1

Nuovi approcci all’identificazione e

caratterizzazione di geni regolati

P

P

P

P

Nuovi approcci all’identificazione e caratterizzazione di geni regolati dallo Scatter Factor HGF e dal suo recettore Met

METASTASI

Trasformazione

Crescitainvasiva

HGF

Y

Y

Y

Y

Met

MORFOGENESI

P

P

PGab1

Grb2 PLC-γ

Ezrina

PI3Kp85

STAT

Bag1

SosRas

PI3Kp85

Sopravvivenza

Scatter

Proliferazione Grb2

2

La risposta trascrizionale all’HGF

mRNA presenti allo stato basale

mRNA presenti dopo stimolazione con HGF

mRNA basaliStimolazione con HGFmRNA basali

mRNA repressi mRNA indotti

stimolazionemRNA basali mRNA basali

mRNA repressi mRNA indotti

1. DIFFERENTIAL DISPLAY

2. SUBTRACTED LIBRARIES

3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA SU MICROARRAY

4. TECNICA DEL “GENE TRAP”

3

1.DIFFERENTIAL DISPLAY

2. SUBTRACTED LIBRARIES

4

5

SOPPRESSI INDOTTI

INVARIATI

10000 cDNA

Estrazione dell’RNA,sintesi del cDNA

e marcatura.

Campione di controllo

Campione stimolato

3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA su MICROARRAY o MACROARRAY

MICROARRAY

Image from Gene-Chips (Microarray)

6

2x suppressed

2x induced

Unstimulated

stim

ulat

ed

10 100 1000 10000 10000010

100

1000

10000

100000

MACROARRAY

7

8

Molto complessacomplessaAnalisi dati

Elevati (attrezzatura)contenutiCosti

Fino a 15.000500-9000Geni analizzati

2-10 µl5-40 ml (come un Northern)Volume ibridizzazione

Sullo stesso vetrinoSu due filtri diversiIbridizzazione

Laser confocalephosphorimagerAnalisi di immagine

Fluorescenza (Cy3, Cy5)33P , 32PSistemi di rivelazione

50-100 µg RNA totale10 µg mRNA

5 µg RNA totale0.5 µg mRNA

Dimensioni campioni

MICROARRAY SU SLIDESMACROARRAY SU NYLON

9

Major HGF-regulated genes and total cDNAs corresponding to extracellular matrix proteins contained on the microarray

Genes regulated by HGF >3-fold are listed in order of fold induction and italicized. In addition, all of the cDNAs corresponding to extracellular matrix proteins, extracted from a total of 8735 spotted cDNAs, are listed in alphabetical order. Average induction and SD were obtained from a triplicate comparison between unstimulated and HGF-stimulated (6h) cells.

To enrich for target genes associated with HGF-induced scattering, two experiments were performed in 0.1% serum and one in 2% serum.

MLP-29 cells respond to HGF and EGF by increasing OPN mRNA and protein

Western blot analysis of OPN protein expression by MLP-29 cells after different timesof HGF or EGF stimulation, as indicated. Total cell lysate (20 mg) was loaded per lane, followed by fractionation in 8% SDS-PAGE and immunoblotting.

10

GFNR(Green Fluorescent Nitro-Reductase)

• quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventa al tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN)

GFNR

EGFP NTR

4. TECNICA DEL “GENE TRAP”

Vettore di espressione per GFNR

11

Fluorescence and drug sensitivity of 293T cells transiently transfected with pEGFP, pGFNR, and pNTR. Relative pGFNR efficiency was estimated either by flow cytometric analysis (left) or by cell counting after 48 h of MN treatment (right). A fluorescence efficiency of 100% corresponds to the mean fluorescence intensity of the green fluorescent subpopulation in the pEGFP-transfected cells. A killing efficiency of 100% corresponds to the difference in cell number between mock-transfected and pNTR-transfected MN-treated cells. Error bars represent standard deviation of triplicates.

Validazione della proteina di fusione: fluorescenza e sensibilità al MN

Validazione della proteina di fusione: correlazione fra fluorescenza e sensibilità al MN

Correlation between fluorescence and MN sensitivity in stable transfectants. MLP-29 cells weretransfected with pGFNR, selected with G418, and FACS-analyzed for green fluorescence beforeand after 48 h of MN treatment. For the analysis, three classes of fluorescence were identifiedand defined as low, medium, and high. In the untreated population, the number of cells in eachclass was assigned the 100% value. After treatment, the abundance of each fluorescent subpopulation was compared with the respective control sample, and percentage of survival was estimated. Error bars are not present because data were obtained by a FACS-based population analysis.

12

Vettore di espressione per GFNR e trappola genica

Gene endogeno

PromotoreEsone1 Esoni 2,3...Introne1

mRNACoda di poliA

Meccanismo di intrappolamento genico

Geneintrappolato

PromotoreEsone1 SA

TRAPPOLA GENICA

GFNR

pAPGK prom

neoEGFP NTR

Cassetta Neo

mRNA ibridoGFNR

pAPGK prom

neo

SA

EGFP NTR

Cassetta NeoCoda di poliA

Esone1

13

Un reporter per i geni regolati: GFNR(Green Fluorescent Nitro-Reductase)

• quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventaal tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN)

• le cellule in cui la trappola genica è integrata a valle di un promotore attivo possono essere identificate e selezionate positivamente al FACS

• le integrazioni a valle di promotori costitutivi possono essere controselezionate mediante trattamento con MN

• le integrazioni a valle di promotori regolati dall’HGF possono essere selezionate stimolando le cellule con HGF prima della selezione positiva (geni indotti) o negativa (geni soppressi)

GFNR

EGFP NTR

Ottimizzazione delle procedure di selezione positiva

infezioneselezione contemporanea con G418

e con MN

rimozione del MN

stimolazione con HGF e isolamento (“sorting”) delle cellule

fluorescenti

screening dei cloni sopravvissuti per identificare quelli indotti dall’HGF

sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina)

muoiono i cloni che hanno integrato la gene trapin un gene trascritto attivamente (geni housekeeping)

le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene indotto dall’HGF

SA

TRAPPOLA GENICA

GFNR

pAPGK prom

neoEGFP NTR

Cassetta Neo

14

infezioneselezione con G418

isolamento (“sorting”) delle cellule fluorescenti

stimolazione con HGFe controselezione con MN

screening dei cloni sopravvissuti per

identificare quelli soppressi dall’HGF

SA

TRAPPOLA GENICA

GFNR

pAPGK prom

neoEGFP NTR

Cassetta Neo

sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina)

le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene attivamente trascritto (geni housekeeping)

Ottimizzazione delle procedure di selezione negativa

muoiono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene housekeeping o in un gene indotto dall’HGF

sopravvivono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene soppresso dall’HGF

Analisi al citofluorimetro di popolazioni di cellule “trappate”

HGF induced traps

First round

HGF induced traps

Second round

HGF suppressed traps

15

ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEI CLONI

Controllo

HGF

Clone E3.2 Clone HF-57

Responsività all’HGF dei cloni intrappolati

0

10

20

30

40

50

60

1.5 - 2 2 - 3 > 3

Livelli di induzione

Abb

onda

nza

rela

tiva

(%)

010

203040506070

1.5 - 2 2 - 3 >3

Livelli di soppressione

Abb

onda

nza

rela

tiva

(%)

16

RACE = RAPID AMPLIFICATION OF cDNA ENDS

Geneintrappolato

PromotoreEsone1 SA

TRAPPOLA GENICA

GFNR

pAPGK prom

neoEGFP NTR

Cassetta Neo

mRNA ibridoGFNR

pAPGK prom

neo

SA

EGFP NTR

Cassetta NeoCoda di poliA

Esone1

add oligo poly G

PCR

retrotrascrizione con primer su GFNR

primer poly C

cDNA

prodotto di PCR

Identificazione dei geni intrappolati

CCCNCNTCNC GGCNTTGTTA CNACNGCTTG CCNAAAGTAT CCAGTGAGAG AGGCAGATGCCCTGGGTGGT AGAGCAGGCT GCTGGTCTGG TCCTCTCTTC AGGAGATTTG CAACCCTGGACAGTAGCGAT ACCGTCGATC CCCACTGGAA AGACGCGAAG AGTTTGTCCT CAACCGCGAGATGGNGGCGA CGGTAGCGCT

primer della RACE gene Tmp SA EGFP

Su 10 cloni sequenziati:

2 corrispondono a geni noti: Tmp e Sprr2h

3 corrispondono a EST: AA274109, AI931556 e C89509

4 corrispondono a sequenze ripetitive

1 non corrisponde ad alcuna sequenza nota

Sequenza del prodotto di 5’-RACE del clone 3E1.8

17

Specificità delle traps

0.4

2.2 2.

6

4.6

1.6

1.5 1.

9

1.7

1.2

0.6

1.7 1.8

1.0

1.8

1.2 1.3

2.6

4.0

0.2

2.3

3.8

3.0

2.3

1.7 2.

2

3.7

2.2

0.10

1.00

10.00

HF-39 E3.2(Novel)

EST Tmp E4H-20-6 Sprr2H H5-16 H5-17 Unknown

HGF FBS HGF+FBS

Fold

Indu

ctio

n

0

200

400

600

Sprr2h

GAPDH

Tempo(ore)

0 1.5 3 6 16

Abb

onda

nza

rela

tiva

(%)

0

2040

6080

100

EST AI931556

GAPDH

Tempo(ore)

0 1.5 3 6 16

Abb

onda

nza

rela

tiva

(%)

Validazione della trappola

Northern blot (RNA di cellule MLP-29 stimolate con HGF a tempi diversi)

18

Conclusioni e Prospettive

• è stato sviluppato un nuovo approccio di intrappolamento genico che consente di identificare in modo veloce ed efficiente i geni la cui trascrizione è regolata da stimoli esogeni (in questo caso l’HGF)

• l’ottimizzazione delle procedure permette lo screening funzionale dell’intero genoma; sono stati così isolati numerosi cloni responsivi all’HGF

• i cloni responsivi costituiscono un insieme di cellule reporter nelle quali si possono valutare, mediante analisi citofluorimetrica, le risposte trascrizionali dei geni intrappolati, usando anche stimoli diversi dall’HGF per una caratterizzazione funzionale più dettagliata