Nuovi derivati porfirinici: proprietà fotodinamiche e prospettive di applicazione
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CAMERINO
Scuola di Scienze del Farmaco e dei Prodotti della Salute
Nuovi derivati porfirinici: proprietà fotodinamiche e prospettive di
applicazione
RelatoriProf. Giulio LupidiProf.ssa Annette HabluetzelProf.ssa Piera Di Martino
LaureandoMarco Pigliacampo
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Le PorfirineCosa sono:-composti macrociclici-Formano complessi molto stabili con metalli di transizione-Complessi metallici con importante ruolo nell’attività biologica-Presentano caratteristiche bande di assorbimento nella regione 400 – 500 nm chiamata Banda di Soret
Terapia fotodinamica (PDT)
Proprietà dei fotosensibilizzatori:I)massimo assorbimento nella regione 600-800; II)alti rendimenti quantici di 1O2; III)fotostabilità; IV)non-tossico e fototossico; V)specificità di ritenzione nel tessuto tumorale; VI)fluorescenza; VII)sufficiente solubilità del sensibilizzatore in mezzi acquosi
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Le PorfirineMeccanismo della PDT
Generazione dell’ 1O2
1)la molecola di PS passa nella forma S02)rilassamento dell’S0 in forma radioattiva3)rilassamento per conversione interna (calore)4)Intersystem crossing verso lo stato T1
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Le PorfirineTipo I: reazioni di trasferimento elettronico tra il PS nello stato T1 ed altre molecole. Si generano ROS dannosi per le cellule.Tipo II: scambio di spin elettronico tra il PS nello stato T1 e l’ossigeno tripletto 3O2. Si produce quindi un’ossigeno singoletto altamente citotossico (1O2).
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Fotosensibilizzatori porfirinici- I generazione (HPD, Photofrin®)- II generazione - III generazione
1) Fotosensibilizzazione prolungata della pelle
2) Penetrazione non ottimale nei tessuti3) Scarsa purezza
Legati a vettori per garantirne un accumulo nel tessuto tumorale
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Terapia fotodinamica (PDT)Terapia innovativa per la cura di neoplasie che coinvolge tre componenti chiave: la luce, l’ossigeno ed una sostanza fotosensibile (fotosensibilizzatore/PS).
Meccanismo biologico d’azione
1) Danno mitocondriale2) Danno al DNA e modifiche all’RNA3) Danno al tessuto vascolare
Apoptosi
Infiammazione acuta
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Applicazioni chimiche e batteriologiche
Tumori
Agenti patogeni- Funghi- Insetti- Batteri
Vettori di agenti
patogeni (Malaria)
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Scopo del lavoro
Malaria vaccino controllo vettori
La porfirina, utilizzata come fotosensibilizzatore per la PDT, permette un buon controllo dei focolai malarici che si possono sviluppare a causa del mancato controllo dei vettori.
I derivati meso-sostituiti sono i più adatti grazie alle loro proprietà
- Chimico-fisiche- Fotobiologiche- Biochimiche- Fisiologiche- Dosaggio ottimale
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Procedimento utilizzato Condizioni di irraggiamentoluce nello spettro del visibile (400/800nm)
Studi fotofisici e fotochimiciporfirina irraggiata e controllata spettrofotometricamente
Potenziale della porfirina come fotosensibilizzatore misurato in base alla resa
quantica (WD) della genesi dell’ossigeno singoletto (1O2)
Studi di formulazione- pellet di cibo larvale (PFP) + C14/C12- formulato C12 + Eudragit S100
Esperimenti di fotosensitizzazione60 larve alimentate con EU-C12 vengono esposte alla
luce. Si effettua quindi il conteggio delle larve morte
Microscopia a fluorescenza utilizzata
per vedere la distribuzione del
formulato
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Risultati ottenutiStudi fotofisici e fotochimici
Porfirina C14
Buona fotostabilità: rimaneva attivata fino
a concentrazioni di 1mM.
Produzione di 1O2 come le porfirine meso-sostituite
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Tempo di incubazione(h)a (%) di larve sopravvissuteb
Proporzione di adulti emersi(%)c
(%) di adulti sopravvissuti dopo esposizione alla
luce d
3 100(0.0) 138/141(97.9) 100
8 99.3(1.2) 128/128(100) 100
24 100(0.0) 138/141(97.9) 100
control 99.4(1.1) 155/157(98.7) 100
Per larve di Ae. Aegipty:
Nessuna fototossicità al buio, anche a concentrazioni submicromolari
Hours of irradiation LC50 (mM) CI95% R2 χ2
1 0.46 0.39-0.53 0.94084 0.29375
6 0.25 0.16-0.35 0.99381 0.03925
12 0.22 0.17-0.28 0.93035 0.39925
12 light+12 dark 0.11 0.08-0.13 0-94142 0.31300
Risultati ottenutiStudi fotofisici e fotochimici
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La mortalità aumenta con il passare dei giorni
92,1% ± 7,9%
Risultati ottenutiStudi fotofisici e fotochimici
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Porfirina
idrofila: incapace di penetrare le membrane lipofile
lipofila: capacità di penetrare le membrane
formulazione in microparticelle disgreganti all’interno dell’intestino
C14 coniugata con un cibo proteico per larve, il PFP. PFP – C14
Risultati ottenutiStudi di formulazione
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Risultati ottenutiStudi di formulazione
% di mortalità su tempo di incubazione*
Treatment 48h 1 week 2 weeks C14 (mg/tray)
Control† 0(0.0) 0(0.0) 0(0.0) 0
0.3μM† 100(0.0) 100(0.0) 0(0.0) 0.230
5 μM† 100(0.00) 100(0.0) 100(0.0) 3.8
C14PF-5‡ 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0(0.0 0.007
C14PF-50‡ 100(0.0) 99.7(0.6) 99.7(0.6) 0.352
- Il C14PF-50 mantiene l’attività larvicida fino a due settimane- Il C14PF-5 perde l’attività già dopo 48h
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Risultati ottenutiStudi di formulazione
Esche larvicide-attivamente consumate dalle larve-compatibili con il rilascio in depositi di acqua domestica-non alterano le caratteristiche organolettiche dell’acqua
Modifiche fisiche portano alla sintesi di derivati utilizzabili
contro vettori di altre malattie (Anofele spp.)
Accettazione come antilarvale da parte della
comunità destinataria
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Risultati ottenutiStudi di formulazione
Fattori chiave per lo scale-up della produzione
- costo della porfirina- formulazione con PFP insolubili
in acqua ma solubili nell’intestino
- modulazione della flottabilità in acqua
C14
troppo costoso
C12
molto più economico
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Risultati ottenutiStudi di formulazione
Comparazione delle proprietà come fotoattivatori
C12 adatta allo scopo
Anfipaticità della porfirina (saggiata con legame alle albumine sieriche umane HSA)
la C12 si lega addirittura meglio
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Risultati ottenutiStudi di formulazione
Esistendo larve con differenti modi di alimentazione, abbiamo la necessità di trovare un formulato in grado di adattarsi alle diverse condizioni di galleggiabilità che incontriamo.
E’ stato riscontrato che il PFP non galleggia
Nuovo formulato con l’Eudragit S100
- stabile a diversi range di pH
- buone proprietà di galleggiabilità
- la C12 vi si lega con alta efficienza
Successivamente si è provveduto a valutare i formulati sotto diversi aspetti chiave:-rilascio della porfirina-stabilità alla luce-galleggiabilità
il migliore composto è risultato essere l’EU-D
(50µM)
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Risultati ottenutiEsperimenti di fotosensitizzazione
Trattamento
Mortalità delle larve dopo incubazione per tutta la notte
Mortalità delle larve dopo 30 min. di esposizione alla luce solare (70
mW/cm2)EU 0 % 0 %EU-C12 0 % 100 %EU-C12 transfer 0 % 100 %EU-C12 water 0 % 5 %
- il complesso Por-Eud non uccide in condizioni di buio- l’azione è correlata all’ingestione del formulato- una piccola mortalità è stata rilevata per acqua EU-C12 filtrata
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Dose della formulazione
Tempo di esposizione alla luce solareSpecie di larve di
zanzara
0 h 0.5 h 3 h 8 h
50 µM EU-C1230 mg
0 94 ± 8 100 ± 1 100 ± 0An. gambiae
50 µM EU-C1230 mg
0 90 ± 2 91 ± 9 97 ± 4An. arabiensis
Risultati ottenutiEsperimenti di fotosensitizzazione
Dose della formulazione
Tempo di esposizione alla luce solareSiti di selezione di
Anopheles spp. larvae
0 h 0.5 h 3 h 8 h
50 µM EU-C1230 mg
0 93 ± 3 100 ± 0 100 ± 0 Soumousso
50 µM EU-C1230 mg
0 93 ± 3 100 ± 0 100 ± 0 Vallée du Kou
E’ da tenere comunque sempre in considerazione che molti altri fattori possono competere con la palatabilità del formulato, sul campo.
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Conclusioni- le porfirine sostituite possono essere considerate come un efficace fotolarvicida- la porfirina C12 meso-sostituita può tranquillamente essere utilizzata al posto
della C14 (più costosa)- la C12, quando presente e quando esposta alla luce, fotoinattiva le larve di
Anopheles, anche in siti di allevamento naturale- l’Eudragit rilascia la C12 più facilmente nelle caecae larvali gastriche, anche se in
presenza di cibo più appetibile mostra una performance deludente
L’approccio della fotoinattivazione porfirina-mediato costituisce quindi un buon controllo per la proliferazione
dei vettori malarici
Sviluppi futuri prevederanno studi del formulato EU-C12 con esperimenti sul campo atti a validare l’attività in presenza di una molteplicità di condizioni naturali
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Ringraziamenti
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Grazie per la cortese attenzione
Marco Pigliacampo