในการเพิม่ปริมาณดวยเทคนิค PCR (Polymerase Chain Reaction) Oligo(dT)20 CAD primer จากขอ 1 โดยเตรียมสวนผสมของปฏิกิริยาทั้งหมด 20 µl ในหลอด PCR ขนาด 0.2 ml ที่ประกอบดวย 1X PCR Buffer minus Mg, 0.2 mM dNTP each, 1.5 mM MgCl2, 0.25 µM Forward Primer, 0.25 µM Reverse Primer, 1 µl cDNA Template, 1 units Platinum Taq DNA Polymerase, Autoclaved distilled water to 20 µl นําเพิ่มปรมิาณดีเอ็นเอในเครือ่ง Themal Cycler ที่กําหนดการเปลี่ยนแปลงของอุณหภมูิแตละขั้นตอนดังนี้ เร่ิมตนที่อุณหภูมิ 94 °C เปนเวลา 2 นาที ในแตละรอบของปฏิกิริยา PCR กําหนดอุณหภูมแิละเวลา Denature 94 °C 30 sec, Anneal 60 °C 1 min, Extend 72 °C 1 min ทําซ้ําจํานวน 35 รอบ ตามดวย Final extend 72 °C 10 min เก็บตัวอยางไวที่ –20 °C จนกวาจะนําไปวิเคราะหผลขั้นตอไป ทําการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณไดโดยใช 1.5% Agarose gel electrophoresis และยอมเจลดวยสารละลาย ethidium bromide จากนัน้นําไปเขาเครื่อง UV Transilluminators เพื่อตรวจดแูถบดีเอ็นเอ พรอมบันทึกภาพ การแยกและดึงดีเอ็นเอกลับมาใช (Recovery of DNA)

แยกผลผลิตดีเอ็นเอที่เพิ่มประมาณโดยเทคนิค PCR ดวย 1.5% Agarose gel electrophoresis แลวยอมดวย gel star (Cambrex) หลังจากนั้นนําไปตดัแถบดีเอ็นเอที่ตองการภายใตเครื่อง Dark Reader transilluminators และแยกสกัดดีเอน็เอออกจากชิน้วุนโดยใช QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) เก็บชิ้นดเีอ็นเอที่แยกไดที่ –20 °C จนกวาจะนําไปใช การเชื่อมตอดีเอ็นเอกับ Vector และการนําเวกเตอรเขาสูเซลแบคทีเรีย (Transformation )

ทําการเชื่อมตอช้ินดีเอ็นเอทีม่ีปลายดาน 3′-A overhangs เขากับ pGEM-T Easy Vector System I (Promega) นําปฏิกริิยาที่ไดไปเก็บที่ 4 °C นาน16 ช่ัวโมง หลังจากนัน้ทําการสงถายดีเอ็นเอเขาเชื้อ Escherichia coli DH5α ที่นํามาทําใหเซลลมีคุณสมบัติเปน Competent cell ดวย CaCl2 โดยนําไป heat-shock ในน้ําทีม่ีอุณหภูมิ 42 °C เปนเวลา 50 วินาที แลวเติม SOC medium นําไปเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 °C ที่เขยาความเรว็ 150 rpm เปนเวลา 1.5 ช่ัวโมง แลวจึงนําไป plate บนอาหารแข็ง LB ที่เติม 100 µg/ml ampicillin 0.5 mM IPTG และ 50 mg/ml X-Gal แลวนําไปเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 °C นาน16 ช่ัวโมง การตรวจหาโคโลนีท่ีมีชิ้นดีเอ็นเอเปาหมาย

ใชเทคนิค Single colony PCR เพื่อหาโคโลนีของแบคทีเรียที่มีช้ินดีเอน็เอเปาหมาย โดยใชไมจิ้มฟนจิ้ม colony ไปใสในหลอดที่มีปฏิกิริยาของ PCR ซ่ึง ประกอบดวย1X PCR Buffer minus Mg, 0.2 mM dNTP each, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM T7 Primer, 0.2 µM SP6 Primer, 1 units Taq DNA

-6-

Polymerase, Autoclaved distilled water to 20 µl นําเพิม่ปริมาณดีเอน็เอในเครื่อง Themal Cycler ที่กําหนดการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิแตละขั้นตอนดังนี้ เร่ิมตนที่อุณหภูมิ 94 °C เปนเวลา 5 นาที ในแตละรอบของปฏิกิริยา PCR กําหนดอณุหภมูิและเวลา Denature 94 °C 30 วินาท,ี Anneal 55 °C 1 นาที, Extend 72 °C 1 นาที ทําซ้ําจํานวน 35 รอบ ตามดวย Final extend 72 °C 10 นาที นําไปตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณไดโดยใช 1.5% Agarose gel electrophoresis แลวยอมดวย ethidium bromide การสกัดพลาสมิด

เล้ียงเชื้อ E. coli DH5α ที่ไดรับการสงถายชิ้นดีเอ็นเอ ในอาหารเหลว LB ที่เติม ampicillin 100 µg/ml นําไปเลี้ยงที่อุณภูมิ 37 °C และเขยาดวยความเรว็ 150 rpm เปนเวลานาน16 ช่ัวโมง จากนั้นตกตะกอนเซลลใน microcentrifuge tube 1.5 ml แลวนําไปแยกสกัดพลาสมิดโดยใช QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) ตรวจสอบพลาสมิดที่แยกไดใช 1% Agarose gel electrophoresis แลวยอมดวย ethidium bromide การหาลําดับการเรียงตัวของชิ้นสวนยีน CAD

ใช ABI PRISM® BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ในการหาลําดบัการเรียงตัวของยีนโดยนําพลาสมดิที่มีช้ินดีเอ็นเอของยีน CAD มาเปนดีเอ็นเอตนแบบในการหาลําดับเบส รวมกับ primer ชนิด T7 และ SP6 พรอมทั้งตรวจสอบลําดับเบสดวยเครื่อง ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer ศึกษาการแสดงออกของยนี CAD ดวยเทคนิค Quantitative Real Time RT-PCR

การออกแบบ primer สําหรับวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีนใชโปรแกรม D-LUX™ Designer (www.invitrogen.com) ทําการออกแบบ primer สําหรับวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีนโดยเทคนิค Quantitative Real Time RT-PCR โดยนําลําดับการเรียงตัวของยีน CAD ที่หาไดจากขอ 11ไปออกแบบ LUX primerที่ติดฉลากดวยสารเรืองแสงชนิด FAM และสั่งสังเคราะห primer ดังกลาวจากบริษัท Invitrogenการวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ในยางพารา

สกัด RNAจากชิ้นสวนใบ โดยใชสารเคมีและปฏิบัติตามวิธี Concert Plant RNA Reagent (Invitrogen life technology) และยอยดวย DNase I Amplification Grade (Invitrogen life technology)เพื่อกําจดัดีเอน็เอที่อาจปนเปอนใน Total RNA จากนั้นนําไปหาปริมาณและความบริสุทธิ์ของ RNA โดยการวัดคาการดดูกลืนแสงดวยเครื่อง spectrophotometer และตรวจสอบดูแถบ RNA ดวย 1.5% Agarose gel electrophoresis หลังจากนัน้ทาํการสังเคราะห cDNA จากTotal RNA โดยใช SuperScrip III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen life technology) และ Oligo(dT)20 primer นํา cDNA ที่ไดไปตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ดวยเทคนิค Quantitative RT-PCR โดยเตรียมสวนผสมของปฏิกิริยาทั้งหมดเปน master mix ซ่ึงแตละหลอดมีปริมาตร 20 µl ที่ประกอบดวย 1X PCR Buffer minus Mg, 0.2 mM dNTP each, 6 mM MgCl2, 0.5 µM Forward

-7-

Primer(CADFL), 0.5 µM Reverse Primer (CADRU), 1 units Platinum Taq DNA Polymerase, Autoclaved distilled water to 18 µ l ดูดสวนผสมทั้งหมดใสใน capillary tube และเตมิ 2 µl cDNA Template (125 ng Total RNA) เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในเครื่องLightCycler® ที่กําหนดการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมแิตละขั้นตอนดงันี้ เร่ิมตนที่อุณภูมิ 95 °C เปนเวลา 2 นาที และกําหนดอุณหภูมิในแตละรอบของปฏิกิริยา PCR คือ Denature 94 °C 5 วินาท,ี Anneal 55 °C 10 วินาท,ี Extend 72 °C 10 วินาที ทําซ้ําจํานวน 45 รอบ หลังจากนั้นใชโปรแกรม Quantification Analysis วิเคราะหผลการแสดงออกของยีน CAD โดยเปรียบเทียบกบัคา Standard ที่เตรียมจากพลาสมิด pGEM-T Easy ที่มีช้ินยีน CAD แทรกอยู โดยที่ความเขมขนของ Standard เทากบั 1 10 100 1,000 และ 10,000 pg โดยเตรียมสวนผสมของปฏิกิริยาทั้งหมดรวมกันครั้งเดียวกับตวัอยางที่ตองการวิเคราะห การหาวิเคราะหคา melting curve เพื่อหาคา Tmของชิ้นสวนยีน CAD

นําตัวอยางดีเอน็เอที่ไดจากการเพิ่มปริมาณและวเิคราะหการแสดงออกของยีนแลวมาวิเคราะหหาคา melting curve โดยกําหนดการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิคือ 90 °C 0 วินาที 55 °C 15 วินาที 90 °C 0 วินาที (กําหนดการเพิ่มของอุณหภูมิเปน 0.1 °C ตอวินาที และกําหนดคา เปน continuous acquisition) 40 °C 0 วินาที จากนั้นใชโปรแกรม Melting Curve Analysis วิเคราะหคา melting curve ระยะเวลาของโครงการ 2 ป (ตุลาคม 25467 – กันยายน 2548) สถานที่ทําการทดลอง หองปฏิบัติการกลาง สํานักวจิัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ กรมวิชาการเกษตร

ผลและวิจารณผลการทดลอง 1. การโคลนชิน้สวนของยีน CAD จากยางพารา

จากการเขาสูฐานขอมูล NCBI Sequence GeneBank เพือ่คนหาขอมูลลําดับเบสของยีน CAD จากของพืชชนิดตาง ๆ พบรายงานลําดับเบสของยีน CAD ในฐานขอมูล พืช Eucalyptus globul, Populus tremuloid, P.deltoides, Eucalyptus salign, Populus balsamife, Saccharum officin, Fragaria x ananas และ M.sativa และเมื่อใชโปรแกรม ClustalW Multiple Alignment มาวิเคราะหหาสวนที่เหมือนกนั พบลําดับเบสที่เหมือนกนับางสวน และพบสวนที่มีลําดับเบสที่สามารถใชเปน Forward Primer (CADF) : 5’-GAGCTCCGATGAAAATGGAA-3’ และ Reverse Primer (CADR) : 5’-TCGATCTGGGAAGTCAATCC-3’ สําหรับเพิ่มปริมาณสวนของยีน CAD จากยางพารา จากการสกัด RNA ของยางพาราพนัธุฉะเชิงเทรา 50 พบวา มีปริมาณ Total RNA เทากับ 554 ng/µl และมีความบรสุิทธิ์เทากับ 1.83 และเมื่อนาํไปตรวจสอบแถบ RNA ดวย Agarose gel electrophoresis

-8-

พบแถบสวนที่เปน 18S rRNA และ 28S rRNA (รูปที่ 1) แสดงใหเห็นวา ในขณะทีท่าํการสกัด RNA Total RNA ที่ไดไมถูกยอยดวย RNase ซ่ึงในทุกขั้นตอนของการสกัดหรือทํางานเกี่ยวกับ RNA จะตองปองกันการปนเปอนของ RNase ที่จะเขาไปปะปนแลวเกิดการยอยสลายตัวอยาง RNA ถาหากพบวาแถบของ RNA ที่ไดเกดิการ smear และมีน้ําหนกัโมเลกลุต่ําแสดงวา RNA ถูกยอยสลายดวย RNase ซ่ึงอาจจะสงผลใหไมประสบผลสําเร็จ ในขั้นตอนการสังเคราะห cDNA จากการทดลองครั้งนี้ผลจากการสกัด พบวาไมมีส่ิงเจือปนที่จะไปยับยั้งการทํางานของเอนไซม DNase I ในการยอย DNA อีกทั้งยังไมยับยั้งการทํางานของเอนไซม SuperScrip III Reverse Transcriptase ในปฏิกิริยาการสังเคราะหสาย First Strand cDNA รวมทั้ง Total RNA ที่ไดมีปริมาณเพียงพอสําหรับการเปลี่ยน mRNA ของยีน CAD ไปเปน cDNA สําหรับงาน RT-PCR มีความจําเปนตองกาํจัดดีเอน็เอ ซ่ึงอาจจะปนเปอนอยูในตัวอยาง Total RNA ที่เตรียมได ในขัน้ตอนกอนการสังเคราะหสาย cDNA ทั้งนี้เพื่อไมใหเกดิการเพิ่มปริมาณของดีเอ็นเอจากสวนของจีโนม โดยการเตมิ DNase I Amplification Grad ซ่ึงการทดลองนี้ตองการเพิ่มปริมาณสวนของยีนที่มีการแสดงออกในรปู mRNA ที่ทําใหเปล่ียนรูปเปน cDNA เทานั้น

-9-

รูปท่ี 1 แสดง RNA ของยางพยอมดวย ethidium bromide M

การใช SuperScript Iสามารถใชปริมาณ Total RNA100 bp. จนถึงมากกวา 12 kp °C จึงเปนขอดีที่ทําใหสังเครสามารถสังเคราะหสาย cDNAกอน เนื่องจาก rRNA และ tRSuperScript III Revers Transการสังเคราะหสาย cDNA ดวเตรียม RNA ไมใหไปทําลาย หลังจากการสงัเคราะห cDNAเกิดขึ้นนอย หากมีการจับกนัรปริมาณจากดีเอ็นเอตนแบบท

ผลการเพิ่มปริมาณสวCADF : 5’-GAGCTCCGATG3’ พบวาสามารถเพิ่มปริมาณprimer ทั้งสอง ไดแถบดีเอน็เอฉะเชิงเทรา 50 ลําดับเบสของย

าราพันธุฉะเชิงเทรา 50 ที่แยกดวย 1% Agarose gel electrophoresis และ:RNA Ladder High Range (Fermentas), 1-3 : Total RNA

II First-Strand Synthesis System for RT-PCRในการ สังเคราะห cDNA เร่ิมตนตั้งแต 1 pg ถึง 5 µg ในการสังเคราะห cDNA ที่มีความยาวตั้งแต

และยัง สามารถใชสังเคราะห cDNA ที่ระดับอุณหภูมิตั้งแต 42 °C – 55 าะหสาย cDNA ไดสายยาวมากขึ้นและสามารถเพิ่มความจําเพาะ อีกทั้งยัง ไดโดยตรง จาก Total RNA โดยไมจําเปนตองแยก mRNA ใหบริสุทธิ์NA ที่อยูใน Total RNA ไมสามารถยับยั้งการทํางานของเอ็นไซม

criptase ได นอกจากนี้ไดเติม RNaseOUT Recombinant ลงไปในปฏกิิริยายเพื่อยับยั้งการทํางานของ RNase ที่อาจจะปนเปอนมาในขั้นตอนการTotal RNA ที่สกัดได จากนัน้ตองเติม RNase H เพื่อกําจดั RNA ออก เสร็จสิ้น เนือ่งจากจะสงผลใหการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอดวยเทคนิค PCR ะหวาง RNA กับ cDNA ที่สังเคราะหได โดยเฉพาะอยางยิ่งถาตองการเพิ่มี่มีสายยาว นของยีน CAD ดวยเทคนิค PCR ในยางพาราพนัธุฉะเชิงเทรา 50 โดยใช AAAATGGAA-3’ และ CADR : 5’-TCGATCTGGGAAGTC AATCC-หรือโคลนชิ้นสวนของยนี CAD จากยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 โดยใช ที่มีขนาดประมาณ 550 bp. (รูปที่ 2)ซ่ึงแสดงใหเห็นวาในยางพาราพนัธุีน CAD มีบางสวนที่เหมือนกันกับยีน CAD ในพืชชนดิอื่นๆ ที่ใช

-10-

เปรียบเทียบความเหมือนกันในการออกแบบ primer ในปฏิกิริยาการเพิม่ประมาณยีน CAD ดวยเทคนิค PCR ไดใชเอน็ไซม Platinum Taq DNA Polymerase ซ่ึงเอ็นไซมนี้มีขอดีคือ ไดผลผลิต PCR มาก สามารถเพิ่มความจําเพาะ และทําใหการเตรียมปฏิกิริยา PCR มีความสะดวกมากขึน้ รวมทั้งยังกาํจัดปญหาการปนเปอนของปฏิกิริยาไดเนื่องจาก เปน hot start เอ็นไซมที่ใชแอนติบอดีสําหรับยับยั้งการทํางานของเอ็นไซมในอณุหภูมิปกติ แตจะมีกิจกรรมไดเมื่อใหความรอนที่อุณหภูมิ 94 °C เปนเวลา 30 วินาที ถึง 2 นาที รูปท่ี 2 แสดงชิ้นสวนของยนี CALadder, 1 : ช้ินสวนยีน CAD ขน

จากการแยกความบริสุทช้ินดีเอ็นเอทีแ่ยกไดมีดีเอ็นเอเพียพบวาประสบผลสําเร็จในการนําเขาสู แบคทีเรีย E. coli โดยตรวเมื่อทําการตรวจสอบดวยเทคนิคเปาหมายไปแทรกอยูทุกโคโลนที่สามารถตรวจหาโคโลนีเปาหมปริมาณเชื้อ และไมตองสกดัพลา

D ที่เพิ่มปริมาณไดจากยางพันธุฉะเชงิเทรา 50, M1 : 100 bp DNA าด 550 bp. และ 2 : Control PCR

ธิ์ของชิ้นสวนของยีน CAD ที่เพิ่มปริมาณไดโดยแยกผานชิน้วุน พบวางแถบเดียว (รูปที่ 3) ซ่ึงมปีริมาณเพียงพอสําหรับนําเชื่อมตอกับ Vector ชิ้นสวนของยีน CAD ไปเชื่อมตอกับ pGEM-T Easy Vector และถายจพบโคโลนีของแบคทีเรียที่มีช้ินดีเอน็เอเปาหมายเปนจํานวนมาก และ Single Colony PCRเพื่อยนืยันผลที่ได พบวาไดมีช้ินสวนของดีเอ็นเอีที่มีสีขาว (รูปที่ 4) (รูปที่ 5) การทํา PCR จากโคโลนีโดยตรงเปนเทคนิคายไดรวดเร็วทราบผลไดภายใน 1 วนัเนื่องจากไมมีขัน้ตอนการเพิ่มสมิด

-11-

รูปท่ี 3 แสดงชิน้ดีเอ็นเอของยีน CAD ที่แยกใชเปนแถบเดียวและดึงดีเอ็นเอกลับมาใช (Recovery of DNA) M1 : 100 bp DNA Ladder, 1 : ช้ินสวนยนี CAD ขนาด 550 bp.

รูปท่ี 4 แสดงแถบดีเอ็นเอ1 : โคโลนีที่มีช้ินสวนยีน C

จากการตรวจหาโคโลนีที่มีช้ินดีเอ็นเอเปาหมาย M1 : 100 bp DNA Ladder, AD, 2 : โคโลนีที่ไมมีช้ินดเีอ็นเอเปาหมาย

-12-

การแยกสกัดพลาสมิดจากแบคทีเรีย E. coli ที่ไดรับการสงถายชิ้นสวนของดีเอ็นเอโดยใช QIAprep Miniprep สามารถแยกแบคทเีรียได 155 ng/µl และมีความบริสุทธิ์เทากับ 1.94ซ่ึงพลาสมิดที่สกัดไดมีปริมาณและความบริสุทธิ์เพียงพอสําหรับการนําไปหาลําดับเบสโดยใช BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing เมื่อนําไปตรวจสอบดวย Agarose gel พบแถบดีเอ็นเอของพลาสมิดดังรูปที่ 5 ซ่ึงการแยกพลาสมิดในขัน้ตอนนี้เปนการแยกพลาสมดิที่ใช QIAprep Miniprep ที่ใชดางทําใหเซลลแบคทีเรียแตกตัว และตามดวยการใช silica membrane ดูดซบัดีเอ็นเอไวและชะลางดีเอ็นเอออกจาก silica โดยบัฟเฟอรที่เหมาะสม ซ่ึงถือไดวาเปนระบบที่ปลอดภัยปฏิบัติไดงายและรวดเรว็นอกจากนี้ยังเปนการลดสารเคมีที่เหลือใชจากหองปฏิบตัิการอีกดวย เนื่องจากไมตองใชสารพวกฟนอล คลอโรฟอรม และ เอทานอล รูปท่ี 5 แสดงแถบดีเอ็นเอของมิดที่สกัดไดและมีช้ินดีเอ็นเอเ

ผลจากการใช primerpGEM-T Easy Vector เมื่อตยีน CAD ที่โคลนไดจากยางพเปรียบเทียบกบัลําดับเบสของEucalyptus salign รองลงมาคglobul, M.sativa, Populus bal48.5% 48.1% 47.3% 46.6%

พลาสมิดที่สกัดจากแบคทีเรีย M1 : 1Kb. DNA Ladder, 1-4 : พลาสปาหมาย T7 และ SP6 หาลําดับเบสของชิ้นสวนยนี CAD ที่แทรกตัวอยูใน ัดสวนที่เปน Vector ออกลําดับเบสที่ไดพบวาลําดับเบสของชิ้นสวนาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 มีขนาดเทากับ 542 bp. (รูปที่ 6) . และเมื่อยีน CAD ในพืชชนิดอื่นพบวามีลําดับเบสเหมือนกันมากที่สุดกับ ือ Fragaria x ananas, P.deltoides, Populus tremuloid, Eucalyptus samifera และ Saccharum officin โดยมีคา Identity 49.7% 49.6% 46.0% และ 44.3%% ตามลําดับ

-13-

TGAGCTCCGATGAAAATGGAAGCAGTGATGGAATGGAAGCCTCCCAGGAATACAACTGAGGTCA

GAAGTTTCTTGGGGCTAGCTGGGTATTGCAGAAGATTTGTGAAGGGATTTTCCTTAATAGCTGCTCTAATGACCAAGTTGTTACACAAGAATGTCAGATTTGACTGGAATGACAAGTATCAGACTAGTTTTGAGAAGTTGAAGGTCTATGTTGACAGAGGCACCAGTGTTAACACAGCTAGTGTCAGGAAAGGACTTTGTGGTCTACAGTGATGCCTCTCATAATGGGTTAGGGTGTGTATTGATGCAAGAGGGGAAGGTGGTCGCTTATGCTTCCCAGGCAGCTAAGGCCACATGAACAGAATTACCCTACCCATGATTTAGAACTTGCAGCAATTATCTTCGCACTAAAGATATAGAGGCACTACTTGTATGGTGAAAAGTGCTACATTTACACAGACCATAAAAGCTTGAAATACTTGCCAACCTAAAAAGAGCTCAACCTTAGACAGAGGCGATGGATTGACTTCCCAGATCGA

รูปท่ี 6 แสดงลําดับเบสของชิ้นสวนยนี CAD ขนาด 542 bp. ที่โคลนไดจากยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 2. ศึกษาการแสดงออกของยนี CAD ดวยเทคนิค Quantitative Real Time RT-PCR

เมื่อใชโปรแกรม D-LUX™ Designerในการออกแบบ primer ที่เหมาะสมสําหรับการวิเคราะหปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ในยางพาราดวยเทคนิค Real-time PCR โดยนําลําดับการเรียงตัวของ ยีนที่โคลนไดจากยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 ไปออกแบบ primer ไดลําดับเบสเพื่อใชสังเคราะห primer (Forward : 5’-GAAAGGACTTTGTGGTCTACA GTG-3’ , Reverse : 5’-GAAGC ATAAGCGACCACCTTCC-3’) ที่ไมมีการติดฉลากดวยสารเรืองแสง เพื่อนํามาตรวจสอบความจําเพาะ พบวา primer ที่ไดสามารถเพิ่มปริมาณชิ้นสวนของยีน CADซ่ึงมีขนาดเทากับ 96 bp. (รูปที่ 7) เพียงแถบเดียว จากนั้นไดสังเคราะห LUX primers ที่ติดฉลากดวยสารเรืองแสงชนิด FAM เพื่อนําไปใชทดสอบปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ในยางพารา ซ่ึง LUX primer เปนชนิดของ primer ที่ และมีความเหมาะสมกับงาน Real Time PCR ทั้งในดาน Quantitative PCR (qPCR) และ RT-PCR (qRT-PCR)ใชงานไดงาย มีความไวสูง นอกจากนี้ยังสามารถวิเคราะหหาคา melting curve ของชิ้นดีเอ็นเอได โครงสรางของ primer เปนแบบ hairpin จึงสงผลใหในสภาพปรกติการเรืองแสงของสารที่ติดฉลากลดลง แตสารเรืองแสงที่ใชติดฉลากจะมีการเรืองแสงเพิ่มขึ้นเปน 10 เทา เมื่อมี primer ปรากฏอยูในเสนดเีอ็นเอที่เปนสายคูในระหวางการเพิ่มปริมาณดเีอ็นเอ (Invitrogen, 2004) การตัวตรวจจับดเีอ็นเอที่เพิ่มปริมาณดวยเทคนิค Real Time PCR โดยใช LUX primer เปนตัวตรวจจับ เปนทางเลือกทีป่ระหยดักวาการใชเทคโนโลยี FRET (Fluorescene Resonance Enercy Transfer) ในลักษณะตางๆ เชน - Hybridization probe ที่ใช Oligonucleotide probe สายส้ันสองสาย

-14-

- Hydrolysis probe (Taqman) ที่ใชสาย Oligonucleotide เสนเดียวแลวติดฉลากดวย Reporter dye และ Quencher dye - Molecular Beacons ที่มีการสังเคราะห probe ใหโคงงอเปน hair pin loop ซ่ึงจะตองติดฉลากดวย Fluorochrome และ Quencher dye

จะเห็นไดวาการใช LUX primer ซ่ึงใชวิธีการติดฉลากที่ primer เพียงที่เดียวเทานั้น นอกจากใชในการตรวจสอบการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในเชิงปริมาณแลว ยังใชหาคา melting curve ของชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณไดอีกดวย จึงเปนระบบทีค่อนขางประหยัดกวาระบบที่กลาวขางตน

รูปท่ี 7 แสดงการตรวจสอบความจําเพาะยนี CAD, M : 100 bp.DNA Ladder, 1 : แถบดีเอ็นเอที่เพิม่ปริมาณไดจากการใช LUX primers ซ่ึงมีขนาดเทากับ 96 bp. , 2 : control PCR จากการใช LUX primer ที่ติดฉลากดวยสารเรืองแสงชนิด FAM คือ CADFL : 5’-cgaatGGAA TCCAAGGGGAAATT[FAM]G -3’ และ CADRU : 5’-TTCAGCAGATGATCCCATA TTCTC-3’ ในการตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ในใบของยางพาราพันธุ ฉะเชิงเทรา 50 พบวาสามารถใชเทคนิค Two Step Quantitative Real-Time RT-PCR ตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของยีนได (รูปที่ 8) โดยเมื่อนําชิน้ดีเอ็นเอของยีน CAD ที่เพิม่ปริมาณไดไปวิเคราะหดวยโปรแกรม melting curve พบวามีคา Tm เทากับ 79.0 ° C (รูปที่ 9)

-15-

รูปท่ี 8 กราฟแสดงปริมาณการแสดงออกของยีน CAD ในใบของยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 กับคาดีเอ็นเอมาตรฐาน ที่ระดับความเขมขน 100-104 pg

รูปท่ี 9 กราฟแสดงคา melting curve ยีน CAD ที่แสดงออกในใบของยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 มีคา Tm : 79.0 ° C

-16-

สรุปผลการทดลองและคําแนะนํา

การทดลองนีส้ามารถใช primer ที่ออกแบบจากพืชชนดิอื่นในการโคลนชิ้นสวนของยีน CAD ในยางพาราพันธุฉะเชงิเทรา 50 โดยพบวาชิ้นสวนของยีนที่โคลนไดมีขนาด 549 bp. และลําดับเบสของยีนเหมือนกนัมากที่สุดกับ Eucalyptus salign และสามารถนําลําดับเบสที่ไดไปใชออกแบบ primer ที่ใหความจําเพาะกับยนี CAD รวมทั้งสามารถใชเทคนิค Two Step Quantitative Real-Time RT-PCR ตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของยีน CAD พบวาสามารถตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของยนี CAD ในยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 และวิเคราะหคา Tm ของชิ้นดีเอ็นเอได เทากบั 79.0 0C

แมวาการทดลองนี้ได Lux primer ที่สามารถใชวัดระดับการแสดงออกของยีน CAD ในยางพาราพันธุฉะเชิงเทรา 50 แตอยางไรก็ตามจําเปนจะตองมีการทดลองขั้นตอไปโดยการนํา Lux primer ที่ไดไปวัดระดับการแสดงออกของยีนกับยางพาราพันธุ ที่ใหเนือ้ไมสูงและต่ํา เพื่อใหไดขอมูลระดับการแสดงออกของยีน CAD ในยางพาราแตละพันธุ สําหรับนําไปใชประโยชนเพื่อเปนขอมูลในการคัดเลือกพันธุในขั้นตอนการปรับปรุงพันธุยางเพื่อเนื้อไม ตอไป

คําขอบคุณ

คณะผูวจิัยขอขอบคุณ ศูนยวิจัยยางฉะเชิงเทรา ที่ไดใหความอนุเคราะหพันธุยางพาราสําหรับใชในการทดลองในครั้งนี้

-17-

เอกสารอางอิง สถาบันวิจัยยาง.2538. 96 ปยางพาราในจังหวัดตรัง. สถาบันวิจยัยาง. กรมวิชาการเกษตร . สถาบันวิจัยยาง.2545. พันธุยางเนื้อไมสูงป 2545. สถาบันวิจัยยาง. กรมวชิาการเกษตร สถาบันวิจัยยาง.2538. คําแนะนําพนัธุยางเนื้อไมป 2545. สถาบันวิจัยยาง. กรมวิชาการเกษตร สรรพกิจ ถาวรวงศ. 2544. เอกสารประกอบการสัมมนายางพาราแหงประเทศไทย คร้ังที่ 4 เร่ือง "พัฒนายางพาราไทย กูภัยเศรษฐกิจ" Appliedbiosystems. 2003. Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA

Templates for Use in Quantitative PCR. http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/ quant_pcr.pdf.

Baucher M., Monties B., Van Montagu M, and Boerjan W. 1998. Crit. Rev. Plant Sci. 17, 125- 197. Chabannes M, Ruel K, Yoshinaga A, Chabbert B, Jauneau A, et al. 2001. In situ analysis of

lignins in transgenic tobacco reveals a differential impact of individual transformations on the spatial patterns of lignin deposition at the cellular and subcellular levels. Plant J. 28: 271-82.

Invitrogen. 2004. Instruction manual of LUX fluorogenic primers for real time PCR and RT-PCR. Invitrogem.com. Jones L, Ennos AR, Turner SR. 2001. Cloning and characterization of irregular xylem4 (irx4): a severly lignindeficient mutant of Arabidopsis. Plant J. 26: 205-16. Meyer K., Cusumano J. C. Somerville C. and Chapple C. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA .93, 6869-6874. Pear J. R., Kawagoe Yl., Schreckengost W. E., Delmer D. P. and Stalker D. M. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12637-12642. QIAGEN. 2003. QIAprep miniprep handbook. pp. 1-23. Takabe K, Nakashma J, Hibino T, et al, 1995. Control of Lignification in Plant Cell Wall.

http://www.metla.fi/iufro/iufro95abs/d5pap13.htm Turner S. R. and Somerville C. R. 1997. Plant Cell. 9, 689-701. Zhong R., Taylor J. J. and Ye Z. H. 1997. Plant Cell. 9 2159-2170