www.azti.es 11/24/2014 1

Nuevo método rápido para la

determinación de histamina en

productos pesqueros

Elisa Jiménez

www.azti.es 11/24/2014 2

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Histamina

Amina biógena formada postmortem en músculo de peces

• Crecimiento bacterias generadoras de histidina decarboxilasa

• Principalmente en escombridos (atunes…) (mayor contenido His)

• Indicador nivel descomposición

• Elevado nivel: causa de reacciones tóxicas (cefalea, hipertensión,

nausea, …)

INTRODUCCIÓN

Imagen: www.rcgroups.com

www.azti.es 11/24/2014 3

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Histamina

• Medición: Cromatografía Líquida con detector de fluorescencia

(LC‐FLD), previa derivatización

• Regulación:

Reglamento (CE) nº 2073/2005, de la Comisión de 15 de noviembre de 2005,

relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios

• Limite máximo permitido

Productos de la pesca procedentes de especies de pescado

asociados a un alto contenido de histidina: 100 mg/Kg

Productos de la pesca sometidos a tratamiento de maduración

enzimática en salmuera, fabricados a partir de especies de

pescados asociados a un alto contenido de histidina: 200 mg/Kg

INTRODUCCIÓN

www.azti.es 11/24/2014 4

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros INTRODUCCIÓN

Aptámeros

• Oligonucleótidos de pequeño tamaño capaces de

unirse específicamente a la molécula de interés frente

a la cual han sido previamente seleccionados

(Ellington y Szostak, 1990)

• ARN o ADN

• Kd= µM (moléculas pequeñas) (hasta nM en proteínas)

Método selección

• SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment

(Tuerk C y Gold L. 1990)

Ellington AD & Szostak JW (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346:818-822.

Tuerk C & Gold L (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249:505–510.

Imagen: www.amsbio.com

www.azti.es 11/24/2014 5

Objetivos

• Desarrollar un sistema de detección rápido de histamina

• Sistema de reconocimiento biológico basado en aptámeros

• Testar los aptámeros seleccionados en sistema SPR (Surface

Plasmon Resonance)

• Implementación de aptámero en un sensor rápido (tiras de

reacción, placas ELISA…)

5

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros OBJETIVOS

www.azti.es 11/24/2014 6

Selección de aptámeros

• Aplicación de protocolo FluMagSELEX para la selección de

aptámeros óptimos (Stoltenburg, 2005)

• Selección a partir de una biblioteca de oligonucleótidos (1015

moléculas)

• Aptámeros: parte variable central (60mer) flanqueados por dos

regiones comunes de anclaje de cebadores (18 mer)

• Histamina pegada a esferas magnéticas

Dynabeads ® M-270 Epoxy (Invitrogen)

• Detección mediante fluorescencia

Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

DESARROLLO

Imagen: Invitrogen Dynal

www.azti.es 11/24/2014 7

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

DESARROLLO

Protocolo de selección

Sucesivos ciclos: n=15

1. Enfrentamiento biblioteca de aptámeros-histamina

2. Lavado de aptámeros no unidos

3. Elución de aptámeros afines

4. Amplificación por PCR de aptámeros con mayor afinidad

5. Separación PAGE desnaturalizante

• Cebadores longitud desigual

• Marcaje fluorescente

6. Vuelta al paso 1

7. Selección negativa

• Esferas no tapizadas con histamina

Imagen: Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous

method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83

www.azti.es 11/24/2014 8

RESULTADOS

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Identificación de aptámeros

• Clonación de aptámeros

pMOS Blue Vector (Amersham)

• Secuenciación de clones positivos

• Análisis de secuencias: búsqueda de motivos comunes

Software Clustal W

• Selección de dos posibles aptámeros afines a histamina

• Análisis de estructura secundaria

Software Mfold

pMOS Blue Blunt-Ended Cloning Kit.GE Healthcare

www.azti.es 11/24/2014 9

RESULTADOS

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Concentración de Histamina (μg/mlL)

Un

idad

es d

e F

luore

scen

cia

(U

F)

Análisis de afinidad

• Test afinidad aptámero-histamina en sistema de fluorescencia ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)

• Aptámero marcado con FAM Incremento concentración histamina > incremento fluorescencia = AFINIDAD

Concentración (µg/mL) UF Unidades Fluorescencia

0.1000 3,965,115.00

0.0500 2,447,103.50

0.0200 1,070,333.50

0.0130 781,517.50

0.0100 462,513.00

0.0050 256,044.00

0.0020 44,121.00

www.azti.es 11/24/2014 10

RESULTADOS

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Aplicación a sensor SPR

• Sistema de Resonancia de Plasmones Superficiales SPR BIACORE X

• Determinación de constante de disociación de la interacción

• Chip CM5: superficie de oro, matriz dextrano-carboximetilada

Reconocimiento aptámero-histamina > señal detectable

Señal mínima: Histamina bajo peso molecular

Cooper MA (2002). Optical biosensors in drug discovery.

Nature Reviews Drug Discovery 1:515-528.

www.azti.es 11/24/2014 11

RESULTADOS

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Optimización

• Conjugación Histamina+BSA (Bovine Serum Albumin)

• Biofuncionalización del chip con BSA

Activación de grupos carboxílicos de BSA con EDC:NHS

• Optimización de variables cinéticas: flujo, volumen de

inyección...

Imagen Estructura BSA. Autor: K.A.Majorek,P.J.Porebski,M.Chruszcz,S.C. Almo,W. Minor,

New York Structural Genomics Research Consortium (NYSGRC)

Imagen Biacore X. www.biacore.com

www.azti.es 11/24/2014 12

ACTIVIDADES FUTURAS

Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros

Futuros pasos

• Incorporación de aptámeros a tiras de flujo laminar

• Detección mediante nanopartículas de oro: en tira o en solución

• Funcionalización de chip SPR cubierto con estreptavidina con

aptámero marcado con biotina

Imagen: Liu J (2006). A Simple and Sensitive “Dipstick” Test in Serum Based on Lateral Flow Separation of Aptamer-Linked Nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed. 45:7955-7959.

www.azti.es | www.alimentatec.com | www.itsasnet.com

T. +34 94 657 40 00

Txatxarramendi ugartea z/g

48395 Sukarrieta, Bizkaia

Herrera Kaia, Portualdea z/g

20110 Pasaia, Gipuzkoa

Astondo Bidea, Edificio 609

Parque Tecnológico de Bizkaia

48160 Derio, Bizkaia

13