Norovirus và phát hiện Norovirus bằng kỹ thuật Timerealtime-PCR

8/12/2019 Norovirus và phát hiện Norovirus bằng kỹ thuật Timerealtime-PCR

http://slidepdf.com/reader/full/norovirus-va-phat-hien-norovirus-bang-ky-thuat-timerealtime-pcr 1/22

Trung Tâm Kiểm nghiệm VSATTP khu vực phía NamLabo Vi sinh thực phẩm

NOROVIRUS VÀPHÁT HIỆN

NOROVIRUS BẰNGKỸ THUẬT

REALTIME-PCR TS.NGUYỄN ĐỖ PHÚC

Phó giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm ATVSTP KV phía nam-Viện Vệ sinh-Y tế công cộng Tp.HCM

TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

Trưởng đơn vị Gene -TT Phòng chống chấn thươngvà các bệnh không lây-Viện VS-YTCC Tp.HCM

Giảng viên trường đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh

Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011

Bệnh tiêu chảy donhiễm Norovirus Phân loại, hình tháihọc và tổ chức bộgen Sự lây truyền, đặcđiểm lâm sàng vàphát sinh bệnh Chẩn đoán Các kỹ thuật sinhhọc phân tử

Phương pháp RT-

PCR

Phương pháp Real-time PCR

Tạo dòng

QUI TRÌNHREALTIME PCR

PHÁT HIỆNNOROVIRUSTRONG NHUYỄNTHỂ HAI MẢNH VỎ

TÀI LIỆU THAMKHẢO



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EIA Enzym ImmunoassayEM Electron microscopyHBGA Histo-blood group antigensIAHA Immune adherence hemagglutination assayIC ImmunochromatographyIEM Immune electron microscopyMCR Multiple Cloning Region.NoV NorovirusORF Open reading framePCR Polymerase chain reactionRdRp RNA-dependent RNA polymeraseRIA RadioimmunoassayRT-PCR Reverse transcription polymerase chain reactionRT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediatedIsothermal AmplificationssRNA single stranded RNAVLPs Virus-like particlesVP Viral coat and capsid Proteins



1

TỔNG QUAN

1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV)

C{c bệnh v ề tiêu chảy l| nguyên nh}n chính của d ịch bệnh v| tử vong ở trẻ em t ại c{c nước đã v| đang ph{t triể n [44,27]. Điều đó được chứng minh ở Ch}uPhi, Ch}u Á v| Mỹ Latinh đã có 744 triệu đế n 1 tỷ trường hợp viêm dạ d|ycấp v| 2 ,4 đế n 3,3 triệu trường hợp tử vong h|ng năm ở trẻ em dưới 5 tuổ i[27,36]. Mặc dù, c{c b{o c{o cho thấ y có ít nhấ t 25 loại vi sinh v ật v| động vậtnguyên sinh có thể g}y ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, trong đó hơn 75% của c{ctrường hợp nguyên nh}n l| do c{c virus, v| 7 nhóm virus thường g}y tiêuchảy l| Rotavirus, Norovirus, Sapovirus, Adenovirus, Astrovirus,Parechovirus, v| Aichivirus được coi l| c{c t{c nh}n chính v|phổ biế n của bệnh viêm dạ d|y ruột cấ p ở người [44,28,29]. Noroviruses (NoVs) được ph{t hiện l ần đầutiên bởi Kapikian v| cộng sự v|o năm 1972 [11] dưới kính hiển vi điện tử (EM). Trướcđ}y, c{c virus được kí hiệu l| “Norwalk-likeviruses”. Chủng nguyên thủy của NoV l|virus Norwalk, chúng được ph{t hiện từ một đợt bùng ph{t viêm dạ d|y ruột cấ p

tính tại một trường tiể u học ở Norwalk,Ohio năm 1968 [11]. NoVs l| th|nh viên củachi Norovirus , cùng với chi Sapovirus trong h ọ Caliciviridae [6]. C{c virus n|y thường nh ỏ v| không có m|ng bao quanh, sRNA(+), với đường k ính khoảng 27-35 nm.

NoV được coi l| nguyên nh}n chính g}y viêm dạ d|y ruột cấp tính ở trẻ em v|người lớn. Bệnh do NoV thường xảy ra v| tìm thấ y ở c{c nơi kh{c nhau: nh|h|ng, trường học, c{c trung t}m chăm sócsức khỏe, bệnh vi ện, nh| điều

dưỡng, v| t|u du l ịch. Hằng năm có hơn 267 triệu nhi ễm do NoV trên to|n thế giới [20, 21,34]. Con đường truy ền chính của virus n|y thường lan truy ền quađường th ực phẩm, đường nước, không khí, v| lan truyền từ người sang người[7,17,22].

2. Phân loại, hình thái học và tổ chức bộgen

Trước đ}y, việc ph{t hiện l}y nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV g}y bệnh ở người nhưng không sinh sản v| ph{t triển được trong c{c nuôi cấ y tế b|o, v| cũng không có động vật thí nghiệm n|o thích hợp cho s ự g}y nhiễmNoV. T ạo dòng của bộ gen virus Norwalk được thực hiện năm 1990 đã dẫn

Hình 1.1: Norovirus dưới kính hiển vi điện tử



2

đế n sự tiế n bộ đ{ng kể trong s ự hiể u biế t v ề virus h ọc ph}n tử v| dịch tễ họccủa NoVs [41]. G ần đ}y, c{c phương ph{p chẩn đo{n ph}n tử nhạy cảm dựatrên phản ứng RT- PCR v| c{c kỹ thu ật giải trình tự bộ gen để ph{t hiện v| môtả đặc điểm NoV đã n}ng cao thêm sự hiể u biế t của chúng ta về d ịch tễ họccủa sự l}y nhiễm NoV [42]. Nh ững k ỹ thu ật n|y đã chứng minh r ằng c{c virusNoV có tính di truyền v| đa dạng v ề kh{ng nguyên [43]. Dựa v|o trình tự giố ngnhau v| ph}n tích ph{t sinh chủng lo|i, NoVs có thể được ph}n loại theonhóm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) v| cụm gen (genocluster). Hi ệnnay, NoVs được ph}n loại th|nh năm nhóm gen kh{c nhau: GI đế n GV [6,30]. NoVs ở người thu ộc GI, GII v| GIV, nhưng hầu hết c{c chủng g}y bệnh ở người thuộc đều thu ộc nhóm genGI và GII. NoVs GIII v| GV cho đến nay đãđược tìm thấ y ở lo|i bò v| c{c lo|i chuột. Trong c{c nhóm gen (genogroups),

NoVs được chia tiếp th|nh c{c kiể u gen (genotypes), trong s ố đó có ít nhấ t 29kiể u g en đã được b{o c{o. Hiện nay nhóm gen GI được chia th|nh t{m kiugen (GI/1 đế n GI/8), GII bao g ồm ít nhấ t 17 kiểu gen (GII/1 đế n GII/17), GIII cóhai kiể u gen (GIII/1- GIII/2) v| mỗi GIV v| GV bao gồm một kiể u gen [43].

C{c ph}n tích về trình tự to|n bộ chi ều d|i bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng c{cchủng virus trong m ột nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng v ề nucleotide, trong khi c{c chủng trong c{c nhóm gen kh{c chỉ chiế m 51-56% sự tương đồng. Ngo|i ra, sự ph}n loại dựa trên trình tự nucleotide c ủa gen choprotein v ỏ capsid cho th ấ y rằng c{c trình tự chệch nhau b ởi 60% giữa c{cgenogroups v| 20- 30% giữa c{c genotypes. Trong cùng genocluster, trình tự vỏ capsid c ủa virus thường rấ t giố ng nhau [5].

Thông qua việc gi{m s{td ịch tễ của NoV trên thế giới đã cho thấy vai trò chủ yế u của những chủng có nhómgen GII, đặc biệt l| những chủng có kiể u genGII/4 chiếm ưu thế l| nguyên nh}n của c{c vụ d ịch (hiện tại ước tính khoảng ~80% của tấ t cả c{c trường hợp l}y nhiễm), v| có c{c biế n thể GII/4 mới xuấ thiện mỗi 1-2 năm. Dường như sự tăng lên thường xuyên của biế n thể GII/4mới đã tiế p di ễn trong năm qua, v| trở th|nh một hiện tượng to|n cầu [31,32].Mặc dù dịch bệnh NoVđược b{o c{o quanh năm,nhưng đỉnh điể m của việc bùng ph{t dịch l| trongmùa đông [1].

NoVs l| th|nh viên củachi Norovirus , trong h ọ Caliciviridae. Hạt Virion

NoV được tạo th|nh bởi



3

cấu trúc đơn của vỏ capsid, v ới khố i 20 mặt đố i xứng. B ề mặt điển hình củahạt virus mang hình d{ng lõm của c{i t{ch. Vỏ capsid g ồm có 90 dimer củamột protein v ỏ đơn , có trọng lượng ph}n tử l| 58 kD.

Bộ gen của NoV bao g ồm m ạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nucleotidecủa sRNA. Bộ gen được chia th|nh 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, v| ORF3).ORF1 mã hóa cho một polyprotein được t{ch ra từ enzym th ủy ph}n protein,tạo th|nh NTPase, protease, v| RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp).ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1, v| ORF3 mã hóa một protein VP2cơ bản nhỏ chưa biế t chức năng [6].

3. Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và phát sinh bệnh

C{c NoV thường l| nguyên nh}n phổ biế n của c{c bệnh viêm dạ d|y ruột cấ pở h ầu hết c{c nhóm tuổi. Nhìn chung, c{c NoV GII l| chủng ph ổ biế n nh ấ tđược b{o c{o trong c{c vụ d ịch trên to|n thế giới [17]. Sự lan truy ền ph ổ biến l|thông qua thức ăn, nước v| môi trường b ị ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người vớingười, trong không khí, v| có thể do m ột số phương thức kh{c chưa biết. C{c

NoV được tìm thấ y trong m ẫu ph}n v| mẫu nôn của một người bị nhiễm bệnh.

Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen NoV

Hình 1.2: Cấu trúc của NoV



4

Có ít nhất 2 nh}n tố góp phần v|o khả năng bùng ph{t dịch bệnh của virus.Thứ nhất, virus l}y nhiễm rất cao v| chỉ một lượng nh ỏ , khoảng 10-100 h ạtvirion, l| đủ để g}y bệnh. Th ứ hai, virus tương đố i b ền trong môi trường, vídụ khả năng chố ng ch ịu đóng băng, nhiệt độ đế n 60 0C, khử khu ẩ n với chlore,

điều kiện acid, gi ấ m , rượu, c{c dung dịch khử trùng tay, v| nồng độ đườngcao [4,38]. Giai đoạn ủ bệnh trung bình của vius ng ắn (12-48h ), nhưng sự ph{tt{n của virus được ph{t hiện ba tu ần sau khi xu ấ t hiện c{c triệu chứng, tạo cơhội để mở rộng ph ạm vi ph{t t{n của virus sang c{cvật chủ kh{c [35]. Hiện nayviệc phòng ngừa v| khố ng chế c{c vụ d ịch của NoV l| dựa v|o việc x{c địnhc{c phương thức truy ền nhi ễm; sự lan truy ền bệnh được cắt đứt bằng việckiểm so{t sự ô nhiễm của thực ph ẩm v| nguồn nước, duy trì vệ sinh c{ nh}n ,v| l|m giảm sự truy ền bệnh từ người sang người.

Triệu chứng nhi ễm NoV có thể có nôn mửa hoặc tiêu chảy, ph ổ biến l| đauquặn, v| đôi khi có sốt. Ph}n tiêu chảy thường không có m{u, thiế u chấ t nhờn,thể lỏng v| có nước. C{c triệu chứng thường kéo d|i khoảng 24-60h [13]. C{ccuộc nghiên cứu trên người tình nguyện cho th ấ y rằng có đến 30% c{c trườnghợp nhi ễm trùng m| không có triệu chứng n|o. Không có c{c điều tr ị kh{ngvirus đặc hiệu, cũng như không có vaccine để ngăn ngừa bệnh [6]. Điều tr ị ch ỉ tập trung v|o chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt l| ngăn ngừa v| điều tr ị mất nước.Những người không thể duy trì sự chố ng m ất nước, đặc biệt l| trẻ em v|người cao tu ổi, có nguy cơ mất nước rấ t cao, d ẫn đế n rố i loạn sự điện giải v|có thể ph ải nhập viện. C{c biế n chứng từ nhiễm NoV có thể thường th ấ y ở trẻ sơ sinh v| người cao tu ổi. Tuy nhiên, dữ liệu m ới cho th ấ y rằng c{c dấ u hi ệuv| c{c biế n chứng l}m s|ng bất thường từ sự l}y nhiễm NoV có thể xảy ra ở những người suy gi ảm miễn d ịch v| căng thẳng tinh th ần [14].

Do không có khả năng nuôi NoV ở người, nên hầu hết c{c dữ liệu v ề bệnh họcv| miễn d ịch học đều thu được từ c{c cuộc nghiên cứu trên những người tìnhnguy ện. C{c nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh b ị nhiễmvirus cho th ấ y sự nhiễm trùng chính thường xảy ra ở ph ần dưới của ru ột nonvới sự dãn nỡ của lông nhung v|sự co ngắn của vi lông nhung [44]. Những vế tviêm loét của niêm mạc ph{t triển sau đó, kế t quả cuối cùng l| dẫn đến tiêuchảy. Nhi ễm trùng do NoV kích thích cơ thể sinh ra kh{ng thể IgG, IgA đặchiệu v| kh{ng thể IgM trong huy ế t thanh, ngay c ả khi đã có sự phơi nhiễmtrước đó. Hầu hết c{c bệnh nh}n đều có sự đề kh{ng với sự t{i l}y nhiễmtrong kho ảng 4 - 6 th{ng. Tuy nhiên, không có sự miễn d ịch l}u d|i [44].

Nghiên cứu ban đầu trong c{c nhóm tình nguyện đã chứng minh r ằng kho ảng30% trường hợp nhi ễm bệnh m| không có triệu chứng đi kèm v| có khoảng50% dẫn đế n bệnh [33,45]. G ần đ}y, nghiên cứu cho th ấ y rằng nh ững người



5

nhiễm bệnh NoV ph ụ thuộc v|o sự hiện diện của c{c thụ thể kh{ng nguyênnhóm m{u histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong ống tiêu hóa[18]. HBGAs ở người l| phức hợp c{c carbohydrate bao gồm một oligosaccharide liên kế t vớiprotein ho ặc lipid trên niêm mạc biểu mô của hệ hô hấ p, sinh d ục, v| ống tiêuhóa, hoặc như c{c oligosaccharide tự do t rong c{c dịch sinh h ọc như nước bọt[23]. Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO , Lewis, v| họ secretor) đã cho thấy có sự liên quan đế n việc nhận diện NoV. S ự phố i hợp của liên kết đặc hiệu chủng v| biể u hi ện biến đổi trên thụ thể HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm của ngườinhiễm kh{c nhau được theo dõi trong c{c vụ d ịch NoV v| trong c{c nghiêncứu ở người tình nguyện [9,39].

4. Chẩn đoán

Có nhiều phương ph{p thích hợp để chẩn đo{n bệnh nhi ễm NoV. Nh ữngphương ph{p n|y bao gồm hiển vi điện tử trực tiế p (EM), hi ển vi điện tử miễnd ịch (IEM), th ử nghi ệm ngưng kế t h ồng c ầu miễn d ịch (IAHA), th ử nghi ệmmiễn d ịch phóng xạ (RIA), thử nghi ệm miễn d ịch enzym (EIA), th ử nghi ệmsắc ký miễn d ịch (IC), RT-PCR, real- time PCR, v| giải trình tự nucleic acid.Trong s ố những phương ph{p n|y thì RT-PCR, real-time PCR v| giải trình tự nucleic acid được sử dụng rộng rãi để ph{t hiện v| x{c định ki ể u gen c ủa NoV[15,28,25,42]. C{c kỹ thu ật n|y đã thay thế c{c thử nghi ệm mi ễn d ịch truy ền thố ng

v| trở th|nh tiêu chuẩn v|ng cho chẩn đo{n nhiễm tr ùng NoV trong thập kỷ qua.

Các kỹ thu ật thông thường . Vì NoV ở người không thể ph{t triển trên môitrường nuôi cấ y tế b|o, chẩn đo{n ban đầu viêm dạ d|y ruột liên quan đế n sự nhiễm NoV được dựa v|o quan s{t trực tiế p bằng c{ch sử dụng EM [11]. Vì kỹ thu ật n|y ph{t hiện một lượng virus > 10 6/ml trong d ịch huy ền phù ph}n, nóchỉ có thể th|nh công khi {p dụng trong giai đoạn sớm của bệnh [38]. Trong khic{c hạt virus n|y có thể được quan s{t trong mẫu lọc của ph}n tiêu chảy ở giai

đoạn rấ t sớ

m, quans{t đượ

c tăng cườ

ng bằng k

ỹ thu

ật IEM v

ới huy

ế t thanh

miễn d ịch thêm v|o. Trong kỹ thu ật n|y, huyế t thanh mi ễn d ịch được sử dụngđể n}ng cao sự ph{t hiện virus b ởi sự ngưng kế t của c{c hạt virus trong d ịchhuy ền phù ph}n. Sự kế t cụm virus x ảy ra trong s ự hiện diện của kh{ng thể đặc hiệu có thể ph{t hiện v| cải thiện kh ả năng chẩn đo{n đặc hiệu. Tuynhiên, kỹ thu ật n|y chỉ được sử dụng cho c{c mẫu ph}n thu nhận trong giaiđoạn đầu của bệnh [19].

Thử nghi ệm ngưng kế t h ồng c ầu miễn d ịch (IAHA) v| RIA đang được ph{ttriển. IAHA l| thử nghi ệm để đ{nh gi{ nồng độ kh{ng thể NoV trong m ộtlượng lớn huy ết thanh vì thế c{c nghiên cứu d ịch tễ học v ề huy ết thanh có thể



6

được thực hiện bằng th ử nghi ệm n|y [12]. Những h ạt virus được l|m sạch từ mẫu ph}n có thể được dùng như một kh{ng nguyên, v| tương t{c của ph ứchợp giữa kh{ng nguyên/kh{ng thể được ph{t hiện bởi sự ngưng kế t h ồng c ầunhóm m{u O ở người. Mặc dù thử nghi ệm có lợi thế l| đòi hỏi kh{ng nguyênít hơn, nó nhanh chóng được thay th ế bằng RIA. RIA đã được ph{t triển nhưl| một phương ph{p thay thế cho IEM để ph{t hiện kh{ng nguyên NoV trongc{c mẫu ph}n [8].

Các kỹ thu ật phân tử: Sau th|nh công về tạo dòng v| giải trình tự bộ genvirus Norwalk (NoV), th ử nghi ệm RT- PCR được ph{t triển để ph{t hiện NoVtrong c ả mẫu bệnh ph ẩm v| mẫu môi trường trong hai th ập kỷ qua. Ứng d ụngRT-PCR v| c{c kỹ thu ật giải trình tự cDNA để ph{t hiện v| mô tả đặc điể m ditruy ền NoV đã tăng cường đ{ng kể sự hiể u biế t của chúng ta về d ịch tễ học

của bệnh nhi ễm NoV [30,39,42]. G ần đ}y, RT-PCR được sử dụng rộng rãi như một công cụ để chẩn đo{n bệnhnhiễm NoV. M ột bước ngoặt đ{ng tin cậy nh ấ t cho ch ẩn đo{n nhiễm NoV l|sự hiện diện RNA c ủa NoV trong c{c mẫu ph}n. Do đó, c{c mẫu được lựachọn l| mẫu ph}n từ bệnh nh}n bị tiêu chảy. Để tạo điều kiện cho vi ệc ph}ntích ph}n tử RNA của NoV, khu ếch đại bộ gen RNA c ủa chúng v| trình tự củasản ph ẩ m khu ếch đại phải được thực hiện. Thêm v|o đó, c{c kỹ thu ật ph}n tử kh{c như l| PCR-miễn d ịch, RT- LAMP v| real-time-PCR, nh ững kỹ thu ật đó

nhanh v| nhạy hơn phương ph{p RT-PCR chu ẩ n, g ần đ}y c{c phương ph{preal-time RT-PCR đã được ph{t triển để ph{t hiện nhanh NoV trong m ột số lượng lớn c{c mẫu ph}n v| mẫu hải sản trong su ốt mùa dịch bệnh v| c{c vụ d ịch của NoV [10,40] .

Trong nh ững năm gần đ}y, baculovirus đã biể u hiện protein v ỏ NoV v| nóđược khai th{c để tạo hạt giố ng virus (VLPs). Nh ững VLPs n|y sau đó biể uhiện hình th{i v| kh{ng nguyên giố ng với c{c hạt virus nguyên thể. C{c VLPsrấ t hữu ích cho việc tạo miễn d ịch của nhi ều lo|i động vật kh{c nhau(chuột,

chuột lang , v| thỏ) để sản xuấ t sản ph ẩ m huy ế t thanh mi ễn d ịch đa v| đơndòng v| sau đó có thể được sử dụng để thiế t lập c{c thử nghi ệm chẩn đo{n cơ bản EIA như thử nghi ệm ELISA v| thử nghi ệm IC [37]. Một số bộ kít ELISAdùng để ph{t hiện NoV trong c{c mẫu ph}n đã được ph{t triển v| thương mihóa. Mặc dù c{c mẫu ph}n có thể được thử nghi ệm trực tiế p bằng nh ững bộ kít ELISA m| không cần bước tinh ch ế v| cô đặc qu{ phức tạp, độ nhạy củaphương ph{p ELISA thì thấp hơn nhiều so v ới phương ph{p RT-PCR [3,2,16]. Độ nhạy thấp l| hạn chế của phương ph{p ELISA, điều đó l|m cho nó không phùhợp cho vi ệc ph{t hiện trực tiếp NoV trong c{c mẫu ph}n , mẫu hải sản m|không có sự cải thiện độ nhạy. G ần đ}y , thử nghi ệm ph{t hiện nhanh b ằng bộ



7

kít IC cũng đã trở th|nh thương mại hóa, có sẵn để ph{t hiện NoV. B ộ kít ICn|y đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với c{c thử nghi ệm bằng ELISA.Tuy nhiên, hạn chế của c{c thử nghi ệm chẩn đo{n EIA cơ bản để ph{t hiệnNoV l| chỉ có kiểu gen NoV m| c{c kh{ng thể đơn dòng đặc hiệu có thể đượcph{thiện.

5. Các kỹ thuật sinh học phân tử

5.1 Ph ương pháp RT -PCR

L| phương ph{p PCR m| nucleic acid đích cần ph ải ph{t hiện l| RNA. Để cóthể thực hiện được PCR n|y thì trước hết RNA đích phải được phiên mãngược (RT-reverse transcription) th|nh cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khu ếch đại trình tự đích trongcDNA b ằng cặp m ồi đặc hiệu cho trình tự n|y.Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT r ồi mới đến PCR, nên kỹ thu ật n|y đượcgọi l| kỹ thu ật RT-PCR. K ỹ thu ật RT-PCR g ồm hai giai đoạn:

− Giai đoạn phiên mã ngược: (RT) l| một giai đoạn hế t sức quan tr ọng quy ế tđịnh sự th|nh công của RT-PCR. Enzym được sử dụng trong giai đoạn n|y l|Reverse transcriptase. M ồi sử dụng trong giai đoạn n|y l| mồi “ngược” củaPCR giai đoạn sau, có thể l| oligonucleotic oligodT (để bắt cặp với đuôi poly Acủa c{c mRNA), hoặc cũng có thể l| một m ồi ngẫu nhiên (random primer) có bản chất l| một hexan nucleotide b ắt cặp ng ẫu nhiên với một trình tự ngắntrên mRNA. − Giai đoạn khu ếch đại: l| phản ứng PCR v ới c{c cặp m ồi đặc hiệu khu ế chđại theo c ấ p số nh}n c{c cDNA nhờ Taq polymerase.5.2 Real – time PCR

Real-time PCR l|một phương ph{p kiểm so{t lượng hu ỳnh quang gi ải phóngra trong ph ản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản ph ẩ m PCR trong t ừng chukỳ của qu{ trình khuếch đại, tr{i ngược với PCR truy ền thố ng ch ỉ biết được

lượng sản ph ẩ m khu ếch đại ở thời điể m cuối cùng của ph ản ứng khu ếch đại.Real-time PCR l| một ph ản ứng động, cho phép ph{t hiện "hu ỳnh quang ph{tra nh ờ sự khu ếch đại của sản ph ẩ m PCR”. Tại mỗi chu k ỳ của ph ản ứng PCR.Ph}n tích kế t qu ả m| không cần qua bước điện di trên gel như phản ứng PCRtruy ền thố ng. Kế t quả được ph}n tích thông qua tín hiệu hu ỳnh quang ph{t ratheo th ời gian t ại mỗi chu k ỳ phản ứng PCR. K ỹ thu ật Real- time PCR cũngqua hai bước giố ng RT-PCR: t ạo cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thựchiện ph ản ứng real-time PCR.



8

5.3 T ạo dòng

Mục đích của việc tạo dòng l| nhằm thu được một lượng lớn bản sao c ủa mộttrình tự DNA x{c định. Chính x{c hơn, tạo dòng chính l| chọn lọc trong m ộtthư viện gen dòng visinh v ật t{i tổ hợp c ần tìm – tức tập hợp vi sinh v ật cùng bắt ngu ồn từ một tế b|o visinh v ật ban đầu có mang vector t{i tổ hợp c ần tìm.

Vector thường được sử dụng l| một plasmid thu ộc thế hệ thứ 3 pGEM-T easy. Đặc điể m của vector pGEM - T easy

- Đầ u thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩ m PCR: pGEM-T Easy vectorđược thiế t kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu. T- nhô ra ở v ị trí gắntăng hiệu qu ả của qu{ trình gắn sản ph ẩ m PCR b ằng c{ch ngăn chặnviệc tự gắn vòng vector v| cung cấ p một đầu T tương thích với đầu A

của sản ph ẩm PCR đã được tạo ra bởi c{cenzym t ổ ng hợp.- Lự a chọn các thể biế n nạ p Xanh/ Trắ ng: pGEM- T Easy l| vector có số lượng

bản copy cao, ch ứa c{c promoter T7 v| SP6 RNA polymerase nằm cạnhvùng MCR (Multiple Cloning Region), bên trong đoạn mã cho α-peptite v|đoạn mã choenzym β-galactosidase. S ự bấ t hoạt do ho ạt động chèn v|o củađoạn α-peptite cho phép x{c định c{c thể chuy ể n nạp hay không chuyể nnạp bằng c{ch s|ng lọc m|u sắc xanh/tr ắng trên đĩa thạch.

- V ị trí enzym giới hạn cho việ c cắt đoạn sản phẩ m gắ n: Vector ch ứa một số lớn v ị trí cắt của enzym gi ới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR. Vị tríMCR của vector pGEM-T Easy n ằm dọc theo c{c vị trí nhận biế t củaenzym EcoRI, BstZI v|NotI, cho phép 3enzym riêng rẽ cắt đoạn chèn.

- Gắn nhanh chóng: Phản ứng gắn có thể được ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệtđộ phòng. Khoảng th ời gian ủ có thể tăng thêm để tăng số lượng khu ẩ nlạc được biế n nạp.

Hình 1.4. Promoter và trình tự đa nối của vector pGEM-T Easy. Sợi trên chịutrách nhiệm tổng hợp RNA nhờ enzym T7 RNA polymerase. Sợi dưới chịu trách

nhiệm tổng hợp RNA nhờ SP6 RNA polymerase.



9

QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄNTHỂ HAI MẢNH VỎ

1. PHẠM VI ÁP DỤNG

X{c định Norovirus trong th ực phẩ m

2. TÀI LIỆU ÁP DỤNG

Tham kh ảo t|i liệu Narayanan Jothikumar, James A. Lowther, KathleenHenshilwood, David N. Lees, Vincent R.Hill and Fan Vinje, 2004, Rapid andSensitive detection of Norovirus by using Taqman-Based one-step RT-PCRassay and Aplication to naturally contaminated Shellfish samples. Appliedand Environmental. Microbiology, p. 1870-1875, 2004

3. NGUYÊN TẮC

Real-time PCR l| một ph ản ứng động , cho phép ph{t hiện "hu ỳnh quang FAMcho ph{t hiện NoV GI v| huỳnh quang HEX cho ph{t hiện NoV GII nh ờ sự khu ếch đại của sản ph ẩ m PCR”. Tại mỗi chu k ỳ của ph ản ứng Real Time PCR,kế t qu ả được ph}n tích thông qua tín hiệu hu ỳnh quang ph{t ra theo thời giantại mỗi chu k ỳ phản ứng PCR. K ỹ thu ật Real- time PCR qua hai bước: tạo

cDNA, v| sau đó sử dụng cDNA n|y để thực hiện ph ản ứng real-time PCR4. DỤNG CỤ- THIẾT BỊ

4.1 Dụng cụ

- Chai Dural 250ml, 500ml

- Eppendorf 1,5ml, 0,2ml

- Ống nghi ệm 18x150mm

- Túi nylon vô trùng - Pipetteman c{c loại 0,5-1000µl

- Eppendorf c{c loại 0,2-0,5ml

- Kéo, ch|y nhựa sử dụng một l ần- Bình cồn- Muỗng, panh. dao, kéo inox

4.2 Thi ế t b ị - C}n ph}n tích



10

- M{y vortex- M{y ủ nhiệt khô- M{y dập mẫu.

- Tủ cấy vô trùng- M{y trộn mẫu

- Tủ cấy vô trùng (Lab hood)

- M{y Vortex

- M{y ly t}m eppendorf

- M{y PCR

- M{y Real Time PCR - Bộ dụng cụ điện di

- M{y chụp UV

- M{y l|m khô 5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT

5.1 Bộ hóa chất tách chiết RNA toàn phần NKRNAPREP

Phương ph{p t{ch chiết thô RNA to|n phần {p dụng cho h ầu hết c{c mẫu thử ,c{c mục đích sử dụng vì đ}y l| phương ph{p rấ t hiệu qu ả cho tấ t cả c{c loạiRNA từ virus, vi khu ẩ n, nấm men,… mẫu th ử có thể l| c{c canh cấ y tế b|o cónh}n hay mô nghiền, vi khu ẩn hay virus trong c{c dịch sinh h ọc như m{u,huy ế t thanh, huy ết tương v| c{c dịch kh{c.

Bộ thuố c thử NKRNAPREP do công ty Nam Khoa cung cấ p. Bộ thuố c thử baog ồm c{c th|nh phần đủ để t{ch chiế t RNA.

Tên thuố c thử Th|nh phần Điều kiện bảo quản

R1RNAPREP Guanidine, ure, phenol, ch ấ t tẩ y 4oC/tố iR2RNAPREP Chloroform 4 oC/tố iR3RNAPREP Isopropanol 4oC/tố iR4RNAPREP Ethanol 75% 4 oC/tố iR5RNAPREP Nước tinh s ạch xử lý DEPC 4oC/tố iTube Tube eppendorf 1.5ml T oPTN

5.2 Bộ hóa chất dùng tổng h ợp cDNA NK



12

Probe: Probe để ph{t hiện NoV GI có đầu gắn hu ỳnh quang FAM v|probe để ph{t hiện NoV GII có đầu g ằn hu ỳnh quang HEX, có trình tự sau:

5.5 Bộ kít Real Time PCR

Thành phầ n Real Time PCR-mix phát hiện Norovirus GI và GII

Tên thuốc thửNồng độ cho 1Real Time PCR

mix

Thể tích phải lấy cho20 Real Time PCR mix

20µl/mix PCR master mix 2X 1x 500µlMồi GI JJ-V1 F (100µM) 12pm 2,4µlMồi JJ-V1 R (100µM) 12pm 2,4µl

JJ V1- Probe (100µM) 5pm 1µlMồi GII JJ-V2 F (100µM) 12pm 2,4µlMồi CO-G2 R (100µM) 12pm 2,4µlRIN-G2- Probe ( 100µM) 5pm 1µlMgCl 2 (50mM) 3,5µM 70µldNTP (100mM) 0,2mM 2µlmiliQ water 219,3µlTổng cộng 800 µl

Chu trình nhiệt chạy Real Time PCR:: 1 chu kỳ 960C trong 3 phút, tiếp theo l|40 chu kỳ ở 950C trong 15 gi}y , 600C trong 1 phút v| chụp Real Time.

6. QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM

6.1 Chu ẩ n b ị cDNA t ừ mẫ u nhuy ễ n th ể hai m ả nh v ỏ

Genogroup Oligonucleotide Trình tự (5'- 3') Vị trí

GI JJV1PTGT GGA CAG GAG ATC GCAATC TC 5319 – 5341

GII RING2-PTGG GAG GGC GAT CGC AATCT 5048 – 5067



13

6.1.1 Chu ẩ n b ị mẫu thực phẩm ph{t hiện Norovirus

C{c mẫu được t{ch chiết riêng biệt, số lượng tố i thiể u 10 con/m ẫu, được cắtnhỏ, cho v|o m{y nghiền, dập đều m ẫu để giải phóng hạt virus ra kh ỏi tế b|o.Hút dịch lỏng của mẫu 200µl, cho v|o ố ng eppendorf lo ại 1,5ml v| tiến h|nht{ch chiế t mẫu thu RNA b ằng bộ kít chiết t{ch mẫu NKRNAPREP của Công tyNam Khoa.

6.1.2 T{ch chiết RNA to|n phần bằng bộ thuố c thử NKRNAPREP

Nguyên tắcDựa trên phương ph{p do Chomczynski v| Sacchi s{ng chế. Nguyên tắcdùng guanidine 14M v| ure, phố i hợp với phenol v| chấ t tẩy kh{c để l|m c{cchất g}y biến tính c{c protein, kế t quả l| c{c protein trong mẫu th ử sẽ bị vónlại, DNA s ẽ tan trong pha phenol, còn RNA thì nằm trong phase nước v| sẽ được t{ch khỏi pha phenol nh ờ thêm v|o chloroform v| quay ly t}m lắng t{ch.RNA trong phase nước sau đó sẽ được kế t tủa nhờ isopropanol

Các bước tiến hành- Cho m ẫu v|o một tube eppendorf chèn thật chặt mẫu để có thể tích 0,2ml

- Thêm 200µl nước cất v|o nghiền bằng cố i, vừa nghi ền vừa thêm dần d ịchv|o cho đế n khi t ổ ng th ể tích cả mẫu l| 1ml

- Ly t}m 13.000 RMP/8 phút - Lấy 100µl dịch nổi cho v|o một tube eppendorf m ới

- Thêm v|o một tube eppendorf d ịch mẫu th ử đã chuẩ n b ị trên 300µl R1r ồi l|m thuần nh ấ t mẫu d ịch trong R1 b ằng c{ch dùng pipette hút lên hútxuố ng nhi ều l ần

- Ủ d ịch thu ần nh ấ t ở 30oC trong 10 phút

- Thêm 80µl R2, lắc nhanh v| úp ngửa dung d ịch trong 15 gi}y

- Giữ dung d ịch ở 30oC trong 10 phút - Ly t}m 13000 prm trong 15 phút

- Hút cẩ n th ận 200µl dịch nổi v|o một tube eppendorf m ới tr{nh khônghút pha giữa

- Thêm 200µl R3, úp ngửa 15 gi}y rồi tiế p tục giữ 30oC trong 10 phút

- Hút bỏ ph ần nước nổi, tr{nh không l|m mấ t tủa RNA (nhi ều k hi khôngthấy) đóng trên một bên đ{y tube

- Rửa tủa với 700µl R4 dùng ly t}m 8,000RPM trong 5 phút



14

- Dùng micropipette hay hút ch}n không hút bỏ tấ t cả ph ần nước nổ i- L|m khô tủa ở 55oC trong 10- 15 phút trong m{y ủ nhiệt khô - Cho v|o tủa khô 30l R5

- Giữ ở 55-60oC trong 10 phút 6.1.3 Tổ ng hợp cDNA b ằng bộ thuố c thử NKcDNA synthesis

Nguyên tắcPhương ph{p n|y sử dụng m ồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamerprimers) m| không cần dùng mồi đặc hiệu để tổ ng h ợp to|n bộ RNA từ mẫuthử th|nh cDNA từ RNA nh ờ men Reverse T ranscriptase. Ngo|i ra trong hệ thố ng ph ản ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ RNA b ị bắt cặp v|o cDNA sau

khi phiên mã ngược th|nh cDNA.

Nguyên tắc phiên mã ngược tổ ng hợp cDNA

Các bước tiến hành Cho 40µl mẫu t{ch chiết RNA v|o tube PCR có chứa sẵn 3µlNKRTmixđang ng}m trong đ{

Thực hiện tổ ng h ợp cDNA trong m{y lu}n nhiệt theo chương trình nhưsau: 5 phút: 25oC, 30 phút: 42oC, 5 phút: 85oC, Giữ 4oC

6.2 Chu trình nhiệt Real Time PCR phát hiện Norovirus GI và GII Sử dụng 5µl mẫu cDNA cho v|o 20 µl Real Time PCR mix v| tiế p tục chạy

Real Time PCR trên m{y Bio Rad, với chu trình nhiệt như sau:- 3 phút 94oC



15

Chạy 40 chu k ỳ - 15 gi}y 96oC- 60 gi}y 60oC

Chụp Real Time

- Giữ 4oC2.7. BIỂU THỊ KẾT QUẢ

Kế t quả ph}n tích dựa trên kế t quả Ct chứng dương v| chứng }m, từ đó suy rakế t quả của mẫu:

Ct

Kết quả dương tính với NoV khi Ct trên chu kỳ ngưỡng



16

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Buesa, J., et al., Sequential evolution of genotype GII.4 norovirus variantscausing gastroenteritis outbreaks from 2001 to 2006 in Eastern Spain, J. Med.Virol., 80, 1288, 2008.

2. Burin, E., et al., Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA orRT-PCR, J. Virol. Methods,137, 259, 2006.

3. Burton-MacLeod, J. A., et al., Evaluation and comparison of two commercialenzym-linked immunosorbent assay kíts for detection of antigenically diversehuman noroviruses in stool samples, J. Clin. Microbiol.,42, 2587, 2004.

4. Caul, E. O., Small round structured viruses: Airborne transmission andhospital control, Lancet, 343, 1240, 1994.

5. Donaldson, E. F., et al., Norovirus pathogensis : Mechanisms of persistenceand immune evasion in human populations, Immunol. Rev., 225, 190, 2008.

6. Green, Y. K., Caliciviridae: The noroviruses, Chapter 28 in Fields Virology , eds.B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (Wolters KluwerHealth/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2007).

7. Galllimore, C. I., et al., Multiple norovirus genotypes characterised from anoyster-associated outbreak of gastroenteritis, Int, J.Food. Microbiol., 103, 323,2005.

8.

Greenberg, H. B., and Kapikian, A. Z., Detection of Norwalk agent antibodyand antigen by solid-phage radioimmunoassay and immune adherencehemagglutination assay, J. Am. Vet. Med. Assoc.,173, 620, 1978.

9. Huang, P., et al., Norovirus and histo-blood group antigens: Demonstrationof a wide spectrum of strain specificities and classification of two major binding groups among multiple binding patterns, J. Virol., 79, 6714, 2005.

10. Kageyama, T., et al., Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR, J. Clin.

Microbiol.,41, 1548, 2003.11. Kapikian, A. Z., et al., Visualization by immune electron microscopy of a 27-

nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis, J.Virol., 10, 1075, 1972.

12. Kapikian,., et al., Prevalence of antibody to the Norwalk agent by a newlydeveloped immune adherence hemagglutination assay, J. Med. Virol., 2, 281,1978.

13. Kaplan, J. E., et al., The frequency of a Norwalk-like pattern of illness inoutbreaks of acute gastroenteritis, Am. J. Public. Health , 72, 1329, 2982.

14. Kaufman, S. S., et al., Calicivirus enteritis in an intestinal transplant recipient, Am. J. Transplant., 3, 764, 2003.



17

15. Khamrin, P. et al., Gentic diversity of noroviruses and sapoviruses in childrenhospitalized with acute gastroenteritis in Chiang Mai, Thailand, J. Med. Virol.,79, 1921, 2007.

16. Khamrin, P., et al., Evaluation of immunochromatography and commercialenzym-linked immunosorbent assay for rapid detection of norovirus antigenin stool samples, J. Virol. Methods,147, 360, 2008.

17. Lopman, B., et al., Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe andepidemic spread of new norovirus variants, Lancet, 363, 682, 2004.

18. Lindesmith, L., et al., Human susceptibility and resistance to Norwalk virusinfection, Nat. Med., 9, 548, 2003.

19. Lewis, D. C., Three serotypes of Norwalk-like virus demonstrated by solid-phase immune electron microscopy, J. Med. Virol.,30, 77, 1990.

20. McEvoy, M., et al., An outbreak of viral gastroenteritis on a cruise ship,Commun. Dis. Rep. CDR. Rev., 6, 188, 1996.

21. McIntyre, L., et al., Gastrointestinal outbreaks asscociated with Norwalk virusin restaurants in Vancouver, British Columbia, Can. Commun. Dis. Rep., 28,197, 2002.

22. Marks, P. J., et al., Evidence for airbone transmission of Norwalk-like (NLV)in a hotel restaurant, Epidemiol. Infect., 120, 481, 2000.

23. Marionneau, S., et al., ABH and Lewis histo-blood group antigens, a modelfor the meaning of oligosaccharide diversity in the face of a changing world,Biochimie,83, 565, 2001.

24. Marina Hoehne and Eckart Schreier, 2006, Detection of Norovirus genogroupI and II by multiplex real time RT- PCR using a 3’-minor groove binder-DNAprobe. BMC infection deseases, 69, 2006.

25. Nguyen, T. A., et al., Diversity of viruses associated with acute gastroenteritisin children hospitalized with diarrhea in Ho Chi Minh City, Vietnam, J. Med.Virol., 79, 582, 2007.

26. Narayanan Jothikumar, James A. Lowther, Kathleen Henshilwood, David N.

Lees, Vincent R.Hill and Fan Vinje, 2004, Rapid and Sensitive detection ofNorovirus by using Taqman-Based one-step RT-PCR assay and Aplication tonaturally contaminated Shellfish samples. Applied and Environmental.Microbiology, p. 1870-1875, 2004.

27. Okítsu-negishi, S., el al., Molecular epidemiology of viral gastroenteritis inAsia, Pediarr. Int., 46, 245, 2004.

28. Phan, T. G., et al., Viral diarrhea in Japanese children : Results from a one-year epidemiologic study, Clin. Lab., 52, 183, 2005.

29. Pham, N. T., et al., Isolation and molecular characterization of Aichi virusesfrom fecal specimens collected in Japan, Bangladesh, Thailand, and Vietnam,



18

J. Clin. Microbiol.,45, 2287, 2007.30. Phan, T. G., et al., Gentic heterogenity, evolution and recombination in

noroviruses, J. Med. Virol., 79, 1388, 2007.31. Patel, M. M., et al., Systematic literature review of role of noroviruses in

sporadic gastroenteritis, Emerg. Infect. Dis., 14, 1224, 2008.32. Patel, M. M., et al., Noroviruses : A comprehensive review, J. Clin. Virol., 44, 1,

2009.33. Parrino, T. A., et al., Clinical immunity in acute gastroenteritis caused by

Norwalk agent, N. Engl. J. Med., 297, 86, 1977.34. Russo, P. L., et al., Hospital outbreak of Norwalk-like virus, Infect. Control

Hosp.Eepidemiol.18, 5671997.35. Rockx, B., et al., Natural history of human calicivirus infection: A prospective

cohort study, Clin. Infect. Dis., 35, 246, 2002. 36. Santos, N., and Hoshino, Y., Global distribution of rotavirusserotypes/genotypes and tis implication for the development andimplementation of an effective rotavirus vaccine, Rev. Med. Virol., 15, 29, 2005.

37. Shiota, T., et al., Characterization of a broadly reactive monoclonal antibodyagainst norovirus genogroups I and II: Recognition of a novel conformationalepitope, J. Virol., 81, 12298, 2007.

38. Thornton, A. C., Jennings-Conklin, K. S., and McCormick, M. I., Noroviruses:Agents in outbreaks of acute gastroenteritis, Disaster Manag. Response, 2, 4,2004.

39. Tan, M., et al., Conversation of carbohydrate binding interfaces: Evidence ofhuman HBGA selection in norovirus evolution, PLoS One, 4, 1, 2009.

40. Tian, P., and Mandrell, R., Detection of norovirus capsid proteins in faecaland food samples by a real time immune-PCR method, J. Appl. Microbiol.,100, 564, 2006.

41. Xi, J. N. et al., Norwalk virus genome cloning and character-ization, Science ,250, 1580, 1990.

42. Yan, H., et al., Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus infecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR, J. Virol.

Methods, 114, 37, 2003.43. Zeng, D. P., et al., Norovirus classification and proposed strain nomenclature,

Virology, 346, 312, 2006.44. Wilhelmi, L., Roman, E., and Sanschez-Fauquier, A., Viruses causing

gastroenteritis, Clin. Microbiol. Infect.,9, 247, 2003.45. Wyatt, R. G., et al., Comparison of three agents of acute infectious

nonbacterial gastroenteritis by cross-challenge in volunteers, J. Infect. Dis.,129, 709, 1974.



19

Quantitative Polymerase Chain Reaction: TaqMan®Probe Detection

(1) Nucleotide(Probe) coupled with

fluorescencedye and quencher

(2) Polymerasewith exonucleaseactivity

(3) Reporter dyeis cleaved

Norovirus và phát hiện Norovirus bằng kỹ thuật Timerealtime-PCR

Documents

Transcript of Norovirus và phát hiện Norovirus bằng kỹ thuật Timerealtime-PCR