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UMI*

EFFETS DE L'ADIPONECTINE SUR LES

CELLULES ENDOMETRIALES PORCINES

par

Karine Brochu-Gaudreau

memoire presente au Departement de biologie en vue

de l'obtention du grade de maitre es sciences (M.Sc.)

FACULTE DES SCIENCES

UNIVERSITE DE SHERBROOKE

Sherbrooke, Quebec, Canada, decembre 2009

1*1 Library and Archives Canada

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395 Wellington Street Ottawa ON K1A 0N4 Canada

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395, rue Wellington Ottawa ON K1A 0N4 Canada

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1*1

Canada

Le 21 decembre 2009

lejury a accept e le memoire de Madame Karine Brochu-Gaudreau dans sa version finale.

Membres du jury

Professeur Richard Blouin Directeur de recherche

Departement de biologie

Madame Marie-France Palin Codirectrice de recherche

Agriculture et Agroalimentaire Canada

Professeur Luc Gaudreau Membre

Departement de biologie

Professeur Benoit Leblanc President rapporteur

Departement de biologie

SOMMAIRE

II est maintenant reconnu qu'un exces ou un manque de tissu adipeux peut avoir un impact

negatif sur la reproduction porcine. Ainsi, une faible adiposite resulte en une augmentation du

temps requis pour le premier oestrus, une diminution des tailles de portees et une

augmentation de l'intervalle sevrage-oestrus. Les producteurs de pores etant payes selon le

rendement en maigre des carcasses de pores envoyes aux abattoirs, la selection genetique des

dernieres annees a surtout ete orientee vers la production de pores de plus en plus maigres.

Cependant, cette reduction du tissu adipeux a, du meme coup, entraine de nombreux

problemes de reproduction et un taux de reforme des truies de plus en plus eleve. Nous savons

aujourd'hui que les cellules adipeuses sont le siege d'une activite metabolique intense et

qu'elles sont capables de secreter une multitude de facteurs vers la circulation sanguine. Parmi

ces facteurs, nous retrouvons diverses adipokines telles la leptine et l'adiponectine, lesquelles

auraient des effets benefiques sur les organes reproducteurs. L'adiponectine est l'adipokine la

plus abondamment secretee par le tissu adipeux et la presence de ses recepteurs, AdipoRl et

AdipoR2, au niveau des ovaires et de l'uterus de la truie suggere un role pour l'adiponectine

sur diverses fonctions reproductrices.

Dans cette etude, nous avons voulu determiner l'effet de l'adiponectine recombinante sur

l'uterus de la truie en utilisant un modele in vitro de culture de cellules endometriales

primaires. Dans un deuxieme temps, nous avons etudie la modulation de l'expression de cette

adipokine et de ses recepteurs pendant le cycle cestral et au debut de la gestation. Utilisant la

methode de PCR en temps reel, nous avons tout d'abord confirme la presence des recepteurs

AdipoRl, AdipoR2 et cadherine 13 dans l'endometre de la truie et constate que l'expression

de ces genes est modulee pendant le cycle oestral, etant a son maximum au milieu de la phase

luteale. Nous avons aussi observe une modulation de l'expression de l'adiponectine dans le

tissu adipeux sous-cutane, avec un transcrit plus abondant chez les truies hypo-prolifiques (<

10 porcelets par portee) et les truies cycliques, comparativement aux truies hyper-prolifiques

(> 15 porcelets par portee) et gestantes (jour 15 de la gestation), respectivement. Dans

l'endometre, le recepteur AdipoR2 est plus fortement exprime chez la truie gestante que chez

ii

la cyclique, alors qu'il est plus eleve chez les truies hypo-prolifiques que chez les hyper-

prolifiques. Chez l'embryon de 15 jours, le profil inverse est observe, avec une quantite plus

elevee de transcrits observee pour les recepteurs AdipoRl et AdipoR2 chez les embryons issus

des truies hyper-prolifiques. Bien que l'expression de la cadherine 13 soit modulee pendant le

cycle cestral, la gestation (cyclique vs gestante) et la prolificite (hyper- vs hypo-prolifique) ne

presentent aucun effet significatif sur son expression. Finalement, 1'utilisation de culture de

cellules stromales endometriales primaires traitees a l'adiponectine recombinante a revele une

augmentation de l'expression en ARN messager des genes de la prostaglandine synthetase 2

(PTGS2) et du facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF), deux genes ayant un role

cle en debut de gestation pour la survie embryonnaire. De plus, cette modulation de

l'expression genique serait mediee par l'activation des voies de signalisation de la MAPK-

ERK1/2 et de la kinase activee par l'AMP (AMPK). Collectivement, ces resultats suggerent

une implication directe de l'adiponectine sur les cellules endometriales porcines et dans les

processus de reproduction chez la truie, autant pendant le cycle oestral qu'en debut de

gestation. De plus, nos resultats identifient l'adiponectine comme un regulateur potentiel des

adaptations metaboliques se produisant en debut de gestation.

Mots-cle : adiponectine, AdipoRl, AdipoR2, cadherine 13, prostaglandine synthetase 2

(PTGS2), endometre, facteur de croissance vasculaire (VEGF), pore, reproduction, uterus.

in

REMERCIEMENTS

J'ai eu l'honneur de participer a un programme de co-direction entre deux institutions

differentes, soit l'Universite de Sherbrooke et Agriculture et Agroalimentaire Canada, avec

deux excellents chercheurs qui m'ont aidee dans mes recherches, non seulement par leur

expertise scientifique mais aussi par leur disponibilite. M. Richard Blouin et Mme Marie-

France Palin, je vous remercie de ce soutien.

Pour son expertise technique remarquable, je tiens a remercier Mme Daniele Beaudry.

Pour ses analyses statistiques et son dur labeur, je remercie Steve Methot. Desolee de t'avoir

fait travailler si fort.

Bien stir, je tiens a remercier le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Genie du

Canada (CRSNG) pour son support financier pour le projet ainsi que la bourse d'etude qu'ils

m'ont octroyee.

IV

TABLE DES MATIERES

SOMMAIRE ii

REMERCIEMENTS iv

TABLE DES MATIERES v

LISTE DES ABREVIATIONS vii

LISTE DES TABLEAUX viii

LISTE DES FIGURES ix

INTRODUCTION 1

A. La production porcine canadienne 1

B. La reproduction chez la truie 2

i. Le cycle oestral 2

Phase folliculaire (proestrus) 2

Oestrus 5

Phase luteale (metestrus et diestrus) 6

ii. La gestation 6

Fecondation 6

Developpement embryonnaire precoce 7

Reconnaissance de la gestation 8

Attachement embryonnaire 8

iii. Facteurs influencant les qualites reproductives de la truie 10

Effet de laparite 10

Taux d'ovulation 10

Intervalle sevrage-cestrus (ISO) 10

Mortalites prenatales 11

C. Tissu adipeux et reproduction 12

v

i. Leptine 13

ii. Adiponectine 14

iii. Autres adipokines 14

Facteur onco-necrosant-a (TNF-a) 14

Interleukine-6 (IL-6) 14

D. Gros plan sur l'adiponectine 15

i. Structure et fonction 15

ii. Recepteurs 19

iii. Signalisation intracellulaire 21

i. Adiponectine et reproduction 23

E. Hypothese et objectifs 25

CHAPITRE 1 27

ARTICLE 1 27

1.1 Introduction 27

1.1.1 Reference 27

1.1.2 Implication de l'auteur dans l'article 27

1.1.3 Impact de cet article 27

1.2 Article 29

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 57

BILBIOGRAPHIE 59

VI

LISTE DES ABREVIATIONS

ACC

AdipoRl,AdipoR2

AMPK

APPL1

COX-l,COX-2

EGF

FSH

GPI

IL-6,-8,-1(3

ISO

LH

MAPK

PGE2

PGES

PGF2a

PPARa

PTGS2

siRNA

TNF-a

VEGF

Acetyl-CoA carboxylase

Recepteurs a l'adiponectine 1 et 2

Proteine kinase activee par l'AMP

Proteine adaptatrice a interaction phosphotyrosine contenant un

domaine PH et un motif « leucine zipper » 1

Cyclo-oxygenase 1,2

Facteur de croissance epithelial

Hormone foliculo-stimulante

Glycosyl-phosphatidyl-inositol

Interleukine-6, -8, -lp

Intervalle sevrage-oestrus

Hormone luteinisante

Proteine kinase activee par les agents mitogenes

Prostaglandine E2

Prostaglandine E synthetase

Prostaglandine F2a

Recepteur a du peroxisome active par la proliferation

Prostaglandine synthetase 2

Petit ARN interferent

Facteur onco-necrosant-a

Facteur de croissance vasculaire endothelial

vn

LISTE DES TABLEAUX

1. Principales adipokines et lew role potentiel connu dans la reproduction 16

Al. Sequences of oligonucleotide primer pairs used in quantitative real- 51

time PCR experiments

« A » signifie que ce tableau se retrouve dans 1'article scientifique insere.

Vl l l

LISTE DES FIGURES

1. Modification de la morphologie ovarienne chez la truie au cours du 3

cycle oestral

2. Resume de la voie de synthese des prostaglandines E2 et 5

F2a

3. Developpement embryonnaire precoce et placentation de Pembryon 9

porcin

4. Principales voies de signalisation activees par les differents isoformes 22

et recepteurs de l'adiponectine

*A1. Relative mRNA abundance of ADIPOR1, ADIPOR2 and CADHERIN 52

13 in the sow endometrium throughout the estrous

cycle

* A2. Adiponectin and adiponectin receptors expression in hyper-and hypo- 53

prolific sows

A3. Cadherin 13 protein expression in the sow endometrium throughout 54

the estrous cycle and in hyper- and hypo-prolific

sows

« A » signifie que la figure se retrouve dans 1'article scientifique insere.

ix

A4. Effect of porcine adiponectin on AMPK and MAPK-ERK1/2 signalling 55

pathways in endometrial cells

*A5. Relative mRNA abundance ofADIPORl, ADIP0R2 and CADHERIN 56

13 in endometrial stromal cells

« A » signifie que la figure se retrouve dans l'article scientifique insere.

x

INTRODUCTION

A. La production porcine canadienne

La production de pores au Canada est une industrie tres importante generant quelques 40

milliards de dollars en revenus chaque annee (Statistique Canada, 2009a). Cependant,

l'industrie du pore au Quebec et au Canada connait une periode difficile depuis les

dernieres annees. Par exemple, pour le premier trimestre de 2009, Statistique Canada

recensait une diminution de 8.6% du nombre total de tetes comparativement a la meme

periode en 2008. De plus, les exportations de tetes sont de plus de 40% inferieures au

maximum atteint lors du meme trimestre en 2008 (Statistique Canada, 2009b). Ces

difficultes economiques effectuent une pression a baisse sur les prix a l'abattage,

reduisant ainsi les benefices encourus par les producteurs de pores. Les producteurs qui

resistent a cette crise financiere tentent de rentabiliser au maximum chacun des pores

produits et comme leur revenu depend du rendement en viande maigre des carcasses de

pore produites, ils ont tout avantage a produire des pores de plus en plus maigres. C'est

ainsi que les programmes de selection genetique privilegies au cours des dernieres annees

ont surtout favorise le developpement de la masse musculaire au detriment de la masse

adipeuse. Au cours des 20 dernieres annees, l'epaisseur de gras dorsal des pores a

l'abattage a ainsi diminue de pres de 40%. Ces changements importants ont toutefois

apporte des problemes de reproduction chez les truies maigres.

Le lien entre l'adiposite des truies et leur qualite reproductive est maintenant etabli: les

truies maigres ont une puberte retardee, de plus petites portees, un plus grand intervalle

sevrage-cestrus (Gaughan et ai, 1997; Chen et al, 2003; Holm et al, 2004) et ont moins

de portees durant leur vie reproductive (Gaughan et al, 1995) que les truie plus grasses.

A l'oppose, un exces de tissu adipeux peut aussi nuire a la reproduction de la truie en

augmentant le taux de reforme en raison de faiblesses aux partes causant des problemes

de locomotion, en augmentatant du nombre de porcelets mort-nes ou par une

augmentation du nombre de problemes lors de la mise-bas (Dourmad et al, 1994; Zaleski

et Hacker, 1993). L'importance du tissu adipeux pour les fonctions reproductives de la

1

femme a aussi ete suggeree il y a longtemps dans une etude de Frisch et al. (1987)

rapportant qu'un ratio minimal de la masse adipeuse sur la masse maigre est necessaire

pour 1'apparition de la puberte et le maintien de la capacite reproductrice.

B. La reproduction chez la truie

i. Le cycle oestral

Le cycle oestral de la truie est d'une duree moyenne de 20 jours, le jour 1 correspondant a

l'cestrus, plus communement appele chaleur (Akins et Morrissette, 1968). Pour mieux

caracteriser ce cycle, il est possible de le diviser en deux ou quatre periodes : la phase

folliculaire et la phase luteale ou l'oestrus, le metestrus, le diestrus et le proestrus. Voici

done une breve description des changements physiologiques et hormonaux observes dans

chacune des phases du cycle oestral chez la truie.

Phase folliculaire (proestrus)

Tel que son nom l'indique, la phase folliculaire consiste en une periode de croissance des

follicules ovariens du stade antral (ou les differentes couches cellulaires entourant

1'ovocyte sont differenciees et ou on peut observer un antre rempli de liquide folliculaire

entre 1'ovocyte et les cellules de la theque) au stade ovulatoire. Cette croissance

s'echelonne sur une periode de 5 a 6 jours avant l'oestrus et l'ovulation. La croissance

folliculaire du stade primordial, dont le developpement s'est arrete a la naissance, au

stade antral est independante du cycle oestral et des hormones qui y sont reliees (Knox,

2005; Morbeck et al, 1992).

La phase folliculaire est initiee a la fin de la phase luteale par un pic de secretion de

l'hormone folliculo-stimulante (FSH), produite par l'hypophyse, qui enclenche le

recrutement des follicules antraux a la surface des ovaires (Knox, 2005). Generalement,

les follicules trop petits subiront une degenerescence nommee atresie (Hunter et Wiesak,

1990) tandis que la croissance des follicules selectionnes et la production d'eestrogenes

2

par ceux-ci sera stimulee par la secretion pulsatile d'hormone luteinisante (LH) qui

augmente tout au long de la phase folliculaire (Knox et al, 2003). Lorsque les niveaux

circulants d'cestrogenes atteignent un certain seuil, une decharge de LH est induite,

provoquant la rupture des follicules et ainsi le relachement des ovocytes (Ainsworth et

al, 1990).

Morphologiquement, la phase folliculaire se traduit par la degenerescence des corps

jaunes en corps blancs et 1'apparition de nouveaux follicules en croissance a la surface de

l'ovaire, tel qu'on peut l'observer a la figure 1, aux stades IV et R (Akins et Morrissette,

1968). Juste avant l'ovulation, on remarque que les follicules sont translucides et saillants

a la surface des ovaires (Akins et Morrissette, 1968).

Figure 1. Modification de la morphologie ovarienne chez la truie au cours du cycle

oestral. (Adapte de Akins et Morrissette, 1968)

3

Pendant la phase folliculaire, l'endometre s'epaissit et devient plus vascularise. Ces

changements sont principalement dus a 1'augmentation du nombre de cellules

glandulaires (Blackwell et al., 2003) et a 1'augmentation de l'expression de VEGF

(Kaczmarek et al, 2007), un facteur angiogenique bien caracterise. L'endometre est done

pret a recevoir les ovocytes suite a 1'ovulation.

Pendant le cycle cestral, les fonctions ovariennes et uterines sont etroitement liees. C'est

principalement par la synthese des prostaglandines F2a (PGF2a) et E2 (PGE2) par

l'endometre que la communication entre l'endometre et les ovaires se produit. Les

prostaglandines sont des molecules lipidiques, derivees de l'acide arachidonique, qui ont

des effets varies a travers l'organisme. Un resume de la voie de synthese des

prostaglandines E2 et F2« est presente a la figure 2. L'enzyme limitant dans cette voie de

synthese est la cyclo-oxygenase (COX), ou prostaglandine synthetase (PTGS) (Vane et

al., 1998). II existe deux formes differentes de cette enzyme, lesquelles sont synthetisees

a partir de deux genes distincts: PTGS-1 et PTGS-2. PTGS-1 est exprime

constitutivement alors que l'expression de PTGS2 est induite par certains stress ou

stimuli (Vane et al., 1998). L'implication essentielle des prostaglandines dans les

processus de reproduction a ete demontree sur des souris dont le gene PTGS2 est

inactive. Ces dernieres demontraient des defauts au niveau de l'ovulation, de la

fertilisation et de 1'implantation, ce qui leur conferait un phenotype de sterilite (Lim et

al., 1997).

Les prostaglandines PGE2 et PGF2« sont produites par les trois types cellulaires de

l'endometre : les cellules epitheliales luminales et glandulaires, ainsi que les cellules

stromales. Cependant, les cellules epitheliales produisent plus de PGF2a que de PGE2

(Blitek et Ziecik, 2004). La PGF2a a un effet luteolytique sur les ovaires, favorisant la

degenerescence des corps jaunes (Wuttke et al., 1998; Gadsby et al., 2006), alors que la

PGE2 a un effet luteinisant qui favorise la croissance des follicules (Evans et al., 1983) et

protege contre 1'effet de la PGF2a (Ford et Christenson, 1991).

4

Lors de la phase folliculaire, les cellules glandulaires de l'endometre, etant en plus grand

nombre, produisent d'importantes quantites de PGF2a, lequel sera dirige vers la

circulation sanguine. L'arrivee de PGF2« aux ovaires entrainera une degradation des

corps jaunes (Wuttke et al, 1998), permettant la croissance de nouveaux follicules

(Niswendere/a/., 1994).

Acide arachidonicjue

COX - X w COX - 2

PGF2*

Figure 2 : Resume de la voie de synthese des prostaglandins E2 et F2a- (Adapte de

Vane et al, 1998)

Oestrus

Chez la truie, l'oestrus correspond aux 24 a 96 heures precedant l'ovulation et a la periode

ou la femelle est receptive au male pour l'accouplement (Beach, 1976). Pendant cette

5

periode, les cestrogenes secretes par les follicules en croissance provoqueraient le

rougissement et l'enflure de la vulve, ainsi que la perte d'appetit et 1'augmentation de

l'activite physique de la truie (Soede et Kemp, 1997).

Phase luteale (metestrus et diestrus)

Suite a 1'ovulation, la LH circulante est en forte concentration. Cette derniere transforme

alors les follicules en corps jaunes par hyperplasie et hypertrophie des cellules de la

theque interne et par la luteinisation des cellules de la granulosa entourant les follicules

(Niswender et al, 1994). Ces corps jaunes produisent a leur tour de la progesterone,

toujours sous 1'influence de la LH (Ainsworth et al, 1990). La progesterone produite

induit une diminution de l'apport sanguin dans l'uterus (de Ziegler et al, 1991), ce qui

pourrait etre explique par un niveau minimal d'expression de VEGF dans l'uterus au

meme moment (Kaczmarek et al, 2007). S'ensuit alors une necrose et l'apoptose des

cellules epitheliales endometriales (Wasowska et al, 2001).

Avec la forte croissance des corps jaunes, les ovaires prennent beaucoup d'ampleur

durant cette phase du cycle cestral, tel qu'on peut l'observer a la figure 1 aux stades II et

III (Akins et Morrissette, 1968).

ii. La gestation

Fecondation

La fecondation resulte d'un synchronisme parfait entre le transport des ovocytes vers le

site de fecondation, situe a la jonction isthme-ampoule de l'oviducte, ainsi que du

transport et de la preparation des spermatozo'ides jusqu'au meme site, le tout dans la

fenetre de viabilite de l'ovocyte (Thibault et Levasseau, 2001).

6

Les ovocytes liberes des follicules ovulatories sont captes par le pavilion de la corne

uterine et sont ensuite transporter par des contractions synchronisers vers le site de

fecondation, a la jonction isthme-ampoule (Thibault et Levasseau, 2001).

Du cote des gametes males, lors de 1'insemination ou de l'accouplement, les

spermatozoi'des sont transportes du col uterin jusqu'a la partie caudale de l'isthme grace

aux contractions uterines. lis y forment alors un reservoir (Rodriguez-Martinez et ah,

2005). Ce reservoir permet de maintenir la viabilite des spermatozoi'des tout au long de la

periode peri-ovulatoire. De ce reservoir, des spermatozoi'des sont graduellement relaches

vers la jonction isthme-ampoule pour y rencontrer les ovocytes (Rodriguez-Martinez et

al, 2005).

Ce n'est pas tout de simplement se rencontrer, plusieurs etapes sont essentielles a la

fecondation : capacitation des spermatozoi'des afin qu'ils soient aptes a rejoindre et a

penetrer 1'ovule, reaction acrosomale qui permet la fusion des membranes externes du

spermatozoi'de et de 1'ovocyte, fusion des membranes nucleaires des gametes afm de

former un zygote diplo'ide et, enfin, l'activation de l'ovocyte pour redemarrer la mitose

(Thibault et Levasseau, 2001).

Developpement embryonnaire precoce

Les zygotes ainsi formes suite a la fecondation sont transportes vers l'uterus via

l'oviducte, ou les deux premieres divisions cellulaires ont lieu (Brussow et al, 2008). Un

embryon de 8-16 cellules est observable au jour 4 (morula) de la gestation, puis un

blastocyste de 16-32 cellules est forme aux jours 5-6. C'est au stade blastocyste que Ton

apercoit les premieres differenciations cellulaires : la masse de cellules interne, qui

formera l'embryon, entouree par le trophoblaste, qui constituera le placenta (Papaioannou

et Ebert, 1988). Afin de pouvoir s'accoler a l'epithelium uterin, le blastocyste, en

croissant, eclot de la zone pellucide au jour 6 post fecondation (Thibault et Levasseau,

2001). Le blastocyste porcin va par la suite changer tres rapidement de morphologie

passant d'un embryon ovoi'de, d'une taille de 0,2 mm, a un embryon filamenteux de pres

7

de 10 mm de longueur, entre les jours 10 et 11, pour atteindre une taille de plus de 100

mm de longueur au jour 12 de la gestation (Geisert et al, 1982). Cette hyperplasie du

blastocyste permet d'augmenter considerablement la surface de contact entre le conceptus

et l'epithelium maternel ce qui favorise les echanges mere-foetus (Stroband et Van der

Lende, 1990).

Reconnaissance de la gestation

C'est la synthese et la secretion d'cestrogenes par les blastocystes en elongation qui

permet la reconnaissance de la gestation par Puterus. Les cestrogenes secretes par les

embryons aux jours 11 et 12 de la gestation permettent de detourner la secretion de PGF2tt

par les cellules endometriales vers la lumiere de Puterus plutot que vers la circulation

sanguine, ce qui permet d'eviter la luteolyse et done de maintenir les corps jaunes

(Geisert et al, 1982; Spencer et al, 2004). Ces memes cestrogenes activent aussi la

secretion uterine de plusieurs facteurs essentiels a la croissance et a Pattachement de

Pembryon a la paroi uterine. Parmi ces facteurs nous retrouvons le VEGF (Ziecik, 2002),

Puteroferrine, qui permet le transport du fer vers le foetus, ainsi que le transporteur du

retinol, qui permet Papport en vitamine A a Pembryon (Davis et Blair, 1993).

Attachement embryonnaire

Simultanement a la periode d'elongation, les embryons entreprennent une migration a

travers la corne uterine afin de se trouver un endroit inoccupe pour s'accoler a la paroi

uterine. Ainsi, au jour 12 de la gestation, les embryons sont espaces de facon equidistante

tout au long de la corne uterine et cessent de se deplacer (Dziuk, 1985). L'attachement

des foetus a l'epithelium uterin s'effectue du jour 12 au jour 18 de la gestation et est suivi

du developpement du placenta jusqu'aux jours 60-70 de la gestation, laquelle est d'une

duree moyenne de 114 jours chez la truie (Geisert et al, 1982). Une proliferation

localisee de Pendometre est induite par l'accolement du trophoblaste a l'epithelium uterin

(Dantzer, 1985), favorisant le rapprochement des deux parties et initiant les echanges

foeto-maternels.

8

Zygote JourO

2 cellules Jour 1

Zone pellucide

8 cellules Jour 2

Masse cellulaire interne

Blast ocoele

Morula Jours 3-4

Blastocyste Jour 5

Blastocoele - "

Masse cellulaire interne

Trophoblaste

Elongation du blastocyste Jour 9

epithelium : uteri n

stroma 1. pcrtc de /.? 2 accolcment 3. apposition 4. adhesion **

orientation contacts ccllulaires du blastocyste

i 1

placenta EP1THEL10-CHORIAL

Figure 3. Developpement embryonnaire precoce et placentation de l'embryon

porcin. (Adapte de Bearden et Fuquay, 1997 ainsi que Thibault et Levasseau, 2001)

9

L'embryon porcin s'implante selon le modele de placenta epitheliochorial diffus, ce qui

signifie que la totalite de la surface du placenta est en contact avec la paroi uterine et que

la phase finale de la placentation est l'attachement du placenta a la paroi uterine sans

aucune invasion de Pendometre par l'embryon (Thibault et Levasseau, 2001).

La figure 3 resume les etapes de developpement embryonnaire precoce et 1'initiation de

la placentation de l'embryon porcin.

iii. Facteurs influencant les qualites reproductives de la truie

Effet de laparite

La parite correspond au nombre de portees de la truie. Ainsi une truie nullipare n'en a eu

aucune, la primipare en est a sa premiere et la multipare en a deja eu plusieurs. La taille

de la premiere portee est habituellement inferieure a celle des suivantes dues a un taux

d'ovulation inferieur ainsi qu'a une survie prenatale et embryonnaire reduite (PERRY,

1960).

Taux d'ovulation

Le taux d'ovulation determine la taille de portee maximale que la truie pourrait avoir.

C'est en comptant le nombre de corps jaunes a la surface des ovaires, suite a l'ovulation,

que le taux d'ovulation est determine (Knox, 2005). Comme ce facteur de fertilite est

facilement transmissible d'une generation a la suivante (Zimmerman et Cunningham,

1975), les races de pores utilisees pour la reproduction sont selectionnees depuis

longtemps pour un taux d'ovulation maximal.

Intervalle sevrage-cestrus (ISO)

L'intervalle sevrage-oestrus (ISO) est une periode de 4 a 9 jours suivant le sevrage,

lequel est necessaire pour la reactivation du cycle oestral. Cette periode ressemble

10

etrangement a la phase folliculaire du cycle cestral (Cox et Britt, 1982) puisque la

croissance des follicules stimulee par la LH, dont la production etait diminuee pendant la

periode de lactation, du a la stimulation des mamelles par les porcelets, reprend alors au

sevrage (De Rensis et al, 1993). Les truies primipares, dont l'organisme n'est

generalement pas prepare a la demande energetique de la lactation, ont 1'habitude de

perdre du poids, ce qui retarde le retour en oestrus (Maurer et al, 1985; Guedes et

Nogueira, 2001). La cle pour un ISO plus court est done une alimentation adequate et une

duree de lactation appropriee, puisqu'une periode de lactation trop courte augmente aussi

la duree de l'ISO (Belstra et al, 2002).

Mortalites prenatales

De l'ovulation a la mise-bas, il existe plusieurs etapes critiques pouvant avoir une

influence sur la survie embryonnaire. Deux vagues de mortalites principales surviennent

pendant la gestation : une en periode de peri-implantation, l'autre lors du developpement

embryonnaire (Foxcroft et al, 2006). C'est lors de la premiere periode que les pertes

embryonnaires sont les plus importantes, pouvant atteindre 40% (Foxcroft et al, 2006).

Ceci s'explique principalement par un besoin de synchronisme alors que les follicules

ovulatoires sont heterogenes (c.-a-d. qu'ils presentent des niveaux de developpement

differents) lors de l'ovulation. En effet, le pic de secretion de LH ne produit pas une

reponse simultanee chez tous les follicules ovulatoires ce qui entraine un etalement dans

la production des ovocytes (Hunter et Wiesak, 1990). Les follicules retardataires

produisent des embryons plus petits (Xie et al, 1990), lesquels prennent plus de temps a

se developper. Pendant ce temps, les embryons plus precoces commencent a secreter des

oestrogenes qui entrainent des changements importants au niveau de la muqueuse uterine,

tel que mentionne precedemment. La paroi uterine n'etant permissive a l'attachement des

embryons que sur une courte periode, les embryons qui tardent a se developper ne

peuvent subsister dans ce nouvel environnement (Pope et al, 1990).

La deuxieme vague de mortalite s'echelonne principalement entre les jours 30 et 50 de la

gestation et est due a une competition pour l'espace uterin, autrement dit la capacite

11

uterine. En effet, si trop d'embryons sont implantes dans les comes uterines, l'espace

reserve a chacun sera insuffisant pour etablir des echanges optimaux de nutriments,

lesquels sont essentiels a leur croissance. Ceci entrainera la perte des embryons les moins

developpes (Pere et ah, 1997; Town et ah, 2005).

C. Tissu adipeux et reproduction

Chez les mammiferes, il est maintenant reconnu qu'un surplus ou une depletion en tissu

adipeux affecte les fonctions reproductives. Mentionnons les dysfonctions menstruelles et

les problemes de fertilite que developpent les athletes feminines de haut niveau (Prather

et Hunt, 2005) ainsi que le syndrome d'ovaire polykystique dont environ 50% des

personnes atteintes ont un surplus de poids (Pasquali et ah, 2003).

Chez la truie, un retard pour l'atteinte de la puberte est observe chez les cochettes dont

l'epaisseur de gras dorsal est inferieur a 14 mm (a 100 kg), de meme que la presence d'un

ISO plus long et un nombre de porcelets nes vivants par portee diminue (Gaughan et ah,

1997; Chen et ah, 2003; Patterson et ah, 2002). Chez ces truies maigres, meme a la

deuxieme parite, les tailles de portees sont plus faibles et 1'ISO plus long que chez les

truies plus grasses (Tummaruk et ah, 2001). Finalement, une faible adiposite ecourtera la

duree de vie productive de la truie (Gaughan et ah, 1995; Serenius et ah, 2006). De plus,

il a ete demontre qu'une epaisseur de gras dorsal de 16 a 19 mm, a la saillie, serait ideale

pour l'obtention des qualites reproductives optimales. Les truies trop grasses ne se

portent pas mieux pour autant: problemes de mise-bas, haut taux de porcelets mort-nes et

developpement de problemes de locomotion, ce qui augmente le taux de remplacement

des truies de reproduction (Dourmad et ah, 1994; Zaleski et Hacker, 1993).

II est maintenant bien accepte que le tissu adipeux est un organe endocrinien a part

entiere secretant plusieurs molecules, lesquelles ont des effets pleiotropique sur divers

tissus et organes de l'organisme (Trayhurn et Wood, 2004). Les molecules secretees par

le tissu adipeux ont ete nominees adipocytokines, puis adipokines, puisque toutes ne sont

pas necessairement des cytokines. Des quelques 50 adipokines decouvertes a ce jour,

plusieurs ont deja ete associees a des processus metaboliques lies a la reproduction

12

(Campos et al., 2008). Cependant, le « secretome » du tissu adipeux ne se limite pas aux

seules adipokines mais il s'etend des cytokines aux facteurs de croissance en passant par

des molecules de regulation de la pression sanguine et du metabolisme des lipides

(Trayhurn et Wood, 2004).

Voici done une breve description des principales adipokines etant impliquees dans divers

caracteres de reproduction chez les mammiferes.

i. Leptine

Etant la premiere adipokine decouverte en 1994, la leptine est l'adipokine la mieux

caracterisee a ce jour. D'abord associee exclusivement au tissu adipeux, sa synthese fut

plus tard observee dans l'estomac, le placenta, les glandes mammaires et les follicules

ovariens (Ahima et al, 2006). De plus, ses recepteurs sont presents dans les ovaires, les

ovocytes, l'uterus et les embryons en periode de preimplantation (Cervero et al, 2006;

Karlsson et al, 1997; Przala et al, 2006). Le premier indice de l'implication de la leptine

dans les processus de reproduction fut observe chez les souris ob/ob, chez qui le gene de

la leptine est mute, qui developpent une obesite morbide et qui sont infertiles (Zhang et

al, 1994). L'injection de leptine recombinante a ces souris induit une perte de poids

significative et restaure la fertilite par 1'augmentation du poids des ovaires et de l'uterus

ainsi que 1'augmentation de la secretion de LH et du nombre de follicules (Barash et al.,

1996; Pelleymounter et al, 1995). Ces fonctions de regulation de l'apport alimentaire et

de la balance energetique sont des plus importantes, en plus de son implication dans

diverses fonctions physiologiques telles que rinflammation et l'angiogenese (Lappas et

al, 2005).

Chez la truie, la leptine presenterait une action autocrine sur l'ovaire puisque la proteine

est presente dans le liquide folliculaire et que ses recepteurs sont observes a la surface de

plusieurs types cellulaires de l'ovaire (Ruiz-Cortes et al, 2000). Les effets de la leptine

sur les caracteres de reproduction sont multiples : de l'augmentation de la steroi'dogenese

13

a la stimulation de la maturation des follicules (Ruiz-Cortes et al, 2003) en passant par la

regularisation de l'implantation (Cervero et al, 2006; Budak et al, 2006).

ii. Adiponectine

L'adiponectine est l'adipokine la plus abondemment secretee par le tissu adipeux et elle

se retrouve done en circulation a des concentrations relativement elevees. Decouverte il y

a moins de 15 ans, cette molecule connait une popularity grandissante en raison de son

implication dans plusieurs processus et desordres metaboliques tel le diabete de type 2 et

le syndrome des ovaires polykystiques. C'est d'ailleurs une des raisons pour lesquelles

nous l'avons choisie comme molecule d'interet.

Une caracterisation plus exhaustive de l'adiponectine est presentee a la section D.

iii. Autres adipokines

Facteur onco-necrosant-a (TNF-a)

Le TNF-a est une cytokine pro-inflammatoire dont l'expression vient principalement des

macrophages (Pennica et al., 1984) mais aussi des adipocytes et d'autres types cellulaires

(Hotamisligil et al, 1993). Outre 1'inflammation, cette cytokine est aussi impliquee dans

la differentiation, la proliferation et la mort cellulaire (MacEwan, 2002). On retrouve de

hauts niveaux de TNFa chez les personnes souffrant d'obesite (Hotamisligil et al, 1993)

Aussi, l'expression de TNFa par les adipocytes, ainsi que ses niveaux plasmatiques, sont

directement correles a 1'indice de masse corporelle et a l'hyperinsulinemie (Gosman et

al, 2006). Au niveau des ovaires, le TNFa influence le developpement folliculaire,

l'ovulation (Sakumoto et Okuda, 2004), la luteolyse (Pitzel et al, 1993), la

steroi'dogenese (Spicer, 1998) ainsi que la production des prostaglandines (Schams et al,

1995).

Interleukine-6 (IL-6)

14

L'IL-6 est aussi une cytokine pro-inflammatoire mais dont le tissu adipeux contribue

pour 30% de la concentration circulante (Gosman et al., 2006). Tel le TNFa, de fortes

concentrations d'IL-6 sont presentes dans le plasma des personnes souffrant d'obesite et

d'hyperinsulinemie. L'IL-6 est d'ailleurs positivement associee a la resistance a

1'insuline, independamment de l'obesite (Di Gregorio et al., 2004). La presence de 1TL-6

et de ses recepteurs dans les ovaires, les follicules ovariens, les corps jaunes et

l'endometre suggere une implication de cette cytokine dans la reproduction (Van der

Hoek et al., 1998; Perrier d'Hauterive et al., 2004). Ses effets en reproduction

s'echelonnent de Pinhibition de la secretion de LH par l'hypophyse a la modulation de

l'expression de ses recepteurs dans l'ovaire, la diminution de la steroi'dogenese dans les

follicules ovariens (Rivier et Vale, 1990; Tamura et al., 2000; Tamura et al., 2001),

l'implantation et le developpement embryonnaire (Perrier d'Hauterive et al., 2004).

Le tableau 1 resume le role connu ou potentiel des differentes adipokines, dont celles

mentionnees ci-haut, en reproduction.

D. Gros plan sur l'adiponectine

i. Structure et fonction

L'adiponectine, aussi appelee Acrp30, apMl, GBP28 et adipoQ, fut decouverte

simultanement chez l'humain et la souris par quatre groupes de recherche differents

(Scherer et al, 1995; Hu et al, 1996; Maeda et al, 1996; Nakano et al, 1996). Cette

proteine de 30 kDa est principalement secretee par le tissu adipeux et sa concentration

dans le plasma atteint 2 a 10 ug/ml chez l'humain (Arita et al, 1999). Cette proteine de

244 acides amines est composee

15

Tableau 1. Principales adipokines et leur role potentiel connu dans la reproduction. (adapte de Campos et ah, 2008)

Adipokine Abondance en circulation selon adiposite

Effet connu ou predit en reproduction

Leptine

Facteur onco-necrosant-a

lnterleukine-6

Resistine

Adiponectine

Visfatine

Omentine

Vaspine

Augmente avec I'accumulation

de tissu adipeux

Augmente avec I'obesite

Augmente avec I'obesite

Augmente avec I'accumulation

de tissu adipeux

Diminue avec I'accumulation

de tissu adipeux, surtout dans

le gras visceral

Augmente avec I'accumulation de gras visceral

Diminue avec I'accumulation

de gras omental

Augmente avec I'accumulation

de tissu adipeux

Regulation de la secretion de

gonadotropines et de la

steroTdogenese

Inhibiteur de la fonction ovarienne

Impliquee dans les processus

inflammatoires, I'ovulation et

I'apoptose dans I'ovaire

Reduit la sensibilite a I'insuline

Effets divers sur I'ovulation, la

steroTdogenese et la fonction

placentaire

Augmente la sensibilite a I'insuline

Augmente la sensibilite a I'insuline

Augmente la sensibilite a I'insuline

d'un peptide signal de secretion en N-terminal, suivi d'une region variable, d'un domaine

collagene et fmalement d'un domaine globulaire similaire au facteur Clq du complement

et structurellement semblable au TNFa (Scherer et ah, 1995; Hu et ah, 1996; Shapiro et

Scherer, 1998). Comme c'est le cas pour les autres proteines possedant un domaine

collagene, la forme de base de l'adiponectine en circulation est le trimere, et plusieurs

trimeres peuvent s'associer en hexameres et en multimeres de haut poids moleculaire

(Wang et ah, 2006). Dans le serum, l'adiponectine se retrouve dans sa forme entiere et

aussi sous une forme globulaire, correspondant au domaine globulaire de la proteine,

resultant d'un clivage proteolytique (Fruebis et ah, 2001). Les formes majoritaires de

16

l'adiponectine dans le plasma sont l'hexamere et le multimere (Nakano et ah, 1996),

alors que les trimeres et la forme globulaire de la proteine s'y retrouvent en faible

concentration, possiblement a cause de leur temps de demi-vie plus court (Pajvani et ah,

2003). II a recemment ete demontre que ces differents assemblages de l'adiponectine

peuvent determiner l'activite de la proteine : le multimere est tres actif dans le foie

(Trujillo et Scherer, 2005) alors que le trimere et la forme globulaire activent des

reponses dans plusieurs autres tissus (Kadowaki et ah, 2006).

L'adiponectine est principalement secretee par le tissu adipeux blanc. Cependant, il a ete

demontre qu'elle peut aussi etre exprimee par l'hypophyse, le foie, le diencephale, le

muscle squelettique, les ovaires, la rate et le rein chez le poulet (Maddineni et ah, 2005).

Chez l'humain, son expression est aussi observee dans la moelle osseuse, les osteoclastes,

des tissus fcetaux, les myocytes et cardiomyocytes ainsi que dans les cellules epitheliales

des glandes salivaires (Nishida et ah, 2007). Ceci suggere done un role

autocrinien/paracrinien complementaire pour l'adiponectine dans divers tissus.

Contrairement a la majorite des adipokines, la concentration serique d'adiponectine est

inversement proportionnelle a l'indice de masse corporelle (Matsubara et ah, 2002; Cnop

et ah, 2003) et, plus precisement, a l'accumulation de gras visceral (Lara-Castro et ah,

2006). Aussi, les niveaux circulants d'adiponectine sont plus eleves chez les femmes que

chez les hommes une fois la puberte atteinte (Gui et ah, 2004; Bottner et ah, 2004;

Combs et ah, 2003). Ce dimorphisme sexuel pourrait etre explique par une plus grande

proportion de multimeres d'adiponectine en circulation chez les femmes (Pajvani et ah,

2003; Peake et ah, 2005). De plus, le fait que l'administration de testosterone diminue les

niveaux circulants d'adiponectine chez l'humain, alors que les traitements a l'oestrogene

exogene ou 1'ovariectomie n'affectent pas les niveaux seriques d'adiponectine (Page et

ah, 2005; Chalvatzas et ah, 2009; Sieminska et ah, 2005), sont aussi des explications

valables pour une plus grande concentration d'adiponectine chez la femme.

La regulation de l'expression du gene de l'adiponectine n'est pas encore totalement

elucidee. L'analyse de son promoteur chez l'humain a revele plusieurs elements de

17

regulation potentiels dont des elements C/EBP, des motifs Spl et des sequences API

(Saito et ah, 1999). II a recemment ete demontre que SIRT1, une proteine deacetylase

NAD+-dependante reconnue pour son implication dans Padipogenese (Picard et ah,

2004), augmente l'expression du gene de l'adiponectine en promouvant la formation du

complexe transcriptionnel FOXO1-C/EBPa qui est recrute par l'element de reponse

C/EBP du promoteur du gene de l'adiponectine (Qiao et Shao, 2006). Comme les

niveaux proteiques de FOXOl et SIRT1 sont diminues dans le tissu adipeux des modeles

de souris obeses et diabetiques, il a ete suggere que cette diminution pourrait avoir un lien

de cause a effet entre la reduction des niveaux d'expression de l'adiponectine et l'obesite

(Qiao et Shao, 2006). La concentration d'adiponectine circulante peut etre regulee par

divers facteurs hormonaux, nutritionnels et pharmacologiques tels que l'insuline et le

TNFa qui ont un effet negatif sur l'expression en ARN messager de l'adiponectine, de

facon dose-dependante (Fasshauer et ah, 2002). De plus, la production d'adiponectine est

diminuee par la prolactine, l'hormone de croissance et les glucocorticoi'des (Swarbrick et

Havel, 2008). D'autre part, les sensibilisateurs a l'insuline tels que les thiazolodinediones

et les fibrates augmentent les niveaux circulants d'adiponectine chez l'humain et les

souris (Maeda et ah, 2001).

Etonnamment, les souris transgeniques surexprimant l'adiponectine montrent une

diminution de 30% en ARN messager de l'adiponectine dans les depots de gras inguinal

et gonadal, comparativement aux souris de type sauvage (Bauche et ah, 2006). Une

diminution simultanee de l'expression de l'ARN messager d'AdipoR2 a aussi ete

observee dans les memes tissus. Ces resultats suggerent que l'adiponectine peut controler

sa propre production et celle de son recepteur dans une boucle de retro-inhibition.

Une des fonctions metaboliques les plus etudiees de l'adiponectine est celle de la

sensibilisation a l'insuline. La concentration d'adiponectine en circulation est

inversement proportionnelle a la concentration de glucose et d'insuline (Hotta et ah,

2000; Weyer et ah, 2001; Spranger et ah, 2003). C'est ce qui expliquerait les niveaux

plus faibles d'adiponectine circulante chez les personnes diabetiques (Hotta et ah, 2000;

Weyer et ah, 2001; Spranger et ah, 2003). De plus, des niveaux eleves d'adiponectine

18

plasmatique sont associes a une reduction des risques de developper un diabete de type 2

(Spranger et al, 2003).

ii. Recepteurs

Jusqu'a maintenant, trois recepteurs a l'adiponectine ont ete identifies: le recepteur a

l'adiponectine 1 et 2 (AdipoRl et AdipoR2) et, plus recemment, la cadherine 13.

Les AdipoRl et AdipoR2 sont des recepteurs a sept domaines transmembranaires dont

l'extremite C-terminale est extracellulaire et le N-terminal intracellulaire, ce qui est

l'inverse des recepteurs couples aux proteines G (Yamauchi et al, 2003). Le gene

AdipoRl code pour une proteine de 375 acides amines dont le poids moleculaire predit

est de 42,4 kDa, alors que le gene AdipoR2 code pour une proteine de 311 acides amines

predisant un poids moleculaire de 35,4 kDa. Ces deux recepteurs sont structurellement

grandement apparentes et leur sequence proteique partage 67% d'homologie. lis sont

aussi grandement conserves a travers les especes avec une homologie de 95 et 97% entre

la souris et Fhumain pour les proteines AdipoRl et AdipoR2, respectivement.

L'utilisation de petits ARN interferents (siRNA) envers AdipoRl ou AdipoR2 dans un

essai de liaison des formes globulaire et entiere de l'adiponectine a permis de determiner

qu'AdipoRl a une forte affinite pour l'adiponectine globulaire et une faible affinite pour

l'adiponectine entiere, alors qu'AdipoR2 a une affinite intermediate pour les formes

globulaire et entiere de l'adiponectine (Yamauchi et al, 2003). Ces deux recepteurs ont

une expression ubiquitaire mais AdipoRl a generalement une expression maximale dans

le muscle squelettique, alors qu'AdipoR2 est plus abondamment exprime dans le foie

chez differentes especes dont l'humain, la souris, le pore et le poulet (Yamauchi et al,

2003; Lord et al, 2005; Ramachandran et al, 2007).

La regulation de l'expression d'AdipoRl et AdipoR2 differe en reponse a differents

stimuli. Par exemple, le jeune n'a aucun effet sur l'expression d'AdipoRl mais augmente

celle d'AdipoR2 dans le tissu adipeux sous-cutane des pores (Ding et al, 2004).

19

L'insuline a ete demontree pour reprimer la transcription d'AdipoRl sans affecter celle

d'AdipoR2 dans les myocytes C2C12 (Sun et al, 2008). Aussi, 1'administration

d'insuline chez des souris diabetiques ramene les niveaux d'AdipoRl dans le muscle

squelettique a des niveaux normaux (Inukai et al, 2005). Par contre, les niveaux

d'expression d'AdipoR2 dans le foie de ces souris diabetiques ne sont pas modules.

II a ete demontre, sur des souris deficientes en AdipoRl ou AdipoR2, que ces deux

recepteurs sont impliques dans le metabolisme energetique tout en ayant des effets

opposes: les souris AdipoRl -/- deviennent obeses et intolerantes au glucose et ont une

depense energetique diminuee, alors que les souris AdipoR2 -/- sont minces, resistantes a

l'obesite provoque par une diete riche en gras et montrent une plus grande depense

energetique (Bjursell et al, 2007).

Un troisieme recepteur « suppose » a l'adiponectine, la cadherine 13, a recemment et

isole par Hug et al. (2004). La cadherine 13, aussi appelee H(heart)-cadherine ou T-

cadherine, est un membre atypique de la famille des cadherines puisqu'il n'a ni domaine

cytoplasmique ni domaine transmembranaire. II est ancre a la membrane plasmique par

un groupement glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) (Hug et al, 2004). Chez l'humain,

la cadherine 13 est une proteine ubiquitaire avec une plus forte expression dans le

systeme cardio-vasculaire (Ivanov et al, 2001). Ce recepteur peut lier les formes

hexameriques et de haut poids moleculaire de l'adiponectine mais pas la forme globulaire

ou trimerique (Hug et al, 2004). Malgre le fait que la cadherine 13 soit depourvue d'un

domaine intracellulaire, des etudes ont demontre qu'elle peut tout de meme participer a la

transduction de signal en agissant a titre de corecepteur ou en faisant competition aux

recepteurs AdipoRl et AdipoR2 pour la liaison de l'adiponectine. Par exemple, la

reduction de l'ARNm de la cadherine 13 par siRNA est associee a une augmentation de

la phosphorylation de la MAPK ERK 72 par l'adiponectine (Lee et al, 2008).

II existe peu d'informations conceraant la regulation de l'expression de la cadherine 13.

La progesterone et le facteur de croissance epidermique (EGF) ont ete demontres pour

augmenter l'expression en ARNm de la cadherine 13 dans des cellules d'osteocarcinome

20

human (Bromhead et ah, 2006). Le stress oxydatif peut aussi activer l'expression de la

cadherine 13, tel qu'il a ete demontre dans des cellules endotheliale de veine ombilicale

humaine (HUVEC) en culture soumises a une privation en serum ou a un ajout de

peroxyde d'hydrogene dans le milieu de culture (Joshi et ah, 2005).

iii. Signalisation intracellulaire

Les voies de signalisation les plus frequemment identifiees pour etre activees par

l'adiponectine sont la proteine kinase activee par l'AMP (AMPK), la proteine kinase

activee par les agents mitogenes p38 (MAPK p38) et le recepteur du peroxisome active

par la proliferation a (PPARa) (Deepa et Dong, 2009). L'AMPK est un senseur

energetique cellulaire, d'expression constitutive, qui est activee par une augmentation du

ratio AMP/ATP intracellulaire (Hardie et ah, 2003). La preuve de l'implication de

l'AMPK dans la signalisation de l'adiponectine a ete faite par 1'abrogation des effets de

l'adiponectine, dont l'activation de 1'acetyl-CoA carboxylase (ACC) et l'oxydation des

acides gras, dans les myocytes en culture transfectes avec un mutant dominant negatif de

l'AMPK (Yamauchi et ah, 2002).

Recemment, la caracterisation de 1'interaction entre les recepteurs a l'adiponectine,

AdipoRl et AdipoR2, et la proteine adaptatrice a interaction phosphotyrosine contenant

un domaine PH et un motif « leucine zipper » 1 (APPL1) a ete une revelation quant a la

comprehension des voies de signalisation activees par l'adiponectine (Deepa et Dong,

2009). A ce jour, 14 proteines sont connues pour lier APPL1, dont des recepteurs

membranaires et diverses molecules impliquees dans la cascade de signalisation de

l'apoptose (Liu et ah, 2002), de la proliferation cellulaire, du remodelage de la

chromatine (Miaczynska et ah, 2004) et de la survie cellulaire (Schenck et ah, 2008).

L'interaction entre APPL1 et le recepteur des androgenes (Deepa et Dong, 2009)

pourrait, entre autres, expliquer l'effet des hormones

21

Adiponectine globulaire

Trimere HMW

AdipoRI •COOH

AdipoR2 •COOH

! i. '-

H if <f 1 A A A A i m W|< A A A A A Atfiiftitfi!

• • • • • * • • • • • • • " • • • •

I A A A

NH':

/

GO ERK1/2

Croissance et survie cellulaire

Extracellulaire

i 1 i i A A A A

Intracellular

Rab5

X Glut4 translocation

Absorption de glucose

GO p38MAPK

/

Oxydation des acides gras

Anti-inflammatoire Cytoprotection

PPARa

Oxydation des acides gras

Figure 4. Principales voies de signalisation activees par les differents isoformes et

recepteurs de l'adiponectine. © 2009 Agriculture et Agroalimentaire Canada.

& represente une phosphorylation.

sexuelles sur la signalisation de l'adiponectine. De plus, APPL1 est maintenant reconnue

conne un facteur important dans la regulation de la sensibilite a l'insuline via la cascade

22

de signalisation de l'adiponectine. Enfin, la surexpression d'APPLl dans des myocytes

C2C12 augmente la phosphorylation de l'AMPK et de la MAPK p38, alors que sa

suppression par siRNA empeche cette activation par l'adiponectine (Mao et al, 2006).

La figure 4 resume les principales voies de signalisation activees par les divers isoformes

de l'adiponectine liant ses differents recepteurs.

i. Adiponectine et reproduction

L'expression proteique de l'adiponectine, d'AdipoRl et d'AdipoR2 est observee dans les

cellules ovariennes de la theque et de la granulosa, dans 1'ovocyte et dans le corps jaune

chez differentes especes (Chabrolle et al., 2007a; Chabrolle et al., 2007b). Chez la truie,

l'adiponectine est aussi presente dans le liquide folliculaire a une concentration

equivalente a 80-90% de celle du serum (Ledoux et al., 2006). Le traitement des cellules

de granulosa porcines avec de l'adiponectine recombinante induit l'expression de genes

ayant un role cle pendant la periode peri-ovulatoire. Parmi ces genes nous retrouvons la

PTGS2, la prostaglandine E synthetase (PGES) et VEGF (Ledoux et al, 2006).

Dans l'ovaire, la majorite des effets de l'adiponectine sur l'expression de genes ou de

proteines sont mediees par l'AMPK (Budak et al., 2006; Chabrolle et al., 2007a;

Chabrolle et al, 2007b), ou ERK 1/2 (Budak et al, 2006; Chabrolle et al, 2007b;

Ledoux et al, 2006). Tel que resume par Dupont et al (Dupont et al, 2008),

l'association entre l'adiponectine et la voie de l'AMPK dans l'ovaire suggere que

l'adiponectine pourrait agir comme un signal regulant la quantite d'energie requise pour

la croissance des follicules et les ovocytes.

Etonnamment, les souris mutantes qui n'expriment pas les genes de l'adiponectine, de

AdipoRl ou de AdipoR2 sont fertiles. II a done ete suggere que l'adiponectine ne serait

pas essentielle aux fonctions ovariennes. L'adiponectine utiliserait plutot son effet

sensibilisateur a l'insuline pour influencer la fonction ovarienne (Adashi, 1998).

23

L'adiponectine a aussi ete observee dans les granules secretaires des cellules epitheliales

de 1'oviducte de rat, ce qui suggere que l'adiponectine pourrait avoir un role au cours des

premiers stades du developpement embryonnaire (Archanco et al, 2007). Dans

1'oviducte de rat, l'expression proteique maximale de l'adiponectine est observee dans les

periodes de proestrus et d'oestrus (Archanco et al, 2007). Dans l'endometre de la

femme, l'expression en ARNm d'AdipoRl et AdipoR2 dans les cellules epitheliales

glandulaires et luminales, ainsi que le stroma sous-jacent, est plus elevee dans la phase

mi-secretoire du cycle menstruel, suggerant alors l'implication de l'adiponectine dans les

changements de l'endometre en preparation a l'implantation de l'ovule feconde

(Takemura et al, 2006). L'adiponectine est exprimee dans l'epithelium et le stroma de

l'endometre, chez le lapin et la souris, lors de la periode de peri-implantation (Schmidt et

al, 2008) et l'adiponectine peut inhiber la secretion des cytokines pro-inflammatoires

interleukine (IL)-6, IL-8 et MCP1, via la voie de l'AMPK, dans les cellules stromales

endometriales humaines induites a l'IL-ip (Takemura et al, 2006). Collectivement, ces

resultats suggerent un effet benefique de l'adiponectine sur le processus d'implantation.

De plus, les recepteurs a l'adiponectine sont aussi presents dans les ovocytes et les

cellules trophoblastiques et embryoblastiques des embryons porcins, murins et de lapin

(Schmidt et al, 2008; Chappaz et al, 2008). II a aussi ete demontre que l'adiponectine

peut ameliorer le developpement embryonnaire porcin jusqu'au stade de blastocyste par

une meiose acceleree et l'activation de la voie de la MAPK p38 (Chappaz et al, 2008).

La presence de l'ARNm et de la proteine de l'adiponectine et de ses recepteurs dans le

placenta humain, particulierement dans le syncytiotrophoblaste, suggere un role pour

l'adiponectine dans la placentation et supporte l'hypothese d'une interaction mere-fcetus

impliquant l'adiponectine (Chen et al, 2006).

Durant le developpement foetal, l'adiponectine peut etre observee dans une variete de

tissus non-adipeux comme l'epiderme, le muscle lisse, la paroi du petit intestin, les

arteres principales et la cornee, suggerant un role potentiel de l'adiponectine dans la

croissance et le developpement du foetus (Corbetta et al, 2005). Cette expression

etendue de l'adiponectine chez l'embryon pourrait expliquer une concentration de deux a

trois fois plus elevee d'adiponectine circulante dans le plasma et le cordon ombilical des

24

nouveau-nes comparativement a celle de la mere (Budak et al, 2006; Corbetta et al,

2005; Kajantie et al, 2004; Mazaki-Tovi et al, 2005; Weyermann et al, 2006; Pinar et

al, 2008; Mazaki-Tovi et al, 2007). En effet, la concentration plasmatique de

l'adiponectine chez le foetus est 20 fois plus elevee a terme qu'a 24 semaines de

grossesse (Kajantie et al, 2004). Chez la mere, la concentration d'adiponectine circulante

augmente dans la premiere moitie de la grossesse (Fuglsang et al, 2006; Nien et al,

2007) puis decroit de facon proportionnelle a l'augmentation de l'indice de masse

corporelle, de la resistance a l'insuline e de l'hemodilution qui surviennent lors de la

seconde moitie de la grossesse (Nien et al, 2007; Naruse et al, 2005; Catalano et al,

2006).

E. Hypothese et objectifs

Tel que mentionne precedemment, la production porcine des deux dernieres decennies a

mene au developpement de pores de plus en plus maigres afin de maximiser le rendement

de chaque pore produit lors de l'abattage. Cependant, cette selection genetique a genere

de nombreux problemes au niveau des performances reproductives des truies (moins de

porcelets par portee, puberte tardive, plus grand delai entre les portees et vie productive

ecourtee). La modulation de l'expression des proteines secretees par le tissu adipeux (ex.

adipokines) pourrait expliquer, du moins en partie, ces changements metaboliques

importants qui contribuent a augmenter les couts de production.

A la lumiere de ces informations, nous nous sommes demande si l'adiponectine peut

avoir un effet direct sur les cellules endometriales porcines et ainsi influencer divers

processus de reproduction chez la truie, etablissant alors un lien de cause a effet

specifique avec la baisse de productivite observee chez la truie maigre. Pour verifier cette

hypothese, le projet fut divise en trois objectifs :

1) Determiner le profil d'expression en ARNm et en proteine des recepteurs a

l'adiponectine (AdipoRl, AdipoR2 et cadherine 13) dans l'endometre de la

truie au cours du cycle cestral;

25

2) Determiner si le profil d'expression de l'adiponectine et de ses recepteurs est

module selon la prolificite de la truie (truies Landrace hypo- et hyper-

prolifiques) et selon son statut gestante ou cyclique (i.e. effet de la gestation).

Pour cet objectif, les niveaux d'expression de l'adiponectine circulante et du

tissu adipeux sous-cutane et visceral seront mesures, de meme que ceux de ses

recepteurs dans l'endometre uterin et les embryons au jour 15 de la gestation;

3) Determiner l'effet de l'adiponectine recombinante sur l'expression de genes

cibles dans un modele in vitro de culture primaire de cellules endometriales de

truie et, determiner quelles sont les voies de signalisation activees par cette

adipokine.

26

CHAPITRE 1

ARTICLE 1

1.1 Introduction

L'article qui suit resume tous les resultats obtenus au cours de mes travaux de maitrise

portant sur la caracterisation de l'effet de l'adiponectine sur les cellules endometriales

porcines autant par des modeles in vivo (population de truies) qu'/'ra vitro (culture de

cellules endometriales primaires)

1.1.1 Reference

Le present article a ete soumis a la revue Endocrinology le 16 decembre 2009 et est done

en attente d'acceptation pour publication.

1.1.2 Implication de 1'auteur dans l'article

Les resultats ont ete majoritairement produits par 1'auteur principal ainsi que la redaction

de toutes les sections de l'article. Mais comme aucun projet de recherche ne s'effectue

seul, des collaborateurs ont contribue au niveau technique (Daniele Beaudry, Marian

Mayhue) ou au niveau de la redaction (Bruce Murphy ainsi que mes co-directeurs de

recherche, Richard Blouin et Marie-France Palin).

1.1.3 Impact de cet article

A notre connaissance, ceci serait le premier article publie concernant le role de

l'adiponectine sur Fendometre porcin. De plus, cette etude en profondeur presente une

caracterisation des voies de signalisation utilisees par l'adiponectine dans cet organe

reproducteur et demontre clairement que cette adipokine active F expression de genes

cibles ayant un role cle dans la survie embryonnaire en debut de gestation (PTGS2 and

27

VEGF). De facon plus systemique, elle demontre que le profil d'expression de

l'adiponectine dans le tissu adipeux est modifie en debut de gestation (jour 15, gestante

vs cyclique) et avec le statut de prolificite de la truie (hyper- vs hypo-prolifique). Ces

modifications suggerent que l'adiponectine pourrait agir comme un regulateur potentiel

des diverses adaptations metaboliques qui surviennent en debut de gestation chez la truie.

Enfm, la modulation de l'expression des recepteurs AdipoRl, AdipoR2 et cadherine 13

dans l'endometre, pendant le cycle oestral et en debut de gestation, suggerent un role

important pour l'adiponectine dans l'initiation des changements necessaires a une

implantation reussie et a de bonnes interactions mere-foetus.

Cette etude permet aussi de mieux cerner 1'importance du tissu adipeux dans la

reproduction chez la truie et certains aspects pourraient etre transferables a d'autres

especes puisque certains de nos resultats sont en accord avec des resultats publies chez

l'humain et la souris. Pour les producteurs de pore, cet article demontre que des facteurs

produits par le tissu adipeux peuvent avoir une reelle influence sur certaines fonctions

reproductrices telles que la gestation, le controle du cycle oestral et 1'implantation. La

production des diverses adipokines (ex. adiponectine) etant en lien avec le niveau

d'adiposite, la selection genetique pour l'obtention de pores de plus en plus maigres

influence forcement les niveaux circulants de ces adipokines. Chez ces truies trop

maigres, il en resulte un desequilibre qui peut influencer diverses fonctions reproductrices

et, comme il est frequemment observe, entrainer une baisse de la taille des portees, une

puberte retardee et une diminution de la periode reproductive.

Pour la communaute scientifique, ceci constitue un autre pas vers la comprehension des

mecanismes de regulation de l'adiponectine et des voies de signalisations activees par

celle-ci dans l'uterus. De facon plus generale, cette etude permet ainsi de mieux

comprendre le role du tissu adipeux, et des facteurs produits par celui-ci, sur les fonctions

reproductrices.

28

1.2 Article

Adiponectin Actions on the Endometrium

Abbreviated title: Adiponectin in the Endometrium

Karine Brochu-Gaudreau1'3, Daniele Beaudry1, Marian Mayhue1, Alan K. Goff2, Richard

Blouin3, Vilceu Bordignon4, Bruce D. Murphy2 and Marie-France Palin1

1 Dairy and Swine Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food

Canada, Sherbrooke, QC, Canada; 2 Centre de recherche en reproduction animale, Faculte de medecine veterinaire,

Universite de Montreal, St-Hyacinthe, QC, Canada; 3 Departement de biologie, Faculte des sciences, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke,

QC, Canada; 4 Department of Animal Science, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences,

McGill University, Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada.

Corresponding author: Marie-France Palin, mariefrance.palin@agr.gc.ca, 2000 College

Street, PO Box 90, Sherbrooke, QC, Canada, JIM 1Z3; phone: 1-819-565-9171, ext. 207;

fax: 1-819-564-5507.

Reprint requests should be addressed to the corresponding author.

Key words: adiponectin, ADIPOR1, ADIPOR2, cadherin 13, endometrium,

prostaglandin-endoperoxide synthase 2, vascular endothelial growth factor.

This project was supported by Natural Sciences and Engineering Council of Canada

(NSERC) grant No. 322101-05 to VB, BDM and MFP.

Authors have nothing to declare.

29

Abstract

Adiponectin, the most abundant protein secreted by the white adipose tissue, has

pleiotropic effects on physiological processes, including reproduction. We examined

whether this adipokine has a direct effect on endometrial cells using a porcine model.

Moreover, we assessed the effects of pregnancy (cyclic vs. day-15 pregnant sows) and

prolificacy (hyper- vs. hypoprolific animals) on the expression profiles of adiponectin and

its receptors. Using real-time quantitative PCR, we demonstrated that adiponectin

receptor-1 (ADIPOR1), ADIPOR2 and cadherin 13 (CDH13) transcripts are present in

the endometrium and are modulated throughout the estrous cycle, peaking during the

mid-luteal phase. Adiponectin mRNA abundance in subcutaneous fat is higher in

hypoprolific than in hyperprolific animals and higher in cyclic pigs than at day-15 of

gestation. In the endometrium, ADIPOR2 and CDH13 transcripts are lower in the

endometrium of hyperprolific than hypoprolific sows, and ADIPOR2 mRNA abundance

is higher in pregnant compared to cyclic animals. In day-15 embryos, ADIPOR1 and

ADIPOR2 transcripts are higher in hyperprolific than in hypoprolific sows. We show that

recombinant porcine adiponectin activates AMP-activated protein kinase (AMPK) and

extracellular receptor kinases (ERK) 1 and 2 signalling pathways in endometrial stromal

cells, leading to the induction of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) and

vascular endothelial growth factor (VEGF) gene expression. Taken together, these results

demonstrate that adiponectin acts directly on endometrial cells, inducing the expression

of genes associated with successful embryo attachment in the pig model. Moreover, our

results identify this adipokine as a potential regulator of the metabolic adaptations that

occur during early pregnancy.

Introduction

Adiponectin is a 30-kDa protein secreted mainly by the white adipose tissue. It circulates

at high levels in the bloodstream, and its serum concentration is inversely correlated with

body fat mass (1). Besides its well-known actions on energy metabolism, insulin sensitivity and

inflammation (2, 3), adiponectin affects numerous target tissues, including the reproductive

organs (4). Three adiponectin receptors have been identified: adiponectin receptor-1

30

(ADIP0R1), ADIPOR2 (5) and cadherin 13 (CDH13) (6). Both ADIPOR1 and

ADIPOR2 are 7-transmembrane domain receptors with an extracellular carboxy terminus

and an intracellular amino terminus (5). Interaction of adiponectin with its receptor is

believed to activate more than one signalling pathway, the most commonly cited being

the AMP-activated protein kinase (AMPK), p38 MAPK and peroxisome proliferator-

activated receptor-a (PPARa) pathways (7). Cadherin 13, also known as T-cadherin or

H(heart)-cadherin, is a truncated receptor that lacks the intracellular domain needed for

signal transduction (6). Studies have demonstrated that CDH13 can participate in

intracellular signalling cascades by competing with ADIPOR1 and ADIPOR2 receptors

for adiponectin binding (8).

A growing body of information, including detection of ADIPOR1 and ADIPOR2

transcripts in the pig ovary and uterus (9), suggests a direct role for adiponectin in

reproductive tissues. The first evidence of adiponectin action on the ovary was provided

by a study demonstrating that the treatment of pig granulosa cells with adiponectin

induces changes characteristic of the periovulatory period (10). In the human uterus,

Takemura et al. (11) reported higher ADIPGR1 and ADIPOR2 mRNA levels in the

endometrium during the mid-secretory phase of the menstrual cycle and demonstrated

that adiponectin increases the phosphorylation of AMPK in endometrial cell cultures,

suggesting a physiological role for adiponectin in this tissue as well. However, the

CDH13 mRNA level has not been investigated in that study, nor was the abundance of

adiponectin and adiponectin receptors mRNA in early gestation. Adiponectin action on

the swine embryo has also been demonstrated, with a positive effect on the in vitro

embryo development of porcine oocytes (12).

The reproductive function of sows is depressed by both an excess and a paucity of

adipose tissue. For example, loss of backfat during lactation is associated with longer

weaning-to-estrus intervals, a decrease in pregnancy rates and a shorter reproductive

lifetime (13, 14). Moreover, McKay (15) showed that sows selected for reduced backfat

thickness wean fewer piglets per litter. In contrast, sows with excessive body fat at the

end of gestation have farrowing difficulties and give birth to more stillborn piglets (16).

31

Given that circulating adiponectin concentrations are inversely related to body fat levels

and that adiponectin seems to have direct effects on ovarian function (10) and embryo

development (12) in this species, we can hypothesize that adiponectin might be an

important factor in the complex equation governing adipose tissue regulation of

reproductive events. The current study was undertaken to determine whether adiponectin

has direct effects on the pig uterus and to establish whether adiponectin can modulate the

expression of downstream target genes known to be key players in reproductive success

of sows. Moreover, we determined whether adiponectin receptor transcripts are

modulated throughout the estrous cycle and assessed the effects of pregnancy (cyclic vs.

day-15 pregnant sows) and prolificacy (hyper- vs. hypoprolific animals) on the

expression profiles of adiponectin and its receptors.

Materials and Methods

Animals and sample collection

A total of 27 muciparous purebred Landrace sows, generously provided by Genetiporc

(St-Bernard, QC, Canada), were selected based on their average number of piglets per

litter: 14 hypoprolific (< 10 piglets per litter) and 13 hyperprolific (> 15 piglets per litter)

sows. Eight hyperprolific and 9 hypoprolific sows were inseminated twice, 12 and 24 h

after estrus detection, with a Landrace-mix semen kindly provided by the Centre

d'insemination porcine du Quebec (CIPQ Inc., St-Lambert, QC, Canada). The remaining

5 hyperprolific and 5 hypoprolific cyclic sows were used to study the effect of pregnancy

status. B-mode ultrasound was used to measure subcutaneous fat thickness between the

third last and fourth last ribs (Ultrascan 50, Alliance Medicale, Montreal, QC, Canada).

At slaughter, on day 15 of pregnancy, subcutaneous and visceral fat tissue samples were

collected, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 C. The reproductive tract was

collected, and the uterine horns were dissected from the mesometrium. The uterine horns

were flushed with 20 ml PBS (135 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 1.5 mM

KH2PO4; pH 7.4) and the collected fluid was centrifuged to precipitate filamentous

conceptuses. The flushed uterine horns were opened on the antimesometrial side, and

32

strips of endometrium were collected on the mesometrial side, at embryo attachment

sites. Samples of endometrial tissue were also collected from the cyclic sows. Uterine

samples of 5 mm x 5 mm x 5 mm (from myometrium to endometrium) were also

collected from all pregnant sows at attachment sites and between sites (intersite) for

immunofluorescence experiments. Blood samples were collected from all the sows and

stored at -20 C until use. The animals were cared for according to the Recommended

Code of Practice (17) and killed using a method approved by the local Animal Care

Committee and following the guidelines of the Canadian Council on Animal Care (17).

The uterine horns of multiparous crossbred (Yorkshire-Landrace x Duroc) sows (n= 18)

were also collected for gene expression determination throughout the estrous cycle. The

cycle stage was determined by ovarian morphology in accordance with Akins and

Morrissette (18): stage 1 corresponds to days 1 to 3 of the cycle; stage 1.5 to days 4 to 6;

stage 2 to days 7 to 9; stage 2.5 to days 10 to 12; stage 3 to days 13 to 15; and the corpus

luteum (CL) regression stage (R) to days 16 to 20. Strips of endometrium and uterine

sections were collected as mentioned above.

Total RNA extraction and complementary DNA synthesis

Approximately 100 mg of each tissue sample was homogenized in TRIzol reagent

(Invitrogen, Grand Island, NY), and total RNA was extracted according to the

manufacturer's instructions. Total RNA was then treated with DNAse I (Invitrogen) to

remove contaminating DNA. First-strand complementary DNA was synthesized using

oligo(dT)i3-i8 primers and the Superscript II preamplification system (Invitrogen)

following the manufacturer's instructions.

Quantitative real-time PCR

Quantitative real-time PCR analyses were performed using Power SYBR Green PCR

Master Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) on an Applied Biosystems

7500 Fast Real-Time PCR System. Primer sequences are presented in Table 1. Cycling

conditions were 2 min at 50 C and 10 min at 95 C, followed by 40 cycles of 3 sec at 95 C

and 30 sec at 60 C. The PCR amplifications were performed in triplicate, and standard

33

curves were established in duplicate for each gene. Standard curves were composed of

serial dilutions of complementary DNA pools from the same tissue and were used to

obtain the relative quantification of mRNA using the standard curve method (Applied

Biosystems, User Bulletin #2) (19). Relative quantification values were normalized by

either peptidylprolyl isomerase A (PPIA) or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

(GAPDH) reference genes (RG), whichever was the least affected by the treatments. The

specificity of the amplified fragments was verified by melting curve analysis. For each

experimental sample, the amount of the studied genes relative to the appropriate RG

mRNA was determined from their respective standard curves. Relative quantity ratios

were obtained by dividing the relative quantity units of the studied genes by those of the

selected RG. Mean values from triplicates were used to perform the statistical analyses.

Immunolocalization of the CDH 13 protein in endometrial tissue

The uterine samples taken from the hypo- and hyperprolific sows and from the cyclic

sows throughout the estrous cycle were fixed in a 4% paraformaldehyde, 0.1 M sodium

cacodylate solution and kept in 0.4% paraformaldehyde. The tissues were embedded in

paraffin, and cut at 5 um. Sections were deparaffinized in SafeClear solution (Fisher

Scientific Inc., Ottawa, ON, Canada) and then rehydrated progressively for 2 x 5 min in

ethanol 100%, 5 min in ethanol 95%, 5 min in ethanol 70% and 30 min in distilled water.

The sections were boiled for 10 min in 0.01 M sodium citrate solution (pH 6.0) for

antigen retrieval. The tissues were then washed in distilled water, followed by 3 x 2 min

in PBS. Non-specific protein binding was blocked by covering the tissues with PBS

containing 10% normal goat serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove,

PA) and 0.3% Triton overnight at 4 C in a moist chamber. The tissues were then

incubated overnight at 4 C in a moist chamber with rabbit anti-mouse H-cadherin

polyclonal antibody (Abeam Inc., Cambridge, MA) diluted 1:200 in blocking solution.

The slides were washed for 3 min in PBS, 5 min in PBS supplemented with 0.4 M

sodium chloride and 3 min in PBS. Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen)

diluted 1:1000 in blocking solution was added to the tissue for 90 min at room

temperature. The slides were mounted with ProLong Gold antifade reagent with

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen) to stain the nuclei. The slides were

34

viewed on an Olympus 1X70 epifluorescence microscope (Olympus, Markham, ON,

Canada). The primary antibody was omitted for negative controls.

Isolation and culture of primary endometrial cells

The uterine horns of 3 multiparous crossbred sows were collected 13 days post-estrus.

Strips of endometrium were immediately cut and placed in 1 ml Hanks' balanced salt

solution (HBSS) without calcium and magnesium supplemented with 1% antibiotic-

antimycotic solution (Invitrogen) and 50 |ig/ml gentamicin sulphate (Sigma-Aldrich,

Oakville, ON, Canada) per gram of tissue. The tissue was rinsed twice with the same

solution before 2.4 units/ml Dispase II (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) was added.

The tissue was incubated for 20 min at 37 C with occasional gentle inversion of the tubes.

A 2.5% pancreatin solution (Invitrogen) was added for a final concentration of 0.25%,

and the digestion continued for 1 h at room temperature with occasional gentle shaking.

Isolated endometrial luminal epithelial cells (LEC) were collected by decanting the

digestion solution from undigested tissues. The decanted cellular suspension was then

centrifuged at 200 x g for 7 min, resuspended in 5 ml erythrocyte lysis buffer (20)

(154 nM NH4C1, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) for 7 min at room temperature, and

centrifuged at 300 x g for 5 min. The cell pellet was resuspended in RPMI-1640 culture

medium containing 1%> antibiotic-antimycotic solution and 20% fetal bovine serum

(FBS) (Invitrogen). The remaining tissue was minced and digested with 0.25% trypsin

(Invitrogen) for 1 h at 37 C. The trypsin was inactivated by adding 10% FBS, and the

digestion was continued with the addition of 0.06% collagenase (Invitrogen) for 1.5 h at

37 C. The remaining undigested tissue was removed by filtration through sterile

cheesecloth sheets. The cellular suspension was then separated by filtration through a

40-um BD Falcon cell strainer (BD, Bedford, MA). Glandular epithelial cells (GEC)

were collected by backwashing the strainer with HBSS while the stromal cells (SC)

passed through the strainer. Both the GEC and SC were centrifuged at 200 x g for 7 min.

The SC were treated for red blood cell lysis in the same manner as the LEC. The LEC

and GEC were then pooled (endometrial epithelial cells, EEC). Cell viability was

determined by trypan blue staining (Biowhittaker, Walkersville, MD), and the cells were

plated at 1 * 106 viable cells per millilitre in 6-well tissue culture plates (Corning,

35

Corning, NY). The SC culture medium was changed after 3 h of incubation to remove

unattached contaminating EEC. The EEC culture medium was transferred into 6-well

CellBIND culture plates (Corning) to get rid of contaminating SC, which adhered to

culture plates while the EEC were still in suspension. The cells were grown in

RPMI-1640 with 1% antibiotic-antimycotic solution and FBS (10% for SC, 20% for

EEC) at 37 C in a humidified incubator with 5% CO2 until confluence was reached.

Contamination of stromal cells by epithelial cells and of epithelial cells by stromal cells

was kept under 5% and 10%, respectively.

Treatment of primary endometrial cells

The recombinant porcine adiponectin used to treat the primary endometrial cells was

produced in Escherichia coli as previously described (10), using native purification

conditions. Both the EEC and SC proliferated in vitro and when cultures reached 90 to

95% confluence, the culture medium was replaced by RPMI-1640 supplemented with

10% KnockOut serum (Invitrogen) and 1% antibiotic-antimycotic solution for an 18-h

starvation period. At the end of that period, the endometrial cells were incubated in

RPMI-1640 supplemented with either adiponectin (10 fig/ml) or 5-aminoimidazole-

4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR; Cell Signalling Technology, Danvers, MA) at

1 mM for 5 min, lOmin, 30 min, 60 min, 12 h and 24 h. In other wells, a 1-h

pretreatment with the MAPK kinase 1/2 (MEK1/2) inhibitor U0126 at 10 uM (Cell

Signalling Technology) or with the protein kinase A (PKA) inhibitor H-89 at 5 uM

(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) was performed before the addition of

recombinant adiponectin (10 |ig/ml) in RPMI-1640 for 5 min, 10 min, 30 min, 60 min,

12 h or 24 h. The control cells did not receive inhibitor pretreatments and were incubated

in RPMI-1640 without adiponectin. Optimal product working concentrations and

incubation times were chosen according to preliminary test experiments. At the end of the

treatments, the cells were harvested, and total RNA and proteins were extracted using the

NucleoSpin RNA/Protein extraction kit (Macherey-Nagel, Easton, PA).

36

Western blot analysis

Western blot analyses of serum samples were performed as previously described in

Jacobi et al. (21). The ANOC 9108 monoclonal anti-human adiponectin antibody, kindly

provided by Dr. Shinji Kihara (Osaka University, Japan), was used at a dilution of 1:500,

and horse anti-mouse IgG (H&L) horseradish peroxidase (HRP)-linked secondary

antibody (Cell Signalling Technology) was used at a dilution of 1:2000.

Precipitated cellular protein extracts, used to study adiponectin signalling pathways, were

resuspended in lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 1%

Triton, 0.5% SDS) and centrifuged at 11,000 x g for 1 min. Protein concentration was

determined using an RC DC protein assay reagent kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules,

CA). Next, 20 ug protein was resolved on a 10% SDS-PAGE gel and then transferred to

a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories). The membranes were blocked in 5%

dried skim milk in PBS containing 0.1 % Tween-20 (PBST). The membranes were

incubated for 16 h at 4 C in the presence of a primary antibody and then incubated for 1 h

at room temperature with the secondary antibody. Detection was initiated with the

Amersham ECL Western blotting detection reagents (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

All antibodies were from Cell Signalling Technology. Activation of the MAPK-ERK1/2

signalling pathway was viewed using p44/42 MAPK rabbit antibody (1:1000) and

phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) rabbit antibody (1:1000). Activation of the

AMPK signalling pathway was viewed using AMPKa rabbit antibody (1:1000) and

phospho-AMPKa (Thrl72) rabbit antibody (1:300). Beta-actin rabbit antibody (1:5000)

was used to verify protein load constancy. Goat anti-rabbit IgG whole antibody HRP-

linked antibody (1:2000) was used as the secondary antibody.

Statistical analysis

Relative adiponectin receptor mRNA abundance throughout the estrous cycle was

analyzed using one-way ANOVA with unequal variances. Relative adiponectin and

adiponectin receptor mRNA abundances in fat tissues, endometrium and embryos were

analyzed using the MIXED procedure of SAS (22) according to a 2><2 factorial

arrangement with prolificacy (hyper- vs. hypo-) and pregnancy (cyclic vs. pregnant) as

37

the main effects. Relative PTGS2 and VEGF mRNA abundances in primary cell cultures

were analyzed by an all pair-wise multiple comparison procedure using a Tukey

correction. Adiponectin receptors mRNA abundances in primary cell cultures were

analyzed using one-way ANOVA. Results are presented as least-squares means ± SEM

of relative mRNA abundance. Statistical significance was set at P < 0.05.

Results

Expression of ADIPOR1, ADIPOR2 and CDH13 mRNA in the endometrium throughout

the estrous cycle

Expression of ADIPOR1 (Fig. 1A), ADIPOR2 (Fig. IB) and CDH13 (Fig. 1C) mRNA

was detected in pig endometrial tissue throughout the estrous cycle. Expression of

ADIPOR1 mRNA (Fig. 1A) was maximal at stage 2 (P< 0.01) and minimal during the

regression of the CL (stage R). The level of ADIPOR2 mRNA (Fig. IB) was maximal at

stage 2 but did not reach significance because of high inter-individual variability.

Nevertheless, significant differences in relative ADIPOR2 mRNA levels were observed

between stage 1 (P<0.01), stage 1.5 (P<0.05), stage 2.5 (P<0.05) and the regression

stage (Fig. IB). Cadherin 13 mRNA levels were higher at stages 2 (P<0.05), 2.5

(P < 0.05) and 3 (P < 0.001) of the estrous cycle, when compared with the CL regression

stage (Fig. 1C).

Modulation of adiponectin mRNA abundance in adipose tissues and of plasma

adiponectin according to pregnancy and prolificacy status

In the subcutaneous fat tissue, the relative adiponectin mRNA abundance was higher in

hypoprolific than in hyperprolific sows (Fig. 2A; P < 0.05) and higher in cyclic than in

day-15 pregnant animals (Fig. 2A; P<0.05). There was no significant difference in

adiponectin gene expression in the visceral fat tissue (Fig. 2A; P > 0.05). In the

bloodstream, the anti-human adiponectin antibody detected 2 proteins of approximately

28 kDa and 30 kDa (Fig. 2B), the most abundant being the 28-kDa protein. Higher

adiponectin protein levels were observed in cyclic than in pregnant sows (Fig. 2B),

whereas there was no difference between hypo- and hyperprolific sows (data not shown).

There was no significant difference in subcutaneous fat thickness between hyper- and

38

hypoprolific sows (8.98 vs. 9.94 mm, P>0.05) or between pregnant and cyclic sows

(9.13 vs. 9.78 mm, P> 0.05).

Relative adiponectin and adiponectin receptor mRNA abundances in the endometrium

and in day-15 embryos of hyper- and hypoprolific sows

As for adiponectin expression in subcutaneous fat tissue, ADIPOR2 mRNA abundance in

the endometrium on day 15 of pregnancy was lower in hyperprolific than in hypoprolific

sows (Fig. 2C; P < 0.05), and CDH13 mRNA abundance followed the same expression

profile (tendency, JP = 0 .09) . There was no significant difference in ADIPOR1 mRNA

levels, measured in endometrial tissue, between hypo- and hyperprolific sows (Fig. 2C;

P > 0.05). Endometrial ADIPOR2 mRNA abundance was higher in pregnant sows than in

cyclic ones (Fig. 2C; P< 0.001), whereas there was no differences in ADIPOR1 and

CDH13 mRNA abundance (P > 0.05).

In day-15 embryos, ADIPOR1 and ADIPOR2 mRNA abundance was higher in

hyperprolific than in hypoprolific sows (Fig. 2D; P<0.05). Relative CDH13 mRNA

abundance, measured in the embryos, was similar in hyper- and hypoprolific sows

(Fig. 2D; P > 0.05). Adiponectin transcripts were undetectable in sow endometrium and

in day-15 embryos (data not shown).

Immunolocalization of the CDH13 protein in endometrial tissue

CDH13 (red fluorescence; Fig. 3) was observed in all endometrial tissue sections and was

localized in the glandular epithelium, the apical surface of the luminal epithelium, the

endothelial cells (EC) and, to a lesser extent, the SC. Analyses of tissue sections

throughout the estrous cycle (Figs. 3A, B, C and D) demonstrated a basal and constant

immunolabelling of CDH13 in the endothelial and stromal compartments. The

immunofluorescence observed in the glandular epithelium varied according to stages of

the estrous cycle: it was absent at stage 1 and during the CL regression stage (R), weak at

stage 2 and the strongest at stage 3. At stage 3 of the cycle, CDH13 immunolabelling was

much stronger in the glandular epithelium than in the luminal epithelium, whereas the

39

opposite was observed at stages 1, 2 and R. A signal that appeared constant was present

at the apical surface of the luminal epithelium throughout the estrous cycle.

Endometrial CDH13 protein expression, measured in hypo- and hyperprolific sows

(Fig. 3E), confirmed its mRNA profile (Fig. 2), with hypoprolific showing the highest

immunofluorescence signal compared to hyperprolific animals (Fig. 3E). Pregnancy

status did not affect CDH13 protein abundance, as demonstrated by similar

immunolabelling observed in both pregnant and cyclic sows. There was no difference in

the immunolabelling signal between tissue sections originating from the conceptus

attachment sites and those originating between sites. Finally, the highest

immunofluorescence intensity appeared present in cells of the glandular epithelium

compared to the other cell types.

Activation by recombinant porcine adiponectin of AMPK and ERK1/2 signalling

pathways in primary endometrial stromal cells

In EEC cultures, the addition of recombinant pig adiponectin had no effect on PTGS2

and VEGF mRNA abundance (data not shown), whereas significant increases were

observed in endometrial SC cultures (Figs. 4B, C, E and F). Therefore, the determination

of the adiponectin intracellular pathways involved in the induction of PTGS2 and VEGF

gene expression was performed in endometrial SC only.

Incubation of SC with the AMPK agonist AICAR (30 min) resulted in a sharp increase in

AMPK phosphorylation, thus demonstrating that the AMPK signalling pathway is fully

functional in these cells (Fig. 4A). The addition of adiponectin to endometrial SC

increased AMPK phosphorylation (~ 2-fold) over a 30-min period (Fig. 4A). The

incubation of SC cultures with adiponectin over a period of 12 h significantly increased

the relative mRNA abundance of PTGS2 and VEGF genes compared with the control

(Figs. 4B and C; P < 0.05). The addition of AICAR increased PTGS2 transcript levels

fourfold (Fig. 4B) compared to the adiponectin treatment (P< 0.001). Similar VEGF

mRNA abundance were obtained when SC were treated with adiponectin or AICAR

(Fig. 4C ;P> 0.05).

40

To investigate whether adiponectin-induced PTGS2 and VEGF gene expression are

mediated through the MAPK-ERK1/2 pathway, SC were treated with the U0126 inhibitor

for 1 h prior to the addition of adiponectin. The addition of adiponectin to the culture

media increased ERK1/2 phosphorylation (Fig. 4D). Treatment of SC with U0126, in the

presence or absence of adiponectin, decreased ERK1/2 phosphorylation (Fig. 4D). As

expected, the addition of recombinant adiponectin resulted in a significant increase in

PTGS2 and VEGF mRNA abundance (Figs. 4E and F). The pretreatment of SC with

U0126 inhibited the adiponectin-induced stimulation of PTGS2 gene expression but had

no effect on the adiponectin-induced stimulation of VEGF gene expression (Fig. 4E and

F).

The PKA inhibitor H-89 had no effect on the adiponectin induction of PTGS2 and VEGF

transcript abundance in endometrial SC at 12 and 24 h (data not shown), thus suggesting

that the PKA pathway is not involved in adiponectin signal transduction in pig

endometrial tissue. Treatment of endometrial SC with adiponectin for a 12-h period did

not affect the mRNA abundances of ADIPOR1, ADIPOR2 and CDH13 genes (Fig. 5).

Discussion

The present study demonstrates that ADIPOR1, ADIPOR2 and CDH13 transcripts are

present in the sow endometrium and that their mRNA abundances are modulated through

the estrous cycle, peaking during the mid-luteal phase. To our knowledge, this is the first

report of CDH13 gene expression in the endometrium. Moreover, immunofluorescence

analysis confirmed the presence of CDH13 protein in different endometrial tissue

compartments, with the highest expression found in the glandular epithelium during the

late luteal phase. In keeping with our results, Takemura et al. (11) observed a significant

increase in ADIPOR1 and ADIPOR2 gene expression during the mid-luteal phase of the

menstrual cycle. Previous studies have demonstrated that ADIPOR1 and ADIPOR2

expression can be modulated by reproductive hormones such as LH (23), 17-(3 estradiol

(24, 25) and testosterone (25). Moreover, the sharp increase in CDH13 mRNA abundance

41

during the mid-luteal stage might be explained by high circulating levels of P4, given that

it was earlier reported that this hormone is a positive regulator of CDH13 expression in

human osteosarcoma cells (26). Together, these observations suggest that ovarian

hormones may affect adiponectin receptor expression in the uterus.

In the human endometrium, adiponectin transcripts were detected throughout the

menstrual cycle (11), and other studies have found adiponectin transcripts in rabbit and

mouse endometrial tissues during the preimplantation period (27). In our study,

adiponectin transcript abundance was below the level of detection in sow endometrial

tissue and day-15 pig embryos. Rabbits, mice and pigs have hemodichorial,

hemotrichorial and epitheliochorial modes of implantation, respectively (28), which

might account for the observed species differences in adiponectin expression in the

embryo and endometrial tissues. Alternatively, adiponectin expression in these tissues

might be modulated throughout pregnancy, as demonstrated by the absence of transcripts

in day-3.5 mouse embryos and their detection in implanted day-5 mouse embryos (27).

In the current study, day-15 pregnant animals had lower adiponectin mRNA levels in

subcutaneous fat and less circulating adiponectin when compared with their cycling

counterparts. These results concur with Combs et al. (29), who reported declining

circulating adiponectin levels with the progression of gestation in mice. Similarly,

circulating adiponectin concentrations were found to be lower in pregnant women

compared with non-pregnant women, but those differences disappeared when adiponectin

levels were corrected for body fat percentage (30). In our study, there were no differences

in the depth of subcutaneous adipose tissue between pregnant and non-pregnant sows,

thus suggesting that the observed decrease in circulating adiponectin is not due to

changes in body fat. Variations in pregnancy hormones concentrations, such as P4, might

have affected adiponectin gene expression in adipose tissue, but this remains to be

determined.

The mRNA abundance of ADIPOR2 in the uterus was higher in day-15 pregnant than in

cyclic animals, a pattern in contrast to adiponectin expression in the subcutaneous

42

adipose tissue. Interestingly, the treatment of 3T3-F442A adipocytes with recombinant

adiponectin caused a decrease in the mRNA abundance of ADIPOR2 but not that of

ADIPOR1 (31). In the same study, it was further demonstrated that ADIPOR2 mRNA

abundance was upregulated in fat tissues of adiponectin-deficient mice, but ADIPOR1

mRNA abundance was not. Based on the abovementioned results, it might be argued that

the higher circulating adiponectin levels found in cyclic sows might be the cause of the

lower ADIPOR2 expression levels we found in the endometrium. However, we have

reported in the present study that the treatment of endometrial SC with adiponectin did

not affect adiponectin receptor mRNA abundance, thus suggesting that circulating

adiponectin levels are not likely to influence adiponectin receptor gene expression in the

uterus. The difference in ADIPOR2 mRNA abundance observed in the sow endometrium

might instead be explained by pregnancy-associated factors, not yet identified.

Differences in the number of young born to litter bearing species can be attributed to the

rate of ovulation, embryo survival and placental formation, among others. The genesis of

differences in the populations of sows we have designated hypo- and hyperprolific is not

known. We sampled these populations to establish whether adiponectin expression

correlated with prolificacy. Our results show that hyperprolific sows have less

adiponectin mRNA in subcutaneous fat and less ADIPOR2 and CDH13 mRNA in the

endometrium, when compared to hypoprolific sows. These differences are not due to

differences in subcutaneous fat accretion, as both groups had similar backfat thickness.

Transgenic mice with elevated circulating adiponectin levels three fold greater than their

wild type counterparts were found to be infertile (32), whereas mice bearing null

mutations of the adiponectin gene are fertile (33). These results suggest that adiponectin

is not mandatory for fertility but that high circulating levels may have an adverse effect.

In the current study, pregnancy and hyperprolificacy were associated with lower

adiponectin gene expression in subcutaneous fat tissue, and lower circulating adiponectin

levels were also found in pregnant compared to cycling animals. It therefore seems that a

lower adiponectin level is favorable for sustaining successful pregnancy. The lower levels

of ADIPOR2 and CDH13 mRNA found in the uterus of hyperprolific sows compared

with the hypoprolific sows remain to be explained.

43

The higher mRNA abundance of ADIPOR1 and ADIPOR2 genes in the day-15 embryos

of hyperprolific, relative to hypoprolific sows, might reflect the higher capacity of the

hyperprolific sows to mediate adiponectin signal transduction in embryonic tissues.

Interestingly, we recently reported that ADIPOR1 and ADIPOR2 are present in

blastocyst-stage pig embryos and that recombinant adiponectin has a positive effect on

the in vitro embryo development of porcine oocytes (12). Those results provide evidence

that adiponectin may play a regulatory role in the intracellular signalling mechanism

affecting embryo development in mammals. Additional experiments are needed to

determine whether the increase in ADIPOR1 and ADIPOR2 mRNA abundances

observed in the hyperprolific sows is associated with improved development of the

embryos.

Adiponectin signal transduction can be mediated through multiple intracellular pathways,

including AMPK, MAPK-ERK1/2 and cAMP/PKA pathways (7, 34). The first, AMPK,

is a ubiquitously expressed cellular energy sensor that is activated by an increase in the

intracellular AMP/ATP ratio (35). In the current study, the addition of porcine

adiponectin to endometrial SC increased AMPK phosphorylation twofold, which

suggests that adiponectin might regulate specific endometrial functions through the

activation of the AMPK signalling pathway. Moreover, this activation is not exclusive to

the pig species, given that the induction of AMPK phosphorylation by adiponectin was

previously observed in human endometrial cell cultures (11). The addition of AICAR to

the endometrial cell cultures resulted in a marked increase in PTGS2 and VEGF gene

expression, and these effects were recapitulated by the addition of adiponectin for the

VEGF gene only. Thus, it seems that the activation of VEGF by adiponectin is mediated

through the AMPK signalling pathway, whereas the activation of PTGS2 is not. But more

experiments should be performed to exclude the involvement of other signalling

pathways.

Our study is the first to demonstrate that recombinant adiponectin can induce the MAPK-

ERK1/2 signalling pathway in endometrial cells, because the addition of adiponectin

44

provoked a clear increase in ERK1/2 phosphorylation, which was abrogated with the

addition of U0126, a specific inhibitor of MAPK-ERK1/2 activation. A similar induction

of ERK1/2 phosphorylation was observed with the addition of adiponectin in porcine

granulosa cells and a pretreatment with U0126 abrogated the ERK1/2 phosphorylation

along with the PTGS2 and VEGF responses to adiponectin (10). In the present study, we

have shown that the addition of U0126 abrogates the PTGS2 response to adiponectin in

endometrial SC but has no effect on VEGF gene expression. Collectively, these findings

suggest that adiponectin can indeed activate the MAPK-ERK1/2 signalling pathway in

porcine endometrial and granulosa cells, but the activation of downstream target genes

through this pathway differs depending on cell type.

PTGS2 is the rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins PGE2 and PGF2«,

which are well known for their implication in the maintenance of early pregnancy in the

pig (36), and VEGF is an important proangiogenic factor implicated in the endometrial

remodelling that occurs in preparation for implantation and in the initiation of

placentation (36). Moreover, the VEGF gene is highly expressed at implantation sites in

early pregnancy in the porcine endometrium (37), and its protein expression is at its

highest at days 18 to 20 of the estrous cycle, when there is an active endometrial

remodelling (38). Taken together, these results suggest that adiponectin, acting on

endometrial cells, modulates the expression of genes with key roles in the remodelling

and attachment processes.

In summary, we found evidence that adiponectin acts directly on porcine endometrial

cells, inducing the expression of PTGS2 and VEGF transcripts, both of which are

required for successful embryo attachment, and thus gestation, in this species. Moreover,

the modulation of endometrial adiponectin receptors mRNA levels throughout the estrous

cycle and with pregnancy reinforces the significance of adiponectin signalling in uterine

function. Finally, the modulation of adiponectin gene expression in subcutaneous fat

tissue identifies this adipokine as a potential regulator of the metabolic adaptations that

occur during early pregnancy.

45

Acknowledgements

We are thankful to Steve Methot for performing the statistical analyses, Gilles Grondin

for sharing his microscopy expertise, Sagal Bachir Osman for technical help, Dr. Shinji

Kihara for providing the ANOC 9108 antibody, the staff of the Swine Complex for

performing animal care and sample collection, Genetiporc Inc. for providing the hyper-

and hypoprolific sows, and the Centre d'insemination porcine du Quebec for providing

the semen.

46

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50

TABLE 1. Sequences of oligonucleotide primer pairs used ill quantitative real-time PCR experiments

Gene* Direction Primer sequence (5'-3') GenBank Accession no.

Lenght(bp)

Adiponectin

ADIPOR1

ADIPOR2

CDH13

PTGS2

VEGF

GAPDH

PPIA

Forward Reverse

Forward Reverse Forward Reverse

Forward Reverse Forward Reverse Forwaid

Reverse

Forward Reverse Forward Reverse

GCCCATTCGCTTTACCAAGA ACCGTGATGTGGAAGGAGAAGTA GCCATGGAGAAGATGGAGGA AGCACGTCGTACGGGATGA TGTTCGCCACCCCTCAGTAT AATGATTCCACTCAGGCCCA

GCCCTGGTGAGCCTTCTTC ATGTTCGTCATGGGTGGTTTC CCGACAGCCAAAGACACTCA

ACCAGGCACCAGACCAAAGA

TGTGCCCACTGAGGAGTTCA

GCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG

CAGCAATGCCTCCTGTACCA GATGCCGAAGTTGTCATGGA GCACTGGTGGCAAGTCCAT AGGACCCGTATGCTTCAGGA

EF60U60

M_00107193.1

AY452711

EU140561

AF207S24

NM_214084

AF017079

AY008846

114

74

71

92

102

109

70

71

a ADIPGR1, adiponectin receptor 1: ADIPOR2. adiponectin receptor 2: CDH13. cadherin 13: PTGS2. prostaglandin-endoperoxide synthase 2; VEGF, vascular endothelial growth factor; GAPDH. slyceraldehyde-3-pliosphate dehydrogenase: PPIA, peptidylprolyl isomerase A

51

1 1.5 2.0 2.5 3 R

Estrous cycle stage

I «

**

i i 1 1.5 2.0 2.5 3 R

Estrous cycle stage

Estrous cvele stage

FIG. 1. Relative mRNA abundance of ADIPOR1 (A), ADIPOR2 (B) and cadherin 13 (C) in

the sow endometrium throughout the estrous cycle. The mRNA expression of all adiponectin

receptors is highest at the mid-luteal stage (stages 2 to 2.5) of the estrous cycle compared to

the corpus luteum regression stage (R). Data are presented as least-squares means ± SEM of

3 animals performed in triplicate. 1fP<0.l,*P< 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. stage R.

52

A B

• Subcutaneous fat • Visceral fat

Hyper Hypo Preplan! Cyclic

Prolificacy Pregnancy

Cvclic Pregnant

28kDa _^.

v 0.8

D

Hyper Hypo

Prolificacy

Pregnant Cyclic

Pregnancy

2.4

2.0

1.6

1.2

0.4

0.0

LL

0.4DIPORI UADIPOR2 • CADHERIN13

rK

I Hyper Hypo

Prolificacy

FIG. 2. Adiponectin and adiponectin receptor expression in hyper- and hypoprolific sows. (A)

Relative adiponectin mRNA abundance in visceral and subcutaneous fat tissues. (B) Western

blot analysis of sow plasma using an anti-human adiponectin monoclonal antibody

(ANOC9108). Representative Western blot showing adiponectin protein in 4 cyclic and

4 pregnant sows. Relative ADIPOR1, ADIPOR2 and cadherin 13 mRNA abundances in the

endometrium (C) and embryos (D) of hypo- and hyperprolific sows. Values are presented as

least-squares means ± SEM of 10 to 18 animals performed in triplicate. -fP < 0.1, *P< 0.05,

**P<0.01.

53

Pregnant

Cyclic Site Intersite

FIG. 3. Cadherin 13 protein expression in the sow endometrium throughout the estrous cycle

(A, stage 1; B, stage 2; C, stage 3; and D, stage R) and in hyper- and hypoprolific sows (E).

Red immunofluorescence: cadherin 13 marked with Alexa Fluor 555 secondary antibody; blue

immunofluorescence: nucleus 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. LEC: luminal

endometrial cells; GEC: glandular endometrial cells: SC: stromal cells; EC: endothelial cells.

Scale bar = 250 urn.

54

<£ ^ & p

P-AMPK

AMPK

r 6-actin

C* -r0"" # <?"

x*

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p-ERK 1/2

ERK 1'2

p-actin

I o -

I Ctrl Adipo AiCAR

Adipo s# .** rii-

FIG. 4. Effect of porcine adiponectin on AMPK and MAPK-ERK1/2 signalling pathways in

endometrial stromal cells. (A) Immunoblot showing the presence of total AMPK and

phosphorylated AMPK (p-AMPK) in control cells (Ctrl) and in cells treated with adiponectin

(Adipo, 10 |ig/ml) or the AMPK agonist AICAR (1 mM) for 30 minutes. (B and C) Relative

mRNA abundance of PTGS2 (B) and VEGF (C) in cells treated with adiponectin (Adipo) or

with AICAR for 12 h. (D) Immunoblot showing that adiponectin treatment (10 |J.g/ml, 10 min)

can induce phosphorylation of ERK1/2 (p-ERKl/2). This effect is abrogated when cells are

pretreated with the MAPK kinase 1/2 (MEK1/2) inhibitor U0126 (10 uM). (E and F) Relative

mRNA abundance of PTGS2 (E) and VEGF (F) in cells treated with adiponectin alone for

12 h (Adipo), cells pretreated with U0126 for 1 h followed by a 12-h incubation period

without adiponectin (U0126), or a 1-h pretreatment with U0126 followed by adiponectin for

12 h (U0126 + Adipo). Ctrl: untreated cells. Data are presented as least-squares means ± SEM

of 3 animals performed in triplicate. f P < 0 . 1 , *P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001.

55

ADIPOR1 ADIPOR2 CADHERIN13

FIG. 5. Relative mRNA abundance of ADIPOR1, ADIP0R2 and cadherin 13 in endometrial

stromal cells. The treatment of porcine endometrial stromal cells with recombinant

adiponectin (10 rig/ml, 12 h) had no effect on the relative mRNA abundances of ADIPOR1,

ADIPOR2 and cadherin 13 genes. Open bars represent transcript abundances in control

cultures, and black bars represent adiponectin-treated cultures. Data are presented as least-

squares means ± SEM of 3 animals performed in triplicate.

56

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ces travaux de maitrise constituent une avancee significative pour la communaute scientifique

et pour les producteurs de pore du Quebec et d'ailleurs dans le monde. En effet, la

demonstration de la modulation de 1'expression de l'adiponectine dans le tissu adipeux avec la

gestation (truies gestantes vs cycliques) et le caractere de prolificite (hyper- vs hypo-

prolifiques) de la truie, suggere que l'adiponectine pourrait etre impliquee dans la regulation

des diverses adaptations metaboliques qui surviennent en debut de gestation. De plus, la

modulation d'expression observee pour les recepteurs de l'adiponectine dans l'endometre et

les embryons suggere un role probable pour l'adiponectine sur les cellules endometriales et

embryonnaires porcines en debut de gestation. Cependant, l'expression plus faible de

l'adiponectine, observee dans le tissu adipeux, et de ses recepteurs dans l'endometre de truies

hyper-prolifiques comparativement aux truies hypo-prolifiques, suggere qu'une repression des

voies de signalisation sous-jacentes pourrait contribuer a l'obtension de tailles de portees plus

grandes, ce qui etait contraire a nos attentes. Toutefois, l'augmentation de l'abondance des

ARN messagers des recepteurs AdipoRl et AdipoR2, observee chez les embryons de truies

hyperprolifiques, suggere un role favorable pour l'adiponectine sur le developpement

embryonnaire. Les niveaux d'adiposite etant les memes pour les truies hyper- et hypo-

prolifiques, divers facteurs hormonaux (c.-a-d. hormones ovariennes) pourraient influencer

l'expression de l'adiponectine et de ses recepteurs en debut de gestation. Des travaux

additionnels seront cependant necessaires pour demontrer un tel effet des hormones sur

l'expression de ces genes.

Les analyses in vitro, realisees sur des cultures de cellules endometriales primaires de truies,

demontrent que l'adiponectine recombinante a un effet direct sur l'activation des voies de

signalisation de l'AMPK et de la MAPK ERK!^, ce qui entraine une augmentation de

l'expression de genes cibles (VEGF et PTGS2) reconnus pour leur role essentiel en debut de

gestation. A la lumiere de ces resultats, une implication de l'adiponectine dans les diverses

adaptation metaboliques et physiologiques survenant en debut de gestation, tel la preparation

57

de 1'epithelium uterin a la reception des ovules fecondes ainsi que les premieres etapes

necessaires a l'implantation et a la placentation des jeunes embryons, est facilement avancee.

Cette etude ne constitue que le debut d'une caracterisation plus exhaustive sur 1'implication

de l'adiponectine sur divers caracteres de reproduction et plus particulierement sur la survie

embryonnaire en debut de gestation. Afin de mieux caracteriser le role potentiel de

l'adiponectine sur l'endometre, il serait interessant de repeter ces analyses sur d'autres races

de pore. De plus, des polymorphismes ont ete identifies dans les genes de l'adiponectine et de

ses recepteurs chez la truie (Houde et ah, 2008) et certains alleles sont associes a des

caracteres de reproduction favorables tels que 1'augmentation de la taille de portee et la

diminution de l'intervalle sevrage-oestrus. II serait done interessant de verifier si les truies

hyper- et hypo-prolifiques, utilisees dans notre etude, presentent aussi ces polymorphismes et

s'il existe un lien entre les differents alleles et les niveaux d'expression observes.

Puisque l'adiponectine est reconnue pour ses proprietes anti-inflammatoires, une analyse de la

modulation de l'expression de cytokines pro- et anti-inflammatoires dans des cultures de

cellules endometrials primaires porcines, traitees ou non a l'adiponectine recombinante, nous

permettrait de verifier si l'implication de l'adiponectine en debut de gestation est liee a la

repression du systeme immunitaire, necessaire pour eviter le rejet des embryons. Finalement,

comme il est bien connu que differents ratios des isoformes de l'adiponectine (globulaire,

trimere, hexamere et multimere de haut poids moleculaire) peuvent avoir des effets

physiologiques differents, il serait interessant de verifier les resultats obtenus en utilisant

differents ratios de ces isoformes.

Bref, ces nouvelles informations concernant les effets de l'adiponectine sur la reproduction

chez la truie ouvrent de nombreuses portes pour des projets de recherche futurs.

58

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