Nuevos desarrollos en la preparación de muestras · • Alcanza el nivel de limpieza del SPE con...
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Nuevos desarrollos en
la preparación de
muestras
Tecnologías que mejoran el
rendimiento y la productividad
Julián de la Mata
Innovation Tour 2015
1
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Preparación de muestras en análisis de alimentos
2
SPE/SPME(Bond Elut)
•Límites de
detección
•Automatización
QuEChERSQuECherS Lípidos
•Fácil de usar
•Ideal para muestras
alimenticias
Extracción Líquido-
líquido.(SLE , en soporte sólido
ChemElut)
•Separación de fases
•A menudo lleva mucho tiempo
Filtration/Captiva
•Retirada de partículas
•Retirada de lípidos
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SPME
Solid Phase Micro-Extraction
(MicroExtracción en Fase Sólida)
3
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La SPME elimina las desventajas de la Técnicas
clásicasVolatiles
• Purge and Trap
• Headspace
Semi-/No-Volatiles
• Extracción Líquido/Líquido (LLE, SLE)
• Solid Phase Extraction (SPE)
• Supercritical Fluid Extraction (SFE)
4
SPME
SPME elimina la mayoría de los inconvenientes de las Técnicas Clásicas,
puede usarse con muestras gaseosas y líquidas, para GC, LC, GC/MS, LC/MS
con y sin automuestreadores
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12
4
6
35
7
8
10
9
11
12
13
14
1516
17 18
1. -HCH
2. -HCH
3. -HCH
4. Heptachlor
5. -HCH
6. Aldrin
7. Heptachlor epoxide
8. Endosulfan I
9. 4,4’-DDE
10. Dieldrin
11. Endrin
12. 4,4’-DDD
13. Endosulfan II
14. 4,4’-DDT
15. Endrin aldehyde
16. Endosulfan sulfate
17. Methoxychlor
18.
En
Endrin ketone
Con agitación
Sin agitación
2 ppb de pesticidas en agua
Análisis de pesticidas en agua
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Preparación de la Muestra por SPE Offline
SPE Offline
• 1000 mL transportados al laboratorio
• Concentración de Trazas en cartucho
o disco
• Elución con pocos ml de disolvente, secado, reconstitución en disolvente adecuado paraseparación por LC o GC
• 1 mL muestra se carga en un vial del autosampler
• 2-20 µL se inyectan en el cromatógrafo
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Ventajas de SPE Offline
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Múltiples métodos publicados disponibles con esta técnica
Amplia Variedad de tipos de sorbente disponibles en función de las propiedades de los distintos analitos y de las distintas matrices
Concentración de analitos para conseguir menores límites de detección a la vez que eliminan interferencias que originan ruido
Adecuado para una amplia variedad de equipos instrumentales
La preparación Offline no bloquea al equipo durante la preparación, manteniendo la flexibilidad
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Preparación de Muestras Online para análisis por
LC-MS/MS
SPE Online (enriquecimiento de trazas)
• 100% muestra preparada se carga en el equipo
• Volumen puede ser <5 mL
• Combinado con detectores más sensibles (MS/MS)
• Se simplifica la logística de hacer llegar las muestras al laboratorio
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Ventajas de la SPE online
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Aproveche la sensibilidad de los sistemas LC-MS/MS con SPE online
Utiliza la muestra completa para lograr bajos límites de detección
Se necesitan pequeños volúmenes de muestra– menores costos de almacenamiento y transporte
Reduce las posibilidades de error causadas por el manejo de muestras.
Ahorro en costes de disolventes – tanto en la compra como en los desechos
No require pasos de evaporación.
No require reconstitución
Los sistemas integrados aumentan la productividad
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QuEChERS : Una
innovadora preparación
de muestras para el
análisis alimentario y
medioambiental
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¿Qué es QuEChERS (pronunciado “Catchers”)• Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS
(Rápido, Fácil,Barato,Efectivo, Robusto y Seguro, RaFaBERS)
• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de
residuos de pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales
• Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las Agencias
Reguladoras de Alimentos Europeas (método prEn 15662: 2007)
• QuEChERS es un método de preparación de muestra rápido para hacer
screening de analitos de interés, no para concentrar muestra.
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Método Luke o SPE tradicional QuEChERS Beneficio
Tiempo estimado para
procesar 6 muestras (min)
120 30 4x más rápido
Solvente usado (mL) 90 mL 10mL 9 x menos solvent
Desechos clorados (mL) 30 mL Ninguno Más seguro, más
ecológico, menos costo
Equipo especializado, material
de vidrio
Embudo, baño de agua,
contenedores de 200mL ,
evaporador, etc.
Ninguno No se necesitan
consumibles adicionales
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La última tecnología en la extracción de Lípidos
EMR-Lipid
Enhanced Matrix Removal
EMR: Tan fácil de usar como QuEChERS; tan límpio
como la SPE
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EMR se adapta perfectamente en los actuales flujos de trabajo.
Tubos EMR-Lipid (p/n 5982-1010)
Tubos EMR-Polish (p/n 5982-0101)Tubos de Extracción
QueChERS
Los productos EMR
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Sorbent EMR - ¿Qué es?
Cuando se active con agua…
- Las interacciones hidrofóbicasselectivas entre los materialesaumentan.
- Suspensión de nano particulas (altaarea superficial).
- Interacciona rápidamente con los grupos funcionales “tipo-Lípidos” de cadena recta.
Mecanismo EMR-Lipid –
Exclusión molecular e interacción hidrofóbica combinadas
1.0 g EMR en tubo de15 mL
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… ¿ y qué hace?
El sorbente EMR retira los Lípidos
¿qué son los lipidos?
Un tipo de hidrocarburos naturales que contienen compuestosconcocidos como grasas y aceites
Acidos Grados Libres
Trigliceridos
Colesterol Fosfolípidos
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¿Con qué no interaccióna EMR?
EMR NO elemina los analitos de interés
¿Excepciones?
Compuestos que contengan grupos funcionales con largascadenas alifáticas (e.g. prostaglandinas)
Fluoroquinolonas Tetracyclines
Vitamina DPAHsPesticidas organoclorados
Pesticidas Imidazoles
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Protocolos EMR para Aplicaciones
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EMR se adapta perfectamente en flujos de trabajo existentes
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)
• Preparación de muestra fácil de usar para análisis de alimentos, muestras sólidas (e.g. vegetales, frutas, carnes, pescados, etc.)
Aplicaciones EMR :- Residuos de plaguicidas en Aguacate,
Extracción líquida modificada (Precipitación Protéica)
• Las proteinas se eliminan con una precipitación antes de la inyección o cleanup (e.g. leche, carne, pescado, etc.)
Aplicaciones EMR :- PAHs en Salmon,- Fármacos veterinarios en hígado
bovino
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Pros
• Fast and inexpensive
• Takes minimal experience
• Doesn’t require special equipment
• Accommodates multiple matrices
• Accommodates large analyte groups
Cons
• Large amount of coextractives
Mejorando la dSPE en QuEChERS
1. Extraction 2. Dispersive SPE
Pros
• Same as extraction
Cons
• Minimal cleanup provided
• Can remove analytes
• Lipids are challenging to remove selectively
19
ExtracciónSPE Dispersiva
Pros
• Rápido y barato
• No se requiere experiencia
• No se requiere equipamiento
especial
• Aplicable a múltiples matrices
• Aplicable a gran grupo de analitos
Contras
• Gran cantidad de interferencias
Pesar muestra Añadir agua,
QC std y std
interno
Añadir
Acetonitrilo
Agitar o Vortex
Añadir paquete de sales Agitar 1 minuto Centrifugar a
4000 rpm, 5 min
Separar fase de
acetonitrilo
Elegir el kit de dispersiva y
añadir el extracto de acetonitrilo
Vortex 1 minuto Centrifugar a
4000 rpm, 5 min
Tomar una aliquota de
sobrenadante y secar o diluir
Poner en vial del
automuestrador para análisis
por GC o LC
Pros
• Las mismas que la extracción
Contras
• Proporciona una mínima limpieza
• Puede eliminar analitos
• Es difícil eliminar los lípidos
selectivamente
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QuEChERS Tradicional versus QuEChERS EMR-
Lipid
Transferir al Vial de análisis Transferir al Vial de análisis
Standard QuEChERS EMR QuEChERS
Extracción/Partición (6 pasos) Extracción/Partición (6 pasos)
↓ ↓
Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar
↓ ↓
Transferir Muestra a dSPE(sorbentes)
Transferir Muestra a dSPE(sorbentes & H20)
↓ ↓
Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar
↓ ↓
Evaporar y reconstituir o diluir Tubo Polish
↓ ↓
Filtrar Precipitado Evaporar y reconstituir o diluir
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(SI se usan sales de extracción)
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Mejorando los flujos de Trabajo de las
Extracciones Líquidas
2. Añadir la muestra de
alimento
1. Añadir solvente de
precipitación.
(ACN)
Sal
Proteinas
Lipidos
Analitos3. Mezclar para precipitar proteinas.
4a. EMR dSPE y Polish. 4b. SPE y/o GPC.
Transferir para analiisis
21
Centrifuge
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Extracción Líquida Tradicional versus EMR-Lipid
Transferir al Vial de análisis Transferir al Vial de análisis
Extracción Líquida con SPE/GPC Extracción Líquida EMR
Añadir Muestra y Acetonitrilo Añadir Muestra y Acetonitrilo
↓ ↓
Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar
↓ ↓
Pretratamiento de Muestra Transferir Muestra y H2O a EMR dSPE
↓ ↓
SPE y/o GPC Mezclar y Centrifugar
↓ ↓
Evaporar y reconstituir o diluir Tubo Polish
↓ ↓
Filtrar Precipitado Evaporar y reconstituir o diluir
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(No se usan sales de extracción)
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EMR – Lipid – dSPE Cleanup
A B C D
E
A. QuEChERS o Extracto Líquido
B. Añadir H2O al tubo EMR (“activación”)
C. Transferir extracto
D. Vortex y centrifugación
E. Sobrenandante (1:1; extracto: H2O)
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EMR – Polish – Separación de fase ACN/H2O
A B C D
E
A. Añadir sobrenadante al tubo EMR – Polish
B. Vortex inmediatamente
C. Separacion de fases después de centrifugación
D. Transferir la capa superior para análisis
E. División final de la muestra para analisis por
GC y LC.
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GC-MS Fullscan de Aguacate
Aguacate – sin tratar
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GC-MS Fullscan de Aguacate
Aguacate – sin tratar
Aguacate – tratado con EMR
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GC-MS Fullscan de alimento para animales
Muestra– sin tratar
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GC-MS Fullscan de alimento para animales
Muestra – sin tratar
Muestra – tratado con EMR
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GC-MS Full Scan– Aceite de Aguacate
Extracto Crudo Aceite
Aguacate
Extracto EMR – Lipid
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GC-MS Fullscan de Espinacas- Eliminación de
pigmentos
30
Blanco de matriz de espinacas con EMR cleanup
Blanco de matriz de espinacas sin cleanup
Blanco de matriz de espinacas con Q-Pigment dSPE cleanup
Blanco de matriz de espinacas con Q-Universal dSPE cleanup
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
Time-->
Abundance
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Conclusiones
• EMR-Lipid proporciona la retirada de lípidos más completa de todos los sorbentes que hay en el mercado.
• Alcanza el nivel de limpieza del SPE con la simplicidad de la dSPE.
• EMR es un procedimiento universal para una gran variedad de tipos de muestra y analítos.
• Se han validado aplicaciones clave con EMR y se ha demostradomejor recuperación, mayor precisión, y una gran disminución del efecto matriz en los instrumentos y resultados.
• EMR se puede implementar inmediamente como dSPE en flujosde trabajo existentes como son QuEChERS y Extracción Líquidamodificada.
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