NMR struktur av UbcH5b

Tiopurinmetyltransferas - TPMT

TPMT

Dipolära kopplingar

Individuella magnetiska moment skapar magnetiska fält. Dessa påverkar magnetiska fält som skapas vid andranäraliggande magnetiska moment. Växelverkan sker parvis: j påverkar k samtidigt som k påverkar j. I en vätska med isotrop rörelse medelvärdas den dipolärakopplingen och endast ett kemiskt shift fås för varje atom.

Levitt

Men vad händer då molekylerna ordnar upp sig?

I en kristall beror det kemiska shiftet också på orienteringen av molekylen relativt det magnetiska fältet, eftersom molekyler med olika

orientering upplever olika ’shielding’ gentemot det yttre fältet.

Levitt

I en slumpvis orienterad fast fas får vi en apparent breddning avdet kemiska shiftet, men det är egentligen en summering av alla

de olika shift som atomerna visar.

Levitt

Hcs ∝ <3cos2θ−1>, Β0

Dipolära kopplingar är symmetriska

Precis som för J-kopplingar finns par av tillstånd, vilket ger en splittringpå två toppar i ett partiellt orienterat system (proteiner/biceller).

HDD ∝ <3cos2θ−1>, 1/r3

Storleken påkopplingen är riktningsberoende mapyttre fältet, och avståndsberoende.

I partiellt ordnade system kan vissa dipolära kopplingarkvarstå (dvs inte medelvärdas). Detta påverkar storleken

på den heteronukleära kopplingskonstanten.

Levitt

Vad händer om vi delvis orienterar molekylerna?

Ett partiellt ordnat system består till exempel av magnetiska biceller som ordnar sig partiellt i ett magnetiskt fält. Denna

ordning påverkar fördelningen av orienteringar som proteinerna i lösningen antar.

Hur ser detta ut i spektra?

Residual Dipolar Couplings (RDCs) mäts från skillnaden i kopplingskonstantmellan icke-dekopplade HSQC spektramed och utan en orienterande fas. Olikakopplingar t ex N-HN, Cα-Hα, och Cα-C kan studeras. Från denna information kan bindningsvektor-orienteringar relativtdet yttre fältet beräknas och användas i strukturberäkningar.

Vi kan orientera strukturelement gentemot det yttre fältet och på

så sätt få bättre strukturer.

RDCs i strukturbestämningar

Simon & Sattler, 2002

Lipsitz & Tjandra, 2004

Den experimentella RDCn och den teoretiskt beräknade RDCn kan användas för förfining av strukturer.

Exempel: multidomänproteiner

• Kristallografi: domänorienteringar påverkas ofta av kristallpackning

• NMR: ofta för få NOEer mellan domänerna för att definiera en orientering

Vad är verkligt?

Domänorientering i kristallstrukturen

Domänorientering i lösning m hj av RDCs

Fischer et al., Biochemistry 1999

Strukturbestämningar bara med RDCs

Bax lab, NIH Betesda; Protein Science 2005

Strukturbestämningar bara med RDCs

Strukturbestämningar bara med RDCs

RDC-bestämningen ger en öppnare struktur av domänparetän kristallografistrukturerna –även mer korrekt med biologiska data

Exempel från review Mackay09, Proteins

Hur binder ACP till LpxA?Viktigt för design av antibakteriella

inhibitorer

Exempel: Proteininteraktioner

LpxA: en trimer

ACP

Jain et al., JMB 2004

Kemisk shift-analys vid komplexbindning…

…tillsammans med RDC-mätningar…

…gav tillräckligt med information för att kunna docka de två proteinerna.

Användning av RDCs: • Förbättra strukturdata map interdomän-

orientering• Snabbt räkna om struktur där domänändringar

förväntas vid t ex ligandbindning• Förbättra kristallstrukturdata map rörliga loopar• Docking och domäninteraktioner• Struktur av stora proteiner / komplex

TROSYNMR-analys av större proteiner (> 30 kDa)

begränsas av två faktorer:

-Snabb transvers relaxation hos intressanta spinn (1H, 15N, 13C): och vi behöver ha magnetiseringen i x-y-planet

för detektion och manipulering

-Snabbare relaxation ju större proteiner

Hur gå vidare?

I ett vanligt HSQC spelar vi in 1H-15N-korrelationer, men vi dekopplar för att inte fåtopparna splittrade av J-kopplingen.

I ett kopplat S-I –system (spinn ½) påverkas den transversella

relaxationen olika för olika magnetiseringsövergångar,

beroende på specifika kemisk-shift-egenskaper och dipol-

dipol-växelverkan. Detta blir än mer uttalat för större proteiner,

och högre fält.

Figure by Sattler & Simon, 2002

Vi kan designa experiment som selektivt väljer ut den smalaste

linjen för varje multiplett!

Vi förlorar något i toppintensitet (eftersom en del av övergångarna

selekteras bort under experimentet) men vi vinner

oerhört i upplösning.

TROSY Konventionellt HSQC

För S. aureus DNA gyrase B, 45 kDa

… och så här ser skillnaden ut i 1D-spektra

Här har vi ännu högre molekylvikter!

S. aureus 7,8-dihydroneopterin aldolase(DHNA), 110 kDa

Vi kan använda dessa metoder för heteronukleär tillordning av stora proteiner.

TROSY-HNCA

Konventionellt HNCA

NMR på membranproteiner

Fernandéz & Wütrich, FEBS Lett. 2003

OBS: proverna måste prepareras, och märkas (2H, 15H, 13C)

NMR på membranproteiner

Fernandéz & Wütrich, FEBS Lett. 2003

OmpX OmpA

PagP

Malate synthase G (MSG) from E. coli - a monomeric 723-residue protein1531 NOE, 1101 dihedral angles, 415 residual dipolar coupling, and 300

carbonyl shift restraints. Tugarinov, Choy, Orekov and Kay, PNAS 2005

Är subdomänerna rörliga? Kan vi utvärdera det med NMR?