1

NMDA-receptor fuumlggő nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Doktori eacutertekezeacutes

Dr Csereacutepneacute Dr Szabadits Eszter

Semmelweis Egyetem

Szentaacutegothai Jaacutenos Idegtudomaacutenyi Doktori Iskola

Teacutemavezető Dr Nyiri Gaacutebor PhD tudomaacutenyos főmunkataacuters

Hivatalos biacuteraacuteloacutek Dr Halasy Katalin DSc egyetemi tanaacuter

Dr Altdorfer Kaacuteroly PhD egyetemi docens

Szigorlati bizottsaacuteg elnoumlke Dr Csillag Andraacutes DSc egyetemi tanaacuter

Szigorlati bizottsaacuteg tagjai Dr Dobolyi Aacuterpaacuted PhD tud főmunkataacuters

Dr Raacutecz Bence PhD egyetemi docens

Budapest 2013

MTA Kiacuteseacutereti Orvostudomaacutenyi Kutatoacuteinteacutezet

2

bdquo A dolgok nem kiacutevuumll kezdődnek hanem beluumll eacutes nem alul hanem feluumll eacutes nem a

laacutethatoacuteban hanem a laacutethatatlanbanrdquo

(Hamvas Beacutela)

3

I TARTALOMJEGYZEacuteK

I Tartalomjegyzeacutek3

II Roumlvidiacuteteacutesek jegyzeacuteke7

III Bevezeteacutes11

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok11

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban12

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe12

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese12

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo15

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban16

III34 A hippokampusz interneuronjaihelliphellip18

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtekhelliphellip19

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek21

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok26

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok26

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben27

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute28

III352 A gamma oszcillaacutecioacute28

III353 Az eacuteles-hullaacutemok29

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcillaacutecioacutekban

29

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes30

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel31

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban32

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok32

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek34

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek35

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai35

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban36

4

III421 DSIDSE37

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD37

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD38

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute38

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter40

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok40

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa42

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja43

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutezok45

III55 A nitrogeacuten-monoxid bdquolebontaacutesardquo szoumlveti elnyelődeacutese helliphelliphelliphelliphellip47

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak47

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai48

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben48

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok50

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete50

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa53

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III631 Szinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesaihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus

vaacuteltozaacutesokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben

(excitotoxicitaacutes)58

IV Ceacutelkitűzeacutesek59

V Kiacuteseacuterleti moacutedszerek helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok61

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek61

5

V3Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata62

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok64

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek

szinteacutezise64

V52 In situ hibridizaacutecioacute65

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletekhellip70

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphellip71

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek

felsziacuteneacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip75

V12 Statisztikai analiacutezisekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76

VI Eredmeacutenyekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttestjeacuten dendritjeacuten eacutes

axon iniciaacutelis szegmentjeacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekbőlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok tartalmaznak

NOsGC α1 alegyseacutegethelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest meacuterete

koumlzti korrelaacutecioacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan

2

bdquo A dolgok nem kiacutevuumll kezdődnek hanem beluumll eacutes nem alul hanem feluumll eacutes nem a

laacutethatoacuteban hanem a laacutethatatlanbanrdquo

(Hamvas Beacutela)

3

I TARTALOMJEGYZEacuteK

I Tartalomjegyzeacutek3

II Roumlvidiacuteteacutesek jegyzeacuteke7

III Bevezeteacutes11

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok11

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban12

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe12

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese12

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo15

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban16

III34 A hippokampusz interneuronjaihelliphellip18

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtekhelliphellip19

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek21

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok26

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok26

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben27

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute28

III352 A gamma oszcillaacutecioacute28

III353 Az eacuteles-hullaacutemok29

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcillaacutecioacutekban

29

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes30

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel31

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban32

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok32

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek34

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek35

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai35

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban36

4

III421 DSIDSE37

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD37

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD38

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute38

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter40

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok40

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa42

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja43

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutezok45

III55 A nitrogeacuten-monoxid bdquolebontaacutesardquo szoumlveti elnyelődeacutese helliphelliphelliphelliphellip47

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak47

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai48

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben48

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok50

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete50

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa53

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III631 Szinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesaihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus

vaacuteltozaacutesokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben

(excitotoxicitaacutes)58

IV Ceacutelkitűzeacutesek59

V Kiacuteseacuterleti moacutedszerek helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok61

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek61

5

V3Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata62

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok64

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek

szinteacutezise64

V52 In situ hibridizaacutecioacute65

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletekhellip70

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphellip71

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek

felsziacuteneacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip75

V12 Statisztikai analiacutezisekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76

VI Eredmeacutenyekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttestjeacuten dendritjeacuten eacutes

axon iniciaacutelis szegmentjeacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekbőlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok tartalmaznak

NOsGC α1 alegyseacutegethelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest meacuterete

koumlzti korrelaacutecioacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan

3

I TARTALOMJEGYZEacuteK

I Tartalomjegyzeacutek3

II Roumlvidiacuteteacutesek jegyzeacuteke7

III Bevezeteacutes11

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok11

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban12

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe12

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese12

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo15

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban16

III34 A hippokampusz interneuronjaihelliphellip18

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtekhelliphellip19

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek21

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok26

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok26

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben27

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute28

III352 A gamma oszcillaacutecioacute28

III353 Az eacuteles-hullaacutemok29

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcillaacutecioacutekban

29

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes30

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel31

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban32

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok32

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek34

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek35

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai35

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban36

4

III421 DSIDSE37

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD37

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD38

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute38

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter40

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok40

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa42

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja43

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutezok45

III55 A nitrogeacuten-monoxid bdquolebontaacutesardquo szoumlveti elnyelődeacutese helliphelliphelliphelliphellip47

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak47

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai48

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben48

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok50

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete50

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa53

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III631 Szinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesaihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus

vaacuteltozaacutesokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben

(excitotoxicitaacutes)58

IV Ceacutelkitűzeacutesek59

V Kiacuteseacuterleti moacutedszerek helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok61

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek61

5

V3Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata62

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok64

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek

szinteacutezise64

V52 In situ hibridizaacutecioacute65

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletekhellip70

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphellip71

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek

felsziacuteneacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip75

V12 Statisztikai analiacutezisekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76

VI Eredmeacutenyekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttestjeacuten dendritjeacuten eacutes

axon iniciaacutelis szegmentjeacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekbőlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok tartalmaznak

NOsGC α1 alegyseacutegethelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest meacuterete

koumlzti korrelaacutecioacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan

4

III421 DSIDSE37

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD37

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD38

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute38

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter40

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok40

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa42

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja43

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutezok45

III55 A nitrogeacuten-monoxid bdquolebontaacutesardquo szoumlveti elnyelődeacutese helliphelliphelliphelliphellip47

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak47

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai48

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a neuronhaacuteloacutezat

műkoumldeacuteseacuteben48

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok50

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete50

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa53

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III631 Szinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesaihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus

vaacuteltozaacutesokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben

(excitotoxicitaacutes)58

IV Ceacutelkitűzeacutesek59

V Kiacuteseacuterleti moacutedszerek helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok61

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek61

5

V3Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata62

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok64

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek

szinteacutezise64

V52 In situ hibridizaacutecioacute65

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletekhellip70

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphellip71

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek

felsziacuteneacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip75

V12 Statisztikai analiacutezisekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76

VI Eredmeacutenyekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttestjeacuten dendritjeacuten eacutes

axon iniciaacutelis szegmentjeacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekbőlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok tartalmaznak

NOsGC α1 alegyseacutegethelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest meacuterete

koumlzti korrelaacutecioacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan

5

V3Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata62

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok64

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek

szinteacutezise64

V52 In situ hibridizaacutecioacute65

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletekhellip70

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphellip71

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek

felsziacuteneacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip75

V12 Statisztikai analiacutezisekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76

VI Eredmeacutenyekhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttestjeacuten dendritjeacuten eacutes

axon iniciaacutelis szegmentjeacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekbőlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok tartalmaznak

NOsGC α1 alegyseacutegethelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest meacuterete

koumlzti korrelaacutecioacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan

6

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegehelliphelliphelliphellip97

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok nagy reacutesze

mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatokhelliphelliphellip99

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

poszszinaptikus NMDA receptorokhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102

VII Megbeszeacuteleacuteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip106

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphellip106

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

salhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip108

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC mediaacutelta jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesrahelliphelliphelliphellip111

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg

szinapszisaibanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokbanhelliphellip114

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacuterahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip117

VII8 Az NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid rendszerrel a

GABAerg szinapszisokbanhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip118

VIII Koumlvetkezteteacutesek120

IX Oumlsszefoglalaacutes121

XIrodalomjegyzeacutek121

XI Sajaacutet koumlzlemeacutenyek jegyzeacuteke141

XII Koumlszoumlnetnyilvaacuteniacutetaacutes142

7

II ROumlVIDIacuteTEacuteSEK JEGYZEacuteKE

2-AG 2-arachidonil-glicerol

5-HT3 szerotonin

ACSF mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutek

AIS axon iniciaacutelis szakasz

AKD agonista-koumltő domeacuten

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-12-oxazol-4-il)propaacutensav

BDNF agyi neurotrofikus faktor

BH4 tertahidrobiopterin

CA1-3 Cornu Ammonis (Ammon-szarv) 1-3 reacutegioacutei

CAMKII kalcium-kalmodulin-fuumlggő kinaacutez

cAMP ciklikus adenozin monofoszfaacutet

CASK kalcium-kalmodulin-fuumlggő szerin kinaacutez

CB1R 1-es tiacutepusuacute kannabinoid receptor

CCK kolecisztokinin

CCK-R kolecisztokinin-receptor

cDNS komplementer DNS

cGMP ciklikus guanozin monofoszfaacutet

CNG ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

COX ciklooxigenaacutez

CREB cAMP-fuumlggő szakasz-koumltő feheacuterje

CRIP kannabinoid-receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

D-AP5 D(-)-2-amino-5-foszfonovaleriaacutensav

DAB 33rsquo-diaminobenzidin

DAG diacilglicerol

DEPC dietilpirokarbonaacutet

DLC dinein-koumlnnyűlaacutenc

DSE depolarizaacutecioacute-indukaacutelta serkenteacuteselnyomaacutes

DSI depolarizaacutecioacute-indukaacutelta gaacutetlaacuteselnyomaacutes

EC sejten kiacutevuumlli

eCB endokannabinoid

8

eNOS endoteliaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

EPSP serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

ER endoplazmaacutes retikulum

FAD flavin-adenin dinukleotid

FMN flavin mononukleotid

GABA gamma-amino vajsav

GABAAR A-tiacutepusuacute GABA-receptor

GAD65 glutaminsav dehidrogenaacutez (65 kD-os)

GC guanilaacutet-ciklaacutez

GKAP guanilaacutet-kinaacutez kapcsolt feheacuterje

GluN1-3 NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet-receptor 1-3-as alegyseacutege

GRIP1 glutamaacutet-receptor koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

GTP guanozin trifoszfaacutet

HCN hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-szabaacutelyozott ioncsatorna

HSA humaacuten szeacuterum-albumin

IBMX 3-izobutil-1-metilxantin

IC sejten beluumlli

IN interneuron

iNOS indukaacutelhatoacute nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

IP3 inozitol-trifoszfaacutet

IPSP gaacutetloacute posztszinaptikus potenciaacutel

IS-1-3 interneuron-szelektiacutev interneuron 1-3-as tiacutepusa

KO geacutenkiuumltoumltt

L-NAME L-nitroarginin-metil-eacuteszter

LOX lipoxigenaacutez

LTDi gaacutetloacute szinapszis hosszuacute-taacutevuacute depresszioacuteja

LTP hosszuacute taacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutes

mAChR muszkarinos tiacutepusuacute acetilkolin-receptor

mEPSP miniatűr serkentő posztszinaptikus potenciaacutel

mGluR metabotropikus glutamaacutet-receptor

mRNS hiacutervivő ribonukleinsav

NADPH nikotinamid-adanin-dinukleotid

9

NCAM neuronaacutelis sejt-adheacutezioacutes molekula

NGF idegi noumlvekedeacutesi faktor

NHA N-hidroxi-arginin

NMDA N-metil-D-aszpartaacutet

nNOS neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez

NO nitrogeacuten-monoxid

NOsGC nitrogeacuten-monoxid-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutez

NTD N-terminaacutelis domeacuten

O-LM oriens-laconosum-moleculare interneuron

ODQ oxadiazolo-quinoxalin

PB foszfaacutet puffer

PCR polimeraacutez-laacutencreakcioacute

PDZ PSD-95Discs largeZonula occludens domeacuten

PKA protein-kinaacutez-A

PKG protein-kinaacutez-G

PLC foszfolipaacutez-C

PP perforaacutens-paacutelya

PP1 protein-foszfataacutez

PSD-95 posztszinaptikus denzitaacutes-95 feheacuterje

PV parvalbumin

RhoA Ras-homoloacuteg geacutencslaacutedba tartozoacute feheacuterje

ROS reaktiacutev oxigeacutengyoumlk

SAP-102 szinapszis-asszociaacutelt feheacuterje-102

SDS naacutetrium-dodecil-szulfaacutet

sGC szolubilis guanilaacutet-ciklaacutez

SKA Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt sejt

SNP naacutetrium-nitroprusszid

SOM szomatosztatin

SPR P-anyag-receptor

SSCAM synaptic scaffolding proteinszinaptikus aacutellvaacutenyozoacutefeheacuterje

STD roumlvid taacutevuacute depresszioacute

str Stratumreacuteteg

10

TBS Tris-pufferelt soacuteoldat

THB tetrahidrobiopterin

TTX tertrodotoxin

VASP vazodilataacutetor-stimulaacutelt foszfoprotein

VDCC feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatorna

vGluT3 3-as tiacutepusuacute vezikulaacuteris glutamaacutettranszporter

VIP vazoaktiacutev intesztinaacutelis polipeptid

11

III BEVEZETEacuteS

Ebben a fejezetben egy roumlvid aacuteltalaacutenos bevező utaacuten ismertetem a hippokampusz

mint kiacuteseacuterleteink modellteruumlleteacutenek a szerkezeteacutet eacutes műkoumldeacuteseacutet majd reacuteszletezem az

eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban kulcsfontossaacuteguacute retrograacuted jelaacutetvitel aacuteltalaacutenos ismeacuterveit Ezt

koumlvetően taacutergyalom a dolgozat alapjaacuteul szolgaacuteloacute nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel elemeit

valamint az NMDA receptorok jellemzőit

III1 Agyunkroacutel eacutes a megismereacutesről filozoacutefiai meggondolaacutesok

Agyunk a termeacuteszet talaacuten legcsodaacutelatosabb eacutes legbonyolultabb keacutepződmeacutenye

Szinte felfoghatatlan hogy idegsejtek koumlzoumltti kapcsolatok eacutes ingeruumlletek keacutepesek olyan

komplex folyamatokat leacutetrehozni mint az emberi gondolkodaacutes logika szemeacutelyiseacuteg

vagy kreativitaacutes A nagy keacuterdeacutes hogy a bdquomegismereacutes taacutergyardquo kutathatoacute felfoghatoacute-e

ugyanazzal amit megismerni kiacutevaacutenunk A goumlroumlg bdquogignoscoacuterdquo (megismer) szoacute eredeti

jelenteacutese szagol szimatol de maacutes a tudaacutessal (bdquooidardquo) gondolkodaacutessal (bdquonoeoacuterdquo)

kapcsolatos szavak eredeti jelenteacutese is a eacuterzeacutekszervi műkoumldeacutessel főleg a laacutetaacutessal fuumlggoumltt

oumlssze Az oacutekori goumlroumlg filozoacutefiaacuteban tehaacutet a megismereacutest eacutes gondolkodaacutest egyfajta

bdquoeacutertelemmel megtoumlltoumltt szemleacutelődeacutesnekrdquo tekintetteacutek Elmeacuten a leacuteleknek azt a reacuteszeacutet

eacutertetteacutek melyben eacuterzeteinket eacutes eacuteszleleteinket taacuteroljuk A szoacute maga Platoacutennaacutel jelenik

meg előszoumlr eacutes maacutes alapokra helyezi a megismereacutes filozoacutefiaacutejaacutet (Steiger K 2008) A

platoacuteni anamneacutezis (visszaemleacutekezeacutes)-elmeacutelet (Platoacuten Menoacuten) leacutenyege hogy a leacutelekben

benne lakozik minden tudaacutes csak megfelelő keacuterdeacutesekkel elő kell vezetni fel kell

eleveniacuteteni az bdquoelfelejtettrdquo tudaacutest- vissza kell emleacutekezni Platoacuten ezen elmeacutelete alapjaacuten a

megfelelő keacuterdeacutesek felveteacuteseacutevel lehetőseacuteguumlnk nyiacutelhat akaacuter az agy megismereacuteseacutere is

Platoacuten azonban a Barlanghasonlat ciacutemű dialoacutegussal (Platoacuten Aacutellam VII 514a-517a)

tovaacutebb megy a megismereacutesről valoacute gondolkodaacutesban A szinte teljes tudatlansaacutegtoacutel (a

barlang aacuternyai) az alapvető megismereacutesen (a bdquokinti vilaacutegrdquo) aacutet a legmagasabb szintű

gondolkodaacutesig (Platoacutennaacutel az ideaacutek vilaacutega a hasonlatban a Nap szemleacuteleacutese) terjedő

leacutepeacuteseken kersztuumll vezet az uacutet De vajon melyik leacutepcsőfokon aacutell a mai tudomaacutenyos

megismereacutes Valoacuteban azt eacuteszleljuumlk kiacuteseacuterleteink soraacuten ami meghataacuterozza agyunk

műkoumldeacuteseacutet teacutenyleg uacutegy műkoumldik ahogy mi elkeacutepzeljuumlk Laacutetjuk az aacuternyakat adoacute

12

taacutergyakat vagy maacuter esetleg kijutottunk a barlangboacutel is Vagy meacuteg mindig csak az

aacuternyakat laacutetjuk a barlangban lekoumltoumlzve Eacutes eljuthatunk-e egyaacuteltalaacuten a Nap

felfedezeacuteseacuteig Az olvasoacutera biacutezom eacuten nem merek aacutellaacutest foglalni a keacuterdeacutesben de egy

biztos csak megfelelő alaacutezattal lehet a tudomaacutenyhoz eacutes agyunk megismereacuteseacutehez nyuacutelni

III2 Az koumlzponti idegrendszerről aacuteltalaacuteban

Az emberi agyat nagysaacutegrendileg 1011

(szaacutez-milliaacuterd) idegsejt alkotja a

koumlzoumlttuumlk leacutetrejoumlvő szinapszisok szaacutema 1014

-ra (szaacutezezer-milliaacuterdra) tehető (Drachman

2005) Ezen kapcsolatok keacutepezik minden idegi műkoumldeacutes alapjaacutet Az idegsejtek preciacutezen

huzalozott mikrohaacuteloacutezataiban specifikus informaacutecioacute taacuterolaacutesaacutera nyiacutelik lehetőseacuteg

Idegrendszeruumlnk nem a sejtek szaporiacutetaacutesaacuteval (sejtosztoacutedaacutes) eacuteri el az uacutejonnan beeacuterkező

ingerek informaacutecioacute feldolgozaacutesaacutet eacutes taacuterolaacutesaacutet hanem a megleacutevő idegsejtek

kapcsolatainak (szinapszisainak) erősiacuteteacuteseacutevel uacutej szinapszisok leacutetrehozaacutesaacuteval Kiveacutetel

termeacuteszetesen ez aloacutel is akad idegi őssejtek talaacutelhatoacutek toumlbb helyen is az emlős koumlzponti

idegrendszerben eacutes neacutehol peacuteldaacuteul a szagloacutegumoacuteban eacutes a hippokampusz gyrus dentatus-

aacutenak szemcssejtjei koumlzoumltt keacutepesek uacutej idegsejteket leacutetrehozni eacutes azokat a haacuteloacutezatba

eacutepiacuteteni Ezen uacutej sejteknek alapvető szerepe van az egyedre jellemző haacuteloacutezat

kialakiacutetaacutesaacuteban (Bergmann and Friseacuten 2013 Freund et al 2013) Talaacuten a legfontosabb

szabaacutelyozaacutesi moacuted amivel az idegrendszer alkalmazkodik a bejoumlvő ingerekhez illetve

amivel a bejoumlvő ingereket integraacutelja belső vilaacutegunk aacutellapotaacuteval az a szinaptikus

plaszticitaacutes A szinapszisok nem aacutellandoacutesult keacutepződmeacutenyek folyamatosan vaacuteltoznak

leeacutepuumllnek kapcsolatok amik maacuter feleslegesseacute vaacuteltak miacuteg maacutesok megerősoumldnek

nagyobbak lesznek Minden emleacutek egy speciaacutelis szinapszis mintaacutezattal rendelkezik Az

hogy ki mennyire keacutepes komplex kreatiacutev gondolkodaacutesra ezen idegi mikro-haacuteloacutezatok

kapcsoltsaacutegaacutetoacutel szinaptikus erősseacutegeitől fuumlgg eacutes nem az idegsejtek szaacutemaacutetoacutel (normaacutelis

agyi műkoumldeacutest felteacutetelezve)

III3 A hippokampusz feleacutepiacuteteacutese eacutes szerepe

III31 A hippokampusz nevezeacutektana reacutetegződeacutese

13

A dolgozat teacutemaacutejaacutet keacutepező kiacuteseacuterletek raacutegcsaacuteloacutekban keacuteszuumlltek eacutes a legtoumlbb

szakirodalmi adat is azokroacutel aacutell rendelkezeacutesre iacutegy a dolgozatban a raacutegcsaacuteloacute

hippokampusz anatoacutemiaacutejaacuteroacutel adok roumlvid bevezeteacutest A hippokampusz az archipallium

reacutesze fejlődeacutestanilag az agy ősibb reacuteszeacutehez tartozik Hippokampusz jelenteacutese csikoacutehal

szerkezeacutere jellemző kettős bdquoCrdquo alakja miatt kapta a neveacutet A hippokampusz formaacutecioacute

keacutet joacutel meghataacuterozott reacutesze az Ammon-szarv (Cornu Ammonis) eacutes a gyrus dentatus

A bdquoCornu Ammonisrdquo (bdquokosszarvrdquo) neacutev szinteacuten az alakjaacutera vezethető vissza A

keacutetoldali hippokampuszt a fimbria-fornix (maacutesneacuteven lyra davidis vagy psalterium

jelenteacutese oacutekori sokhuacuteros haacuterfaszerű hangszer szinteacuten alakjaacutera utal) koumlti oumlssze

1 Aacutebra A hippokampusz sematikus aacutebraacuteja Ramoacuten y Cajal (1893) nyomaacuten

Az aacutebraacuten a hippokampusz-szubikulaacuteris komplex principaacutelis sejtjeinek vaacutezlatos kapcsolat

rendszere laacutethatoacute A hippokampusz speciaacutelis memoacuteriafolyamatokban jaacutetszott

műkoumldeacuteseacuteben alapvető fontossaacuteguacute szerepet jaacutetszik a gyrus dentatus szemcsesejtjei eacutes az

Ammon-szarv CA3 majd CA1 piramissejtjei koumlzt leacutetrejoumlvő uacuten bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo A hippokampusz legjelentősebb serkentő bemeneteacutet a kuumllső- eacutes belső

vilaacutegunkboacutel szaacutermazoacute informaacutecioacutekat egyaraacutent integraacuteloacute entorhinaacutelis keacuteregből joumlvő

rostok alkotjaacutek (perforaacutens paacutelya)

14

A hippokampusz joacutel elkuumlloumlnuumll az agykeacuteregtől (neopallium) az entorhinaacutelis

keacutereg 6 reacutetegű sejtaacutellomaacutenyaacuteboacutel szubikulumon mint aacutetmeneti keacuteregteruumlleten keresztuumll

jutunk az archikortikaacutelis hippokampuszba (1aacutebra) Santiago Ramoacuten y Cajal (1893

1911) majd keacutesőbb taniacutetvaacutenya Lorente de Noacute (1934) Golgi impregnaacutecioacutes vizsgaacutelatai

vezettek a hippokampusz kuumlloumlnboumlző sejtjeinek (principaacutelis eacutes bdquonem-principaacutelisrdquo

sejteknek) meghataacuterozaacutesaacutehoz valamint ezek alapjaacuten a hippokampusz reacutegioacuteinak

nevezeacutektanaacutenak bevezeteacuteseacutehez (Lorente de Noacute 1934) amit a mai napig hasznaacutelunk Az

Ammon-szarv reacutegioacutei (a bdquoCornu Ammonisrdquo roumlvidiacuteteacutese alapjaacuten) CA1 reacutegioacute iacuteves

kanyarodoacute reacuteszeacutet CA3ab reacutegioacutenak a gyrus dentatus hilusaacuteba nyuacuteloacute reacuteszeacutet CA3c

reacutegioacutenak nevezzuumlk Megkuumlloumlnboumlztetnek CA2 reacutegioacutet is melyek CA3 piramissejt

tulajdonsaacutegokat mutatnak de nem kapnak moharost bemenetet Raacutegcsaacuteloacutekban e reacutegioacute

meacuterete kicsi Ezen kiacutevuumll megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a gyrus dentatus-t melynek szinteacuten bdquoCrdquo

alakja reacuteveacuten joumln leacutetre a hippokampuszra jellemző kettős bdquoCrdquo forma A gyrus dentatus

elsődleges principaacutelis sejtjei a szemcsesejtek melyek a hilus koumlruumll egy alsoacute (vagy

kuumllső) eacutes egy felső (vagy belső) eacutelbe rendeződnek Az Ammon-szarv eacutes gyrus dentatus

koumlzoumltti hasadeacutekot nevezzuumlk fissura hippocampinak A hippokampusz egyes reacutegioacuteit

tovaacutebbi reacutetegekre lehet osztani (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter 1995)

Az Ammon-szarv reacutetegződeacutese

- alveus (csak a CA1 reacutegioacuteban)

- stratum oriens

- stratum pyramidale

- stratum lucidum (a CA3 specifikus egyeduumllaacutelloacute reacutetege)

- stratum radiatum

- stratum lacunosum-moleculare

A gyrus dentatus-ban az alaacutebbi reacutetegek talaacutelhatoacutek

- stratum moleculare

- stratum granulosum

- hilus

15

III32 A hippokampusz principaacutelis sejtjei a bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo

A hippokampusz principaacutelis sejtjei az Ammon-szarv piramissejtjei valamint a

gyrus dentatusban leacutevő szemcsesejtek eacutes mohasejtek A CA1 piramissejtek lokaacutelis

kollateraacutelisai maacutes piramis sejteket kismeacuterteacutekben idegzik be a maradeacutek helyi

kollateraacutelisaik főkeacutent helyi uacuten visszacsatoloacute gaacutetloacute interneuronokon veacutegződnek A CA3

piramissejtek joacuteval nagyobbak a CA1 piramissejtekneacutel apikaacutelis dendritjuumlk a piramisejt-

reacuteteg alatti str lucidumban roumlgtoumln elaacutegazik eacutes szaacutemos tuumlske is talaacutelhatoacute rajta Speciaacutelis

keacutepződmeacutenyuumlk az uacuten bdquothorny excrescencesrdquo szarv szerű kituumlremkedeacutesek melyen a

szemcsesejtek oacuteriaacutes mohaterminaacuteisai veacutegződnek A CA3 piramsejtek erőteljes rekurrens

illetve ellenoldali associaacutecioacutes kapcsolatokkal rendelkeznek A CA3c piramissejtejei

kisseacute kuumlloumlnboumlznek a CA3ab sejtjeitől apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeik nem nagyon

kuumlloumlnboumlzetethetők meg eacutes mindkettő gazdagon rendelkezik szarv-szerű

kituumlremkedeacutesekkel

A gyrus dentatus szemcsesejtjeinek nincsenek bazaacutelis dendritjeik apikaacutelis

dendritjuumlk a str moleculare-ban fut egeacuteszen a fissura hippocampiig Nincsenek helyi

rekurrens kapcsolataik egymaacutest nem idegzik be helyi kollateraacutelisokat adnak viszont a

hilusban elhelyezkedő mohasejtekre A mohasejtek eacuterdekes sejttiacutepust keacutepviselnek

Serkentő sejtek szaacutemos tuumlskeacutevel a dendritjeiken de nem toumlmoumlruumllnek kuumlloumln reacutetegbe a

hilusban elszoacutertan talaacutelhatoacutek Terminaacutelisaik a szemcsesejtek proximaacutelis

dendritszakaszaira (esetenkeacutent sejttestjeacutere) vetiacutetenek vissza Egyes elmeacuteletek szerint

szaacutermazaacutesukat tekintve lecsuacuteszott piramissejtek ami annak tuumlkreacuteben hogy

morfoloacutegiailag nehezen kuumlloumlnboumlztethetők meg a CA3c piramissejtjeitől eacutes a CA3

bizonyiacutetottan visszavetiacutet a gyrus dentatus szemcssejtjeire nem lehetetlen

A hippokampusz serkentő kapcsolatrendszereacutenek legfontosabb

informaacutecioacutefeldolgozoacute mechanizmusa az uacuten bdquohaacuteromszinapszisos hurokrdquo A

hippokampusz legjelentősebb glutamaacuteterg bemente az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkezik a

szubikulumon keresztuumll Az enthorninaacutelis keacutereg integraacutelja a kuumlloumlnboumlző agykeacutergi

eacuterzeacutekszervi teruumlletekről szaacutermazoacute maacuter előzetesen feldolgozott kuumllső eacutes belső vilaacutegunkat

reprezentaacuteloacute informaacutecioacutet eacutes ezt koumlzvetiacuteti a hippokampusz feleacute a perforaacutens paacutelyaacuten

keresztuumll A perforaacutens paacutelya (PP) az Ammon-szarv eacutes gyrus detatus hataacuteraacuten futva leacutep be

egyreacuteszt a CA1-3 reacutegioacute str lacunosum-moleculare-ba maacutesreacuteszt a gyrus dentatus str

16

moleculare-ba A PP rostjai a str moleculare kuumllső 23-aacuteban a szemcsesejtek dendritjein

(illetve bizonyos interneuronok dendritjein laacutesd III34 alfejezetet) veacutegződnek

topografikusan Ez a PP-szemcsesejt szinapszis a jelfeldolgozaacutes első leacutepcsője A

szemcsesejtek ingeruumllete a mohaterminaacutelisokon keresztuumll tevődik aacutet a CA3

piramissejtek proximaacutelis dendritszakaszaira (illetve bizonyos interneuronokra laacutesd

III33 alfejezetet) kialakiacutetva a CA3 reacutegioacute kuumlloumln speciaacutelis reacutetegeacutet a str lucidumot Ez

keacutepezi a informaacutecioacute feldolgozaacutes maacutesodik aacutellomaacutesaacutet A CA3 piramissejtek ingeruumllete a

Schaffer Kaacuteroly (1864-1939) utaacuten elnevezett Schaffer-kollateraacutelisokon keresztuumll jut

veacuteguumll a CA1 piramisejtek apikaacutelis eacutes bazaacutelis dendritjeire mely a 3 szinapszist keacutepezi a

bdquohaacuteromszinapszisos-hurokbanrdquo A CA1 piramisejtek rostjai az alveusban oumlsszeszedődve

a szubikulumon keresztuumll visszateacuternek az entorhinaacutelis keacuteregbe (de maacutesik reacutetegeacutebe) A

hippokampusz aacuteltal feldolgozottaacutetdolgozott informaacutecioacute tehaacutet aacutetteacutetelesen az entorhinaacutelis

keacuteregből jut vissza a toumlbbi agykeacutergi teruumlletre (OrsquoKeefe Nadel 1978 Amaral Witter

1995)

III33 A hippokampusz szerkezeteacutenek szerepe a deklaratiacutev memoacuteria

kialakiacutetaacutesaacuteban

A hippokampusznak keacutetseacutegbevonhatatlan szerepe van a tanulaacutes- eacutes

memoacuteriafolyamatokban Az uacutej informaacutecioacutek feldolgozaacutesa soraacuten keacutet folyamatra van

szuumlkseacuteg első koumlrben egy generalizaacuteloacute folyamat megy veacutegbe (a bdquotaacutergyrdquo besorolaacutesa a

megfelelő agyunkban maacuter leacutetező bdquoskatulyardquo megkereseacuteseacutevel) majd egy specifikaacutecioacute

joumln leacutetre (a bdquoskatulyaacutenrdquo beluumll az uacutej bdquodologrdquo miben teacuter el a bdquoskatulyardquo toumlbbi elemeacutetől)

Ennek pontos lekeacutepezeacuteseacutehez keacutet kuumlloumln neuronhaacuteloacutezatra van szuumlkseacuteg A generalizaacuteloacute

folyamat az agykeacutergi műkoumldeacuteshez koumlthető a koumlrnyezet reprezentaacutecioacuteja jelentősen

aacutetfedő sejtaktivitaacutesok reacuteveacuten valoacutesul meg iacutegy specifikus informaacutecioacute nem joumlhet leacutetre a

haacuteloacutezatban A specifikaacutecioacute a hippokampusz feladata a koumlrnyezet lekeacutepezeacutese szinte aacutet

nem fedő mikrohaacuteloacutezatok kialakulaacutesaacuteval joumln leacutetre (Kaacuteli S eacutes Acsaacutedy L 2003) Vagyis

a hippokampusz a deklaratiacutev memoacuteriaacuteban jaacutetszik szerepet ez tartalmazza a bdquotiszta

fogalmakatrdquo (clarus3= vilaacutegos) De mi az a szerkezeti kuumlloumlnbseacuteg ami az agykeacutereggel

szemben keacutepes hasonloacute bementekhez kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati aktivitaacutest produkaacutelni A

memoacuteria alapjaacuteul szolgaacuteloacute Hebb-feacutele autoasszociatiacutev haacuteloacutezat ugyanis mind az

17

agykeacuteregben mind a hippokampuszban megtalaacutelhatoacute A vaacutelasz a bdquohaacuteromszinapszisos

hurokrdquo egyes principaacutelis sejtjeinek egyedi tulajdonsaacutegaiban eacutes kapcsolataiban talaacutelhatoacute

(Acsaacutedy eacutes Kaacuteli 2007) A generalizaacutelt informaacutecioacute az entorhinaacutelis keacutergen keresztuumll

eacuterkezik agyunk egyik legkuumlloumlnlegesebb serkentő sejtjeacutere a szemcsesejtre ami a

legfontosabb aacutellomaacutes a specifikus informaacutecioacute kialakiacutetaacutesaacuteban A szemcsesejtek nagyon

erős szűreacutest veacutegeznek a bejoumlvő informaacutecioacuten azaacuteltal hogy rendkiacutevuumll hiperpolarizaacuteltak eacutes

nagyon alacsony az alapaktivitaacutesuk Mivel nincsenek bazaacutelis dendritjeik eacutes egymaacutesssal

sincsenek oumlsszekoumltve nem joumln leacutetre autoasszociatiacutev haacuteloacutezat a bekeruumllő informaacutecioacute

nagyon pontosan keacutepeződik le a szemcsesejtekben A gyrus dentatus legfontosabb

feladata tehaacutet a jel szelekcioacuteja eacutes kategorizaacutecioacuteja A koumlvetkező leacutepeacutes hogy a

szemcsesejtek a megszűrt informaacutecioacutet rendkiacutevuumll pontosan adjaacutek aacutet a CA3

piramissejteknek Ehhez egyreacuteszt annak a neacutehaacuteny ceacutelelemnek a nagyon pontos

kivaacutelasztaacutesa szuumlkseacuteges ami a CA3 reacutegioacuteban az informaacutecioacutet koacutedoloacute autoasszociatiacutev

mikrohaacuteloacutezatot leacutetrehozza maacutesreacuteszt a haacuteloacutezat toumlbbi tagjaacutenak elcsendesiacuteteacutese A

szemcsesejt speciaacutelis egyedi terminaacutelisa a mohaterminaacutelis keacutepes ellaacutetni mindkeacutet

feladatot egyszerre A moharostok ceacutelelem specifikusan keacutetfeacutele terminaacutelissal

rendelkeznek az oacuteriaacutes terminaacutelisok kizaacuteroacutelag piramissejt-tuumlskeacuteken a kis terminaacutelisok

csak helyi GABAerg interneuronokon veacutegződnek Az egy szemcsesejt aacuteltal adott oacuteriaacutes-

mohaterminaacutelisok szaacutema igen keveacutes (szaacutezas nagysaacutegrendű) de nagy hateacutekonysaacuteguacute

emellett a kis mohaterminaacutelisok szaacutema araacutenyait tekintve oumltszoumlroumlseacutere tehető a

serkentőhoumlz keacutepest (Acsaacutedy et al 1998) Ezzel a kapcsolatrendszerrel egysejt szinten

nagy hateacutekonysaacuteguacute pontos ingeruumllet-aacutetadaacutes populaacutecioacutes szinten erős gaacutetlaacutes eacuterhető el a

haacuteloacutezatban A keacutet terminaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegaiban fellelhető kuumlloumlnbseacutegek tovaacutebbi

magyaraacutezatot adnak az informaacutecioacutekoacutedolaacutes szabaacutelyozaacutesaacutera Miacuteg az oacuteriaacutesterminaacutelisok a

transzmisszioacute frekvenciaacutejaacutenak noumlvekedeacuteseacutevel facilitaacuteloacute szinaptikus vaacutelaszt (facilitaacuteloacute

EPSP) adnak addig a kis terminaacutelisok frekvencia-fuumlggeacuteseacutere a depressziacutev (depresszaacuteloacute

EPSP) vagy enyheacuten facilitaacuteloacute vaacutelasz jellemző (Toth et al 2000) Egy adott frekvenciaacuten

a keacutet mechanizmus eredője fogja meghataacuterozni a CA3 piramissejt ingeruumlleteacutet alacsony

szemcsesejt aktivitaacutes soraacuten (ami haacuteloacutezati bdquozajrdquo-keacutent eacuterteacutekelhető) az erős gaacutetlaacutes dominaacutel

miacuteg neacutehaacuteny de fokozott aktivitaacutesuacute szemcsesejt aktivitaacutesa (informaacutecioacute-koacutedolaacutes) soraacuten a

serkenteacutes erősoumldeacutese eacutes a gaacutetlaacutes gyenguumlleacutese reacuteveacuten a kivaacutelasztott piramissejtek

ingeruumlletbe joumlnnek (a haacuteloacutezat toumlbbi piramissejtje pedig gaacutetolt marad) A szemcsesejt-

18

CA3 piramissejt kapcsolat tovaacutebbi jellemzője a nem-asszociatiacutev preszinaptikus LTP

(Lauri et al 2001) A CA3 piramissejtek kiterjedt rekurrens kollateraacutelisai reacuteveacuten a CA3

reacutegioacute autoasszociatiacutev haacuteloacutezati tulajdonsaacuteggal rendelkezik A megszerezett specifikus

informaacutecioacute erős szinaptikus kapcsolatokkal oumlsszekoumltoumltt piramissejt-mikrohaacuteloacutezatokban

taacuteroloacutedik ami kontextusfuumlggő moacutedon a haacuteloacutezat egyes elemeinek aktivitaacutesa reacuteveacuten a

mikrohaacuteloacutezat egeacuteszeacutet aktivaacutelhatja iacutegy komplex emleacuteknyomok felideacutezeacutese vaacutelik lehetőveacute

A CA1 piramisejtekben ezt koumlvetően integraacuteloacutedik a CA3 piramissejtek ingeruumllete (str

radiatum) az entorhinaacutelis keacuteregből eacuterkező perforaacutens-paacutelya bemenettel (str lacunosum-

moleculare) A CA1 piramissejtek plaszticitaacutesaacutehoz (LTP kialakulaacutesa) elengedhetetlen

meacuteg a helyi GABAerg interneuronok teacuterben eacutes időben preciacutezen szabaacutelyozott haacuteloacutezati

műkoumldeacutesre kifejtett hataacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) Az iacutegy keletkező

emleacuteknyomok lassuacute folyamat soraacuten tevődnek aacutet a generalizaacuteloacute agykeacutergi teruumlletekre

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy a hippokampusz specifikus műkoumldeacuteseacutenek

haacutettereacuteben egyedi strukturaacutelis feleacutepiacuteteacutese aacutell (gyrus dentatus-CA3 kapcsolat)

autoasszociatiacutev haacuteloacutezata előtt egy kategorizaacuteloacute haacuteloacutezat (gyrus dentatus) talaacutelhatoacute Ezek a

tulajdonsaacutegok teszik keacutepesseacute arra hogy nagy szaacutemuacute komplex emleacuteknyom gyors eacutes

aacutetfedeacutesmentes taacuterolaacutesaacutet veacutegezze

III34 A hippokampusz interneuronjai

Interneuron alatt klasszikusan azokat a nem principaacutelis (nem glutamaacuteterg)

idegsejteket eacutertjuumlk melyek a helyi haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben szabaacutelyozaacutesaacuteban vesznek

reacuteszt eacutes nem vetiacutetetenek maacutes agyteruumlletre Jelen eacutertekezeacutesben hippokampaacutelis

interneuron alatt kizaacuteroacutelag a GABAerg interneuronokat eacutertem E definiacutecioacute nem

szerencseacutes manapsaacuteg hiszen ma maacuter joacutel ismert hogy nemcsak a principaacutelis sejtek

vetiacutetenek maacutes agyteruumlletekre hanem GABAerg bdquointerneuronokrdquo is nem is

elhanyagolhatoacute szerepet toumlltve be Jobb nevezeacutektan hiaacutenyaacuteban azonban a vetiacutető

GABAerg idegsejteket is az interneuronok koumlzeacute soroljuk

A GABAerg sejtek jelaacutetvivő anyaga a gamma-amino-vajsav (GABA) mely

neacutehaacuteny kiveacuteteltől (pl az idegsejtek fejlődeacuteseacutenek korai szakaszaacuteban az uacuten bdquoGABA-

switchrdquo előtt a GABA serkentő tulajdonsaacuteguacute) eltekintve gaacutetloacute neurotranszmitter Fő

feladatuk tehaacutet a principaacutelis sejtek gaacutetlaacutesa tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk időbeli preciacutez

19

szabaacutelyozaacutesa (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A hippokampaacutelis interneuronok ndash

szemben a kvaacutezi egyforma piramissejtekkel ndash nem alkotnak egyseacuteges populaacutecioacutet a

kuumlloumlnboumlző alpopulaacutecioacutek szaacutema ma maacuter 20 foumlleacute tehető (Klausberger eacutes Somogyi 2008

2 aacutebra) Az interneuronok sokfeacuteleseacutege azonban nem ceacuteltalan kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

műkoumldeacutesek szabaacutelyozaacutesaacutenak szolgaacutelataacuteban aacutellnak (Klausberger et al 2005)

Szaacutemos anatoacutemiai tulajdonsaacuteg alkalmas lehet az interneuron alpopulaacutecioacutek

elkuumlloumlniacuteteacuteseacutere iacutegy peacuteldaacuteul a ceacutelelem specificitaacutes a dendritfa elaacutegazoacutedaacutesa a reacutetegekben

illetve hogy egyes tiacutepusok jellemzően mely peptid neuromodulaacutetorokat vagy kalcium-

koumltő feheacuterjeacuteket fejezik ki

A tovaacutebbiakban neacutehaacuteny azonoshasonloacute funkcioacute betoumllteacuteseacutere specializaacuteloacutedott

interneuronok csoportjainak tulajdonsaacutegait reacuteszletezem peacuteldaacutekkal illusztraacutelva

Mivel a legtoumlbb ismeret a CA1 reacutegioacute interneuronjairoacutel aacutell rendelkezeacutesuumlnkre

ezeacutert a CA1 reacutegioacute interneuronjait hasznaacutelva modellkeacutent mutatom be a fő csoportokat

(2aacutebra)

A tovaacutebbiakban a ceacutelelem specificitaacutest alapul veacuteve az alaacutebbi csoportosiacutetaacutest alkalmazom

- dendritikus gaacutetloacutesejtek

- periszomatikus gaacutetloacutesejtek

- interneuron-specifikus interneuronok

- vetiacutető interneuronok

III341 A dendritikus gaacutetloacutesejtek

A dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzoumls tulajdonsaacutega hogy axonterminaacutelisaik a

piramissejt valamely dendritszakaszaacuten veacutegződnek a beeacuterkező serkentő szinapszisok

szoros szomszeacutedsaacutegaacuteban Ebből koumlvetkeztethető hogy feladatuk elsősorban a

piramissejt bemeneteacutenek szabaacutelyozaacutesa az egyes serkentő szinapszisok plaszticitaacutesaacutenak

heteroszinaptikus befolyaacutesolaacutesa a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok gaacutetlaacutesaacuteval annak meghataacuterozaacutesa hogy melyik szinapszis erősoumldhet

meg eacutes mely ingeruumllet juthat el a sejttestig

Ennek a feladatnak az ellaacutetaacutesaacutera egy dendritikus gaacutetloacutesejt aacutetlagosan 3-18

szinapszist ad egy piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseire eacutes a gaacutetlaacutes

kisebb meacuterteacutekű Ebbe a csoportba tartoznak a 2 aacutebra 5-11 eacutes 13 szaacutemmal jeloumllt

20

interneuronjai A dendritikus gaacutetloacutesejtek sokfeacuteleseacutege azzal magyaraacutezhatoacute hogy a

piramissejt dendritfaacutejaacutenak kuumlloumlnboumlző szegmenseit bemenet-specifikusan innervaacuteljaacutek

illetve sajaacutet bemenetuumlket elteacuterő forraacutesboacutel kapjaacutek E keacutet tulajdonsaacuteg alapjaacuten

megkuumlloumlnboumlztetuumlnk uacuten bdquofeed-forwardrdquo (előrehatoacute) eacutes bdquofeed-backrdquo (visszahatoacute) gaacutetlaacutest

Az előrehatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt azon rostok hataacutesaacutet moacutedosiacutetja a piramissejtben

amelyből sajaacutet bemeneteacutet is kapja tehaacutet az adott afferens sajaacutet hateacutekonysaacutegaacutet sajaacutet

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben szabaacutelyozza A visszahatoacute gaacutetlaacutes eseteacuteben a gaacutetloacutesejt aacuteltal

kapott bemenet maacutes forraacutesboacutel szaacutermazik mint az aacuteltala moacutedosiacutetott bemenet (Freund eacutes

Buzsaacuteki 1996)

2 Aacutebra GABAerg interneuronok a hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A sematikus aacutebraacuten a hippokampaacutelis CA1 reacutegioacute eddig ismert interneuronjai eacutes

axonarborizaacutecioacutejuk reacutetegeloszlaacutesa laacutethatoacute Az aacutebra bal szeacuteleacuten olvashatoacutek a

hippokampusz reacutetegei A keacutek sziacuten aacuteranyalataival a CA1 piramissejtek narancssaacuterga

sziacutennel a periszomatikus gaacutetloacutesejtek pirossal a dendritikus eacutes vetiacutető interneuronok

roacutezsasziacutennel az IN-specifikus gaacutetloacutesejtek sejttestje eacutes fő dendritjei laacutethatoacutek Lilaacuteval

jeloumlltek az interneuron-axonok melyek citromsaacuterga terminaacutelisokban veacutegződnek Az

21

aacutebra bal feleacuten talaacutelhatoacutek a kuumllső eacutes belső forraacutesboacutel szaacutermazoacute glutamaacuteterg bemenetek

Az interneuronok sokfeacuteleseacutege teacuterbeli eacutes időbeli preciacutez szabaacutelyozaacutesa a piramissejt-

haacuteloacutezat normaacutel műkoumldeacuteseacutenek szolgaacutelataacuteban aacutell (Moacutedosiacutetva Klausberger eacutes Somogyi

Science 2008)

A Schaffer-kollateraacutelis bemenettel (piramissejt bazaacutelis eacutes proximaacutelis apikaacutelis

dendritszakaszai-strata oriens eacutes radiatum) asszociaacuteloacutedik ndash csak a legfontosabbakat

kiemelve- a bdquobistratifiedrdquo (bdquokeacutet-reacuteteget innervaacuteloacuterdquo bisztratifikaacutelt sejt 2 aacutebra 5 szaacutemuacute

sejt) a Schaffer-kollateraacutelis asszociaacutelt (SKA emellett CCK-tartalmuacute) dendritikus

gaacutetloacutesejt (2 aacutebra 8 szaacutemuacute sejt) valamint az bdquoIvyrdquo (bdquoborostyaacutenrdquo)-sejt (2 aacutebra 6 szaacutemuacute

sejt) Dendriteloszlaacutesuk alapjaacuten a bisztratifikaacutelt- eacutes az Ivy-sejt bemeneteacutet is a Schaffer-

kollateraacutelisok biztosiacutetjaacutek iacutegy előrehatoacute gaacutetloacutesejtek (Fuentealba et al 2008 Klausberger

eacutes Somogyi 2008)

Az entorhinaacutelis eredetű perforaacutens-paacutelya bemenettel (piramissejt distaacutelis apikaacutelis

dendritszakasza-str lacunosum-moleculare) asszociaacuteloacutedik az O-LM (Oriens-

Lacunosum-Moleculare (2 aacutebra 7 szaacutemuacute sejt) a perforaacutens-paacutelya asszociaacutelt (2 aacutebra 10

szaacutemuacute sejt) eacutes a neurogliaform (2 aacutebra 11 szaacutemuacute sejt) sejt Miacuteg az O-LM sejtek

elsősorban a lokaacutelis piramissejtek rekurrens kollateraacutelisaiboacutel kapjaacutek a bemenetet

(tipikus visszahatoacute gaacutetloacutesejt) addig a maacutesik kettő elsősorban a perforaacutens-paacutelyaacutetoacutel

(előrehatoacute-gaacutetlaacutes) A neurogliaform sejtek nevuumlkből koumlvetkezően is nagyon elteacuternek a

klasszikus neuronok feleacutepiacuteteacuteseacutetől elsősorban a lassuacute toacutenikus GABAerg

transzmisszioacuteban vesznek reacuteszt (Armstrong et al 2012 Tamaacutes et al 2003) eacutes toacutenikus

nitrogeacuten-monoxid felszabadiacutetaacutesaacutera keacutepesek (laacutesd III355)

III342 A periszomatikus gaacutetloacutesejtek

Mivel a periszomatikus gaacutetlaacutes kiemelt fontossaacuteggal biacuter a haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

eacutes az eacutertekezeacutesben szereplő kiacuteseacuterletek is főkeacutent ezen sejtek szinapszisaira iraacutenyulnak a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek tulajdonsaacutegait reacuteszletesebben taacutergyalom Periszomatikus

reacutegioacute alatt a piramissejt sejttesteacutet (aacuteltalaacuteban) a sejttestből kiinduloacute axon iniciaacutelis

szegmentjeacutet (AIS) illetve az uacuten sejttest-ekvivalens dendrit szakaszokat (tuumlskementes

proximaacutelis dendritek a sejttesttől szaacutemiacutetott ~100 mikronon beluumll) eacutertjuumlk (Megiacuteas et al

22

2001) A reacutegioacute fő jellemzője hogy serkentő bemenet nem eacuterkezik raacute kizaacuteroacutelag a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek innervaacuteljaacutek szimmetrikus szinapszisokat keacutepezve (Megiacuteas et

al 2001) Sokkal keveacutesbeacute heterogeacuten populaacutecioacutet keacutepeznek mint a dendritikus

gaacutetloacutesejtek Mivel a periszomatikus reacutegioacute az akcioacutes-potenciaacutel generaacutelaacutesaacuteban jaacutetsza a fő

szerepet ezeacutert ezek az interneuronok a piramissejtek kimeneteacutet a naacutetrium-fuumlggő akcioacutes

potenciaacutelok kialakulaacutesaacutenak valoacutesziacutenűseacutegeacutet szabaacutelyozzaacutek Bemenetuumlk nem asszociaacuteloacutedik

specifikusan kuumlloumln egyik afferenssel sem (a kosaacutersejteknek keveacutesbeacute jelentős

mennyiseacutegű dendritje talaacutelhatoacute a str laconosum-moleculare-ban ami arra utal hogy

kevesebb entorhinaacutelis bementet kapnak) viszont jelentős szaacutemuacute serkentő bemenetet

kapnak a piramissejtektől A piramissejt-interneuron kapcsolatra nagy amplituacutedoacutejuacute

serkentő potenciaacutel jellemző ami aacuteltalaacuteban egy szinapszison keresztuumll megy veacutegbe

(Gulyaacutes et al 1993)

3 Aacutebra A hippokampaacutelis CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus gaacutetlaacutes

feleacutepiacuteteacuteseacutenek vaacutezlata

Az aacutebraacuten a piramissejt sejttestjeacutere eacuterkező keacutet kuumlloumlnboumlző gaacutetloacutesejt- a parvalbumin (PV)

tartalmuacute eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacute kosaacutersejt- szinapszisa a jelaacutetvitelben

fontosabb szerepet jaacutetszoacute receptorai illetve főbb bemenetei laacutethatoacutek Miacuteg a PV+

23

kosaacutersejt a piramissejt ritmikus gaacutetlaacutesaacuteeacutert tehető felelősseacute ezaacuteltal bdquooacuteraműrdquo

pontossaacuteggal segiacutetve a neuronhaacuteloacutezati frekvencia kialakulaacutesaacutet addig a CCK+ kosaacutersejt

keacutereg alatti bemeneteinek is koumlszoumlnhetően a gaacutetlaacutes bdquofinom hangolaacutesaacutebanrdquo vesz reacuteszt

belső vilaacutegunknak hangulati eacuteletuumlnknek megfelelően (Moacutedosiacutetva Freund TF 2003

TINS)

Olyan nagy hateacutekonysaacuteguacute ez a serkentő aacuteram hogy aacuteltalaacuteban az interneuon

kisuumlleacuteseacutehez is vezet Ebbe a csoportba tartozik az axo-axonikus ndash Szentaacutegothai Jaacutenos

nyomaacuten kandelaacuteber ndash sejt (2 aacutebra 1 szaacutemuacute sejt) eacutes a kosaacutersejtekA kandelaacuteber-sejtek az

egyetlen specifikusan csak az axon iniciaacutelis szegmenet beidegző interneuronok rostjaik

vertikaacutelis terminaacutelis fuumlzeacutereket alkotnak egy-egy piramissejt axon iniciaacutelis szegmentje

koumlruumll ahol toumlbbszoumlroumlsen szinaptizaacutelnak

A kosaacutersejtek a sejttestet eacutes a proximaacutelis dendritszakaszokat is beidegzik nagy

amplituacutedoacutejuacute gaacutetloacute-potenciaacutelokat hoznak leacutetre aacutetlagosan 2-8 koumlzel elhelyezkedő

szinapszison keresztuumll A kosaacutersejtek ezaacuteltal nagy hateacutekonysaacuteggal keacutepesek gaacutetolni a

piramissejt akcioacutes potenciaacuteljaacutet Egy kosaacutersejt egyetlen akcioacutes potenciaacuteja maacuter 3

szinapszison keresztuumll megakadaacutelyozza a piramissejt ismeacutetelt kisuumlleacuteseacutet Jellemző

feheacuterjetartalmukat tekintve a kosaacutersejtek keacutet fő populaacutecioacutejaacutet a parvalbumin (PV 2

aacutebra 2 szaacutemuacute sejt) eacutes a kolecisztokinin (CCK) tartalmuacuteakat kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg a

kandelaacuteber-sejtek mind PV tartalmuacuteak A CCK tartalmuacute kosaacutersejtek tovaacutebb oszthatoacuteak

vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGluT3 2 aacutebra 4 szaacutemuacute sejt) eacutes vazoaktiacutev

intesztinaacutelis polipeptid (VIP 2 aacutebra 3 szaacutemuacute sejt) tartalmuk alapjaacuten Funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteg egyelőre nem volt kimutathatoacute a keacutet CCK tartalmuacute alpopulaacutecioacute koumlzoumltt ezeacutert

jellemzeacutesuumlk egyuumltt toumlrteacutenik mint CCK tartalmuacute kosaacutersejtek

A keacutet kosaacutersejt tiacutepus teljesen maacutes feladatra specializaacuteloacutedott a neuronaacutelis haacuteloacutezat

szabaacutelyozaacutesaacutet illetően ami receptoraik eacutes bemeneteik kuumlloumlnbseacutegeacuteben is tetten eacuterhető eacutes

elteacuterő fizioloacutegiai tulajdonsaacutegokat koumllcsoumlnoumlz a keacutet sejttiacutepusnak (3aacutebra) (Freund 2003

Freund eacutes Katona 2007 Klausberger et al 2005)

A PV kosaacutersejtek transzmisszioacuteja nagyon hateacutekony gaacutetlaacutest eredmeacutenyez de

egyben rigid is keveacutes ponton szabaacutelyozhatoacute nem plasztikus A PV kosaacutersejtek fő

serkentő bemeneteacutet a piramissejtektől kapja meacuteghozzaacute nagyreacuteszt bdquoelőrehatoacuterdquo serkenteacutes

formaacutejaacuteban (a CA3 piramissejtektől vagyis Schaffer-kollateraacutelisoktoacutel) kisebb

meacuterteacutekben a helyi piramissejtek bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutese folytaacuten Keacuteregalatti

24

modulaacutetoros (monoaminerg) eacutes GABAerg bementuumlk joacuteval kevesebb A serkentő

szinapszisok fontos tulajdonsaacutega nem plasztikusak a kapott ingeruumlletet pontosan

koumlzvetiacuteti a haacuteloacutezatra A PV kosaacutersejtek egymaacutest is beidegzik sőt elektromos

szinapszisokkal (uacuten bdquogap junctionrdquo-oumlkoumln keresztuumll) is oumlssze vannak kapcsolva

szinciacuteciumot alkotva Egy PV sejt nagyjaacuteboacutel 20-50 maacutesik PV kosaacutersejttel aacutell ilyen

szoros kapcsoltsaacutegban Ennek jellentősseacutege oacuteriaacutesi a haacuteloacutezati szinkronizaacutecioacute

szemponjaacuteboacutel (reacuteszletesen laacutesd III35 alfejezetben) A PV sejtek fizioloacutegiai

tulajdonsaacutegai reacuteszben ezeknek a tulajdonsaacutegoknak is koumlszoumlnhető uacuten bdquogyors tuumlzeleacutesűrdquo

interneuronok a tuumlzeleacutesi mintaacutezatuk nem mutat alkalmazkodaacutest megbiacutezhatoacutean eacutes

bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal tuumlzelnek a haacuteloacutezati frekvenciaacutet meacuteg 100 Hz felett is keacutepesek

koumlvetni Az időbeli preciacutezitaacuteshoz meacuteg hozzaacutejaacuterul hogy a PV terminaacutelisban nagyon

szoros kapcsolat van a kalcium-szenzorok eacutes a kalcium csatornaacutek koumlzoumltt a kalcium

csatornaacutek a szinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban helyezkednek el azonnali vezikula-uumlruumlleacutest

eredmeacutenyezve A PV terminaacutelisboacutel toumlrteacutenő GABA felszabadulaacutes eddigi ismereteink

alapjaacuten M2 tiacutepusuacute muszkarinos acetil-kolin receptoron (mAchR) eacutes micro-opioid receptoron

keresztuumll szabaacutelyozhatoacute (mindkettő csoumlkkenti a GABA felszabadulaacutesaacutet) A PV

szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α1 alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok

vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a szorongaacutesoldoacute benzodiazepinek hataacutesa keveacutesseacute

eacuterveacutenyesuumll A PV kosaacutersejt-szinciacutecium feladata tehaacutet bdquooacuteraműrdquo pontossaacuteggal

szinkronizaacutelni az aacuteltaluk beidegzett 1000-2000 piramissejtet a kuumlloumlnboumlző haacuteloacutezati

oszcillaacutecioacutek soraacuten Ez alapvető fontossaacuteguacute a kognitiacutev folyamatok kialakiacutetaacutesaacuteban (laacutesd

meacuteg III35 alfejezetben)

A CCK kosaacutersejtek aacuteltal leacutetrehozott gaacutetlaacutes ezzel szemben sok ponton

modulaacutelhatoacute plasztikus folyamat Legszembetűnőbb bemeneti kuumlloumlnbseacuteget a keacutereg

alatti modulaacutetoros innervaacutecioacute adja a belső vilaacutegunkat eacutes hangulati eacuteletuumlnket

reprezentaacuteloacute szerotonerg bemenet a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll szelektiacuteven idegzi

be a CCK tartalmuacuteakat A szerotonerg rostok a mediaacuten raphe magcsoportboacutel

szaacutermaznak eacutes 5-HT3 tiacutepusuacute ionotrop szerotonin receptoron hatnak miacuteg a kolinerg

rostok α7 nikotinikus acetil-kolin receptoron keresztuumll serkentik a CCK kosaacutersejteket

Glutamaacuteterg bemenetuumlk toumlredeacuteke a PV kosaacutersejtekeacutenek annaacutel toumlbb gaacutetloacutebementet

kapnak viszont a calretitin tartalmuacute interneuron-specifikus sejtektől A CCK sejtek

glutamaacuteterg bemenete nemcsak szaacutemaacuteban teacuter el a PV sejthez keacutepest de toumlbb forraacutesboacutel

25

szaacutermazoacute informaacutecioacute (CA3- Schaffer kollateraacutelis CA1 piramissejt-kollateraacutelis vagyis

mind az bdquoelőrehatoacuterdquo mind a bdquovisszahatoacuterdquo serkenteacutes) integraacutecioacutejaacutera is keacutepesek Miacuteg a PV

sejt kisuumlleacuteseacutet eredmeacutenyezi a Schaffer-kollateraacutelisok ingeruumllete addig a CCK sejtek

szaacutemaacutera ez az ingeruumllet nem elegendő A CCK kosaacutersejtek csak akkor keruumllnek

ingeruumlletbe ha eleacuteg erős a Schaffer kollateraacutelis bemenet ahhoz hogy a helyi CA1

piramissejtek is aktivaacuteloacutedjanak eacutes ezek bdquovisszahatoacuterdquo lokaacutelis kollateraacutelisai is ingerlik a

CCK sejteket A CCK sejtek nem alkotnak szinciacuteciumot nem jellemző raacutejuk az a szoros

kapcsoltsaacuteg amit a PV sejtekneacutel laacutettunk Tuumlzeleacutesi mintaacutezatukra a bdquoszabaacutelyos tuumlzeleacutesrdquo

jellemző maximaacutelisan 40-50 Hz-ig keacutepesek koumlvetni az aktivaacutelaacutesi frekvenciaacutet eacutes

akkomodaacuteloacutednak vagyis ismeacutetelt ingerleacutes eseteacuten egyre ritkaacutebban keletkeznek akcioacutes

potenciaacutelok A CCK kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a kalcium csatornaacutek nem a szinaptikus

aktiacutev zoacutenaacuteban hanem a terminaacutelis taacutevolabbi reacuteszein helyezkednek el ezaacuteltal laacutezaacuten

kapcsoloacutednak a kalcium szenzorokhoz A CCK kosaacutersejtek szinapszisaira toumlbbszoumlroumls

bdquofelszabadulaacutesi helyrdquo jellemző egyetlen aktiacutev zoacutenaacuten beluumll (sokszor invaginaacutecioacute is

megfigyelhető a szinaptikus feluumllet noumlveleacuteseacutere) ez eredmeacutenyezi hogy a CCK sejtek

GABA uumlriacuteteacutese aszinkron moacutedon eacutes időben elnyuacutejtva jelentkezik A CCK terminaacutelisok

GABA uumlriacuteteacutese szaacutemos receptor aktivaacutecioacutejaacuteval modulaacutelhatoacute Ezek koumlzuumll kiemelendő a

CB1 kannabinoid receptor melynek aktivaacutecioacuteja a terminaacutelis kuumlloumlnboumlző meacuterteacutekű

elcsendesiacuteteacuteseacutehez vezet A folyamat melyet bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutes-

elnyomaacutesnakrdquo (DSI) nevezuumlnk retrograacuted uacuteton a piramissejt aktivaacutecioacutejaacutetoacutel fuumlggően

endokannabinoidok szinteacuteziseacutevel joumln leacutetre mely a preszinaptikus CB1 receptorok

aktivaacutecioacutejaacuteval gaacutetolja a kalcium csatornaacutek műkoumldeacuteseacutet ezaacuteltal a GABA felszabadulaacutesaacutet

(laacutesd meacuteg III421 alfejezetben) A CCK szinapszis posztszinaptikus oldalaacuten az α2

alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű GABAA receptorok vannak tuacutelsuacutelyban melyeken a

benzodiazepinek szorongaacutesoldoacute hataacutesa eacuterveacutenyesuumll Oumlsszesseacutegeacuteben elmondhatoacute hogy a

CCK kosaacutersejtek eacuterzelmi motivaacutecioacutes eacutes a szervezet aacuteltalaacutenos aacutellapotaacuteroacutel informaacutecioacutekat

hordozva a piramissejtek bdquofinom hangolaacutesaacuterardquo specializaacuteloacutedtak A idegrendszer

egyetlen olyan sejtje amin konvergaacutelnak a szorongaacutes molekulaacuteris koacutedaacutesaacuteban reacutesztvevő

transzmitter-rendszerek eacutes receptorok iacutegy a hangulati eacutelet zavaraiban (szorongaacutes eacutes

depressziacutev aacutellapotok) keacutetseacuteget kizaacuteroacute szereppel biacuter

A periszomatikus kosaacutersejtek tehaacutet a bdquoritmustrdquo (PV) eacutes a bdquokedeacutelytrdquo (CCK)

koumlzvetiacutetik a haacuteloacutezatba (Freund 2003 Freund eacutes Katona 2007)

26

III343 Az interneuron-specifikus interneuronok

Az interneuron-specifikus gaacutetloacutesejtek (a tovaacutebbiakban IS-sejtek) attoacutel

kuumlloumlnlegesek hogy ceacutelelemuumlk nem a piramissejt valamely szegmense hanem maacutes (joacutel

meghataacuterozott) interneuronok Haacuterom tiacutepusaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg az IS-sejteknek (IS-1-

3 2aacutebra 19-21 szaacutemuacute sejtjei) Az IS-1 sejtek kiterjedt szinciacuteciumot alkotnak szaacutemos

dendrodendritikus kapcsolatuk reacuteveacuten ami ennek a sejtpopulaacutecioacutenak a gyors szinkron-

kisuumlleacuteseacutet teszi lehetőveacute A dendritikus gaacutetlaacutes szinkronizaacutecioacuteja reacuteveacuten elengedhetetlen

fontossaacuteggal biacuternak a dendritikus aacuteramok eacutes plaszticitaacutes hateacutekony szabaacutelyozaacutesaacuteban Az

IS-3 tiacutepusuacute sejtek szelektiacuteven az O-LM sejtet idegzik be diszinhibicioacutet teacuteve lehetőveacute a

piramissejt disztaacutelis dendritszakaszain (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuron-

szelektiacutev interneuronoknak tehaacutet jelentős szerepe van a hippokampaacutelis haacuteloacutezat

oszcillaacutecioacutejaacutenak eacutes diszinhibicioacutejaacutenak kontrolljaacuteban (Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

III344 A vetiacutető GABAerg interneuronok

Vetiacutető GABAerg gaacutetloacutesejtek alatt a hippokampuszon beluumll maacutesik reacutegioacuteba vetiacutető

illetve a hippokampuszon kiacutevuumllre taacutevolra vetiacutető GABAerg sejteket eacuterjuumlk Az előbbire

peacutelda a visszavetiacutető-sejt (bdquoback-projectionrdquo neuron 2aacutebra 16 szaacutemuacute sejt (Sik et al

1995 Sik et al 1994) mely elsősorban a CA3 reacutegioacuteba kisebb meacuterteacutekben a gyrus

dentatus hilusaacuteba vetiacutet vissza eacutes a bdquovisszahatoacuterdquo-gaacutetlaacutesban jaacutetszik szerepet Szaacutemos

boutonja talaacutelhatoacute kapillaacuterisok koumlzvetlen koumlrnyezeteacuteben de direkt kapcsolatba nem leacutep

az endothellel Jellemző feheacuterjeacuteje mely immunohisztokeacutemiai jeloumlleacuteseacutere is hasznaacutelhatoacute

a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) Utoacutebbi keacutet tulajdonsaacutegaacuteboacutel koumlvetkezően

a hippokampaacutelis neuronhaacuteloacutezat homeosztatikus szabaacutelyozaacutesaacuteban jaacutetszik szerepet (laacutesd

meacuteg a III355 alfejezetben)

A taacutevolra vetiacutető sejtek fő ceacutelpontja a szeptaacutelis teruumllet a szubikulum eacutes a

retrohippokampaacutelis keacuteregteruumllet Ezek koumlzuumll kiemelendő a hippokamposzeptaacutelis

gaacutetloacutesejt (2aacutebra 18 szaacutemuacute sejt) melynek fő bemenete a CA1 piramissejt

kollateraacutelisaiboacutel szaacutermazik Taacutevoli axonjai elsősorban a mediaacutelis szeptum (PV tartalmuacute)

27

GABAerg interneuronjait innervaacuteljaacutek (Toacuteth et al 1993) miacuteg lokaacutelis axonjai a CA1

valamennyi reacutetegeacuteben szeacutetaacutegaznak eacutes szelektiacuteven interneuronokon veacutegződnek

Morfoloacutegiaacutejukboacutel koumlvetkezően jelentős szerepet jaacutetszanak a piramissejt-haacuteloacutezat

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben a helyi eacutes a szeptaacutelis (ritmusgeneraacuteloacute uacuten pacemaker)

interneuronok egyuumlttes szinkronizaacutecioacutejaacuteban ezaacuteltal a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutek

szabaacutelyozaacutesaacuteban (laacutesd III35 alfejezetben) A retrohippokampaacutelis (2 aacutebra 15 eacutes 17

szaacutemuacute sejtjei) eacutes szubikulaacuteris (2 aacutebra 12 szaacutemuacute sejt) teruumlletre vetiacutető sejtek a CA1

piramissejtek rostjaival paacuterhuzamosan haladnak a ceacutelteruumlletre eacutes ritmikus kisuumlleacutessel

koumlvetik a hippokampaacutelis oszcillaacutecioacutekat melynek szerepe van a hippokampuszboacutel az

eacuterintett teruumlletekre koumlzvetiacutetett informaacutecioacute aacutetadaacutesaacuteban (Klausberger eacutes Somogyi 2008)

(funkcioacuteik az III35 alfejezetben olvashatoacute)

III35 A hippokampaacutelis interneuronok szerepe a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

A hippokampaacutelis interneuronok teljes egeacuteszeacuteben lefedik a piramissejt felsziacuteneacutet

(laacutesd III34 alfejezet) Az interneuronok sokfeacuteleseacutegeacutenek teacuterbeli eacutes legfőkeacuteppen időbeli

rendezettseacutegeacutenek kulcsszerepe van a keacutergi haacuteloacutezatok kuumlloumlnboumlző agyi aacutellapotokhoz

rendelt oszcillaacutecioacuteinak leacutetrehozaacutesaacuteban eacutes olyan komplex folyamatokban mint az

eacuterzelmekkel sziacutenezett emleacuteknyomok taacuterolaacutesa eacutes felideacutezeacutese a vilaacuteg dolgainak

megismereacutese eacutes eacuterteacutekeleacutese valamint a kognitiacutev viselkedeacutes (Klausberger eacutes Somogyi

2008) Miacuteg az informaacutecioacute hordozoacutei jelen felteacutetelezeacutesek szerint elsősorban a

piramissejtek az interneuronok bdquooumlsszefuumlggeacutest adnak a tartalomnakrdquo (bdquocontext for the

contentrdquo (Freund eacutes Buzsaacuteki 1996) Az interneuronok szerepet jaacutetszanak az

oszcillaacutecioacutek kialakiacutetaacutesaacuteban az oszcillaacutecioacutek taacutevoli agyteruumlletekre koumlzvetiacuteteacuteseacuteben eacutes a

kapillaacuterishaacuteloacutezattal bdquoegyuumlttműkoumldeacutesbenrdquo a neuronhaacuteloacutezat aktivitaacutesaacutenak megfelelő

anyagcsere igeacuteny kieleacutegiacuteteacuteseacuteben Mivel az oszcillaacutecioacutek kialakulaacutesa nem taacutergya jelen

dolgozatnak csak az interneuronok szerepeacutenek megeacuterteacutese ceacuteljaacuteből nagyon roumlviden

ismertetem ezeket

A hippokampusz viselkedeacutesfuumlggő elektromos aktivitaacutesmintaacutezatai oszcillaacutecioacutei

1 Theacuteta-oszcillaacutecioacute 4-8 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely a hippokampusz bdquoonlinerdquo

aacutellapotaacutet tuumlkroumlzi exploraacutecioacute eacutes paradox alvaacutes alatt tapasztalhatoacute

28

2 Gamma-oszcillaacutecioacute 30-80 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes keacutet fajtaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztetjuumlk meg

a bdquotheacutetaacuteba aacutegyazott gammaacutetrdquo eacutes az bdquoeacuteles hullaacutemot koumlvető gammaacutetrdquo

3 Eacuteles-hullaacutemuacute aktivitaacutes 100-200 Hz frekvenciaacutejuacute aktivitaacutes mely nyugalomban

eacutetkezeacutes soraacuten eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes soraacuten figyelhető meg

III351 A theacuteta oszcillaacutecioacute

A theacuteta oszcillaacutecioacute szerepe egyfajta zajszűreacutes a valoacutes informaacutecioacute eacutes a haacuteloacutezati

haacutetteacuter-aktivitaacutes szeacutetvaacutelasztaacutesa Kialakiacutetaacutesaacuteban neacutelkuumlloumlzhetetlen a mediaacutelis szeptum

(tovaacutebbiakban szeptum) mind GABAerg mind kolinerg sejtcsoportja melynek rostjai a

hippokampuszba vetiacutetenek A GABAerg rostok szelektiacuteven idegzik be a hippokampusz

neacutehaacuteny interneuronjaacutet (Freund eacutes Antal 1988) Ezek koumlzeacute tartoznak a calbindin tartalmuacute

bdquobisztratifikaacuteltrdquo eacutes a szomatosztatin tartalmuacute O-LM dendritikus gaacutetloacutesejtek valamint a

periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a keacutet PV tartalmuacute sejtcsoport a kandelaacuteber sejtek eacutes

PV kosaacutersejtek A szeptum feladata a hippokampaacutelis interneuronok ritmusos

kisuumlleacuteseacutenek eleacutereacutese (a szeptaacutelis -PV tartalmuacute- GABAerg sejtek ritmusgeneraacutetor -uacuten

bdquopacemakerrdquo- sejtek) mely ezt koumlvetően szinkronizaacutelja a piramissejtek kisuumlleacuteseit is

(Freund eacutes Gulyaacutes 1997)

A szeptohippokampaacutelis GABAerg sejtek preciacutez az egyes interneuron

populaacutecioacutekra kifejtett időben joacutel meghataacuterozott gaacutetloacute hataacutesa (a dendritikus sejteket az

EC theacuteta csuacutecsaacuten a periszomatikus sejteket az EC theacuteta voumllgyeacuteben) eacutes a faacutezis-

előretoloacutedaacutes jelenseacutege (mely valoacutesziacutenűleg az eCB aacuteltal a CCK kosaacutersejteken leacutetrehozott

DSI eredmeacutenye laacutesd III342 alfejezetben) reacuteveacuten a piramissejt haacuteloacutezatboacutel kiemelkedik

az a neacutehaacuteny egymaacutestoacutel akaacuter taacutevol levő piramissejt ami informaacutecioacutehordozaacutesa reacuteveacuten egy

mikrohaacuteloacutezat reacutesze lesz Ez a mikrohaacuteloacutezat lesz alkalmas arra hogy a memoacuteria

konszolidaacutecioacuteja (eacuteles-hullaacutemok) soraacuten komplex emleacuteknyomokat taacuteroljon

III352 A gamma oszcillaacutecioacute

A gamma oszcillaacutecioacute szerepe hogy lehetőveacute tegye azt a 2-3 ms pontossaacuteguacute

oszcillaacutecioacutet ami az LTP kialakulaacutesaacutehoz szuumlkseacuteges (laacutesd az III641 alfejezetben) A

koacutedoloacute piramissejtek a theacuteta egy koraacutebbi faacutezisaacuteban (a faacutezis-előretoloacutedaacutes reacuteveacuten) a CCK

29

tartalmuacute kosaacutersejtek gaacutetlaacutesa aloacutel felszabadulnak eacutes keacutepesek tuumlzelni Ezt a neacutehaacuteny

piramissejtet ami az informaacutecioacute koacutedolaacutesaacuteban vesz reacuteszt tovaacutebb kell szinkronizaacutelni

hogy megfelelő frekvenciaacuten tuumlzeljenek a potenciaacutecioacutehoz Erre alkalmas interneuron az

bdquooacuteramű pontossaacuteguacuterdquo PV kosaacutersejt aminek gaacutetlaacutesaacutetoacutel a piramissejtek nem tudnak

megszabadulni Az oszcillaacutecioacute a CA3 reacutegioacuteboacutel indul a CA3 piramissejtek szinkron

kisuumlleacuteseacutet koumlzvetlenuumll koumlveti a PV interneuronok kisuumlleacutese (Csicsvari et al 2003 Haacutejos

et al 2004)

A gamma-oszcillaacutecioacute toumlbb keacuteregteruumlleten szinkron moacutedon jelenik meg iacutegy

lehetőseacuteg nyiacutelik a beeacuterkező informaacutecioacute kuumlloumlnboumlző modalitaacutesainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutera

III353 Az eacuteles-hullaacutemok

Piheneacutes eacutes lassuacute hullaacutemuacute alvaacutes alatt a hippokampuszban megjelenik az eacuteles-

hullaacutem aktivitaacutes melynek feladata a memoacuteria konszolidaacutecioacuteja A CA3 piramissejtek

nagy frekvenciaacutes tuumlzeacuteleacutessorozataacutenak (bdquoburstrdquo) koumlvetkezteacuteben joumln leacutetre melynek

kialakulaacutesaacuteban nagy szerepe van a PV kosaacutersejteknek A populaacutecioacutes sorozatkisuumlleacutesben

elteacuterő szaacutemuacute piramissejt vesz reacuteszt a kialakuloacute mikrohaacuteloacutezat jelentős megerősoumldeacuteseacutet

hozva leacutetre Mineacutel hosszabb ideig tartoacutezkodik egy sejt az eacuteles-hullaacutem aktivitaacutesban annaacutel

jobban megerősiacuteti a kapcsolataacutet a mikrohaacuteloacutezat toumlbbi elemeacutevel (Buzsaacuteki 1986) Ez teszi

lehetőveacute komplex emleacuteknyomok kuumlloumlnboumlző reacutesz-aspektusainak egyuumlttes taacuterolaacutesaacutet A

memoacuterianyom felideacutezeacutese soraacuten pedig az emleacutek egy kis reacuteszleteacuteeacutert bdquofelelősrdquo piramissejt

aktivitaacutesa hozza ingeruumlletbe az egeacutesz mikrohaacuteloacutezatot Mineacutel erősebb a kapcsolat annaacutel

koumlnnyebben toumlrteacutenik a felideacutezeacutes is A keacutetfaacutezisuacute memoacuteria-modell alapjaacuten tehaacutet egy

hosszabb expolaacutecioacutes faacutezis (theacuteta oszcillaacutecioacute-specifikus informaacutecioacute begyűjteacutese) utaacuten a

teljes informaacutecioacute akaacuter egyetlen eacuteles-hullaacutemba toumlmoumlruumllve keruumll eltaacuterolaacutesra (Buzsaacuteki

1989)

III354 A taacutevolra vetiacutető GABAerg neuronok szerepe az oszcilllaacutecioacutekban

A taacutevoli kortikaacutelis eacutes szubkortikaacutelis teruumlletekre vetiacutető GABAerg interneuronok

(laacutesd az III344 alfejezetben) koumlvetve a haacuteloacutezati mintaacutezatot ritmikusan tuumlzelnek az

egyes oszcillaacutecioacutek alatt ezzel hozzaacutejaacuterulnak a taacutevoli teruumlletek időbeli

30

szinkronizaacutecioacutejaacutehoz Habaacuter az agyteruumlletek koumlzoumltti informaacutecioacute-aacutetadaacutes a glutamaacuteterg

piramissejtek axonjain keresztuumll toumlrteacutenik a piramissejt-haacuteloacutezat a szuumlkseacuteges időbeli

precizitaacutest nem keacutepes kialakiacutetani az agyteruumlletek koumlzoumltt A vetiacutető GABAerg sejtek a

ceacutelteruumllet adott sejteinek aktivitaacutesaacutet gaacutetolva előkeacutesziacutetik a haacuteloacutezatot a glutamaacuteterg

rostokon keresztuumll eacuterkező specifikus informaacutecioacute fogadaacutesaacutera (Klausberger eacutes Somogyi

2008)

III355 Homeosztatikus szabaacutelyozaacutes

Az agyi veacuteraacuteramlaacutes eacutes a neuraacutelis aktivitaacutes szoros kapcsoltsaacutegban aacutellnak

egymaacutessal A kommunikaacutecioacute (mint a legtoumlbb esetben) keacutetiraacutenyuacute a neurovaszkulaacuteris

iraacutenyban bizonyos hippokampaacutelis interneuronok koumlzvetiacutetik a megnoumlvekedett haacuteloacutezati

aktivitaacutest az erek feleacute ami vazodilatilaacutecioacutet ezaacuteltal jobb oxigeacuten eacutes gluumlkoacutez ellaacutetaacutest

biztosiacutet a vaszkuloneuraacutelis iraacuteny eseteacuteben az endothel hormonok eacutes maacutes molekulaacutek

felszabadiacutetaacutesaacuteval keacutepes befolyaacutesolni a neuronok ingeruumlleteacutet (Garthwaite 2008) A

legfontosabb szabaacutelyozoacute molekula mindkeacutet iraacutenyban a nitrogeacuten-monoxid (NO) Az

interneuronok koumlzuumll az Ivy (borostyaacuten) a neurogliaform eacutes a visszavetiacutető sejt keacutepes NO

felszabadiacutetaacutesra (laacutesd meacuteg III341 eacutes III344 alfejezetben) a bennuumlk leacutevő neuronaacutelis

NO-szintaacutez (nNOS) enzimnek koumlszoumlnhetően A haacuteloacutezati aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben- az Ivy

sejt Schaffer a neurogliaform entorhinaacutelis a visszavetiacutető sejt pedig CA1 piramissejt

bemenetet kap- a felszabaduloacute NO egyreacuteszt a kapillaacuterisok vazodilataacutecioacutejaacutet maacutesreacuteszt a

neuronok pre- eacutes posztszinaptikus serkenthetőseacutegeacutenek lassuacute modulaacutelaacutesaacutet teszi lehetőveacute

A vaszkulaacuteris oldalroacutel az NO forraacutesa az endotheliumban leacutevő endotheliaacutelis NO-szintaacutez

(e-NOS) Az erekből felszabaduloacute toacutenikus alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO (az

interneuronaacutelis NO toacutenussal egyuumltt) hozzaacutejaacuterul a serkentő sejtek LTP-jeacutenek

kialakulaacutesaacutehoz Ezt az a meglepő adat is alaacutetaacutemasztja hogy annak elleneacutere hogy e-NOS

nincs neuronaacutelis elemben az e-NOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban gyenguumllt a szinaptikus

plaszticitaacutes (Garthwaite 2008) A fent emliacutetett folyamatok soraacuten felszabaduloacute NO a

pikomoacutelos tartomaacutenyba esik ilyen koncentraacutecioacuteban az NO nem viselkedik

szabadgyoumlkkeacutent iacutegy ezekkel a hataacutesaival sem kell szaacutemolni (Hall and Garthwaite 2009

Wood et al 2011)

31

III4 A retrograacuted jelaacutetvitel

Amikor keacutemiai szinapszisok transzmisszioacutejaacuteroacutel beszeacuteluumlnk aacuteltalaacuteban az akcioacutes

potenciaacutel vezeacuterelte anterograacuted jelaacutetvitelre gondolunk vagyis a preszinaptikus sejt

terminaacutelisaacuteboacutel felszabaduloacute jelaacutetvivő molekula a szinaptikus reacutesen keresztuumll a

posztszinaptikus sejt receptoraihoz koumltődve fejti ki a hataacutesaacutet Mostanra nyilvaacutenvaloacutevaacute

vaacutelt azonban hogy a szinaptikus informaacutecioacute-aacuteramlaacutes keacutetiraacutenyuacute az anterograacuted mellett a

posztszinaptikus sejt egeacutesz repertoaacuterral rendelkezik retrograacuted jelaacutetvivő molekulaacutekboacutel

amik a preszinaptikus sejtet befolyaacutesoljaacutek A retrograacuted jelaacutetvitel olyan folyamatokban

jaacutetszik szerepet mint a szinapszisok kialakulaacutesa eacutes eacutereacutese a fejlődeacutes korai szakaszaacuteban

vagy a szinapszisok plaszticitaacutesa a felnőtt aacutellatban Tekintettel arra hogy jelen dolgozat

a felnőtt agyban veacutegbemenő folyamatokra koncentraacutel a tovaacutebbiakban csak az utoacutebbi

felnőtt aacutellatra vonatkozoacute aacuteltalaacutenos ismeacutervek ismerteteacutese koumlvetkezik

4 Aacutebra A retrograacuted

jelaacutetviteli uacutetvonalak

tiacutepusainak oumlsszefoglaloacute

vaacutezlata

Az aacutebraacuten egy sematikus

szinaptikus apparaacutetus

laacutethatoacute A retrograacuted

jelaacutetvitel eseteacuteben a

neurotranszmitter a

posztszinaptikus oldalon

keacutepződik hataacutesaacutet pedig a

preszinaptikus oldalon fejti

ki Hataacutesmechanizmus

alapjaacuten haacuterom formaacutejaacutet

kuumlloumlniacutethetjuumlnk el (az aacutebraacuten

balroacutel jobbra haladva) 1 szekreacutecioacute posztszinaptikus vezikulaacuteboacutel toumlrteacutenő felszabadulaacutes

(pl neurotrofin) 2 a pre- eacutes posztszinaptikus membraacuten koumlzt leacutetesuumllő memraacuten-kapcsolt

feheacuterjeacutek aacuteltali jelaacutetvitel (pl neuroligin-neurexin) 3 membraacutenon szabadon aacutetdiffundaacuteloacute

(membraacuten-permeaacutebilis) jelaacutetvivők (pl nitrogeacuten-monoxid endokannabinoidok) A

32

preszinaptikus terminaacutelis folyamataiba toumlrteacutenő beavatkozaacutes sokreacutetű lehet (pl

anterograacuted transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesa receptor internalizaacutecioacute stb) Az aacutebraacuten bdquoXrdquo

jeloumlli a retrograacuted transzmisszioacute taacutevoli propagaacutecioacutejaacutet (Moacutedosiacutetva Tao HW eacutes Poo M

2001 PNAS)

III41 Retrograacuted jelaacutetvitel az aktivitaacutesfuumlggő szinaptikus plaszticitaacutesban

A szinaptikus plaszticitaacutes legjobban tanulmaacutenyozott formaacuteja talaacuten a glutamaacuteterg

szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute potenciacuterozoacutedaacutesa (LTP) eacutes depresszioacuteja (LTD) Egyes

szinapszisok erősoumldhetnek (LTP) miacuteg maacutesok gyenguumllhetnek (LTD) Mindkeacutet

folyamatban aacuteltalaacuteban mind preszinaptikus mind posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok

leacutetrejoumlnnek Retrograacuted jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel a preszinaptikus vaacuteltozaacutesok jaacutetszaacutek a

koumlzponti szerepet Ilyen vaacuteltozaacutes a neurotranszmitter felszabadulaacutesaacutenak

noumlveleacutesecsoumlkkenteacutese a vezikula-felszabadulaacutes mechanizmusaacuteba uacutejrahasznosiacutetaacutesaacuteba eacutes

uacutejratoumllteacuteseacutebe valoacute beavatkozaacutessal de kialakulhat olyan jel is ami a terminaacutelisboacutel a

sejttest feleacute halad eacutes a szinaptikus potenciaacutecioacute taacutevoli hataacutesait hozza leacutetre

A retrograacuted jelaacutetvitel haacuterom formaacutejaacutet kuumlloumlnboumlztethetjuumlk meg (Tao eacutes Poo 2001) 4

aacutebra)

1 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-permeaacutebilis faktorokkal

2 retrograacuted jelaacutetvitel membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutekkel

3 retrograacuted jelaacutetvitel szekretaacutelt feheacuterjeacuteken keresztuumll

III411 Membraacuten-permeaacutebilis faktorok

Ezek koumlzeacute tartozik a veacuterlemezke-aktivaacuteloacute faktor az arachidonsav az

endokannabinoidok a nitrogeacuten-monoxid eacutes a szeacuten-monoxid Jelentősebb hataacutesa

(jelenlegi tudaacutesunk szerint) az endokannabinoidoknak eacutes a nitrogeacuten-monoxidnak van A

nitrogeacuten-monoxid jelaacutetviteli rendszereacutenek vizsgaacutelata keacutepezi a jelen dolgozat kiacuteseacuterletes

eredmeacutenyeinek nagy reacuteszeacutet ezeacutert a nitrogeacuten-monoxiddal kapcsolatos ismeretek

taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetben (III5) toumlrteacutenik

Az endokannabinoidok (eCB) lipid termeacuteszetű jelaacutetvivő anyagok koumlzoumls

vaacutezukat arachidonsav adja melyre a legtoumlbb esetben amid- eacuteszter- vagy eacuteterkoumlteacutessel

33

kapcsoloacutedik a molekulaacutera specifikus csoport Legtoumlbb ismeretuumlnk a 2-arachidonil-

glicerinről (2-AG) eacutes az N-arachidonil-etanolamidroacutel (anandamid) van A koumlzponti

idegrendszerben receptoruk a preszinaptikusan elhelyezkedő Gio kapcsolt metabotroacutep

CB1 kannabinoid receptor A kannabinoidok a transzmitter felszabadulaacutes gaacutetlaacutesaacutet

hozzaacutek leacutetre mely mind cAMP-fuumlggő mind c-AMP fuumlggetlen uacuteton (A-tiacutepusuacute eacutes bdquobefeleacute

egyeniraacutenyiacutetoacuterdquo K+-csatornaacutek aktivaacutelaacutesaacuteval eacutes N- eacutes PQ-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő Ca

2+-

csatornaacutek gaacutetlaacutesaacuteval) megy veacutegbe Endokannabinoid jelaacutetvitel roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevon is

keacutepes gaacutetolni a transzmisszioacutet (ezen folyamatok reacuteszletes leiacuteraacutesa az III42 fejezetben

toumlrteacutenik) A hippokampuszban ezekben a retrograacuted szabaacutelyozaacutesokban a 2-AG szerepe

bizonyiacutetott A 2-AG teljes agonistaacuteja a CB1 receptornak miacuteg az anandamid csak

reacuteszleges agonista ezen kiacutevuumll a hippokampuszban az anandamid retrograacuted uacutetvonala is

megkeacuterdőjelezhető (Nyilas et al 2008) A 2-AG szinteacutezise foszfolipaacutez C (PLC)βndashfuumlggő

eacutes fuumlggetlen uacuteton megy veacutegbe A PLCβ fuumlggetlen uacutetvonal indukcioacuteja magas

posztszinaptikus kalcium felszabadulaacutesaacuteval diacil-glicerin (DAG) lipaacutez aktivaacutelaacutesaacuteval

toumlrteacutenik (Ca2+

-fuumlggő eCB szinteacutezis) A kalcium beaacuteramlaacutes az extracellulaacuteris teacuterből

feszuumllseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon eacutesvagy NMDA-receptorokon keresztuumll toumlrteacutenik A

PLCβ fuumlggő uacutetvonal alapvetően metabotropikus receptorok aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten indul

Endokannabinoid szinteacutezist indukaacutelnak oumlnmagukban az I csoportuacute metabotroacutep

glutamaacutet-receptorok (mGluR I mGluR1 eacutes mGluR5) M1M3 tiacutepusuacute muszkarinos

acetil-kolin receptorok (mAChR) glukokortikoid receptorok oxitocin eacutes orexin-

receptorok ha eleacuteg rdquoerőteljesrdquo receptoraktivaacutecioacute (magas koncentraacutecioacutejuacute agonista

mellett) joumln leacutetre Minden felsorolt receptor Gq11 ndashfeheacuterje kapcsolt eacutes PLCβ

stimulaacutecioacutehoz vezet iacutegy ehhez az uacutetvonalhoz nem szuumlkseacuteges a sejten beluumlli kalcium-

koncentraacutecioacute emelkedeacutese (receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezis) A PLC-fuumlggő eCB szinteacutezis

egy speciaacutelis esete amikor a metabotroacutep-receptor aktivaacutecioacuteja nem elegendő (keveacutes

agonista) az eCB jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz de egy egyidőben eacuterkező depolarizaacutecioacute

(kismeacuterteacutekű Ca2+

-szint emelkedeacutes is elegendő) ami oumlnmagaacuteban szinteacuten nem indukaacutelna

eCB-szinteacutezist egyuumlttesen keacutepes aktivaacutelni a szinteacutezist (Ca2+

-asszisztaacutelt receptor-

vezeacuterelt eCB szinteacutezis) Ebben a paradigmaacuteban a PLCβ koincidencia-detektornak

tekinthető A hataacutes szinergista nagyobb mint amit a keacutet komponens bdquoszaacutemtani

oumlsszegeacutebőlrdquo vaacuternaacutenk (Kano et al 2009) Minden eCB mediaacutelta roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute

34

potenciaacutecioacute e haacuterom mechanizmus egyikeacutet hasznaacutelja (reacuteszletesen az III42 fejezetben

olvashatoacute)

III412 Membraacuten-koumltoumltt sejtkapcsoloacute feheacuterjeacutek

A sejtek aacutetmeneti vagy tartoacutes oumlsszekoumltteteacuteseieacutert a sejtadheacutezioacutes molekulaacutek (az

angol roumlvidiacuteteacutesből CAM) tehetők felelősseacute Kalciumfuumlggő csalaacutedjukat kadherineknek

kalciumfuumlggetlen csalaacutedjukat pedig Immunglobulin tiacutepusuacute CAM-nak nevezzuumlk Az

idegrendszerben előbbire peacutelda a -neuronaacutelis- N-kadherin utoacutebbira a ndashneuronaacutelis-

NCAM (Roumlhlich P 2006)

Koumlzuumlluumlk szaacutemos feheacuterjeacuteről bizonyiacutetottaacutek hogy szerepe van a szinaptikus

plaszticitaacutesban iacutegy peacuteldaacuteul az NCAM-ről kadherinekről vagy a neuroligin-neurexin

kapcsolatroacutel Az NCAM geacutenkiuumltoumltt aacutellatban eltűnt az LTP mind a CA1 mind a CA3

reacutegioacuteban A kadherin eseteacuteben hasonloacutet tapasztaltak antitesttel vagy gaacutetloacutepeptiddel

gaacutetolt kadherin szignifikaacutensan csoumlkkentette az LTP-t aneacutelkuumll hogy hataacutessal lett volna

az alap jelaacutetvitelre vagy a roumlvidtaacutevuacute plaszticitaacutesra A kadherin gaacutetlaacutesa azonban csak az

LTP indukcioacutes faacutezisaacuteban volt hataacutessal ami arra utal hogy a kadherin a kezdeti

szignalizaacutecioacutes leacutepeacutesben jaacutetszik szerepet A kadherin-kadherin kapcsolat a preszinaptikus

aktiacutev zoacutena eacutes a posztszinaptikus denzitaacutes direkt strukturaacutelis uacutejrarendezeacuteseacutet

eredmeacutenyezheti LTP indukaacuteloacute jelaacutetviteli kaszkaacutedok beindiacutetaacutesaacutera is keacutepes habaacuter ennek

sem preszinaptikus sem posztszinaptikus mechanizmusa nem ismert (Tao eacutes Poo

2001)

A neuroligin-neurexin kapcsolat szaacutemos szinaptikus folyamat befolyaacutesolaacutesaacutera

keacutepes differenciaacutecioacute eacutereacutes valamint mind a serkentő mind a gaacutetloacute szinapszisok

plaszticitaacutesa A neurexin a preszinaptikus a neuroliginek a posztszinaptikus oldalon

helyezkednek el (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011) Neuroliginek PDZ

koumltőhelyuumlk segiacutetseacutegeacutevel koumltődnek a szinaptikus horgonyzoacutefeheacuterjeacutehez (PSD-95 a

glutamaacuteterg gefirin a GABAerg szinapszisokban) Jelenlegi ismereteink szerint a

neuroligin-1 a glutamaacuteterg a neuroligin-2 a GABAerg a neuroligin-3 mindkeacutet tiacutepusuacute

miacuteg a neuroligin-4 glicinerg szinapszisokban talaacutelhatoacute Szaacutemos irodalmi adat van arra

hogy a neacutegy neuroligin fontos szerepet jaacutetszik a plaszticitaacutesban A neuroligin-1 az

NMDA receptorok dokkolaacutesaacutet szabaacutelyozza hiaacutenyaacuteban a teacuterbeli memoacuteria gyenguumlleacutese

35

(LTP gyenguumlleacutes) eacutes sztereotip viselkedeacutes alakult ki autisztikus tuumlnet egyuumlttest ideacutezve

(Blundell et al 2010 Budreck et al 2013) A neuroligin-2 hiaacutenyaacuteban a gaacutetloacute

szinapszisok funkcioacutejaacutenak gyenguumlleacutese figyelhető meg a gaacutetloacute szinapszisok szaacutemaacutenak

megtartaacutesaacuteval (Blundell et al 2009) A neuroligin-3 mutaacutecioacuteja mindkeacutet szinapszison

hatva komplex vaacuteltozaacutesokat hoz leacutetre a gaacutetloacute szinapszisok fokozott műkoumldeacuteseacutet okozta

az agykeacuteregben eacutes a hippokampuszban a serkentő szinapszisokban noumlvelte az AMPA eacutes

NMDA receptorok szaacutemaacutet ezzel jelentősen erősiacutetve az LTP-t a szinapszisok

strukturaacutelis aacuteteacutepuumlleacuteseacutehez eacutes a dendritelaacutegazoacutedaacutesok noumlvekedeacuteseacutehez vezetett (Etherton et

al 2011 Tabuchi et al 2007) A neurexinek (α eacutes β) preszinaptikusan helyezkednek

el eacutes CASK feheacuterjekomplexen keresztuumll koumltődnek a kalcium-fuumlggő vezikulaacuteris

apparaacutetushoz ezaacuteltal keacutepes befolyaacutesolni a vezikulafelszabadulaacutest A neurexin-

neuroligin kapcsolat keacutepes a szinaptikus aktivitaacutes fuumlggveacutenyeacuteben befolyaacutesolni a

neurotranszmisszioacutet a szinapszis meacutereteacutet eacutes a plaszticitaacutesban szerepet jaacutetszoacute receptorok

dokkolaacutesaacutet (Bang eacutes Owczarek 2013 Bottos et al 2011)

III413 Szekretaacutelt feheacuterjeacutek

A szekretaacutelt molekulaacutek koumlzuumll a neurotrofinok toumllthetik be a retrograacuted jelaacutetvivő

anyag szerepeacutet Legfontosabb keacutepviselőjuumlk az agyi neurotrofikus faktor (BDNF) a

posztszinaptikus membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval kalciumfuumlggő moacutedon szekretaacuteloacutedik A

legtoumlbb neurotrofin preszinaptikusan leacutevő receptora uacutetjaacuten a neurotranszmitter

felszabadulaacutes noumlveleacuteseacuten keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet pl a mEPSP frekvenciaacutejaacutenak

noumlveleacuteseacutevel A BDNF hataacutesa valoacutesziacutenűleg kinaacutezok reacuteveacuten a szinaptikus vezikulaacuten leacutevő

szinapszin foszforilaacutecioacutejaacuteval jaacuter ami azonnal serkenti a glutamaacutet felszabadulaacutesaacutet A

BDNF genetikai eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval az LTP indukcioacuteja nem ment veacutegbe a CA1 reacutegioacuteban

azonban visszaaacutelliacutethatoacute volt a normaacutelis műkoumldeacutes BDNF tartalmuacute adenoviacuterussal fertőzoumltt

agyszeleteken eacutes kiacutevuumllről adagolt BDNF segiacutetseacutegeacutevel is (Tao eacutes Poo 2001)

III414 A retrograacuted jelaacutetvitel taacutevoli hataacutesai

A retrograacuted jelaacutetvitel lokaacutelis (monoszinaptikus) hataacutesain kiacutevuumll taacutevolabbi

hataacutesokkal is rendelkezhet A diffuacutezibilis molekulaacuteknaacutel szaacutemiacutetaacutesba kell venni hogy

36

milyen koncentraacutecioacuteban milyen taacutevolsaacutegban tud hatni maacutes szinapszisokon (bdquolateraacutelis

propagaacutecioacuterdquo pl heteroszinaptikus LTDLTP az endokannabinoid rendszerben) Egy

maacutesik eacuterdekes jelenseacuteg a retrograacuted jel preszinaptikus sejtben toumlrteacutenő visszaterjedeacutese

(bdquotaacutevoli propagaacutecioacutejardquo a 4 aacutebraacuten bdquoXrdquo jeloumlleacutessel) A jel egeacuteszen a preszinaptikus sejt

dendritjeinek szinapszisaacuteig is terjedhet Megfigyelteacutek hogy koumlzvetlenuumll a korrelaacutelt

tuumlzeleacutessel kivaacuteltott LTP utaacuten a preszinaptikus sejt serkenthetőseacutege aacutetmenetileg

jelentősen megnőt A taacutevoli hataacutes pontos molekulaacuteris mechanizmusa nem ismert de

mivel az időben gyorsan kialakul felteacutetelezhető hogy olyan maacutesodlagos jelaacutetvivők

jaacutetszhatnak benne szerepet mint a kalcium inozitol-trifoszfaacutet (IP3) vagy cAMP

Receptor-ligand komplexek (pl neurotrofinok koumlzuumll a NGF BDNF) eseteacuteben retrograacuted

axonaacutelis transzportot is leiacutertak (Tao eacutes Poo 2001)

III42 Retrograacuted jelaacutetvitel a hippokampuszban

A hippokampaacutelis piramissejtek megfelelő műkoumldeacuteseacutehez elengedhetetlen a

glutamaacuteterg eacutes GABAerg szinapszisainak roumlvid- eacutes hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesa egyaraacutent

(laacutesd peacuteldaacuteul III351 alfejezetet) Ezek kialakiacutetaacutesaacutehoz a piramissejt retrograacuted jelaacutetviteli

uacutetvonalakat vesz igeacutenybe melyek koumlzuumll a membraacuten-permeaacutebilis faktorok jaacutetszaacutek a

legfőbb szerepet A glutamaacuteterg szinapszisok hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) a

nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya miacuteg elcsendesiacuteteacuteseacutehez az NO (LTD) eacutes az endokannabinoid

(eCB) (STDeacutes LTD) rendszer egyaraacutent jaacuterul hozzaacute A GABAerg szinapszisok gaacutetlaacutesa ndash

eddigi adatok alapjaacuten- az endokannabinodok aacuteltal szabaacutelyozoacutedik de csak a CCK

tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban Maacutes a toumlbbi interneuronok szinapszisait

befolyaacutesoloacute retrograacuted transzmitter-rendszeről mindezidaacuteig nem volt tudomaacutesunk Az

NO hataacutesainak taacutergyalaacutesa kuumlloumln fejezetet eacuterdemel tekintettel a dolgozatban betoumlltoumltt

koumlzponti szerepeacutere (laacutesd III572 alfejezetben)

Az eCB aacuteltal leacutetrehozott roumlvidtaacutevuacute (maacutesodpercekig legfeljebb percekig tartoacute)

gaacutetlaacutes (eCB-STD) koumlzeacute tartozik a bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo

(DSIDSE) az NMDA-vezeacuterelt eCB-STD eacutes a metabotroacutep receptorok (mGluR-I

mAChR CCK-R) vezeacuterelte eCB-STD A hosszuacutetaacutevuacute (legalaacutebb egy oacuteraacuten aacutet tartoacute)

vaacuteltozaacutesokhoz tartozik a serkentő eacutes gaacutetloacute szinapszisok LTD-je (eCB-LTD eacutes eCB-

LTDi) eacutes a heteroszinaptikus modulaacutecioacute

37

III421 DSIDSE

A bdquodepolarizaacutecioacute kivaacuteltotta gaacutetlaacutesserkenteacutes-elnyomaacutesardquo (DSIDSE) a

piramissejtek massziacutev depolarizaacutecioacutejaacutenak eredmeacutenye Az eCB szinteacutezise PLC-fuumlggetlen

moacutedon magas sejten beluumlli kalcium koncentraacutecioacute kialakulaacutesaacuteval indul meg (laacutesd

III411 alfejezetben) a piramissejtben A kannabinoidok a preszinaptikus CB1

receptorokat aktivaacutelva a lehetseacuteges maacutesodlagos uacutetvonalak koumlzuumll (laacutesd III411)

elsősorban a cAMP-fuumlggetlen (Gβγ-vezeacuterelte) kation csatornaacutekon toumlrteacutenő direkt hataacutes

reacuteveacuten hozzaacutek leacutetre a gyorsan kialakuloacute de aacutetmeneti gaacutetlaacutesaacutet a gaacutetloacuteserkentő

neurotranszmitternek A DSI eacutes a DSE nagysaacutega elteacuterő ami valoacutesziacutenűleg a keacutet

terminaacutelis populaacutecioacute elteacuterő CB1 receptor mennyiseacutegeacuteből fakad (a GABAerg rostokon

toumlbbszoumlroumlse a CB1R sűrűseacutege a glutamaacutetergeacutenek ezaacuteltal nagyobb gaacutetlaacutes joumln leacutetre)

(Katona et al 2006 Nyiacuteri et al 2005) Ezen kiacutevuumll a DSE kialakulaacutesaacutehoz hosszabb

elnyuacutejtott depolarizaacutecioacutera van szuumlkseacuteg A GABAerg terminaacutelisok eseteacuteben a CB1

receptorok eloszlaacutesa kettősseacuteget mutat egy reacuteszuumlk a szinapszis koumlruumlli gyűrűben

sűrűsoumldik maacutesik reacuteszuumlk a szinapszistoacutel taacutevol a preterminaacutelis axon reacuteszen duacutesul

Figyelembe veacuteve a DSI soraacuten kialakuloacute gyors hataacutest eacutes a kaacutelium eacutes kalcium csatornaacutek

elhelyezkedeacuteseacutet valoacutesziacutenűsiacutethető hogy a roumlvidtaacutevuacute szabaacutelyozaacutesban a szinapszis

koumlrnyeacuteki receptorok tehetők felelősseacute (Katona eacutes Freund 2008) A DSI

mechanizmusaacutenak oacuteriaacutesi jelentőseacutege a piramissejtek faacutezis-előretoloacutedaacutesaacuteban rejlik (laacutesd a

III342 eacutes III351 alfejezeteket) ami lehetőveacute teszi az informaacutecioacutekoacutedoloacute

piramissejttek szinapszisainak megerősoumldeacuteseacutet

III422 NMDA-vezeacuterelt eCB-STD

A feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutekon kiacutevuumll a feszuumlltseacuteg- eacutes ligand-fuumlggő

NMDA-tiacutepusuacute glutamaacutet receptorokon keresztuumll is kialakul az a magas sejten beluumlli

kalcium koncentraacutecioacute ami eCB szinteacutezishez vezet (PLC-fuumlggetlen Ca2+

-fuumlggő eCB

szinteacutezis) A GABAerg szinapszisokra (IPSP-re) kifejtett hataacutesaacutet azonban

hippokampaacutelis sejtkultuacuteraacuten a fizioloacutegiaacutes tartomaacutenyon tuacuteli extreacutem magas NMDA

koncentraacutecioacuteval (200microM helyileg adagolva) tudtaacutek csak megfigyelni Eacutelettani

mennyiseacutegű NMDA (20microM) adaacutesa nem okozott eCB-STD-t a GABAerg

38

szinapszisokban (Ohno-Shosaku et al 2007) (Ennek jelentősseacutege a VII8 fejezetben

olvashatoacute)

III423 metabotroacutep receptorok vezeacuterelte eCB-STD

A metabotroacutep receptorok aacuteltal kivaacuteltott eCB felszabadulaacutes a bdquoreceptor-vezeacuterelt

eCB szinteacutezisrdquo esetleg a bdquoCa2+

-asszisztaacutelt receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo (laacutesd

III411) mechanizmusaacuteval joumln leacutetre A hippokampusz piramissejtjein eddig az

mGluR5 M1M3 eacutes CCK receptorokroacutel bizonyiacutetottaacutek hogy keacutepesek endokannabinoidok

szinteacuteziseacutet indukaacutelni mGluR5 kivaacuteltotta eCB-STD mind glutamaacuteterg mind GABAerg

szinapszisokban meacutertek Az mGluR5 receptorok tuacutelnyomoacute toumlbbseacutege a glutamaacuteterg

szinapszisok periszinaptikus gyűrűjeacuteben helyezkedik el a tuumlskeacuteken kiacutevuumlli

szomatodendritikus reacutegioacuteban jelentősen csoumlkkent a szaacutemuk eacutes nincsenek GABAerg

szinapszisokban (Lujaacuten et al 1997) Iacutegy valoacutesziacutenűsiacutethető hogy az mGluR5 hataacutesa a

tuumlskeacutekben homoszinaptikus a dendritikus reacutegioacuteban pedig a taacutevolabb elhelyezkedő

extraszinaptikus mGluR5 receptorok fejthetik ki hataacutesukat a CCK-tartalmuacute dendritikus

interneuronok terminaacutelisain Muszkarinos receptorok (M1M3) főkeacutent a piramissejtek

dendritjein extraszinaptikusan helyezkednek el (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) aktivaacutecioacutejuk eCB-fuumlggő GABAerg aacuteramok gaacutetlaacutesaacutet ideacutezteacutek elő

Glutamaacuteterg aacuteramok gaacutetlaacutesa csak sejtkultuacuteraacuteban ideacutezhető elő CCK receptorokon

keresztuumlli eCB szinteacutezis csak a CCK-tartalmuacute interneuronok szinapszisaiban megy

veacutegbe eacutes hasonloacutean a toumlbbi folyamathoz a GABAerg aacuteramok eCB-STD hataacutesaacutet hozza

leacutetre

III424 eCB-LTDLTDi heteroszinaptikus modulaacutecioacute

A hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacuteshoz a CB1 receptorok perceken aacutet tartoacute aktivaacutecioacuteja

szuumlkseacuteges Mechanizmusaacutet tekintve bdquoreceptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-sel joumln leacutetre

Kiacuteseacuterletes adatok alapjaacuten a hippokampuszban mGluR5 aktivaacutecioacuteja indiacutetja be

posztszinaptikus kalcium nem szuumlkseacuteges a kialakulaacutesaacutehoz Ennek elleneacutere

valoacutesziacutenűsiacutethető hogy fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az mGluR5 aktivaacutecioacuteja mellett a

glutamaacutet transzmisszioacute helyi kalcium emelkedeacutessel is jaacuter ami bdquoCa2+

-asszisztaacutelt

39

receptor-vezeacuterelt eCB szinteacutezisrdquo-hez vezet Kimutattaacutek azt is hogy az LTDi eseteacuteben a

Schaffer-kollateraacutelisok ingerleacutese koumlvetkezeacuteben aktivaacuteloacutedoacute mGluR5 receptorok

heteroszinaptikusan gaacutetoltaacutek a CB1 receptorral rendelkező GABAerg terminaacutelisokat

(Chevaleyre eacutes Castillo 2003) Heteroszinaptikusan valoacutesziacutenűleg nem a szinapszis

koumlruumlli hanem a preterminaacutelis axon koumlzeli CB1 receptorok aktivaacuteloacutednak koumlnnyebb

hozzaacutefeacuterhetőseacuteguumlk miatt (Nyiacuteri et al 2005) A heteroszinaptikus szabaacutelyozaacutes egy maacutesik

formaacuteja amikor is a gaacutetloacute szinapszisban kialakult LTD koumlzvetett moacutedon koumlzeli

glutamaacuteterg szinapszisok megerősoumldeacuteseacutehez (LTP) vezet mivel a gaacutetlaacutes megszűneacuteseacutevel

maacuter kuumlszoumlb-alatti ingerekkel is potenciaacutecioacute eacuterhető el A CB1 receptorok hosszuacute

aktivaacutecioacuteja beindiacutetja a Gαi uacutetvonalat is ami az bdquoadenilaacutet-ciklaacutez-cAMP-protein-kinaacutez Ardquo

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezi ezen keresztuumll pedig egy preszinaptikus aktiacutev zoacutena

feheacuterje (RIM-1α) hosszuacutetaacutevuacute gaacutetlaacutesaacutet hozza magaacuteval a GABAerg szinapszisokban eacutes a

PQ tiacutepusuacute feszuumllseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek permanens gaacutetlaacutesaacutet a serkentő

szinapszisokban (Katona eacutes Freund 2008)

A heteroszinaptikus modulaacutecioacute kapcsaacuten laacutethatoacute hogy az eCB jel teacuterben terjed

ritkaacuten szoriacutetkozik egyetlen szinapszis szabaacutelyozaacutesaacutera (meacuteg a receptor-mediaacutelt esetben

is) Kimeacuterteacutek hogy keacutet egymaacuteshoz koumlzeli piramissejt eseteacuteben akkor terjedt aacutet a DSI a

nem depolarizaacutelt sejtre ha a sejttestek taacutevolsaacutega kevesebb mint 20 mikron (Ohno-

Shosaku et al 2000 Wilson eacutes Nicoll 2001)

Oumlsszegzeacuteskeacutent elmondhatoacute hogy az endokannabinoid jelaacutetvitel aacuteltalaacutenosan

eleacuterhető a glutamaacuteterg szinapszisok szaacutemaacutera miacuteg a GABAerg szinapszisok eseteacuteben

kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneuronokra korlaacutetozoacutedik Az endokannabinoid jelaacutetvitel

sok esetben nem igeacutenyeli a preszinaptikus sejt aktivitaacutesaacutet a posztszinaptikus sejt

ingeruumllete oumlnmagaacuteban is elegendő a folyamat beindiacutetaacutesaacutehoz miacuteg maacutes esetekben (főkeacutent

a glutamaacutetergekneacutel) a pre- eacutes posztszinaptikus aktivitaacutes koincidenciaacuteja szuumlkseacuteges Az

endokannabinoid jel aacuteltalaacuteban nem szinapszis-specifikus hatoacutetaacutevolsaacutega ~20 mikronra

tehető Ezek alapjaacuten felmeruumll tehaacutet a keacuterdeacutes hogy leacutetezik-e egy maacutesik aacuteltalaacutenosan toumlbb

interneuron szaacutemaacutera is eleacuterhető retrograacuted szabaacutelyozaacutes leacutetezik-e szinapszis-specifikus

retrograacuted szabaacutelyozoacuterendszer eacutes leacutetrejoumlhet-e a GABAerg szinapszisok potenciaacutecioacuteja a

gaacutetlaacutessal szemben

40

III5 Nitrogeacuten-monoxid mint neurotranszmitter

A nitrogeacuten-monoxid (NO) megfelel a neurotranszmitterektől elvaacutert

kriteacuteriumoknak azaz

1 rendelkezik szintetizaacuteloacute apparaacutetussal

2 szinteacutezise szabaacutelyozhatoacute

3 felszabadulaacutesaacutet koumlvetően keacutepes eljutni a szinapszist alkotoacute maacutesik sejthez (anterograacuted

esetben a posztszinaptikus- retrograacuted esetben a preszinaptikus-sejthez)

4 rendelkezik receptorral

5 rendelkezik a jelaacutetvitel időbeli leaacutelliacutetaacutesaacutehoz vezető folyamattal

6 maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonal(ak)at indiacutet be a fogadoacute sejtben valamely hataacutest

eredmeacutenyezve

Ezen pontok menteacuten haladva mutatom be a NO jelaacutetvitelt a koumlzponti

idegrendszerben majd reacuteszletezem eddig ismert fizioloacutegiai hataacutesait

III51 A nitrogeacuten-monoxid szinteacutezise nitrogeacuten-monoxid szintaacutezok

A nitrogeacuten-monoxid (NO) szinteacuteziseacutet kizaacuteroacutelag a nitrogeacuten-monoxid-szintaacutezok (NOS)

veacutegzik Keacutet konstitutiacutev izoformaacuteja az enzimnek a neuronaacutelis NOS (nNOS) eacutes az

endotheliaacutelis NOS (eNOS) miacuteg indukaacutelhatoacute formaacuteja (iNOS) immunsejtekben

(makrofaacutegok mikroglia) talaacutelhatoacute eacutes csak patoloacutegiaacutes esetekben aktivaacuteloacutedik iacutegy ez

utoacutebbit a tovaacutebbiakban nem reacuteszletezem (Foumlrstermann et al 1991)

Az nNOS eacutes eNOS cellulaacuteris eacutes subcellulaacuteris eloszlaacutesaacutet illetően a rsquo90-es eacutevekben

taacutemadt neacutemi zavar a szakirodalomban Toumlbb csoport eredmeacutenyei azt mutattaacutek hogy

eNOS neuronaacutelis elemekben is a hippokampuszt neacutezve a piramissejtekben talaacutelhatoacute

miacuteg az interneuronok egyes tiacutepusai pedig nNOS-t fejezneacutenek ki Ezek a kiacuteseacuterletek meacuteg

kuumlloumlnboumlző specificitaacutesuacute gaacutetloacuteszereken eacutes nem megfelelően tesztelt antitestekkel veacutegzett

immunreakcioacutekon alapultak de a geacutenkiuumltoumltt aacutellatok megjeleneacuteseacutevel (nNOS eacutes eNOS

KO) a 2000-es eacutevek elejeacutere megoldoacutedott a probleacutema nNOS kizaacuteroacutelag neuronaacutelis

sejtekben talaacutelhatoacute (mind piramissejtekben mind interneuronokban) az eNOS pedig az

41

erek endotheacutel-sejtjeire korlaacutetozoacutedik (Blackshaw et al 2003 Jinno eacutes Kosaka 2002

2004) Az endotheliaacutelis NO szerepeacutet a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben maacuter koraacutebban

ismertettem (laacutesd III355 alfejezet) a tovaacutebbiakban kizaacuteroacutelag a neuronaacutelis eredetű

NO-val eacutes NO-szintaacutezzal kapcsolatos adatokat taacutergyalom Az nNOS haacuterom aacutetiacuteroacutedaacutes

utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik az nNOSα a legszeacutelesebb koumlrben elterjedt

eacutes legnagyobb mennyiseacutegben megtalaacutelhatoacute izoforma a β eacutes γ izoformaacutek eseteacuteben

hiaacutenyzik a feheacuterje N-terminaacutelis horgonyzoacute domeacutenje

5 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid

retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvo-

nalaacuteban szerepet jaacutetszoacute főbb

alkotoacuteelemek sematikus

aacutebraacuteja

Az aacutebraacuten egy szinapszis

sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A

posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacuteban helyezkednek el az

NMDA receptorok melyeket

PDZ domeacutennel rendelkező

horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl PSD-

95) kapcsoljaacutek oumlssze a

membraacuten alatt talaacutelhatoacute

nNOS molekulaacutekkal Az

nNOS Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid (NO)

termeleacutes Az NO membraacuten-permeaacutebilis tulajdonsaacutega folytaacuten szabadon aacutetdiffundaacutel a

preszinaptikus terminaacutelisba ahol receptoraacuten az NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezon

(NOsGC-eacuten) hatva cGMP termeleacuteshez vezet

Az nNOSγ-nak nincs enzimatikus aktivitaacutesa az nNOSβ enzim rendelkezik neacutemi

aktivitaacutessal de ennek csak az nNOSα hiaacutenyaacuteban van jelentőseacutege mert ekkor jelentősen

megnő az agykeacuteregben a szintje (Garthwaite 2008) Az nNOSα (tovaacutebbiakban nNOS)

dimer formaacuteban van jelen mivel azonban minden nNOS molekulaacutehoz egy Ca2+

-

kalmodulin is koumltődik aktiacutev aacutellapotaacuteban tulajdonkeacuteppen tetramer szerkezet joumln leacutetre

42

(Alderton et al 2001 Stuehr et al 2004) Az nNOS N-terminaacutelis domeacutenje az uacuten

horgonyzoacute (PDZ-koumltőhelyekkel rendelkező) domeacuten mely horgonyzoacute feheacuterjeacuteken

keresztuumll az nNOS koumltődeacuteseacutet teszi lehetőveacute a serkentő szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutehoz (5 aacutebra Tochio et al 2000) Ilyen horgonyzoacute feheacuterje a PSD-95

(posztszinaptikus denzitaacutes feheacuterje-95) GRIP1 (glutamaacutet receptorral koumllcsoumlnhatoacute feheacuterje

1) vagy az SSCAM (szinaptikus aacutellvaacutenyozoacute molekula) (Brenman et al 1996 Daff

2010) Ezek a horgonyzoacute feheacuterjeacutek koumltik a glutamaacutet-receptorokat is az akiacutev zoacutenaacuteba iacutegy

egy nagy makromolekulaacuteris komplex (bdquotranszduciszoacutemardquo) alakul ki a gyors jelaacutetvitel

szolgaacutelataacuteban Az nNOS koumlzeacutepső domeacutenje az uacuten bdquooxigenaacutezrdquodomeacuten mely koumlti a

protoporfirin IX (hem) eacutes tetrahidrobiopterin (THB vagy BH4) kofaktorokat eacutes a

szubsztraacutet L-arginint A C-terminaacutelis domeacuten az uacuten bdquoreduktaacutezrdquo domeacuten mely tartalmazza

az alloszteacuterikus aktivaacutetor Ca2+

-kalmodulin koumltőhelyeacutet valamint az elektron-

transzportlaacutenc elemeit egy NADPH-t egy FAD-ot eacutes keacutet FMN-ot Az NO szinteacutezise

keacutet leacutepeacutesben zajlik az elektron donor a NADPH+H+ mely Ca

2+-kalmodulin

jelenleacuteteacuteben aacutetatadja az elekektronokat a FAD-FMN redox-laacutencnak a reduktaacutez domeacutenen

beluumll majd az FMN-ről aacutetkeruumll az elektron az oxigenaacutez domeacuten hem vas-ionjaacutera

(ferroferri aacutetalakulaacutes) majd a veacutegső elektrontranszport soraacuten egy oxigeacuten molekula

segiacutetseacutegeacutevel az L-arginin pozitiacutev toumllteacutesű guanidil-csoportjaacutenak egyik nitrogeacutenje

hidroxilaacuteloacutedik eacutes N-hidroxi-L-arginin (NHA) aacutetmeneti termeacutek eacutes egy viacutezmolekula

keletkezik A maacutesodik leacutepeacutesben meacuteg egy oxigeacuten molekula eacutes elektron segiacutetseacutegeacutevel

kialakul a citrullin karboxi-csoportja felszabadul a NO eacutes meacuteg egy viacutezmolekula

keletkezik (Alderton et al 2001 Daff 2010 Stuehr et al 2004) Egy egyenletben iacuterva

(1 mol nitrogeacuten-monoxidra szaacutemolva)

C6H14N4O2 + 2 O2 + 15 (NADPH+H+) = C6H13N3O3 + NO + 2H2O + 15 NADP

+

(L-Arg) (citrullin)

III52 A nitrogeacuten-monoxid szinteacuteziseacutenek szabaacutelyozaacutesa

Az NO szinteacutezishez szuumlkseacuteges oxigeacuten miatt az nNOS O2-eacuterzeacutekenyseacutege meacuteg a

fizioloacutegiaacutes O2 koncentraacutecioacute mellett is jelentősen kihat a keletkező nitrogeacuten-monoxid

mennyiseacutegeacutere (az agyi [O2]~20 microM az nNOS O2-fuumlggeacutese Km= 350microM) Ennek

43

kiacuteseacuterletes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt hatalmas a jelentősseacutege amikor fizioloacutegiaacutes NO hataacutesokat

szeretneacutenk meacuterni ugyanis a fizioloacutegiaacutes (in vitro) tuacuteleacutelő szeletek karbogeacuten gaacutezzal toumlrteacutenő

O2 ellaacutetaacutesa soraacuten 210microM-1mM [O2] joumln leacutetre raacuteadaacutesul oxigeacuten graacutedienssel kell szaacutemolni

a szelet meacutelyebb reacutetegei feleacute haladva Ezekben a kiacuteseacuterletekben akaacuter tiacutezszeres

mennyiseacutegű NO is keletkezhet a fizioloacutegiaacuteshoz keacutepest amit aacuteltalaacuteban nem vesznek

figyelembe az eredmeacutenyek eacuterteacutekeleacuteseacuteneacutel (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szinteacutezishez

szinteacuten elengedhetetlen a Ca2+

-kalmodulin jelenleacutete (Bredt and Snyder 1990 Lee and

Stull 1998) Az nNOS kalcium-fuumlggeacutese Km=~05 microM Ehhez helyileg

(bdquokompartmentbenrdquo) felszabaduloacute nagyobb kalcium is elegendő nem szuumlkseacuteges

sejtszintű depolarizaacutecioacute azonban kimutattaacutek hogy az nNOS aktivaacutecioacutejaacutehoz szuumlkseacuteges

kalcium extracellulaacuteris forraacutesboacutel szaacutermazik (Alagarsamy et al 1994) Iacutegy a

kalciumforraacuteskeacutent csak a feszuumlltseacuteg-fuumlggő kalcium-csatornaacutek eacutes az NMDA-tiacutepusuacute

glutamaacutet receptorok joumlnnek szoacuteba A glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev

zoacutenaacutejaacuteban az NMDA receptorok az nNOS eacutes egyeacuteb strukturaacutelis feheacuterjeacutek

makromolekulaacuteris komplexet alkotva lehetőveacute teszik hogy az NMDA receptorokon

keresztuumll beaacuteramloacute kalcium azonnal nNOS aktivaacutecioacutet indukaacuteljon (5 aacutebra) Minden

egyes NMDA-receptor egy nNOS molekulaacuteval van oumlsszekoumltve Az nNOS szaacutemos

foszforilaacutecioacutes hellyel is rendelkezik aminek koumlszoumlnhetően kinaacutezok szabaacutelyozhatjaacutek

aktivitaacutesaacutet A teljesseacuteg igeacutenye neacutelkuumll ilyen kinaacutez pl a Ca2+

-kalmodulin-dependens kinaacutez

II (CAMKII) ami mint egy visszacsatoloacute mechanizmus mintegy feleacutere keacutepes

csoumlkkenteni az nNOS aktivitaacutesaacutet

III53 A nitrogeacuten-monoxid keacutemiai tulajdonsaacutegai koncentraacutecioacuteja

Az NO gaacutez halmazaacutellapotuacute molekula speciaacutelis tulajdonsaacutega a toumlbbi

neurotranszmitterhez keacutepest hogy szabadon diffundaacutel vizes eacutes lipid faacutezisban is kivaacuteloacute a

membraacutenpermeaacutebilitaacutesa tehaacutet szinteacuteziseacutet koumlvetően mind pre- mind posztszinaptikus

hataacutesait figyelembe kell venni Diffuacutezioacuteja meglepően gyors becsleacutesek szerint a szoumlveti

diffuacutezioacutes koefficiense 848microm2s vagyis egy aacutetlagos NO molekula ~08 microm-t tudna

megtenni 100 micros alatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Szerkezete alapjaacuten nagyon

reakcioacutekeacutepes meacutegis keacutemiai tulajdonsaacutegai nagyban fuumlggenek koncentraacutecioacutejaacutetoacutel

44

6 Aacutebra A nitrogeacuten-monoxid hataacutesai a koncentraacutecioacute fuumlggveacutenyeacuteben

A konstitutiacutev moacutedon műkoumldő NO szintaacutezok ndash endoteliaacutelis (eNOS) eacutes neuronaacutelis (nNOS)

ndash eseteacuteben a felszabaduloacute nitrogeacuten-monoxid (NO) a pikomoacutelos tartomaacutenyba esik mely

tartomaacutenyban az NO nem viselkedik szabad gyoumlkkeacutent csak pozitiacutev hataacutesai figyelhetők

meg A patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt aktivaacuteloacutedoacute indukaacutelhatoacute NO szintaacutez (iNOS) eseteacuteben

az NO koncetraacutecioacuteja a mikromoacutelos tartomaacutenyig nyuacutelik iacutegy reaktiacutev oxigeacuten-gyoumlkkeacutent

(ROS) viselkedve sejtkaacuterosiacutetoacute hataacutesai keruumllnek előteacuterbe(Moacutedosiacutetva Eduardo eacutes mtsai

2011)

Az NO viselkedeacuteseacutenek koncentraacutecioacutefuumlggeacuteseacutet a 6 aacutebra mutatja be Miacuteg

patoloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt az indukaacutelhatoacute NOS nitrogeacuten-monoxid termeleacutese eleacuteri

mikomoacutelos tartomaacutenyt eacutes reaktiacutev oxigeacutengyoumlkkeacutent (ROS) viselkedve a toxikus hataacutesai

keruumllnek előteacuterbe addig az utoacutebbi eacutevek legfontosabb felfedezeacutese e teacuteren hogy a

fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neurotranszmisszioacute reacuteveacuten felszabaduloacute NO pikomoacutelos

(legfeljebb 1nM) tartomaacutenyba esik (Hall eacutes Garthwaite 2009 Wood et al 2011) A

nagy neheacutezseacutegeacutet az adja a szoumlveti NO-koncentraacutecioacute meacutereacuteseacutenek hogy a meacuterőelektroacutedaacutek

45

nem voltak eleacuteg specifikusak ezeacutert joacuteval nagyobb koncentraacutecioacutek meruumlltek fel a

szakirodalomban Egy uacutej fejleszteacutesnek koumlszoumlnhetően most maacuter pontosabban meacuterhető az

NO mennyiseacutege Ezen kiacutevuumll egy szaacutemiacutetoacutegeacutepes modell is napvilaacutegot laacutetott amiben egy

glutamaacuteterg szinapszist modellezve hataacuteroztaacutek meg a maximaacutelisan felszabaduloacute NO

mennyiseacutegeacutet Egy 50 NMDA-RnNOS komplexet tartalmazoacute szinapszist vettek alapul

(ami szaacutem kicsit tuacutelbecsuumllt Kennedy 2000) eacutes azt az extreacutem helyzetet felteacutetelezteacutek

hogy az oumlsszes receptor eacutes enzim egyszerre teljes hateacutekonysaacuteggal aktivaacuteloacutedik Ennek

eredmeacutenyekeacuteppen a szinaptikus NO koncetraacutecioacuteja 1 nM lett ami a szoumlveti eacutes

enzimatikus elnyelődeacutest figyelembe veacuteve 1microm taacutevolsaacutegban 250 pM alaacute csoumlkken Ebben

a tartomaacutenyban az NO reaktiacutev szabadgyoumlk tulajdonsaacutega elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű

semleges molekulakeacutent viselkedik (Hall eacutes Garthwaite 2009) A szakirodalomban

fellelhető toumlbbszaacutez nanomoacutelostoacutel mikromoacutelosig terjedő NO koncentraacutecioacute mellett (pl

NO donorokkal) meacutert bdquofizioloacutegiairdquo hataacutesokat koumlruumlltekinteacutessel kell kezelni Egy maacutesik

fontos koumlvetkezteteacutes a fent leiacutertakboacutel hogy a koumlzponti idegrendszerben nem aacutellja meg a

helyeacutet a NO bdquoteacuterfogati-transzmisszioacuterdquo-jaacutenak az elmeacutelete mivel az NO hatoacutetaacutevolsaacutega

joacuteval kisebb (max1-2 microm) mint koraacutebban gondoltaacutek eacutes valoacutejaacuteban szinapszis specifikus

szabaacutelyozaacutest tesz lehetőveacute

III54 A nitrogeacuten-monoxid receptorai NO-szenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezok

Az NO receptora a koraacutebban szolubilis guanilaacutet-ciklaacuteznak (sGC) nevezett enzim

Az elnevezeacutes azeacutert nem volt szerencseacutes mert az enzim nem minden formaacuteja

bdquoszolubilisrdquo ezeacutert az uacutej nevezeacutektan szerint NO-szenzitiacutev-guanilaacutet-ciklaacuteznak (NOsGC)

nevezzuumlk megkuumlloumlnboumlztetve a partikulaacuteris GC-toacutel ami az NO-inszezitiacutev GC nevet

kapta tekintettel arra hogy az NO nem csak a pitvari natriuretikus peptid (ANP) ligand

aktivaacutelja (Kobiałka and Gorczyca 2000) Az NOsGC az NO fő receptora (5 aacutebra)

Heterodimer formaacuteban alkot funkcionaacutelis egyseacuteget melyben egy α- eacutes egy β- alegyseacuteg

vesz reacuteszt (Koesling et al 2004 Krumenacker et al 2004 Russwurm eacutes Koesling

2002 Russwurm et al 2001) Az α-alegyseacuteg keacutet fajtaacuteja az α1 eacutes az α2 Kinetikaacutejukban

semmilyen kuumlloumlnbseacuteg nem igazolhatoacute egyetlen ismert fontos tulajdonsaacutega az α2

alegyseacutegnek az α1-hez keacutepest hogy PDZ-koumltő domeacutennel rendelkezik ezaacuteltal keacutepes

szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez koumltődni (membraacuten-asszociaacutelt NOsGC) miacuteg az α1

46

tartalmuacute receptorok ennek hiaacutenyaacuteban valoacuteban bdquoszolubilisekrdquo maradnak A β-alegyseacuteg is

keacutet formaacuteban β1 eacutes β2 alegyseacutegkeacutent leacutetezik A β2-alegyseacuteg azonban csak patholoacutegiaacutes

aacutellapotokban jelenik meg (pl beacutelrendszeri daganatokban a beacutelhaacutemsejtekben) ezeacutert az

NOsGC aacutellandoacute alegyseacutege a β1 alegyseacuteg A β1 alegyseacuteg geacutenjeacutenek kiuumlteacutese letaacutelis

fenotiacutepust eredmeacutenyez (Friebe et al 2007) miacuteg csak az α1 vagy α2 alegyseacutegek kiuumlteacutese

nem okoz letalitaacutest (Mergia et al 2006)

Keacutetfeacutele heterodimer leacutetezik tehaacutet az agyban az α1β1 eacutes az α2β1 alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű receptor A receptor-dimernek haacuterom domeacutenjeacutet kuumlloumlnboumlzetjuumlk meg a

hemkoumltő domeacutent a dimerizaacutecioacutes domeacutent eacutes a katalitikus domeacutent A hemkoumltő domeacuten egy

ugyanolyan hemcsoportot tartalmaz ami a hemoglobin molekulaacuteban az oxigeacutenkoumlteacuteseacutert

felelős meacutegis ahogy a hem-csoport beeacutepuumll a receptorba rendkiacutevuumlli specificitaacutesa lesz a

nitrogeacuten-monoxidra (10000-szer nagyobb az affinitaacutesa) A katalitikus domeacuten felelős a

GTP cGMP aacutetalakiacutetaacuteseacutert Inaktiacutev aacutellapotban a hem-csoport egy hisztidinnel

kapcsoloacutedik a feheacuterjeacutehez a katalitikus egyseacuteg pedig nyitott aacutellapotban van Az NO

koumltődeacuteseacutenek hataacutesaacutera a hisztidin-csoport elmozdul ami konformaacutecioacutes vaacuteltozaacutesokat ideacutez

elő a feheacuterjeszerkezetben ami veacuteguumll a katalitikus egyseacuteg zaacuteroacutedaacutesaacutehoz eacutes a cGMP

szinteacutezis beindulaacutesaacutehoz vezet Az NO koumltődeacuteseacutet koumlvetően keacuteseacutes neacutelkuumll azonnal elindul

a guanilaacutet-ciklaacutez aktivitaacutes az NO eltaacutevoliacutetaacutesaacuteval pedig 200 ms-on beluumll lecseng a cGMP

termeleacutes (Bellamy et al 2000) Az NOsGC 50-os aktivitaacutesa ~1nM NO koncetraacutecioacute

mellett eacuterhető el Eszerint fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzt az NOsGC szubmaximaacutelis

hataacutesfokon műkoumldik meacutegis jelentős hataacutesok meacuterhetők Ez arra vezethető vissza hogy

az NOsGC sokszorosaacutera erősiacuteti a jelet Meacutereacutesek alapjaacuten az enzimet aacutetlagosan eleacuterő 03

nM NO mintegy 04microM cGMP szinteacutezishez vezet vagyis 1000-szereseacutere erősoumldik a

jelaacutetvivő molekulaacutek szaacutema Az NOsGC olyan eacuterzeacutekenyseacutegű hogy maacuter paacuter molekula

NO (kis pikomoacutelos mennyiseacutegben) is keacutepes kivaacuteltani az aktivitaacutesaacutet eacutes az amplifikaacutecioacute

miatt a maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalakat is be tudja indiacutetani (Garthwaite 2008) A

receptor alegyseacutegek sejtszintű elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban mRNS eacutes feheacuterje

szinten vizsgaacuteltaacutek a β1 alegyseacuteget mind interneuronokban mind piramissejtekben az α

alegyseacutegeket pedig az α1 eacutes α2 kuumlloumlnvaacutelasztaacutesa neacutelkuumll hasonloacute sejtes eloszlaacutesban

mutattaacutek ki (Burgunder eacutes Cheung 1994 Ding et al 2004 Gibb and Garthwaite 2001

Pifarreacute et al 2007) Szubcellulaacuteris szinten az NOsGC elsősorban a glutamaacuteterg

szinapszisok preszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkedik el (Burette et al 2002) Az

47

NOsGC szaacutemos kinaacutez foszforilaacutecioacutes ceacutelpontjai de fizioloacutegiaacutes szabaacutelyozaacutesuk nagy reacutesze

meacuteg felderiacuteteacutesre vaacuter Ismert a cAMP-fuumlggő protien kinaacutez (PKA) guanilaacutet-ciklaacutez

aktivitaacutesra kifejtett noumlvelő hataacutesa eacutes az M2 muszkarinos AchR Src-kinaacutezon keresztuumlli

gaacutetloacute hataacutesa

III55 A nitrogeacuten-monoxid terjedeacuteseacutenek leaacutelliacutetaacutesa szoumlveti elnyelődeacutese

Koraacutebban sokan azzal eacuterveltek hogy az NO-nak nincs szuumlkseacutege lebontoacute

folyamatokra hiszen reaktivitaacutesaacuteboacutel koumlvetkezően uacutegyis roumlvid időn beluumll veacuteges a hataacutesa

A nanomoacutelos eacutes kisebb tartomaacutenyokban amit most fizioloacutegiaacutesnak tekintenek mint maacuter

emliacutetettem az NO hataacuterozottan nem reaktiacutev iacutegy ezzel a keacuterdeacutessel foglalkozni kell

Egyetlen ismert reakcioacuteja van az alacsony koncentraacutecioacutejuacute NO-nak is ROS termeacutekkel

(keacutemiai NO-elnyelődeacutes) de az is joacuteteacutekony hataacutesuacute a lipid-peroxyl gyoumlkoumlk megkoumlteacuteseacutevel

megaacutelliacutetja a lipid-peroxidaacutecioacutet Az NO enzimatikus elnyelődeacuteseacutenek egyik ismert eleme

az oxi-hemoglobin mely NO hataacutesaacutera nitraacutet keacutepződeacutese mellett methemoglobinnaacute

alakul A folyamat nagyon gyors de az erek taacutevolsaacutega miatt az NO feacutel-eacuteletideje ~1 s

alakulna miacuteg a valoacutesaacutegban enneacutel sokkal hamarabb lecseng az NO-jel (agyszoumlvetben 6-

60 ms alatt (Garthwaite 2008) Mostansaacuteg laacutetott napvilaacutegot hogy a piramissejtek is

tartalmaznak hemoglobint de ennek szerepe eacutes jelentőseacutege az NO megkoumlteacuteseacuteben meacuteg

nem tisztaacutezott (Schelshorn et al 2009) Ezen kiacutevuumll az agyszoumlvet olyan feheacuterjeacuteit hoztaacutek

meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe az NO megkoumlteacuteseacutevel mint a lipooxigenaacutez (LOX) prosztaglandin-H

szintaacutez vagy a citokroacutem-c oxidaacutez illetve egyeacuteb metalloproteinek A pontos

mechanizmus amelyen keresztuumll ezekkel az enzimekkel az NO reagaacutelna nem

egyeacutertelmű (Hall eacutes Garthwaite 2009)

III56 NO indukaacutelta maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak

Az NOsGC a hippokampaacutelis neuronokban az egyetlen enzim ami cGMP

termeleacutesre keacutepes iacutegy a keletkező neuronaacutelis cGMP az NO hataacutesaacutenak a koumlvetkezmeacutenye

(5 aacutebra) A cGMP ezt koumlvetően toumlbb maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalat aktivaacutelhat A

cGMP direket hataacutest fejt ki a ciklikus nukleotid-fuumlggő ioncsatornaacutekra (CNG) vagy a

hiperpolarizaacutecioacute-aktivaacutelta ciklikus nukleotid-modulaacutelta csatornaacutekra (HCN) A

48

legszeacutelesebb koumlrű hataacutes a cGMP-fuumlggő protein kinaacutezon (PKG) keresztuumll toumlrteacutenik A

PKG enzimek koumlzuumll a PKG1β eacutes a PKG II talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (de Vente

et al 2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKG szubsztraacutetjai koumlzeacute

tartoznak preszinaptikusan a vezikula felszabadulaacutesban szerepet jaacutetszoacute feheacuterjeacutek koumlzuumll a

VASP RhoA eacutes septin3 posztszinaptikusan az LTP eacutes a sejt bdquotuacuteleacuteleacuteseacutet hordozoacute jelrdquo

kialakiacutetaacutesaacuteban reacuteszt vevő IP3R protein-foszfataacutez 1 2 (PP12) CREB Akt stb

(Hardingham eacutes Bading 2003 Schlossmann eacutes Hofmann 2005) A cGMP visszahat

sajaacutet lebontoacuteenzimjeire is a foszfodieacuteszteraacutez (PDE) 2 eacutes 5 aktivitaacutesaacutenak fokozaacutesaacuteval

sajaacutet lebontaacutesaacutet gyorsiacutetja miacuteg a PDE3 gaacutetlaacutesaacuteval a cAMP hidroliacuteziseacutet lassiacutetja noumlvelve a

cAMP szintjeacutet A cAMP-cGMP araacutenyok eltolaacutesa uacutejabb szabaacutelyozaacutesi uacutetvonalakat nyit

meg A cGMP lebontaacutesaacuteban a PDE 12356910 eacutes 11 vehet reacuteszt (Domek-Łopacińska

eacutes Strosznajder 2005 Van Staveren et al 2003) A maacutesodlagos uacutetvonalak hataacutesa

minden esetben attoacutel fuumlgg hogy az adott terminaacutelispopulaacutecioacuteban a repertoaacuter mely

elemei vannak jelen Terminaacutelistoacutel fuumlggően ezen adatok joacute reacutesze azonban meacuteg nem aacutell

rendelkezeacutesre a szakirodalomban

III57 A NO fizioloacutegiai hataacutesai

Mivel az NO rendkiacutevuumll gyorsan szabadon diffundaacutel kis taacutevolsaacutegra pre-eacutes

posztszinaptikus hataacutesait egyaraacutent figyelembe kell venni iacutegy a jelaacutetvitel fő

meghataacuterozoacuteja a felszabadulaacutes pontos helye illetve a receptor szubcellulaacuteris

elhelyezkedeacutese A NO koumlzponti idegrendszerben azon beluumll is elsősorban a retrograacuted

jelaacutetvitelben betoumlltoumltt szerepeacuteről esik majd szoacute de nem keveacutesbeacute fontos a NO koumlrnyeacuteki

(autonoacutem) idegrendszerben betoumlltoumltt anterograacuted jelaacutetviteleacutenek szerepe sem (Blottner

1999)

III571 nNOS tartalmuacute interneuronok a hippokampuszban eacutes szerepuumlk a

neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

nNOS tartalmuacute interneuronok koumlzeacute tartozik a dendritikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll az

Ivy eacutes a neurogliaform sejt valamint a vetiacutető gaacutetloacutesejtek koumlzuumll a visszavetiacutető-sejt

49

Morfoloacutegiaacutejuk a III341 eacutes III344 alfejezetben a neuronhaacuteloacutezat műkoumldeacuteseacuteben

betoumlltoumltt homeosztatikus szerepuumlk pedig a III355 alfejezetben keruumllt taacutergyalaacutesra

III572 Az NO jelaacutetvitel szerepe a glutamaacuteterg szinapszisok plaszticitaacutesaacuteban

A nitrogeacuten-monoxid a szinaptikus plaszticitaacutes szaacutemos molekulaacuteris

mechanizmusaacuteban reacuteszt vesz beleeacutertve a hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutest (long-term

potentiation LTP) eacutes a hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus gyenguumlleacutest (long-term depression LTD)

ezaacuteltal keacutepes lehet befolyaacutesolni a tanulaacutesi eacutes memoacuteriafolyamatokat (Bon eacutes Garthwaite

2003 Doyle et al 1996 Edwards eacutes Rickard 2007 Hawkins et al 1998 Prast eacutes

Philippu 2001) Ezen folyamatok neuronaacutelis ceacuteleleme a hippokampaacutelis piramissejtek

haacuteloacutezata A koumlzponti idegrendszerben a nitrogeacuten-monoxid hataacutesa aacuteltalaacutenosan a

glutamaacuteterg szinapszisok retrogaacuted jelaacutetviteleacutehez koumlthető amikor is az NO a

posztszinaptikus oldalon keacutepződik eacutes a preszinaptikus neurotranszmitter felszabadulaacutest

szabaacutelyozza A szinaptikus plaszticitaacutes kialakulaacutesa soraacuten a legtoumlbb esetben pre- eacutes

posztszinaptikus vaacuteltozaacutesok is veacutegbemennek eacutes az NO adott agyteruumllettől eacutes sejttiacutepustoacutel

fuumlggően mindkeacutet folyamatban reacuteszt vehet Tovaacutebb bonyoliacutetja a helyzetet hogy a

koumlzponti idegrendszerben az elteacuterő szinapszisokban rendelkezeacutesre aacutelloacute kuumlloumlnboumlző

effektor-rendszerek eacutes szabaacutelyozaacutesok miatt ugyanaz az NO-jel ellenteacutetes hataacutest vaacutelthat

ki Peacuteldaacuteul a kiagyban az NO cGMP-PKG1α uacutetvonalon az AMPA-receptorok

hosszuacutetaacutevuacute foszforilaacutecioacutejaacutet ideacutezi elő ami endocitoacutezisukhoz ezaacuteltal posztszinaptikus

LTD-hez vezet Ezzel szemben a hippokampuszban az NO-cGMP-PKGII uacutetvonalon

kersztuumll az AMPA receptorok eacutes horgonyzoacute feheacuterjeacutek foszforilaacutecioacuteja a szinapszis

strukturaacutelis aacutetalakulaacutesaacutehoz eacutes az AMPA receptorok szinapszisba eacutepiacuteteacuteseacutehez vezet ami

nagyobb amplituacutedoacutejuacute glutamaacuteterg aacuteramokhoz koumlvetkezeacuteskeacutepp posztszinaptikus

(NMDAR-fuumlggő) LTP kialakulaacutesaacutehoz vezet A hippokampaacutelis piramissejtekben a

posztszinaptikus LTP hosszuacutetaacutevuacute fenntartaacutesaacutehoz geacutenexpresszioacutes vaacuteltozaacutesok is

szuumlkseacutegesek mely a CREB (ldquocAMP response element binding proteinrdquo) transzkripcioacutes

faktor PKG-n keresztuumlli foszforilaacutecioacute reacuteveacuten valoacutesul meg Az NO preszinaptikus hataacutesait

szinteacuten kettősseacuteg uralja A hippokampaacutelis NMDAR-fuumlggő LTP soraacuten a preszinaptikus

NO-PKG uacutetvonalon a preszinaptikus aktiacutev zoacutena struktuacuteraacutelis feleacutepiacuteteacuteseacuteben reacuteszt vevő

feheacuterjeacutek (VASP RhoA) eacutes a kalcium-csatornaacutek modulaacutecioacuteja a glutamaacutet felszabadulaacutes

50

noumlvekedeacuteseacutehez vezet Ugyanezen szinapszisban az NO a glutamaacutet-uumlriacuteteacutes csoumlkkeneacuteseacutet

preszinaptikus LTD-t is ki tudott vaacuteltani (Zhang et al 2006) Az NMDA-NO indukaacutelta

LTP kivaacuteltaacutesaacuteban valoacutesziacutenűleg mindkeacutet NOsGC heterodimer reacuteszt vesz mert baacutermelyik

receptor genetikai kiuumlteacutese az LTP eltűneacuteseacutet okozta (Garthwaite 2008)

III6 N-metil-D-aszpartaacutet (NMDA) tiacutepusuacute glutamaacutet receptorok

Az NMDA receptorok az ionotroacutep glutamaacutet-receptorok csalaacutedjaacuteba tartoznak

vagyis aktivaacutecioacutejukat (agonista koumltődeacuteseacutet) koumlvetően ioncsatornakeacutent viselkednek A

receptornak toumlbb kuumlloumlnlegesseacutege van Az egyik hogy nagy a kalcium-permeaacutebilitaacutesa

iacutegy naacutetrium eacutes kaacutelium mellett elsősorban kalcium-ionokat enged aacutet a poacuterusaacuten A maacutesik

hogy poacuterusaacutet egy magneacutezium-ion zaacuterja el ami csak megfelelő depolarizaacutecioacute hataacutesaacutera

taacutevozik eacutes csak ezutaacuten indulhat meg az ionaacuteramlaacutes A harmadik hogy keacutet kuumlloumlnboumlző

agonista koumltődeacutese szuumlkseacuteges az aktivaacutecioacutejaacutehoz glicin (vagy D-szerin) eacutes glutamaacutet (vagy

aszpartaacutet) E speciaacutelis tulajdonsaacutegok reacuteveacuten az NMDA receptorok feszuumlltseacuteg- eacutes

ligandfuumlggő kalcium-csatornaacutek amik koincidencia-detektorkeacutent viselkednek hiszen a

pre- eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes aktivitaacutesa erősen noumlveli kinyiacutelaacutesuk valoacutesziacutenűseacutegeacutet

III61 NMDA receptorok feleacutepiacuteteacutese alegyseacutegek szerkezete

Az NMDA receptoroknak haacuterom alegyseacuteg-csalaacutedja van a GluN1 (koraacutebbi

nevezeacutektan alapjaacuten NR1 vagy δ1) GluN2 (koraacutebban NR2 vagy α) eacutes GluN3 (koraacutebban

NR3) A funkcionaacutelis NMDA receptorok heterotetramert alkotnak mely koumltelezően 2

GluN1 eacutes klasszikusan 2 GluN2 alegyseacutegből aacutellnak (Laube et al 1998 Monyer et al

1992) A GluN2 helyett GluN3 alegyseacuteget tartalmazoacute receptorok egeacuteszen maacutes receptort

hoznak leacutetre (laacutesd alaacutebb) A GluN1 alegyseacutegeket egyetlen geacuten koacutedolja ami viszont 8

lehetseacuteges aacutetiacuteroacutedaacutes utaacuteni hasiacutetaacutesi (splice) vaacuteltozattal rendelkezik (GluN1-1a-4a eacutes

GluN1-1b-4b (Dingledine et al 1999) A neacutegy GluN2 alegyseacuteget (GluN2A-D) neacutegy

kuumlloumln geacuten koacutedolja eacutes az alegyseacutegek teacuterben eacutes időben elteacuterő moacutedon expresszaacuteloacutednak A

keacutet GluN3 alegyseacuteget szinteacuten keacutet kuumlloumln geacuten koacutedolja

51

7 Aacutebra Az NMDA receptor szerkezeti modellaacutebraacuteja

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis hetero-tetramert alkotnak Műkoumldeacutesuumlkhoumlz

neacutelkuumlloumlzhetetlen keacutet GluN1 alegyseacuteg a maacutesik keacutet helyen baacutermilyen GluN2 (vagy GluN3)

alegyseacuteg reacuteszt vehet a receptor alkotaacutesaacuteban Az alegyseacutegek alapszerkezete (domeacutenjei)

rendkiacutevuumll konzervatiacutev (N-terminaacutelis bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera Agonista-koumltő bdquokagyloacuterdquo-

struktuacutera Poacuterus-domeacuten eacutes C-terminaacutelis domeacuten) moacutedon eacutepuumllnek fel Az NMDA

receptorokat jellemző funkcionaacutelis heterogenitaacutes az alegyseacutegek feheacuterjeszerkezeteacuteben

kiemelt helyeken toumlrteacutenő vaacuteltozaacutesokra vezethető vissza a receptorok affinitaacutesaacutenak eacutes

kinetikaacutejaacutenak vaacuteltozaacutesait eredmeacutenyezve A keacutet bdquokagyloacuterdquo-struktuacutera zaacuteroacutedaacutesaacutenak-

nyitoacutedaacutesaacutenak koumlvetkezteacuteben leacutetrejoumlvő molekulaacuteris feszuumlltseacuteg huacutezoacuteerő hataacuterozza meg a

poacuterus aacutellapotaacutet (Moacutedosiacutetva Paoletti eacutes Neyton 2007)

52

A heterodimerek oumlsszeaacutelliacutetaacutesaacuteban kuumlloumlnboumlző GluN1 izoformaacutek (de bdquoardquo eacutes bdquobrdquo

tiacutepus egyszerre nem (Blahos eacutes Wenthold 1996 Chazot eacutes Stephenson 1997) eacutes

kuumlloumlnboumlző GluN2 alegyseacutegek is reacuteszt vehetnek melyek ezt koumlvetően heterotetramert

alkotnak A molekulaacuteris komplex kapcsoloacutedaacutesa keacutetfeacutele keacuteppen is leacutetrejoumlhet a bdquonem

alternaacuteloacuterdquo esetben a keacutet GluN1 eacutes GluN2 egymaacutes mellett helyezkedik el (GluN1

GluN1 GluN2 GluN2) az bdquoalternaacuteloacuterdquo modellben pedig felvaacuteltva (GluN1 GluN2

GluN1 GluN2) azonban a funkcionaacutelis receptorban az alegyseacutegek alternaacutelva

helyezkednek el (Riou et al 2012 Sobolevsky et al 2009)

Az alegyseacutegek modulaacuteris feleacutepiacuteteacutese megegyezik neacutegy domeacuten vesz reacuteszt az

alkotaacutesukban (7 aacutebra) az extracellulaacuteris N-terminaacutelis domeacuten (NTD) az agonista-koumltő

domeacuten (AKD) a poacuterus-domeacuten eacutes az intracellulaacuteris C-terminaacutelis domeacuten Az NTD nagy

vaacuteltozatossaacutegot mutat eacutes az egyes alegyseacutegek tulajdonsaacutegainak meghataacuterozaacutesaacuteban

komoly szerepet jaacutetszik Az alloszteacuterikus modulaacutetorok koumltőhelye talaacutelhatoacute a domeacuten

bdquomeacutelyeacutenrdquo mely koumltődeacutes hataacutesaacutera kagyloacuteszerű feleacutepiacuteteacutese nyiacutelt-zaacutert aacutellapotok koumlzt

vaacuteltozik Az AKD hasonloacutean kagyloacuteszerű szerkezettel rendelkezik aminek a meacutelyeacuten az

egyes agonista-koumltő helyek talaacutelhatoacutek (A GluN1 eseteacuteben glicinD-szerin a GluN2

eseteacuteben glutamaacutetaszpartaacutet a GluN3 eseteacuteben szinteacuten glicin) A poacuterus domeacutent haacuterom

transzmembraacuten szegmens (M1-M3-M4) eacutes egy intracellulaacuteris hurok (M2) alkotja ami a

csatorna kialakiacutetaacutesaacuteban vesz reacuteszt Az intracellulaacuteris domeacuten a legvaacuteltozeacutekonyabb

hosszaacutet tekintve eacutes elsősorban a membraacutenba szaacutelliacutetaacutesban a lehorgonyzaacutesban eacutes a

jelaacutetvivő-komplexekhez valoacute csatlakozaacutesban jaacutetszik szerepet (Lau eacutes Zukin 2007 Ryan

et al 2008)

A csatorna nyitaacutesa a koumlvetkezőkeacuteppen megy veacutegbe mindkeacutet agonista bekoumltődik

az AKD koumltőhelyekre melynek hataacutesaacutera a bdquokagyloacutekrdquo bezaacuteroacutednak Ez olyan molekulaacuteris

feszuumlltseacuteget okoz a receptorszerkezetben hogy gyakorlatilag bdquoszeacutethuacutezzardquo a poacuterus

domeacutent eacutes megnyitja a csatornaacutet Amikor alloszteacuterikus gaacutetloacuteszerek kapcsoloacutednak az

NTD-hez annak zaacuteroacutedaacutesaacutet okozva akkor az NTD-AKD koumlzoumltti aacutethidaloacute szekvencia

megfeszuumll eacutes nem engedi becsukoacutedni az AKD struktuacuteraacutejaacutet megakadaacutelyozva ezzel a

csatorna megnyiacutelaacutesaacutet (Ryan et al 2008)

53

III62 NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesa

Az NMDA receptorok funkcionaacutelis heterogenitaacutesaacutet elsősorban a GluN2

alegyseacutegek vaacuteltozatossaacutega adja Habaacuter elmeacuteletileg 8-feacutele GluN1 alegyseacuteg leacutetezhet az

izoformaacutek előfordulaacutesi gyakorisaacutega nem egyforma az bdquoardquo dominaacutel a bdquobrdquo-formaacuteval (ami

egy hozzaacuteadott N1 kazettaacuteval rendelkezik) szemben a GluN1-1 a rosztraacutelis (agykeacutereg

hippokampusz) a GluN1-4 a kaudaacutelis (agytoumlrzs kisagy) agyteruumlleteken van tuacutelsuacutelyban

(a GluN1-2 eacutes 1-3 nagyon ritkaacutek) Mivel a GluN1 alegyseacuteg elengedhetetlen az NMDA

receptor műkoumldeacuteseacutehez (a teljes GluN1 geacutenkiuumltoumltt aacutellat eacuteletkeacuteptelen) maacuter embrionaacutelis

kortoacutel megfigyelhető kifejeződeacutese A GluN2 alegyseacuteg neacutegy izoformaacuteja (GluN2A-2D)

egyreacuteszt elteacuterő teacuterbeli eacutes időbeli expresszioacutejaacuteval maacutesreacuteszt elteacuterő kinetikai

parameacutetereivel jaacuterul hozzaacute az NMDA receptorok vaacuteltozatossaacutegaacutehoz Az embrionaacutelis

fejlődeacutes soraacuten a GluN2B eacutes 2D vesz reacuteszt a receptoralkotaacutesban majd a posztnataacutelis

első-maacutesodik heacuteten (eacuteppen mikor a serkentő GABA-gaacutetloacute GABA aacutetalakulaacutes is zajlik) a

GluN2D nagymeacuterteacutekben a GluN2B kismeacuterteacutekben csoumlkken eacutes ezzel paacuterhuzamosan

megnő a GluN2A szintje A GluN2C szinteacuten a posztnataacutelis fejlődeacutes 2 heteacuteben vaacutelik

jelentősseacute expresszioacuteja a felnőtt aacutellatban a kisagyra eacutes a szagloacutegumoacutera koncentraacuteloacutedik

A GluN2D felnőttben maacuter csak szubkortikaacutelis teruumlleteken illetve interneuronokban

fejeződik ki (Paoletti 2011 Watanabe et al 1993) A GluN2 alegyseacutegek kinetikaacuteja eacutes

alloszteacuterikus modulaacutecioacuteja is igen elteacuterő A GluN2A alegyseacuteg gyors kinetikaacuteval

rendelkezik glutamaacutet aktivaacutecioacutejaacutet koumlvetően nagy amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes gyors lecsengeacutes

figyelhető meg ezt koumlveti a GluN2B majd GluN2C miacuteg a GluN2D-t maacuter kis

amplituacutedoacutejuacute aacuteram eacutes hosszuacute lecsengeacutesi idő jellemzi Elteacuterő a alegyseacutegek glutamaacutet-

eacuterzeacutekenyseacutege konduktanciaacuteja eacutes magneacutezium-szenzitivitaacutesa is Miacuteg a GluN2A eacutes 2B

poacuterusaacutet jelentősen gaacutetolja a magneacutezium-ion addig a maacutesik keacutet alegyseacuteg eseteacuteben ez

elenyeacutesző (Dingledine et al 1999 Paoletti 2011) A GluN2A termeacuteszetes specifikus

alloszteacuterikus modulaacutetora a cink-ion mely szinaptikusan vezikulaacuterisan uumlruumll a glutamaacutet

mellett szaacutemos esetben eacutes keacutepes az NTD-hez koumltődve annak zaacuteroacutedaacutesaacutet előideacutezni

(Paoletti 2011) A GluN2B cink-eacuterzeacutekenyseacutege elenyeacutesző mesterseacuteges gaacutetloacuteszere az

ifenprodil mely hasonloacute mechanizmussal hat az NTD-n A keacutet alloszteacuterikus gaacutetloacuteszer

annyira specifikus erre a keacutet alegyseacutegre hogy fizioloacutegiai kiacuteseacuterletekben egyeacutertelműen

meghataacuterozhatoacute az alegyseacutegek araacutenya A GluN2C eacutes 2D egyik modulaacutetorral szemben

54

sem mutat megfelelő affinitaacutest eacutes nem rendelkezik sajaacutet specikifkus

szabaacutelyozoacutemolekulaacuteval sem (Paoletti 2011)

A GluN3 alegyseacutegek pedig valoacutesziacutenűleg nem is glutamaacutet receptort formaacutelnak-

hiszen nincs glutamaacutet koumltőhelyuumlk- inkaacutebb glicin receptoroknak lenneacutenek tekinthetők

(laacutesd meacuteg III61 alfejezetben) ezen kiacutevuumll in vivo kifejeződeacutese eacutes műkoumldeacutese meacuteg

keacuterdeacuteses iacutegy a tovaacutebbiakban ezen alegyseacutegek alkotta receptorokroacutel nem esik szoacute

III63 NMDA receptorok szubcellulaacuteris elhelyezkedeacutese

Az NMDA receptorok az endoplazmatikus retikulumban (ER) toumlrteacutenő szinteacutezist

koumlvetően a sejtek plazmamembraacutenjaacuteba eacutepuumllnek be A membraacutenba szaacutelliacutetaacuteseacutert

lehorgonyzaacuteseacutert a receptor C-terminaacutelis domeacutenje felelős (Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004

Ryan et al 2008) A megfelelő membraacutentranszporthoz mind a GluN1 mind a GluN2

alegyseacutegre szuumlkseacuteg van GluN1 hiaacutenyaacuteban laacutetszoacutelag nem vaacuteltozik a GluN2 alegyseacutegek

mennyiseacutege lokalizaacutecioacuteja annaacutel inkaacutebb nem tudnak kileacutepni az ER-ből iacutegy abban

elektron-denz granulumokat keacutepeznek a membraacutenjeloumlleacutes megszűnik (Fukaya et al

2003) A GluN2 alegyseacuteg hiaacutenyaacuteban a receptorok szinaptikus beeacutepuumlleacutese seacuteruumllt valamint

a GluN1 alegyseacutegek gyors proteoliacutezise figyelhető meg (Abe et al 2004) Tehaacutet a

GluN1 C-terminaacutelisa elsősorban az ERmembraacuten iraacutenyuacute szaacutelliacutetaacuteseacutert a GluN2

alegyseacutegek C-terminaacutelisa pedig ndash PDZ koumltőhelyuumlk reacuteveacuten ndash a szinapszisba eacutepuumlleacuteseacutert eacutes a

GluN1 alegyseacuteg (eacutes ezaacuteltal a heterodimer majd a heterotertramer) stabilitaacutesaacuteeacutert felelős

NMDA receptorok nemcsak szinaptikusan de extraszinaptikusan is megfigyelhetők

ahol elteacuterő feladatokat laacutetnak el

III631 Szinaptikus NMDA receptorok

Az NMDA receptorok nagy reacutesze szinaptikusan a glutamaacuteterg szinapszisok

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban helyezkenek el Ahogy azt maacuter koraacutebban is

emliacutetettem a GluN1 eacutes GluN2 alegyseacutegek C-terminaacutelis domeacutenje bdquoiraacutenyiacutetjardquo az NMDA

receptorokat a posztszinaptikus denzitaacutesba ahol a szinapszis strukturaacutelis eacutes jelaacutetviteli

feheacuterjeacuteiből leacutetrejoumlvő molekulaacuteris komplexhez koumltődnek A GluN2 alegyseacuteg PDZ

koumltőhelyeacuten keresztuumll koumltődik az NMDA receptor a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez

55

(PSD-95 PSD-93 SAP-102 GRIP1 SSCAM) Ezek a feheacuterjeacutek szaacutemos PDZ domeacutennel

rendelkeznek amivel toumlbb feheacuterjeacutet szoros kapcsolatba hoznak A PSD-95 olyan

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteket koumlt a komplexbe (CRIP GKAP dinein koumlnnyű-laacutenc-DLC

neuroliginek stb) melyek a szinapszis strukturaacutelis eacutepuumlleacuteseacutet teszik lehetőveacute A maacutesik

fontos molekulacsoport amit a komplexhez koumltnek az NMDA-receptorok jelaacutetviteleacuteeacutert

felelős apparaacutetus az nNOS kalmodulin CaMKII stb (Valtschanoff eacutes Weinberg

2001) A jelaacutetvitel ceacutelelemeinek kompartmentalizaacutecioacutejaacuteval gyors eacutes hateacutekony jelaacutetvitel

eacutes szabaacutelyozaacutes joumln leacutetre A legelterjedtebb szinaptikus NMDA receptorok a

GluN1GluN2A eacutesvagy GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok A felnőtt

hippokampusz piramissejtjeiben is csak ezek az alegyseacutegek fordulnak elő (Ito et al

1997 Watanabe et al 1993) A kisagyban emellett meacuteg a GluN1GluN2C

alegyseacutegkompoziacutecioacute is jelentős A hippokampuszban a GluN1GluN2D kizaacuteroacutelag

interneuronokban az azokra eacuterkező serkentő szinapszisokban talaacutelhatoacute (Standaert et al

1996)

III632 Extraszinaptikus NMDA receptorok

Extraszinaptikus NMDA receptoroknak nevezzuumlk a glutamaacuteterg szinapszisoktoacutel

taacutevolabb a dendrittuumlskeacuteken kiacutevuumll eső dendritikus eacutes szomatikus NMDA receptorokat A

denrittuumlskeacuteken periszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok (~5) ugyanis a

glutamaacutet bdquotuacutelcsordulaacutesrdquo reacuteveacuten meacuteg koumlnnyen aktivaacuteloacutedhatnak szemben a valoacutedi

extraszinaptikus receptorokkal (Koumlhr 2006) Hippokampaacutelis piramissejtekben meacuterve az

extraszinaptikus NMDA receptorok araacutenya az oumlsszes NMDA receptor mintegy 36-a

(Harris and Pettit 2007) Koraacutebban azt gondoltaacutek hogy a szinaptikus-extraszinaptikus

receptorok alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlkben kuumlloumlnboumlznek egymaacutestoacutel a GluN2A tartalmuacuteak a

szinapszisban a GluN2B tartalmuacuteak azon kiacutevuumll helyezkedneacutenek el Meacuteg funkcionaacutelis

kuumlloumlnbseacuteggel is ellaacutettaacutek ezt a szeparaacutecioacutet a szinaptikus GluN2A felelne a plasztikus

folyamatokeacutert a GluN2B pedig a sejt halaacutelaacutehoz vezető tuacutelserkenteacuteseacutert

(ldquoexcitotoxicitaacutesrdquo) Mindkeacutet paradigmaacutet sokszorosan caacutefoltaacutek azoacuteta GluN2B tartalmuacute

receptorok jelen vannak a szinapszisban eacutes fontos szerepet jaacutetszanak az LTP

kialakulaacutesaacuteban eacutes a GluN2A tartalmuacute receptorok is jelentős mennyiseacutegben vannak

extraszinaptikusan (Koumlhr 2006) Araacutenyaikat tekintve nagyjaacuteboacutel 50-50 az eloszlaacutesa

56

mindkeacutet alegyseacutegnek mindkeacutet kompartmentben sőt meacuteg heterotrimer

(GluN1GluN2AGluN2B) receptrokat is kimutattak (Harris eacutes Pettit 2007) Ezenkiacutevuumll

a szinaptikus receptorok is keacutepesek reacuteszt venni a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (Koumlhr 2006)

Magyaraacutezatkeacutent laacutetott napvilaacutegot az NMDA receptorok mobilis termeacuteszete miszerint

vaacutendorolnak a keacutet kompartment koumlzoumltt (Tovar eacutes Westbrook 2002) amit szinteacuten

caacutefoltak Az NMDA receptorok viszonylag stabil reacuteszei a membraacutennak

szinaptikusextraszinaptikus elhelyezkedeacutesuumlkeacutert sokkal inkaacutebb a C-terminaacutelisukat

szabaacutelyozoacute mechanizmusok mintsem alegyseacutegoumlsszeteacuteteluumlk felelős (Harris eacutes Pettit

2007 Peacuterez-Otantildeo eacutes Ehlers 2004) A GluN2 alegyseacuteg kuumlloumlnboumlző tirozinjainak

(Tyr1472Tyr1336) foszforilaacutecioacutejaacuteval specifikusan tudtaacutek az NMDA receptorok

szinaptikusextraszinaptikus szaacutelliacutetaacutesaacutet előideacutezni (Goebel-Goody et al 2009) Az

extraszinaptikus NMDA receptorokat jelenleg a gliaacutelis eredetű glutamaacutet eacuterzeacutekeleacuteseacuteben

tartjaacutek fontosnak Az asztroglia sejtek a szinapszisokat (serkentőt eacutes gaacutetloacutet egyaraacutent)

koumlrbefogva pontosan eacuterzeacutekelik a haacuteloacutezati aktivitaacutesokat eacutes szinciacuteciumuk reacuteveacuten ezt

koumlzvetiacutetik is a piramissejt haacuteloacutezatra A piramissejtekben kialakuloacute kismeacuterteacutekű kalcium-

aacuteram extraszinaptikus eredetű eacutes NMDA receptor fuumlggő mechanizmus eacutes reacuteszt vesz a

piramissejtek szinkronizaacutecioacutejaacuteban eacutes segiacuteti a plasztikus folyamatokat is (Auld eacutes

Robitaille 2003 Fellin et al 2004)

III64 Az NMDA receptorok fizoloacutegiai hataacutesai

Az NMDA receptorok szaacutemos fizioloacutegiaacutes eacutes patoloacutegiaacutes folyamatban reacuteszt

vesznek iacutegy hataacutesaik ismerete neacutelkuumlloumlzhetetlen teraacutepiaacutes ceacutelpontkeacutent valoacute

alkalmazaacutesukban Klinikai kutataacutesok koumlzpontjaacuteban aacutell a kognitiacutev folyamatok

helyreaacutelliacutetaacutesaacutet ceacutelzoacute NMDA receptor-aktivaacutecioacute Alzheimer-demenciaacuteban eacutes

szkizofreacuteniaacuteban (a szkizofreacutenia kognitiacutev tuumlneteieacutert az NMDA receptor alulműkoumldeacutest

teszik felelősseacute) illetve az NMDA-receptorok gaacutetlaacutesa az iszkeacutemiaacuteshipoxiaacutes kaacuterosodaacutes

okozta koacuteros tuacutelserkenteacutesben

57

III641 NMDA receptorok szerepe a hosszuacutetaacutevuacute plasztikus vaacuteltozaacutesokban

Az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja feszuumlltseacuteg- eacutes ligandfuumlggeacutesuumlk miatt a glutamaacutet

(eacutes glicin) koumlteacuteseacutetől oumlnmagaacuteban nem koumlvetkezik be Előszoumlr az AMPA receptorok

aktivaacutecioacuteja megy veacutegbe ez biztosiacutetja a kellő depolarizaacutecioacutet az NMDA receptorok Mg2+

-

blokkjaacutenak kiloumlkődeacuteseacutehez A depolarizaacutecioacute maacutes tuumlskeszinapszis ingeruumlleteacuteből eacutes

visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelboacutel is szaacutermazhat (ldquocsendesrdquo szinapszisok eseteacuteben

AMPA receptorok szinaptikus hiaacutenyaacuteban kizaacuteroacutelag ez a mechanizmus eacuterveacutenyesuumll) Az

időbeliseacuteg rendkiacutevuumll fontos annak meghataacuterozaacutesaacuteban hogy hosszuacutetaacutevuacute megerősoumldeacutes

(LTP) vagy gaacutetlaacutes (LTD) alakul ki nagy frekvenciaacutes stimulaacutecioacute megerősoumldeacutest alacsony

frekvenciaacutes ingerleacutes gaacutetlaacutest vaacutelt ki Toumlbb ezer molekulaacutet azonosiacutetottak maacuter aminek koumlze

lehet ezen folyamatok kialakiacutetaacutesaacutehoz eacuteppen ezeacutert nagyon neheacutez meghataacuterozni mi az

ami teacutenyleg neacutelkuumlloumlzhetetlen eacutes mi tekinthető ldquocsakrdquo szabaacutelyozoacute folyamatnak (Nicoll

eacutes Roche 2013) Megproacutebaacutelok kiemelni egy-keacutet aacuteltalaacutenosan elfogadott mechanizmust

amit szorosan kapcsolnak az LTPLTD-hez Az NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis

kalcium beaacuteramlaacutes NO termelődeacutest vaacutelt ki ami ezt koumlvetően cGMP termelődeacuteseacutehez

vezet a hippokampuszban (East eacutes Garthwaite 1991) Az NO hataacutesaacutera bekoumlvetkező

hosszuacutetaacutevuacute vaacuteltozaacutesokat maacuter a III572 alfejezetben is ismertettem Az NO hataacutesain

kiacutevuumll posztszinaptikusan a kalcium-kalmodulin koumltődeacutes koumlvetkezteacuteben aktivaacuteloacutedik a

kalcium-kalmodulin kinaacutez II (CaMKII) mely autofoszforilaacutecioacuteval jaacuter eacutes ezt koumlvetően

kalcium-fuumlggetlen konstitutiacutev aktivitaacutesra tesz szert Szubsztraacutetjainak foszforilaacutecioacuteja

(valoacutesziacutenűleg a RhoA jaacutetsza a főszerepet) az AMPA receptorok exocitoacutezisaacutet okozza

maacuteig feltaacuteratlan mechanizmus alapjaacuten (Nicoll eacutes Roche 2013)

Ezen kiacutevuumll megfigyelhető a szinapszis aacuteteacutepuumlleacutese is a szorosan koumltoumltt

citoszkeletaacutelis feheacuterjeacuteknek koumlszoumlnhetően Ennek eredmeacutenyekeacuteppen nemcsak a

posztszinaptikus receptorok dokkolaacutesa (AMPA NMDA) koumlnnyebb de a szinapszis

teacutenyleges megnagyobbodaacutesa megerősoumldeacutese is leacutetrejoumln pl az SSCAM aacuteltal a komplexbe

koumltoumltt neuroliginek reacuteveacuten ami oumlnmagaacuteban a szinapszis meacutereteacutet keacutepes szabaacutelyozni a

preszinaptikus neurexin-β-val pedig struktuacuteraacutelisan ldquotartja oumlsszerdquo a szinapszist (Bang eacutes

Owczarek 2013) A neuroligin-neurexin kapcsolat seacuteruumlleacutese az LTP gyenguumlleacuteseacutehez

vezet (laacutesd III412 alfejezetben) Az LTD kialakulaacutesaacuteban a magas intracellulaacuteris

kalcium aktin depolimerizaacutecioacutera kifejtett hataacutesaacutet veszik alapul ami a szinapszis

58

strukturaacutelis gyenguumlleacuteseacutehez eacutes az NMDA receptorok eltaacutevoliacutetaacutesaacutehoz vezet Ez a kalcium

aacuteltalaacuteban nemcsak NMDA receptoroktoacutel szaacutermazik hanem belső raktaacuterakboacutel is

metabotroacutep receptorok paacuterhuzamos aktivaacutecioacuteja reacuteveacuten (mAchR mGluRI-csoport Hunt

eacutes Castillo 2012)

III642 NMDA receptorok szerepe a koacuteros tuacutelserkenteacutesben (excitotoxicitaacutes)

Az NMDA receptorok tuacutelzott aktivaacutecioacuteja fizioloacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt nem

joumln leacutetre a glutamaacutet visszaveacutetel eacutes a jelaacutetvitelt posztszinaptikusan szabaacutelyozoacute negatiacutev

visszacsatolaacutessal műkoumldő enzimrendszerek miatt Patholoacutegiaacutes koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt ndash

oxigeacutenhiaacuteny (hipoxia) vagy oxigeacuten- eacutes veacuterellaacutetaacutes hiaacutenya (iszkeacutemia) miatt- azonban a joacutel

szabaacutelyozott rendszerek felborulnak A glutamaacutet felhalmozoacutedaacutesa reacuteszben a transzporter

mechnizmusok gaacutetlaacutesaacutenak reacuteszben ellenteacutetes műkoumldeacutesuumlknek (kifeleacute pumpaacuteljaacutek a

glutamaacutetot) koumlszoumlnhető mely az NMDA receptorok (szinaptikus eacutes extraszinaptikus

receptorok egyaraacutent) permanens aktivaacutecioacutejaacutehoz eacutes koumlvetkezmeacutenyes kalcium

beaacuteramlaacuteshoz vezet Miacuteg a fizioloacutegiaacutes kalcium mindig Ca2+

-kalmodulin kapcsoloacutedaacuteson

keresztuumll fejti ki hataacutesaacutet ilyenkor a tuacutelzott mennyiseacutegű kalcium direkt hataacutesai

dominaacutelnak Az nNOS-NO rendszer folyamatos aktivaacutelaacutesa tuacutelzott NO termelődeacuteshez

vezet Az NMDA receptorok eacutes nNOS negatiacutev visszacsatoloacute szabaacutelyozaacutesa a magas

kalcium-szint miatt nem műkoumldnek A magas intracellulaacuteris kalcium koncetraacutecioacute

koumlvetkezteacuteben a mitokondrium kalcium felveacutetele fokozoacutedik csoumlkken a

membraacutenpotenciaacutel-kuumlloumlnbseacutege ezzel leaacutell az ATP-szinteacutezis sőt meg is fordulhat a

folyamat a maacuter megleacutevő ATP molekulaacutek bontaacutesaacuteval Az elektrontranszport-laacutenc

kisiklaacutesaacuteval megnő a reaktiacutev oxigeacutengyoumlkoumlk (ROS) termeleacutese ami a maacuter jelentős

mennyiseacutegű NO-dal koumllcsoumlnhatva peroxi-nitritteacute alakul tovaacutebbi sejtkaacuterosodaacutest ideacutezve

elő Egyuumlttesen ezek a folyamatok irreverzibilis vaacuteltozaacutest eacutes az apoptoacutezis beindiacutetaacutesaacutet

(kaszpaacutez-kaszkaacuted) eredmeacutenyezik a sejt halaacutelaacutehoz vezetve (Hardingham eacutes Bading

2003 Papadia eacutes Hardingham 2007)

59

IV CEacuteLKITŰZEacuteSEK

A piramissejtekre eacuterkező gaacutetlaacutes alapvető fontossaacuteguacute a haacuteloacutezati szinkron-

műkoumldeacutesekhez (pl theacuteta-oszcillaacutecioacute) Ha egy piramissejt valoacutes informaacutecioacutet koacutedol (pl

teacuter-informaacutecioacute) az erős periszomatikus gaacutetlaacutes elleneacutere is keacutepes a tuumlzeleacutesre a populaacutecioacutes

szinkron kisuumlleacuteshez keacutepest a theacuteta koraacutebbi faacutezisaacuteban (faacutezis-előretoloacutedaacutes) ezaacuteltal a

koacutedolt informaacutecioacute bdquobeeacuteg a haacuteloacutezatbardquo hosszuacutetaacutevuacute szinaptikus vaacuteltozaacutesok joumlhetnek leacutetre

A faacutezis-előretoloacutedaacutes molekulaacuteris haacutettereacuteben olyan folyamatok valoacutesziacutenűsiacutethetők

melyek a piramissejt aktivitaacutesaacutetoacutel fuumlggően retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonalak beindiacutetaacutesaacuteval

jaacuter mely felszabadiacutetja a piramissejtet az erős periszomatikus gaacutetlaacutes aloacutel Ilyen a

GABAerg szinapszisokban is joacutel felteacuterkeacutepezett retrograacuted rendszer az endokannabinoid

rendszer ami a periszomatikus gaacutetloacutesejtek koumlzuumll csak a kolecisztokinin (CCK)

tartalmuacuteak szinapszisaiban talaacutelhatoacute meg Egy maacutesik a serkentő szinapszisok

plaszticitaacutesaacuteban jelentős szereppel biacuteroacute retrograacuted jelaacutetviteli uacutetvonal a nitrogeacuten-monoxid

jelpaacutelya Miacuteg a serkentő (glutamaacuteterg) szinapszisokban betoumlltoumltt szerepeacuteről hatalmas

szakirodalom talaacutelhatoacute mindezidaacuteig nem vizsgaacuteltaacutek gaacutetloacute (GABAerg) szinapszisokban

valoacute előfordulaacutesaacutet Fő keacuterdeacutesuumlnk tehaacutet az volt megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid

rendszer az oly fontos periszomatikus gaacutetloacutesejtek szinapszisaiban mutat-e sejtspecikus

eloszlaacutest mint az endokannabinoid rendszer vagy eacuteppen ellenkezőleg egy aacuteltalaacutenos

retrograacuted uacutetvonalat keacutepvisel

Az alaacutebbi keacuterdeacuteseket tettuumlk fel

- megtalaacutelhatoacute-e a neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten

- mely periszomatikus szinapszispoulaacutecioacute (CCKPV) fejez ki nNOS-t

- megtalaacutelhatoacute-e a nitrogeacuten-monoxid receptora a GABAerg terminaacutelisokban

- mely GABAerg alpopulaacutecioacutek fejezik ki a receptort eacutes

- milyen alegyseacuteg-oumlsszeteacutetellel rendelkezik az NO receptor ezekben a sejtekben

A nitrogeacuten-monoxid jelpaacutelya aktivaacutelaacutesa az intracellulaacuteris kalcium-koncentraacutecioacute

fuumlggveacutenye A tovaacutebbiakban arra kerestuumlk a vaacutelaszt milyen kalcium forraacutesok

60

vezethetnek NO szinteacutezishez A serkentő szinapszisokban az nNOS aktivaacutelaacutesa NMDA

receptorokon keresztuumll az extracellulaacuteris teacuterből lokaacutelisan beaacuteramloacute kalcium

kalmodulinhoz valoacute koumltődeacuteseacutevel toumlrteacutenik

A maacutesodik kiacuteseacuterletsorozatban arra voltunk kiacutevaacutencsiak a GABAerg szinapszisokban

is keacutepes-e betoumllteni az NMDA receptor ezt a szerepet

Keacuterdeacuteseink az alaacutebbiak voltak

- fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletben NMDA adagolaacutes keacutepes-e beindiacutetani az NO-rendszert

a GABAerg szinapszisokban

- anatoacutemiai moacutedszerekkel kimutathatoacute-e az NMDA receptor a piramissejtek

periszomatikus GABAerg szinapszisaiban posztszinaptikusan

- milyen alegyseacutegek vesznek reacuteszt ezen receptorok alkotaacutesaacuteban

- kvantitatiacutev moacutedon a periszomatikus szinapszisok mekkora haacutenyada rendelkezik

NMDA receptorokkal

- interneuron specifikus-e az NMDA receptorok GABAerg szinapszisokban valoacute

megjeleneacutese vagy aacuteltalaacutenos mechanizmusroacutel van szoacute

Keacuterdeacuteseink megvaacutelaszolaacutesaacutehoz kvalitatiacutev (beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes

immunperoxidaacutez moacutedszer) eacutes kvantitatiacutev ( beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany eacutes fagyasztva

toumlrt replika immunarany moacutedszer) anatoacutemiai moacutedszereket molekulaacuteris bioloacutegiai

moacutedszert (in situ hibridizaacutecioacute) eacutes farmakoloacutegiai (in vitro fizioloacutegiaacutes tuacuteleacutelő szeletek drog-

kezeleacutese) kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk

61

V KIacuteSEacuteRLETI MOacuteDSZEREK

V1 Kiacuteseacuterleti aacutellatok

A kiacuteseacuterleti aacutellatok felhasznaacutelaacutesa minden esetben az Inteacutezet Etikai Koacutedexeacutenek a

magyarorszaacutegi 1998 eacutevi XXVIII toumlrveacutenynek (az ldquoaacutellatok veacutedelmeacuteről eacutes kiacutemeacuteleteacuterőlrdquo)

illetve annak 2002 eacutevi moacutedosiacutetaacutesaacutenak (LXVIII aacutetv) eacutes a 2431998 (XII31)

Kormaacutenyrendeletnek megfelelően toumlrteacutent ami elveiben megegyezik az Euroacutepai

Koumlzoumlsseacutegek Tanaacutecsaacutenak EEC 609 szaacutemuacute Utasiacutetaacutesaacuteval (86609EEC ldquoUtasiacutetaacutes a

kiacuteseacuterleti eacutes maacutes tudomaacutenyos ceacutelra hasznaacutelt gerinces aacutellatok oltalmaacuterardquo 1986 November

24) A kiacuteseacuterletek soraacuten fiatal felnőtt hiacutem Wistar patkaacutenyokat (Charles River Budapest)

eacutes 30-60 nap koumlzoumltti fiatal felnőtt hiacutem C57BL6 egereket (MTA-KOKI Orvosi

Geacutentechnoloacutegiai Reacuteszleg) hasznaacuteltunk A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS)

geacutenkiuumltoumltt egerek a Jackson Laboratoacuteriumboacutel szaacutermaztak (Jax mice The Jackson

Laboratory Maine USA) A sejttiacutepus specifikus NMDA receptor 1 alegyseacuteg (GluN1)

geacutenkiuumltoumltt egeret melynek kizaacuteroacutelag az agykeacutergi serkentő sejteiből hiaacutenyzott a GluN1

alegyseacuteg (cxGluN1KO) maacuter koraacutebban jellemezteacutek (Iwasato et al 2000)

V2 Transzkardiaacutelis perfuacutezioacutek

Az aacuteltalaacutenos aneszteacuteziaacutet a replika kiacuteseacuterleteket kiveacuteve altatoacute kokteacutellal eacutertuumlk el

mely 25 ketamint 05xilazin-hidrokloridot 025 promethazinium-kloridot

00025 benzetonium-kloridot eacutes 0002 hydrochinonumot tartalmazott A kokteacutelt

intraperitoneaacutelisan alkalmaztuk 02 ml100 g testtoumlmeg araacutenyban A replika kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az aacutellatok altataacutesa naacutetrium-pentobarbitaacutel (50 mgkg) intraperitoneaacutelis

injektaacutelaacutesaacuteval toumlrteacutent Az aacutellatok transzkardiaacutelis fixaacutelaacutesaacutet fizioloacutegiaacutes soacuteoldattal toumlrteacutenő

gyors aacutetmosaacutes előzte meg (1-2 percig) majd ezt koumlvette a fixaacuteloacute oldattal valoacute perfuacutezioacute

A fixaacuteloacute oldat oumlsszeteacutetele az alaacutebbiak szerint vaacuteltozott a kuumlloumlnboumlző immunreakcioacutek

eseteacuteben a beaacutegyazaacutes előtti nNOS-immunarany reakcioacutehoz az egereket 1

paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M foszfaacutet-puffer (PB) oldattal (pH 74) perfundaacuteltuk

60 percig a beaacutegyazaacutes előtti ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez az immunfluoreszcens a

beaacutegyazaacutes előtti eacutes utaacuteni NMDA-R immunarany reakcioacutekhoz eacutes az in situ

62

hibridizaacutecioacutehoz 4 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M PB oldattal (pH 74)

perfundaacuteltunk 30 percig Az in situ hibridizaacutecioacutehoz hasznaacutelt oumlsszes oldat 01

diethylpyrocarbonate (DEPC)-tal lett kezelve 1 oacuteraacuten aacutet majd autoklaacutevozva lett A

beaacutegyazaacutes előtti NOsGCα1 alegyseacuteg immunperoxidaacutez jeloumlleacutes elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelataacutehoz előszoumlr 4 paraformaldehidet tartalmazoacute naacutetrium-acetaacutet pufferrel

(pH=60) perfundaacuteltunk 2 percig majd ezt koumlvette a 4 paraformaldehidet tartalmazoacute

Borax-puffer (pH=85) 40 percig A replika kiacuteseacuterletek eseteacuteben az eacuterrendszer aacutetmosaacutesa

09 naacutetrium-kloridot tartalmazoacute 25mM foszfaacutet-pufferrel (PBS) toumlrteacutent 1 percen

keresztuumll majd 2 paraformaldehidet eacutes 15 teliacutetett pikrinsavat tartalmazoacute 01 M PB

oldattal fixaacuteltuk az egereket 12 percen aacutet A replika kiacuteseacuterletek kiveacuteteleacutevel a fixaacuteloacute oldat

utaacuten 01 M PB oldattal perfundaacuteltuk aacutet az eacuterrendszert 10 percig Ezt koumlvetően az agy

eltaacutevoliacutetaacutesra keruumllt a koponyaacuteboacutel eacutes ezt utoacutelagos immerzioacutes fixaacutelaacutes neacutelkuumll koumlvette a

vibratoacutemos metszetkeacutesziacuteteacutes

V3 Antitestek specificitaacutesaacutenak vizsgaacutelata

A kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepusok megjeloumlleacuteseacutere hasznaacutelt elsődleges antitesteket

(kolecisztokinin parvalbumin szomatosztatin P-anyag receptor kannabinoid 1

receptor) a gyaacutertoacute laboratoacuteriumokban maacuter koraacutebban tesztelteacutek azok specifikusnak

bizonyultak eacutes munkaacutenk soraacuten mi is a vaacutert festődeacutesi mintaacutezatot kaptunk a

hippokampuszban Az nNOS antitestet nNOS geacutenkiuumltoumltt egereken teszteltuumlk eacutes nem

kaptunk jeloumlleacutest ezekben az aacutellatokban (9 aacutebra) A nitrogeacuten-monoxid szenzitiacutev guanilaacutet-

ciklaacutez (NOsGC) ellen keacuteszuumllt antitestek specificitaacutesaacutet szinteacuten teszteltuumlk (Reacuteszletes leiacuteraacutes

a VI3 fejezetben talaacutelhatoacute) A cGMP eacutes a glutaminsav-dekarboxilaacutez 65 (GAD65)

antitestek specificitaacutesaacutet koraacutebban maacuter alaposan megvizsgaacuteltaacutek (Chang and Gottlieb

1988 de Vente et al 1987 Tanaka et al 1997) A vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3

(vGluT3) antitest specificitaacutesaacutet vGluT3 geacutenkiuumltoumltt aacutellat felhasznaacutelaacutesaacuteval bizonyiacutetottuk

A GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg ellen keacuteszuumllt antitest szinteacuten specifikusan

jeloumllte meg a piramissejtek sejttesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisokat (Kasugai et al

2010)) Az NMDA receptor 1 (GluN1) 2A (GluN2A) eacutes 2B (GluN2B) alegyseacutegeacutenek C-

terminaacutelisa ellen termeltetett antitesteket koraacutebban maacuter alaposan tesztelteacutek immunoblot

antigeacuten-peptid teljes eacutesvagy reacutegioacute-specifikus geacutenkiuumltoumltt egerek segiacutetseacutegeacutevel mind

beaacutegyazaacutes előtti mind beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben (Abe et

63

al 2004 Akashi et al 2009 Fukaya et al 2003 Watanabe et al 1998) A beaacutegyazaacutes

előtti NMDA receptor immunarany kiacuteseacuterletekben ugyanazt az emeacuteszteacutesi protokolt

hasznaacuteltuk amit az antitestek teszteleacuteseacuteneacutel is hasznaacuteltak (Watanabe et al 1998)

Tovaacutebbi kontroll kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk hogy bizonyiacutetsuk hogy pontosan a mi kiacuteseacuterleti

koumlruumllmeacutenyeink koumlzt specifikus festődeacutest adnak-e az NMDA receptor antitestek

Fagyasztva-toumlreacuteses replikaacutekat keacutesziacutetettuumlnk vad tiacutepusuacute eacutes cxGluN1KO egerek

hippokampuszaiboacutel hogy a replika immunarany kiacuteseacuterletekben is bizonyiacutetsuk a GluN1

antitest specificitaacutesaacutet Nem talaacuteltunk szinaptikus aranyszemcseacuteket a piramissejteken eacutes

elhanyagolhatoacute mennyiseacutegű haacutetteacuter aranyszemcseacutet talaacuteltunk a piramissejtek sejttesteacuten

(15 aacutebra) Ezen kiacutevuumll a GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany jeloumlleacutes ugyanazt a

mintaacutezatot eacutes eloszlaacutest mutatta a szoumlvetben mindhaacuterom anatoacutemiai kiacuteseacuterletsorozatban

Tovaacutebbaacute a beaacutegyazaacutes utaacuteni (Lowicryl) immunarany kiacuteseacuterletekben uacutegynevezett

bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterleteket is veacutegeztuumlnk ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető metszetein

kuumlloumln-kuumlloumln keacutesziacutetettuumlnk GluN1 GluN2A eacutes GluN2B immunarany festeacutest Amennyiben

egy szinapszis pozitiacutevnak bizonyult valamelyik alegyseacutegre azt a szinapszist

megvizsgaacuteltuk a maacutesik alegyseacuteg jeloumlleacutesre a szomszeacutedos metszeteken Habaacuter

meglehetősen valoacutesziacutenűtlen hogy ezzel a moacutedszerrel ugyanazon receptor molekula keacutet

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeacutet megjeloumlljuumlk arra meacutegis alkalmas hogy a kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeket

egyazon szinapszisban kimutassuk Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a GluN2 jeloumllt

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben megtalaacutelhatoacute volt a GluN1 alegyseacuteg is a szomszeacutedos

metszetek egyikeacuten (16 aacutebra E 23 szinapszisboacutel 12 pozitiacutev 2 egeacuter) vagyis a haacuterom

antitest ugyanazt a sejtmembraacuten domeacutent jeloumlli ami tovaacutebb bizonyiacutetja az antitestek

specificitaacutesaacutet

Vizsgaacuteltuk tovaacutebbaacute a fluoreszcens eacutes arany-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

lehetseacuteges keresztreakcioacuteit egymaacutessal vagy a maacutesik elsődleges antitesttel a kettős

jeloumlleacuteses kiacuteseacuterletekben Egyik esetben sem talaacuteltunk keresztreakcioacuteit Az antitestekkel

kapott specifikus jeloumlleacutes nem volt megfigyelhető az elsődleges antitestek hiaacutenyaacuteban

illetve a fluoreszcens kiacuteseacuterletek eseteacuteben meacuteg az autofluoreszcencia jelenseacutege is

kizaacuterhatoacute volt

64

V4 Farmakoloacutegiai hatoacuteanyagok

A tuacuteleacutelő hippokampusz szeletek farmakoloacutegiai befolyaacutesolaacutesaacutehoz a koumlvetkező

hatoacuteanyagokat hasznaacuteltuk az IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) BAY-736691 L-

arginine L-NAME (L-NG-Nitroarginine methyl-ester-hydrochloride) eacutes az MK801 a

Sigma-Aldrich termeacuteke Az NMDA D-AP5 (D-(-)-2-Amino-5-phosphonopentanoic

acid) ODQ (1H-[124]Oxadiazolo[43-a]quinoxalin-1-one) nifedipin eacutes az SNX482 a

Tocris Bioscience-toacutel szaacutermazott A tetrodotoxin (TTX) az Alomone Labs-től a

nitroprusszid-naacutetrium (SNP) a Flukatoacutel lett rendelve

V5 In situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek

V51 NOsGC alegyseacutegek kimutataacutesaacutehoz szuumlkseacuteges riboproacutebaacutek szinteacutezise (taacuters-

munkacsoport munkaacuteja)

Riboproacutebaacutek keacutesziacuteteacuteseacutehez patkaacuteny NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek alapvetően nem

aacutetfedő (kevesebb mint 50-os egyezeacutes) koacutedoloacute szekvenciaacuteit (GenBank hozzaacutefeacutereacutesi

szaacutem gi1655846 az α1 eacutes gi13027399 az α2 alegyseacuteg eseteacuteben) sokszorosiacutetottaacutek

Wistar patkaacuteny teljes hippokampaacutelis mRNS mintaacuteboacutel kinyert cDNS-ből reverz-

transzkriptaacutez polimeraacutez-laacutencreakcioacute (PCR) segiacutetseacutegeacutevel A primerek hossza eacutes

szekvenciaacuteja a koumlvetkező volt (a nukleotidok szaacutemozaacutesa a nyiacutelt olvasaacutesi keret kezdeteacutetől

indul) α1 alegyseacuteg 800 baacutezispaacuter 481-től 1280-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC

ACG GGG GAG T reverz primer 5rsquo-ACT AGC GAG GAC TGG GGT TT α2

alegyseacuteg 903 baacutezispaacuter 444-től 1346-ig előre tartoacute primer 5rsquo-CTC AAG ATC ACG

GGG GAG T reverz primer 5rsquo-TGG GAA GTA CCT TGT GGA ATG A primereket

Primer3 szoftver (Rozen eacutes Skaletsky 2000) segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetetteacutek el A PCR

termeacutekeket pBluescript II SKndash (Fermentas Vilnius Litvaacutenia) SmaI helyeacutere kloacutenoztaacutek

A kloacutenok megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes iraacutenyultsaacutegaacutet szekvenaacutelaacutes soraacuten igazoltaacutek Az α1 alegyseacuteg

elleni egyszaacuteluacute sense proacutebaacutet PstI az antisense proacutebaacutet XbaI emeacuteszteacutessel miacuteg az α2

alegyseacuteg elleni sense proacutebaacutet HindIII az antisense proacutebaacutet NotI emeacuteszteacutessel keacutesziacutetetteacutek el

Az egyszaacuteluacute minta DNS-eket geacutelkivonaacutes utaacuten 1microgmicrol koncetraacutecioacuteban DEPC-kezelt

65

desztillaacutelt viacutezben higiacutetva taacuteroltaacutek -20 oC-on Az in vitro aacutetiacuteraacutest 2 oacuteraacutes 37

oC-on toumlrteacutenő

inkubaacutelaacutes soraacuten veacutegezteacutek 20microl teljes teacuterfogatban mely 1 microg minta-DNS-t 1 egyseacuteg

aacutetiacuteroacute-puffert 1 egyseacuteg Digoxigenin RNS-jeloumllő kevereacuteket 40U Rnaacutez gaacutetloacutet eacutes 20U T3

vagy T7 RNS-polimeraacutezt tartalmazott DEPC-kezelt keacutetszer desztillaacutelt viacutezben Minden

hozzaacutevaloacutet a Roche Molecular Diagnostics-toacutel (Mannheim Neacutemetorszaacuteg) szereztek be

A digoxigeninnel jeloumllt riboproacutebaacutekat Dnaacutezzal kezelteacutek majd az RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen Hilden Neacutemetorszaacuteg) segiacutetseacutegeacutevel tisztiacutetottaacutek Ezutaacuten geacutel-

elektroforeacutezis hasznaacutelataacuteval hataacuteroztaacutek meg a riboproacutebaacutek megőrzoumlttseacutegeacutet eacutes

mennyiseacutegeacutet

V52 In situ hibridizaacutecioacute (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

A hibridizaacutecioacute soraacuten hasznaacutelt oumlsszes oldatot 01 DEPC-cel kezelteacutek majd

autoklaacutevoztak A vegyszereket a Sigmaacutetoacutel (Budapest Magyarorszaacuteg) szerezteacutek be Az

50 microm vastag patkaacuteny vagy egeacuter agyszeletek inkubaacutelaacutesaacutet Rnaacutez-mentes steril

sejtkultuacutera-taacutel kamraacuteiban veacutegezteacutek A metszeteket előszőr 3x20 percig soacutes foszfaacutet-

pufferben (PBST mM-ban 137 NaCl 27 KCl 10 Na2HPO4 2 KH2PO4 eacutes 01

Tween 20 pH 74) mostaacutek majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltaacutek hibridizaacutecioacutes pufferben

mely 12 microgml digoxigeninnel-jeloumllt riboproacutebaacutet 50 formamidot 5 egyseacuteg SSC-t 1

SDS-t 50microgml eacutelesztő tRNS-t eacutes 50microgml heparint tartalmazott DEPC-el kezelt

desztillaacutelt viacutezben A mosaacutesok eacutes az inkubaacutecioacutek alatt a meszeteket tartalmazoacute sejtkultuacutera-

taacutelat egy nedvesiacutetett kamraacuteban raacutezoacutegeacutepen tartottaacutek Az inkubaacutecioacute utaacuten a metszeteket 30

percig mostaacutek első mosoacuteoldattal (50 formamid 5 egyseacuteg SSC eacutes 1 SDS DEPC-

kezelt desztillaacutelt viacutezben) 60degC-on majd 45 percig maacutesodik mosoacuteoldattal (50

formamid eacutes 2 egyseacuteg SSC DEPC-kezelt desztillaacutelt viacutezben) ugyancsak 60degC-on A

metszeteket ezt koumlvetően 5 percig mostaacutek 76 pH-juacute soacutes Tris-pufferben melyhez 01

Tween 20-at adtak (TBST) Ezutaacuten 10 normaacutel kecske szeacuterumot tartalmazoacute TBST-ben

(TBSTN) blokkoltaacutek a metszeteket egy oacuteraacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten majd egy eacutejszakaacuten

aacutet 4 degC-on inkubaacuteltaacutek őket TBSTN-ben mely 11000-re kihigiacutetott alkalikus-

foszfataacutezzal jeloumllt juh-anti-digoxigenin Fab IgG-fragmentumot tartalmazott (Roche

Molecular Diagnostics Neacutemetorszaacuteg) Ezutaacuten a metszeteket 3x20 percen keresztuumll

mostaacutek TBST-vel majd előhiacutevtaacutek a reakcioacutet 35microl 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfaacutet-ot

66

eacutes 35 microl nitro blue tetrazolium kloridot tartalmazoacute friss kromogeacuten oldatban (mM-ban

100 NaCl 100 Tris-Cl pH 95 20 MgCl2 2 (ndash) tetramizol hidroklorid eacutes 01 Tween

20) A metszeteket az előhiacutevoacute oldat 1 ml-jeacuteben inkubaacuteltaacutek 6-8 oacuteraacuten aacutet soumlteacutetben majd a

reakcioacutet PBST-vel aacutelliacutetottaacutek le Veacuteguumll 3x10 percig mostaacutek a metszeteket 01 M foszfaacutet-

pufferben majd uumlveg taacutergylemezekre kiszedteacutek eacutes Vectashield-del (Vector

Laboratories) fedteacutek le

V6 Kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterletek

Miutaacuten 40 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica

VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon eacutes alaposan kimostuk a maradeacutek fixaacuteloacutet a szoumlvetből a

metszeteket 1 humaacuten szeacuterum albumin (HSA) oldatban majd az alaacutebbi molekulaacutek

ellen keacuteszuumllt elsődleges antitest kevereacutekek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig TBS-ben

hiacutegiacutetva NOsGCα1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 11000 Sigma) eacutes kolecisztokinin

(egeacuter monoklonaacutelis anti-CCK 13000 CURE) vagy NOsGCα1 eacutes parvalbumin (egeacuter

monoklonaacutelis anti-PV 11000 Swant) vagy NOsGCα1 eacutes nNOS (egeacuter monoklonaacutelis

anti-nNOS N2280 1500 Sigma) vagy NOsGCα1 eacutes szomatosztatin (patkaacuteny

monoklonaacutelis anti-SOM MAB354 170 Chemicon) vagy nNOS eacutes kannabinoid

receptor 1 (nyuacutel poliklonaacutelis anti-CB1 1500 Haacutejos et al 2000) vagy nNOS eacutes P-

anyag receptor (nyuacutel poliklonaacutelis anti-SPR AB5060 15000 Chemicon) Alapos TBS

mosaacutes utaacuten a metszeteket fluoreszcens festeacutekkel jeloumllt maacutesodlagos antitestek

kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk 5 oacuteraacuten keresztuumll A CCK PV eacutes nNOS megjeloumlleacuteseacutere voumlroumls

fluoreszcens Alexa594 egeacuter ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a CB1eacutes SPR

festeacuteseacutehez zoumlld fluoreszcens Alexa488 nyuacutel ellen keacuteszuumllt IgG-t (1200 Invitrogen) a

SOM jeloumlleacuteseacutehez pedig FITC patkaacuteny ellen keacuteszuumllt IgG-t (150 Jackson

ImmunoResearch) hasznaacuteltunk Az NOsGCα1 jeloumlleacutes eseteacuteben vagy zoumlld fluoreszcens

Alexa488 nyuacutel ellenes IgG-t vagy voumlroumls fluoreszcens Alexa594 nyuacutel ellenes IgG-t

(mindkettő 1200 Invitrogen) hasznaacuteltunk Az immunfesteacutes soraacuten nem hasznaacuteltunk

detergenseket A metszeteket 0025-os reacutez-szulfaacutet oldattal kezeltuumlk 30 percig hogy

csoumlkkentsuumlk a metszek autofluoreszcenciaacutejaacutet (Schnell et al 1999) majd TBS mosaacutest

koumlvetően mikroszkoacutepos taacutergylemezre szedtuumlk ki a metszeteket eacutes Vectashield (Vector

67

Laboratories) felhasznaacutelaacutesaacuteval fedtuumlk le fedőlemezzel Az immunreakcioacutekat Zeiss

Axioplan2 fluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk ki

V7 Beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek

A dorzaacutelis hippokampuszokboacutel Leica VT1000S tiacutepusuacute vibratoacutemon 60 microm-es

metszeteket keacutesziacutetettuumlnk eacutes alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket 1 humaacuten

szeacuterum albumint (HSA) tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk majd 2 napon aacutet

inkubaacuteltuk a NOsGC α1 eacutes β1 alegyseacuteg ellen termeltetett elsődleges antitesttel (nyuacutel

poliklonaacutelis anti-NOsGCα1 Sigma kataloacutegusszaacutem G4280 sorozatszaacutem 011K4888

110000 a tuumlkoumlrkeacutep-kiacuteseacuterletek eseteacuteben eacutes 11000 az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatoknaacutel nyuacutel poliklonaacutelis anti-NOsGC β1 Cayman Chemical

kataloacutegusszaacutem160897 sorozatszaacutem 13452114000) TBS pufferben oldva Alapos

TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben hiacutegiacutetott biotin-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestekkel (kecskeacuteben termelt poliklonaacutelis nyuacutel ellenes IgG Vector Laboratories

1200) majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldattal (Elite ABC

1300 Vector Laboratories) kezeltuumlk Az immunperoxidaacutez reakcioacute megjeleniacuteteacuteseacutehez

33-diaminobenzidin (DAB Sigma) kromogeacutent hasznaacuteltunk A bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek

eseteacuteben a DAB csapadeacutekot nikkel-ammoacutenium-szulfaacutet hozzaacuteadasaacuteval erősiacutetettuumlk (DAB-

Ni) A metszeteket ezt koumlvetően ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk kiveacuteve a bdquotuumlkoumlrkeacuteprdquo

kiacuteseacuterletek eseteacuten majd mindet viacutezteleniacutetettuumlk felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-

oxidban veacuteguumll epoxi-alapuacute gyantaacuteba aacutegyaztuk (Durcupan ACM Fluka) A viacutezteleniacuteteacutesi

eljaacuteraacutes soraacuten a metszeteket 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal

kezeltuumlk 30 percig

V8 Beaacutegyazaacutes előtti immunarany eacutes kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez

kiacuteseacuterletek

Az nNOS lokalizaacutecioacutejaacutehoz az egereket 1 paraformaldehidet tartalmazoacute 01 M

PB oldattal perfundaacuteltuk majd 60 microm-es metszeteket keacutesziacutetettuumlnk a dorzaacutelis

hippokampuszokboacutel Alapos PB eacutes TBS mosaacutest koumlvetően a metszeteket TBS-ben oldott

1 HSA oldatban majd az elsődleges antitestek oldataacuteban inkubaacuteltuk 2 napig nNOS

68

(nyuacutel poliklonaacutelis anti-nNOS 1500 Zymed Laboratories) illetve a kettős festeacutesek

eseteacuteben nNOS eacutes CCK (15000) vagy nNOS eacutes PV (17000) TBS-ben hiacutegiacutetva (GelBS)

Szaacutemos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 05 halbőr-zselatint (GE Healthcare) eacutes 05

HSA-t tartalmazoacute TBS oldatban blokkoltuk 1 oacuteraacuten aacutet Ezt koumlvette az arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitestek oldata 1nm-es arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt (kecske

poliklonaacutelis antitest 180 GE Healthcare) vagy 08 nm arany-koumltoumltt nyuacutel ellen keacuteszuumllt

(kecske poliklonaacutelis antitest 180 Aurion) antitesteket higiacutetottuk GelBS-ben eacutes

inkubaacuteltuk 1 napig Alapos TBS mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez PB mosaacutesokat koumlvetően intenzifikaacutelaacutest elősegiacutető pufferben (ECS Aurion)

majd ezuumlst-intenzifikaacuteloacute (SE-EM Aurion) oldatban inkubaacuteltuk a metszeteket 60 percig

Ezt ECS majd PB mosaacutes koumlvette A kizaacuteroacutelag immunarany reakcioacuteban reacutesztvevő

metszetek ezutaacuten ozmium-tetroxid kezeleacutesben reacuteszesuumlltek majd viacutezteleniacutetettuumlk őket Az

immunarany-immunperoxidaacutez kettős festeacutesek eseteacuteben a metszeteket a tovaacutebbiakban

biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitest-oldatban inkubaacuteltuk (egeacuter elleni loacute poliklonaacutelis

antitest 1200 Vector Laboratories) 24 oacuteraacutera majd avidin-biotin komplexhez koumltoumltt

torma-peroxidaacutezt (Elite ABC 1300 Vector Laboratories) tartalmazoacute TBS oldatban

inkubaacuteltuk a metszeteket 3 oacuteraacuteig Az immunperoxidaacutez reakcioacutet 33-diamino-benzidin

(DAB Sigma) segiacutetseacutegeacutevel tettuumlk laacutethatoacutevaacute A metszeteket ozmium-tetroxiddal

kezeltuumlk majd felszaacutelloacute alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-

alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-

alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet oldattal 30 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az

elektronmikroszkoacutepos vizsgaacutelatokhoz kis gyantaacuteba aacutegyazott szoumlvetmintaacutekat vaacutegtunk ki

eacutes ragasztottuk Durcupan blokkokra majd 70 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket

keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute ultramikrotoacutemon A metszeteket pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektron-

mikroszkoacutepon veacutegeztuumlk Az nNOS immunarany kiacuteseacuterletekneacutel az aranyszemcseacuteket az

anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus plazmamembraacuten

menteacuten meacutertuumlk A plazmamembraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 40 nm-es taacutevolsaacutegon beluumll

elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

Az NMDA receptorok szinaptikus detektaacutelaacutesaacutehoz elengedhetetlen az

immunreakcioacute előtti pepszines emeacuteszteacutes (Watanabe et al 1998) ezeacutert 1mgml pepszin

69

(DAKO) tartalmuacute 02 M soacutesav-oldattal kezeltuumlk a metszeteket 10 percig 37 Cordm-on Ezt

koumlvetően a paraformaldehid fixaacutelaacutes koumlvetkezteacuteben a szoumlvetben leacutetrejoumlvő szabad oxo-

csoportokat TBS-ben oldott 50 mM glicin (Sigma-Aldrich) segiacutetseacutegeacutevel koumltoumlttuumlk meg

majd 1 HSA oldatban blokkoltunk Ezt koumlvetően vagy csak az NMDA-R alegyseacutegek

(nyuacutel poliklonaacutelis antitestek GluN1 18 μgml GluN2A 18 μgml GluN2B 13 μgml)

ellen termelt elsődleges antitesteket vagy az NMDA-R alegyseacutegek vGluT3

(tengerimalac poliklonaacutelis anti-vGluT3 13000 Chemicon AB5421) eacutes NMDA-R

alegyseacutegek PV (egeacuter monoklonaacutelis anti-PV 17000 Swant) ellenes elsődleges

antitestek kevereacutekeacutet hiacutegiacutetottuk 01 BSA-c trade (Aurion TBS-BSA-c) tartalmuacute TBS

oldatban eacutes 3 napig inkubaacuteltuk benne a metszeteket Szaacutemos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten

14 nm meacuteretű aranyszemcseacutevel koumltoumltt maacutesodlagos nyuacutel ellenes antitesttel inkubaacuteltuk 1

napig a metszeteket (Nanogold Fabrsquo konjugaacutelt antitest NanoProbes 1100 TBS-BSA-

c oldatban hiacutegiacutetva) Alapos TBS-BSA-c mosaacutes utaacuten a metszeteket 2 glutaacuteraldehidet

tartalmazoacute PB oldattal kezeltuumlk 15 percig hogy az arany szemcseacuteket hozzaacutekoumlssuumlk a

szoumlvethez Ezt koumlvette az ezuumlst-intenzifikaacutelaacutes (SE-EM Aurion 40 perc)

szobahőmeacuterseacutekleten A kombinaacutelt immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletek eseteacuteben a

metszetek a tovaacutebbiakban 1 napig inkubaacuteloacutedtak biotin-koumltoumltt maacutesodlagos antitestek

(tengerimalac elleni kecske IgG 1200 Vector Laboratories egeacuter elleni szamaacuter IgG

11000 Jackson Laboratories) oldataacuteban Ezt koumlvette a TBS-ben hiacutegiacutetott avidin-biotin

komplexhez koumltoumltt torma-peroxidaacutez oldat 3 oacuteraacutera majd DAB kromogeacuten segiacutetseacutegeacutevel

tettuumlk laacutethatoacuteva a jeloumlleacutest A metszeteket ozmium-tetroxiddal kezeltuumlk majd felszaacutelloacute

alkoholsorban eacutes propileacuten-oxidban viacutezteleniacutetettuumlk eacutes epoxi-alapuacute (Durcupan) gyantaacuteba

aacutegyaztuk A viacutezteleniacuteteacutesi eljaacuteraacutes soraacuten 70-os etil-alkoholban hiacutegiacutetott 1 uranil-acetaacutet

oldattal 20 percig kontrasztoztuk a metszeteket Az elektronmikroszkoacutepos

vizsgaacutelatokhoz a hippokampaacutelis szoumlvetmintaacutekat kis Durcupanreg tartalmuacute oumlntőformaacuteba

aacutegyztuk majd 60 nm vastagsaacuteguacute sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk Leica EM UC6 tiacutepusuacute

ultramikrotoacutemon A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk

A szemikvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuteben az aranyszemcseacutek

sűrűseacutegeacutet az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg szinapszis eacutes a nem-szinaptikus

plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott 50 nm-es taacutevolsaacutegon

beluumll elhelyezkedő aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

70

V9 Lowicryl beaacutegyazaacutes eacutes beaacutegyazaacutes utaacuteni kvantitatiacutev immunarany kiacuteseacuterletek

Fixaacutelaacutest koumlvetően 300 microm vastagsaacuteguacute metszeket keacutesziacutetettuumlnk Leica VT1200S

tiacutepusuacute vibratoacutemmal majd alapos PB mosaacutest koumlvetően a metszeteket noumlvekvő

koncetraacutecioacutejuacute szaharoacutez-oldatban (05 1 eacutes 2M szaharoacutez 01 M PB-ben oldva)

inkubaacuteltuk A metszeteket Leica CPC segiacutetseacutegeacutevel folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre

hűtoumltt arannyal bevont reacutez korongokra csaptuk hogy gyors eacutes egyenletes fagyaacutest eacuterjuumlnk

el majd a fagyott metszeteket aacutetszaacutelliacutetottuk Leica AFS-be amiben az alacsony

hőmeacuterseacutekletű viacutezteleniacuteteacutest eacutes a Lowicryl HM20 (Chemische Werke Lowi) gyantaacuteba

toumlrteacutenő fagyasztva beaacutegyazaacutest veacutegeztuumlk A hippokampuszokboacutel 50 eacutes 70 nm vastagsaacuteguacute

sorozatmetszeteket keacutesziacutetettuumlnk A sorozatmetszeteket vagy pioloformmal fedett

egynyiacutelaacutesuacute nikkel gridekre szedtuumlk fel ami csak egyoldali immunreakcioacutet tesz lehetőveacute

(egyoldali kiacuteseacuterletek) vagy haacuteloacutes nikkel gridekre szedtuumlk fel mely esetben a

metszeteknek mindkeacutet oldala egyszerre reacuteszt vesz az immunreakcioacuteban (keacutetoldali

kiacuteseacuterletek) Egyoldali kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk az uacuten ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletekhez melyek

soraacuten tovaacutebb bizonyiacutetottuk antitestjeink specificitaacutesaacutet azzal hogy az NMDA-R

kuumlloumlnboumlző alegyseacutegeit egyazon szinapszisban azonosiacutetottuk A keacutetoldali kiacuteseacuterletek

eseteacuteben az immunarany jel sokkal erősebb de a szinaptizaacuteloacute terminaacutelisok

rekonstrukcioacuteja nem lehetseacuteges Ezen reakcioacutekban a haacuteloacutes grideket előszoumlr 2-3

maacutesodpercig marattuk teliacutetett naacutetrium-etanolaacutet oldatban majd alaposan lemostuk őket

desztillaacutelt viacutezben Ezt koumlvetően minden gridet blokkoloacute oldat cseppjeiben inkubaacuteltuk 1

oacuteraacuten aacutet majd eacutejszakaacutera elsődleges antitesteket tartalmazoacute cseppekben inkubaacuteltunk A

blokkoloacute oldat amit az elsődleges eacutes maacutesodlagos antitestek hiacutegiacutetaacutesaacutehoz is hasznaacuteltunk

TBS-ben oldott 2 human szeacuterum albumint tartalmazott Az NMDA-R alegyseacutegek

elleni elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel

GluN1 24 μgml GluN2A 20 μgml GluN2B 18 μgml) 18 oacuteraacutes inkubaacutelaacutesa utaacuten TBS-

ben mostuk a grideket majd 5 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 5nm arany-koumltoumltt maacutesodlagos

antitestek oldataacuteboacutel keacuteszuumllt cseppekben (nyuacutel elleni kecske IgG 1100 British Biocell

International) A ldquotuumlkoumlrkeacuteprdquo kiacuteseacuterletek eseteacuteben 08 nm nagysaacuteguacute arany-koumltoumltt

maacutesodlagos antitesteket hasznaacuteltunk (1100 nyuacutel elleni szamaacuter IgG Aurion) majd az

aranyszemcseacutek meacutereteacutet ezuumlst intenzifikaacuteloacuteval (SE-EM 40 percig szobahőmeacuterseacutekleten

Aurion) noumlveltuumlk meg Szaacutemos mosaacutest koumlvetően veacuteguumll desztillaacutelt viacutezben oumlbliacutetettuumlk le a

71

metszeteket eacutes teliacutetett uranil-acetaacutet vizes oldataacuteval majd oacutelom-citraacutettal kontrasztoztuk

meg őket A kieacuterteacutekeleacutest Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A

keacutetoldali kvantitatiacutev immunarany NMDA-R meacutereacutesek eseteacuten az aranyszemcseacutek sűrűseacutegeacutet

az anatoacutemiailag meghataacuterozott GABAerg eacutes glutamaacuteterg szinapszis eacutes a nem-

szinaptikus plazmamembraacuten menteacuten meacutertuumlk A membraacuten siacutekjaacutetoacutel szaacutemiacutetott keacutetszer 45

nm-es taacutevolsaacutegon (a membraacuten egyik ill maacutesik oldala feleacute) beluumll elhelyezkedő

aranyszemcseacuteket tekintettuumlk membraacuten-asszociaacuteltnak

V10 SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunarany kiacuteseacuterletek

A perfuacutezioacutet koumlvetően 130microm vastag koronaacutelis hippokampusz szeleteket

metszettuumlnk Dosaka tiacutepusuacute vibratoacutemon majd egy eacutejszakaacuten aacutet inkubaacuteltuk a szeleteket

30-os glicerolt tartalmazoacute PB oldatban 4 Cordm-on A metszetekből kivaacutegtuk a

hippokampuszt majd ezt koumlvetően joacute hővezető reacutez-korongok koumlzeacute szoriacutetva

nagynyomaacutesuacute fagyasztoacutegeacuteppel (high-pressure freezing machine HPM 100 BAL-TEC

Balzers Lichtenstein) folyeacutekony nitrogeacuten hőmeacuterseacutekletűre hűtoumlttuumlk majd a fagyott

metszeteket kettős replika asztalba helyeztuumlk eacutes -140 Cordm-on ketteacutetoumlrtuumlk A fagyasztva

toumlrt felsziacuteneket 8 nm vastag szeacuten 2 nm vastag platina veacuteguumll 15 nm vastag szeacuten

depoziacutecioacutejaacuteval replikaacuteltuk a fagyasztva-toumlrő replika geacutepben (freezendashfracture replica

machine BAF 060 BAL-TEC) A mintaacutekat 20 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk 25 naacutetrium-

dodecil-szulfaacutetot (SDS) eacutes 20 szaharoacutezt tartalmazoacute 15 mM koncentraacutecioacutejuacute Tris

pufferben (pH=83) 80 Cordm-on hogy eltaacutevoliacutetsuk a szoumlvetet a replikaacutekroacutel A replikaacutekat

ezutaacuten 005 szarvasmarha szeacuterum albumint (BSA Nacalai Tesque Kyoto Japan)

tartalmazoacute 25mM-os TBS-ben mostuk majd 1 oacuteraacuten aacutet blokkoloacute oldatba tettuumlk (5BSA

25mM-os TBS-ben) A replikaacutekat előszoumlr csak az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő

elsődleges antitestek (nyuacutel poliklonaacutelis antitestek Prof Watanabe M laborjaacuteboacutel GluN1

6 μgml GluN2A 10 μgml GluN2B 8 μgml blokkoloacute oldatban hiacutegiacutetva) oldataacuteban

inkubaacuteltuk egy eacutejszakaacuten aacutet szobahőmeacuterseacutekleten TBS mosaacutesokat koumlvetően a GABAAR

β3 alegyseacuteg elleni (125 tengerimalac szeacuterum Prof Shigemoto R laborjaacuteboacutel (Kasugai

et al 2010) elsődleges eacutes az NMDA-R alegyseacutegeket felismerő arany-koumltoumltt nyuacutel ellenes

maacutesodlagos (5nm kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) antitestek kevereacutekeacuteben

inkubaacuteltuk a replikaacutekat egeacutesz eacutejszaka szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvette a GABAAR

megjeloumlleacuteseacutere szolgaacuteloacute arany-koumltoumltt tengerimalac ellenes maacutesodlagos antitest (10nm

72

kecske poliklonaacutelis antitest 125 BBI) TBS eacutes desztillaacutelt vizes mosaacutes utaacuten a replikaacutekat

pioloformmal fedett parallel saacutevos reacutez gridekre szedtuumlk fel A kieacuterteacutekeleacutest Philips

Tecnai 10 eacutes Hitachi H-7100 tiacutepusuacute elektronmikroszkoacutepon veacutegeztuumlk A replika mintaacutek

eseteacuteben a membraacuten ketteacutetoumlreacuteseacuteből kifolyoacutelag megkuumlloumlnboumlztetjuumlk a citoplazmatikus (P)

oldal feleacute tekintő eacutes az extracellulaacuteris teacuter (E) feleacute tekintő toumlreacutesi felsziacutent Ebből kifolyoacutelag

C-terminaacutelis antitesttel keacuteszuumllt immunarany jeloumlleacutest a P-oldalon N-terminaacutelis antitesttel

keacuteszuumllt reakcioacutet az E-oldalon lehet detektaacutelni A membraacutenba aacutegyazott feheacuterjeacutek (IMP)

jellegzetes keacutepet adnak a replikaacutenak (laacutesd 8aacutebra)

V101 GABAerg szinapszisok meghataacuterozaacutesa a replikaacutelt piramissejtek felsziacuteneacuten

A replika jeloumlleacutes egyik nagy előnye hogy a szinapszisokat nem kell szaacutemos

metszetből rekonstruaacutelni mert egyből laacutethatoacute az egeacutesz szinapszis a replikaacutelt piramissejt

felsziacuteneacuten (8 aacutebra) A fagyasztott metszetek gyakran toumlrnek a szomatikus membraacuten

menteacuten feltaacuterva ezzel a membraacutenban elhelyezkedő feheacuterjeacuteket A GABAAR jeloumlleacutes

beduacutesulaacutesa alapvető jellegzetesseacutege a GABAerg szinapszisoknak (8 aacutebra)

A klasszikus immunhisztokeacutemiai moacutedszerek eseteacuteben a szoumlvetminta gyantaacuteba

van aacutegyazva eacutes a szinapszisok azonosiacutetaacutesa legtoumlbbszoumlr a szinaptikus reacutesre merőleges

metszeacutesi siacutekből toumlrteacutenik A pre- eacutes posztszinaptikus struktuacuteraacutek joacutel laacutethatoacuteak a szinapszis

szeacuteleinek megaacutellapiacutetaacutesa joacutel meghataacuterozott A replikaacutelt szinapszisok viszont maacutesok A

fagyasztva toumlrt replikaacutek felsziacuteneacuten a transzmembraacuten feheacuterjeacutek (intramembrane particles

IMP-k) sűrűseacutege valamivel nagyobb a felteacutetelezhetően GABAerg szinapszisokban mint

az extraszinaptikus membraacutenfelsziacuteneken Mivel azonban nem minden IMP

csoportosulaacutes jelent GABAerg szinapszist mi kizaacuteroacutelag a GABAAR jeloumlleacutes lokaacutelis

sűrűseacutegeacutet hasznaacuteltuk a GABAerg szinapszisok hataacuterainak meghuacutezaacutesaacutehoz (8 aacutebra)

Roumlviden a kettős immunarany reakcioacute utaacuten hatalmas piramissejt felsziacuteneket (koumlruumll-

beluumll 60 microm2 teruumlletet minden neuronboacutel) rekonstruaacuteltunk nagy nagyiacutetaacuteson 100-200

elektronmikoszkoacutepos keacutepet keacutesziacutetve sejtfelsziacutenenkeacutent Abobe Photoshop CS4 Extended

program felhasznaacutelaacutesaacuteval egy sugaacuteriraacutenyuacute szuumlrkeseacutegi gradienst fektettuumlnk minden egyes

GABAAR immunarany reacuteszecskeacutere (ez a gradiens olyan mint egy korong) A GABAAR

immunarany reacuteszecske pontosan a koumlzeacuteppontjaacuteban helyezkedett el ennek a gradiens-

korongnak

73

8 aacutebra A piramissejtek sejttesteacutenek felsziacuteneacuten leacutevő GABAerg szinapszisok

meghataacuterozaacutesa fagyasztva-toumlrt replika mintaacutekon

A Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten immunarany kiacuteseacuterletből szaacutermazoacute piramissejtek

sejttest-membraacutenjaacutenak sejtplazma felőli oldala (P-oldal) laacutethatoacute A GABAA receptor β3

alegyseacutegeacutenek immunarany jeloumlleacuteseacuteből szaacutermazoacute aranyszemcse-csoportok (10

nanomeacuteteres fekete szemcseacutek fekete nyiacutellal jeloumllve) joacutel illeszkednek a membraacutenba

aacutegyazott reacuteszecskeacutek (IMP intramembraacuten partikulum) csoportosulaacutesaival (nyiacutelhegyek)

Az NMDA receptor jeloumlleacutes (ez esetben GluN2A 5 nanomeacuteteres fekete szemcseacutek feheacuter

nyiacutellal jeloumllve) szinteacuten asszociaacuteloacutedott a GABAA receptor jeloumlleacutessel

B Mivel IMP csoportosulaacutesok GABAAR jeloumlleacutes neacutelkuumll is vannak a sejttestek felsziacuteneacuten

ezeacutert a szinaptikus teruumllet meghataacuterozaacutesaacutenak alapjaacutet a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes

keacutepezte A B aacutebraacuten piros jeloumlleacutessel laacutethatoacute a GABAAR immunarannyal jeloumllt helyzete

Fekete-feheacuter gradienssel tettuumlk laacutethatoacutevaacute a GABAAR helyi sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet Egy adott

sűrűseacuteg-eacuterteacuteket meghataacuterozva huacuteztuk meg az aacuteltalunk szinapszisnak vett teruumllet hataacuteraacutet

(feheacuter vonallal jeloumllve az aacutebraacuten) Mivel replika mintaacutekon nem hasznaacutelhatoacutek a szinapszis

meghataacuterozaacutes klasszikus morfoloacutegiai kriteacuteriumai ez az elfogultsaacuteg neacutelkuumlli sűrűseacuteg-

74

kriteacuterium keruumllt alkalmazaacutesra a kiacuteseacuterletsorozatban Mivel azonban ez feltehetőleg nem

egyezik meg a klasszikus szinaptikus teruumllettel ezeacutert megkuumlloumlnboumlzteteacuteskeacuteppen

szinapszis-asszociaacutelt teruumlletnek neveztuumlk Ezzel a moacutedszerrel az NMDA-receptor jeloumlleacutes

elhelyezkedeacutese semmilyen moacutedon nem tudta befolyaacutesolni a szinaptikus teruumllet

meghataacuterozaacutesaacutet

C A szinapszis-asszociaacutelt teruumllet meghataacuterozaacutesa (feheacuter vonallal jeloumllve) utaacuten az aacutebraacuten

saacuterga sziacutennel jeloumlltuumlk meg az NMDA receptort jeloumllő aranyszemcseacutek helyzeteacutet

D Ezt koumlvetően veacutegeztuumlk el az NMDA-receptorok (saacuterga jel) mennyiseacutegi vizsgaacutelataacutet a

szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten beluumll eacutes kiacutevuumll Leacutepteacutek 100 nm

A gradiens kiterjedeacutese a 10 nm-es aranyszemcse szeacuteleacutetől szaacutemiacutetva 200 nm

hosszuacutesaacutegig terjedt A szuumlrkeseacutegi skaacutela maximaacutelis eacuterteacuteket vett fel az arany szemcse

felett eacutes nulla eacuterteacuteket 200nm taacutevolsaacutegra (a korong szeacuteleacuten) A szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei

lineaacuterisan csoumlkkentek a korong szeacutele feleacute haladva Tekintve hogy ezek a szuumlrkeseacutegi

gradiensek minden egyes arany szemcse foumlleacute lettek helyezve nagy reacuteszuumlk aacutetlapoloacutedott

egymaacutessal főleg a szinapszisokban Az aacutetlapoloacutedott szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekek a sejtfelsziacutenről

keacuteszuumllt fotoacute minden adott pixeleacutenek eseteacuteben oumlsszegezve lett ami egy uacutej szuumlrkeseacutegi

teacuterkeacutepet hozott leacutetre a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutegeacutenek fuumlggveacutenyeacuteben (8 aacutebra a koumlnnyebb

bemutathatoacutesaacuteg kedveacuteeacutert a folyamatos szuumlrkeseacutegi skaacutela eacuterteacutekei szuumlrkeseacutegi leacutepeacutesekbe

lettek aacutetvaacuteltva) A oumlsszegzet szuumlrkeseacutegi intenzitaacutesok kirajzoltak sejtfelsziacuteni teruumlleteket

melyeknek magas a GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege Miutaacuten meghataacuteroztunk egy megfelelő

szuumlrkeseacutegi eacuterteacutekhataacutert a felteacutetelezett szinaptikus teruumlleteket koumlruumll lehetett hataacuterolni

pusztaacuten a sejtfelsziacuteni lokaacutelis GABAAR jeloumlleacutes sűrűseacutege alapjaacuten Veacuteguumll a koumlruumllhataacuterolt

szinaptikus teruumlleteket lemeacutertuumlk eacutes az immunarany-jeloumllt NMDA receptorokat

megszaacutemoltuk a szinapszis hataacuterain beluumll A koumlruumllhataacuterolaacutesi eljaacuteraacutes fő ceacutelja nem az volt

hogy uacutejraalkossuk pontosan ugyanazt a szinapszis definiacutecioacutet amit klasszikusan a pre- eacutes

posztszinaptikus struktuacuteraacutek megfigyeleacuteseacutevel koumlnnyűszerrel meg lehet tenni ha a

szinaptikus reacutes siacutekjaacutera merőleges a metszeacutesis siacutekunk A ceacutelunk az volt hogy talaacuteljunk

olyan GABAAR asszociaacutelt teruumlleteket (ebben a munkaacuteban egyszerűen GABAerg

szinapszisok) melyeket elfogatlanul tudunk koumlrbehataacuterolni Ha egyszer a hataacutervonal

meg lett huacutezva azt minden egyes kiacuteseacuterleti mintaacuten alkalmaztuk fuumlggetlenuumll attoacutel hogy

az NMDA-R immunarany szemcseacuteknek milyen az elhelyezkedeacutese Oumlsszegezve ez a

75

moacutedszer lehetőveacute tett egy olyan elfogulatlan megkoumlzeliacuteteacutest mellyel tesztelhető az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute asszociaacutecioacuteja a replika mintaacutekon

V11 Farmakoloacutegiai kiacuteseacuterletek tuacuteleacutelő szeleten cGMP immunfluoreszcens

kiacuteseacuterletek

A tuacuteleacutelő szeletek elkeacutesziacuteteacuteseacutehez az egerekeket (n=10 C57Bl6 eacutes n=4 nNOS--)

meacutely izofluraacuten aneszteacuteziaacuteban dekapitaacuteltuk az agyakat eltaacutevoliacutetottuk a koponyaacuteboacutel majd

bdquovaacutegoacute-oldatbanrdquo (szaharoacutez 2045mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4

125mM CaCl22H2O 05 mM MgCl26H2O 5mM NaHCO3 26mM) 300microm

vasagsaacuteguacute koronaacutelis hippokampusz szeleteket metszettuumlnk Leica VT1000S tiacutepusuacute

vibratoacutemon A kiacuteseacuterletek előtt a szeleteket 1 oacuteraacuten aacutet inkubaacuteltuk karbogeacuten gaacutezzal

(95O25CO2) teliacutetett mesterseacuteges agy-gerivelői folyadeacutekkal (artificial cerebrospinal

fluid ACSF NaCl 126mM gluumlkoacutez 10mM KCl 25mM NaH2PO4 125mM

CaCl22H2O 2mM MgCl26H2O 2mM NaHCO3 26mM) toumlltoumltt uacuten felsziacuteni kamraacuteban

szobahőmeacuterseacutekleten Ezt koumlvetően a szeleteket 12 kamraacutes steril sejtkultuacuteraacutes taacutelba (12-

well cell-culture plate TPP Switzerland) raktuk ahol minden egyes kamraacutet egyeacutenileg

egyenlő meacuterteacutekben buboreacutekoltattunk karbogeacuten gaacutezzal Minden kamraacutet 1 ml moacutedosiacutetott

ACSF (mACSF) oldattal toumlltoumlttuumlnk meg ami 1 mM IBMX eacutes 100 microM BAY-736691

tiacutepusuacute foszfodieacuteszteraacutez-gaacutetloacutet (PDE-gaacutetloacutekat hogy elkeruumlljuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes

02 mM L-arginint (az nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott Az L-argininnek ebben a

koncentraacutecioacuteban (02 mM) oumlnmagaacuteban semmilyen hataacutesa sincsen az nNOS aktivitaacutesra

eacutes a cGMP szinteacutezisre (Garthwaite et al 1989) 20 perces mACSF oldatban toumlrteacutenő

előkezeleacutes utaacuten a kontroll kamraacutehoz nem adtunk semmit miacuteg 200 microM SNP-t (NO

donort) adtunk 10 percre az ldquoSNP-kamraacutekhozrdquo eacutes 5microM NMDA-t adtunk 3 percre az

ldquoNMDA-kamraacutekhozrdquo Pontosan ugyanolyan reacutegioacute-specifikus cGMP jeloumlleacutest figyeltuumlnk

meg ha 5 30 150 vagy 300 microM NMDA-t adtunk a szeletekhez Azokban a

kiacuteseacuterletekben ahol az nNOS-t NOsGC-t a feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutekat

(VDCC) vagy az NMDA-receptorokat gaacutetoltuk az előinkubaacutelaacuteshoz hasznaacutelt

mACSFoldatot kiegeacutesziacutetettuumlk az adott gaacutetloacuteszerrel eacutes ezzel az oldattal veacutegeztuumlk a

szeletek előkezeleacuteseacutet 20 percig majd hozzaacuteadtuk az 5microM NMDA-t adtunk 3 percre Az

76

inkubaacutelaacutesokat koumlvetően az oldatokat gyorsan jeacuteghideg 4-os paraformaldehid fixaacuteloacutera

csereacuteltuumlk majd a szeleteket 48 oacuteraacuten aacutet tovaacutebb fixaacuteltuk ugyanebben az oldatban 4Cordm-on

A cGMP immunfluoreszcens megjeleniacuteteacuteseacutehez a szeleteket 2-os agarba aacutegyaztuk eacutes

Leica VT1200S tiacutepusuacute vibratoacutemon a 300microm vastag szeleteket uacutejrametszettuumlk 50microm

vastagsaacuteguacutera Miutaacuten 09 NaCl-ot eacutes 03 Triton X-100-at (Sigma) tartalmazoacute foszfaacutet

pufferben (PBST) 1 oacuteraacuten aacutet mostuk a metszeteket PBST-ben oldott 5 normaacutel szamaacuter

szeacuterummal (Vector Laboratories) 1 oacuteraacuten keresztuumll blokkoltuk a metszeteket Ezt koumlvette

az elsődleges antitestek oldata baacuteraacutenyban keacuteszuumllt cGMP ellenes (Prof J de Vente

laboratoacuteriumaacuteboacutel 14000) eacutes kettős immunfluoreszcens jeloumlleacutes eseteacuten egeacuterben keacuteszuumllt

glutamaacutet-dekarboxilaacutez 65 (GAD65 Millipore MAB351 1250) ellenes antitesteket

hiacutegiacutetottuk PBS-ben Szaacutemos PBS mosaacutest koumlvetően a kettős jeloumlleacutes eseteacuteben szamaacuterban

termeltetett biotin-koumltoumltt egeacuter ellenes antitestet (1200 Jackson Laboratories)

hasznaacuteltunk PBS-ben PBS mosaacutesok utaacuten az oumlsszes metszetet fluorokroacutemmal jeloumllt

maacutesodlagos antitestek kevereacutekeacuteben inkubaacuteltuk a metszeteket Alexa Flour 488 (baacuteraacuteny

elleni szamaacuter IgG 1200 Invitrogen) eacutes Alexa Fluor 594 (streptavidin 1200

Invitrogen) PBS-ben oldva Alapos PBS eacutes PB mosaacutes utaacuten a metszeteket mikroszkoacutepos

taacutergylemezre szedtuumlk ki eacutes Aqua-PolyMount (Polysciences Europe) hozzaacuteadaacutesaacuteval

fedtuumlk le fedőlemezzel Az egeacutesz kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan mACSF

oldattal melyhez hozzaacutetettuumlnk 1 microM tetrodotoxint (TTX) de nem tartalmazott

magneacutezium-ionokat A kiacuteseacuterleteket Olympus Optical FluoView300 paacutesztaacutezoacute konfokaacutelis

leacutezer mikroszkoacuteppal vagy Zeiss Axioplan 2 epifluoreszcens mikroszkoacuteppal eacuterteacutekeltuumlk

ki

V12 Statisztikai analiacutezisek

Az nNOS eacutes az NOsGC sejttest szintű elhelyezkedeacuteseacutenek meghataacuterozaacutesaacutera

iraacutenyuloacute fluoreszcens kiacuteseacuterletek soraacuten minden patkaacuteny dorzaacutelis hippokampuszaacuteboacutel

szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon hat 40 μm vastag koronaacutelis metszet keruumllt

teszteleacutesre kolokalizaacutecioacutenkeacutent a hippokampusz teljes rosztro-kaudaacutelis kiterjedeacuteseacuteben A

kolokalizaacutecioacutet csak abban az esetben vizsgaacuteltuk ha a sejt sejtmagja detektaacutelhatoacute volt

hogy biztos legyen hogy a sejt nagy reacutesze vizsgaacutelhatoacute Minden vizsgaacutelt sejt eseteacuteben

77

meacutereacutesre keruumllt a sejt keresztmetszeti teruumllete A meacuterendő sejtek kivaacutelasztaacutesa egy a

keacutepekre szisztematikus veacuteletlenszerű moacutedon elhelyezett haacuteloacute segiacutetseacutegeacutevel toumlrteacutent Azok

a sejtek melyek kivaacutelasztaacutesra keruumlltek a tovaacutebbiakban egyeacutenileg alapos vizsgaacutelat

taacutergyaacutet keacutepezteacutek A sejtek meacutereacuteseacutehez a ldquoNIH ImageJ image analyzerrdquo szoftvert az

adatok elemzeacuteseacutehez pedig a ldquoStatSoft Statisticardquo (Tulsa OK verzioacute7) szoftvert

hasznaacuteltuk Nem volt ceacutelunk hogy meghataacuterozzuk a kuumlloumlnboumlző markerekkel vizsgaacutelt

sejtek abszoluacutet szaacutemaacutet a hippokampuszban az araacutenyszaacutemok kvantitatiacutev meacutereacuteseacutet

veacutegeztuumlnk el Abercrombie korrekcioacute (Abercrombie 1946) hasznaacutelataacuteval kiegeacutesziacutetve

Abban az esetben amikor az adatok Gauss-eloszlaacutest mutattak a Shapiro-Wilksrsquos W-

teszt alapjaacuten parametrikus statisztikai jellemzőket alkalmaztunk (aacutetlag plusmn standard

deviaacutecioacute) Az adatok nagy reacutesze azonban nem mutatott Gauss-eloszlaacutest iacutegy nem-

parametrikus statisztikaacutekat hasznaacuteltunk ez esetben pedig a nemparametrikus

jellemzőket adtuk meg (mediaacuten interkvartilis taacutevolsaacuteg) A keacutetcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest

a nem-parametrikus MannndashWhitney U-teszttel a sokcsoportos oumlsszehasonliacutetaacutest a

szinteacuten nem-parametrikus KruskalndashWallis teszttel veacutegeztuumlk el Azokban a meacutereacutesekben

amikor az aranyszemcseacutek eacutes a szinapszis meacuteretek koumlzti korrelaacutecioacutet vizsgaacuteltuk az adatok

szinteacuten nem normaacutel eloszlaacutest mutattak ezeacutert a nem-parametrikus Spearman R-

korrelaacutecioacutet alkalmaztuk A null-hipoteacutezist akkor vetettuumlk el ha p-eacuterteacutek nem eacuterte el a

005 eacuterteacutekhataacutert ekkor a populaacutecioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteg illetve az adatok koumlzti korrelaacutecioacute

szignifikaacutensnak lett minősiacutetve

78

VI EREDMEacuteNYEK

Az Eredmeacutenyek fejezetben előszoumlr a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel egyes elemeinek

vizsgaacutelataacutet ceacutelzoacute kiacuteseacuterletsorozat eredmeacutenyeinek bemutataacutesaacutera keruumll sor (VI1-VI5)

Ezt koumlvetően a NO jelpaacutelya GABAerg szinapszisokban bekoumlvetkező aktivaacutelaacutesaacutenak

lehetseacuteges mechanizmusai keruumlltek koumlzeacuteppontba iacutegy a maacutesodik kiacuteseacuterletsorozat az

NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutenak hataacutesaacutera jelentkező NO jelaacutetvitelre (VI6) eacutes az

NMDA receptorok GABAerg szinapszisokhoz valoacute elhelyezkedeacuteseacutere (VI7-VI9)

iraacutenyult

VI1 A neuronaacutelis nitrogeacuten-monoxid szintaacutez (nNOS) asszociaacuteloacutedik a GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteval a CA1 piramissejtek sejttesteacuten

dendritjeacuten eacutes axon iniciaacutelis szegmentjeacuten

Koraacutebban maacuter kimutattaacutek hogy a nitrogeacuten-moxodiot előaacutelliacutetoacute enzim az nNOS a

piramissejtek serkentő szinapszisainak posztszinaptikus oldalaacuten talaacutelhatoacute meg

(Blackshaw et al 2003 Burette et al 2002 Wendland et al 1994) Azonban gyengeacuten

fixaacutelt agyszoumlveten beaacutegyazaacutes előtti immunarany technika hasznaacutelataacuteval előszoumlr sikeruumllt

kimutatnunk hogy az nNOS nemcsak a dendritikus tuumlskeacutekben de a piramissejteken

leacutevő szimmetrikus GABAerg szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is

Egyazon kiacuteseacuterletben keacutesziacutetett nNOS immunarany jeloumlleacutes teljesen hiaacutenyzott az nNOS

geacutenkiuumltoumltt egerek metszeteiből (9 aacutebra A) miacuteg a vad tiacutepusuacute egerekben erősen jeloumllt

szomatikus szinapszisok voltak laacutethatoacutek (9 aacutebra B C) Az immunarany jeloumlleacutes raacuteadaacutesul

nem veacuteletlenszerű moacutedon asszociaacuteloacutedott a piramissejtek membraacutenjaacutehoz hanem

specifikusan halmozoacutedott fel a szimmetrikus szinapszisokban (9 aacutebra B C 10 aacutebra A

D-H) eacuteppuacutegy mint az aszimmetrikus tuumlske szinapszisokban (10 aacutebra B C N O) Az

immunarany jel relatiacutev lineaacuteris sűrűseacutegmeacutereacuteseacuteből kideruumllt hogy miacuteg a jelsűrűseacuteg a

szimmetrikus szinapszisok aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban ~135 +- 031 aranyszemcsemicrom membraacuten

(aacutetlag +- SD) volt addig mindoumlssze 003 +- 002 aranyszemcsemicrom sűrűseacuteg volt a

szinapszis koumlzeli extraszinaptikus membraacutenteruumlleteken

79

9 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten illetve a jeloumlleacutes teljes

hiaacutenya az nNOS-geacutenkiuumltoumltt (KO) aacutellatban

(A) A beaacutegyazaacutes előtti immunhisztokeacutemiai reakcioacute utaacuten keacutesziacutetett felveacutetelek az nNOS

immunarany-jeloumlleacutes teljes hiaacutenyaacutet mutatjaacutek nNOS KO egeacuter szinapszisaiban (uumlres

nyiacutelhegyek) melyeket axonterminaacutelisok (t) leacutetesiacutetenek posztszinaptikus sejttesteken (s)

(B C) Ugyanebben a kiacuteseacuterletben a vad-tiacutepusuacute (WT) egerekből szaacutermazoacute mintaacutekban

erőteljes jeloumlleacutes figyelhető meg a GABAerg szinapszisokban Az ezuumlsttel intenzifikaacutelt

immunarany szemcseacutek (fekete nyiacutelhegyekkel jeloumllve) a szimmetrikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban vannak jelen Leacutepteacutek 05 microm

Neacutemi jel megfigyelhető volt meacuteg a piramissejt citoplazaacutejaacuteban az endoplazmaacutes retikulum

ciszternaacutei felett eacutes erős jeloumllődeacutest figyeltuumlnk meg az nNOS pozitiacutev interneuronok

sejttesteacuteben eacutes dendritjeiben (10 aacutebra I) A piramissejtek sejttesteacutet keacutetfeacutele interneuron

idegzi be a parvalbumin (PV) immunreaktiacutev interneuronok melyek a sejttestre eacuterkező

terminaacutelisok koumlruumllbeluumll keacutetharmadaacutet adjaacutek eacutes a kolecisztokinin (CCK) pozitiacutev

kosaacutersejtek melyek koumlruumllbeluumll egyharmadaacutet keacutepezik a szomatikus terminaacutelisoknak (laacutesd

III342 alfejezetben (Nyiacuteri et al 2001a) Az egeacuter hippokampuszban teljesen

80

rekonstruaacutelt szimmetrikus szinapszisokat vizsgaacuteltunk eacutes azt talaacuteltuk hogy a teljesen

rekonstruaacutelt szomatikus szinapszisok legalaacutebb 76-a (az egyes aacutellatokban meacutert

szaacutezaleacutekok mediaacutenja ami az alaacutebbi araacutenyokboacutel adoacutedott 1619 1520 eacutes 1621 a 3

egeacuterben) (9 aacutebra B C eacutes 10 aacutebra A) miacuteg az axon iniacuteciaacutelis szegmenten (AIS)

rekonstruaacutelt szinapszisoknak legalaacutebb 32-a (mediaacuten az alaacutebbi araacutenyokboacutel 722 1026

eacutes 620 a 3 egeacuterben) (10 aacutebra E F) bizonyult pozitiacutevnak az aranyszemcseacutek

posztszinaptikus denzitaacuteshoz valoacute asszociaacutecioacuteja alapjaacuten Feltehetően ez az adat

alulbecsli az nNOS-t tartalmazoacute szinapszisok valoacutes szaacutemaacutet mivel igen nagy

mennyiseacutegben talaacutelhatoacutek meg horgonyzoacute eacutes egyeacuteb feheacuterjeacutek a posztszinaptikus

denzitaacutesban neheziacutetve a szinapszist feleacutepiacutető feheacuterjeacutek immunhisztokeacutemiai detektaacutecioacutejaacutet

Mivel a periszomatikus GABAerg gaacutetlaacutest oumlsszesen haacuteromfeacutele interneuron laacutetja el (a

CCK- eacutes PV-pozitiacutev kosaacutersejtek eacutes a PV-pozitiacutev axo-axonikus vagy maacutes neacuteven

kandelaacuteber-sejtek laacutesd a III342 alfejezetben) iacutegy ezek az adatok joacutel interpretaacutelhatoacutek

Maacutes a helyzet azonban a dendriteken leacutevő szinapszisokkal amit szaacutemos interneuron

innervaacutel (laacutesd a III341 alfejeztben) ezeacutert a dendritikus szinapszisok

elektronmikroszkoacutepos meacutereacuteseacutet nem veacutegeztuumlk el Mindazonaacuteltal szaacutemos dendritikus

szimmetrikus szinapszist intenziacuteven pozitiacutevnak talaacuteltunk mindhaacuterom egeacuterben Az egeacuter

hippokampuszhoz hasonloacutean a patkaacuteny hippokampusz szomatikus (10 aacutebra G IndashK)

dendritikus (10 aacutebra H L) eacutes AIS (10 aacutebra M) szinapszisai is szaacutemos esetben nNOS

immunarany jeloumlltek voltak A patkaacutenyban veacutegzett kiacuteseacuterletek soraacuten immunarany-

immunperoxidaacutez kettős festeacutest is veacutegeztuumlnk hogy direkt kolokalizaacuteljuk az nNOS

immmunarany jeloumlleacutest a CCK eacutes PV immunreaktiacutev terminaacutelisok teljesen rekonstruaacutelt

szinapszisaiban Azt talaacuteltuk (mindhaacuterom vizsgaacutelt patkaacutenyban) hogy az nNOS jelen

volt a posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban mind a CCK mind a PV aacuteltal keacutepzett szomatikus

szinapszisokban (10 aacutebra IndashK) a PV-pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban melyek az

AIS-en veacutegződnek (10 aacutebra M) eacutes a dendritre eacuterkező CCK-pozitiacutev eacutes negatiacutev

terminaacutelisok szinapszisaiban is (10aacutebra L) Tekintve hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok

a piramissejtek kuumlloumlnboumlző sejtfelsziacuteni domeacutenjeit ceacutelozzaacutek ez azt jelenti hogy legalaacutebb

oumlt kuumlloumlnboumlző interneuron tiacutepus piramissejtre eacuterkező szinapszisaacuteban megtalaacutelhatoacute az

nNOS posztszinaptikusan Az NO receptoraacutenak eloszlaacutesa a hippokampuszban tovaacutebb

erősiacutetette ezt a megaacutellapiacutetaacutest (laacutesd alaacutebb)

81

82

10 Aacutebra Az elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes

laacutethatoacute egerek eacutes patkaacutenyok szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisok

posztszinaptikus oldalaacuten

Az nNOS-ellenes immunarany jeloumlleacutes az egeacuter (AndashF) eacutes a patkaacuteny (GndashO)

hippokampuszaacutenak CA1 reacutegioacutejaacuteban nem csak az aszimmetrikus (sp) (B C N O)

hanem a szimmetrikus szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacuteban is jelen van A jeloumlleacutes

megfigyelhető sejttestre (A G IndashK) dendritekre (A D H L) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszokra (AIS a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot uumlres nyiacutelhegyek jeloumllik E F

M) eacuterkező szinapszisok sorozatmetszeteiben Az nNOS posztszinaptikusan van jelen

mind a kolecisztokinint (CCK I L) mind pedig a parvalbumint (PV J K M)

tartalmazoacute terminaacutelisok szinapszisaiban I Az nNOS-pozitiacutev interneuronok dendritjei

(d) is erős jeloumlleacutest mutatnak t terminaacutelis s sejttest d dendrit sp tuumlske Leacutepteacutek 05

microm

VI2 Az NO receptor α1 eacutes α2 alegyseacutegeacutenek sejttiacutepus specifikus mRNS megoszlaacutesa a

hippokampuszban (taacuters-munkacsoport munkaacuteja)

Ahogyan a bevezeteacutesben reacuteszleteztem (III54 alfejezet) keacutetfeacutele alegyseacuteg

oumlsszeteacutetelű funkcionaacutelisan fontos NO receptor leacutetezik ami az NO jelaacutetvitel

tovaacutebbiacutetaacutesaacutera keacutepes az α1β1 eacutes az α2β1 kompoziacutecioacutejuacute heterodimerek Mivel a kuumlloumlnboumlző

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptorok koumltődeacutese a szinaptikus horgonyzoacute feheacuterjeacutekhez elteacuterő eacutes

a jelaacutetviteli regulaacutecioacutejuk is maacutes lehet az egyes neuronokban megvizsgaacuteltuk hogy az

NOsGC egyes α alegyseacutegei mely neuronokban fejeződnek ki Digoxigenin-jeloumllt

riboproacutebaacuteval taacuters-munkacsoport segiacutetseacutegeacutevel keacutesziacutetett in situ hibridizaacutecioacutes kiacuteseacuterletekből

(amit kromogeacuten pufferben oldott 5-bromo-4-kloro-3-indolyl-foszfaacutet eacutes nitro-keacutek

tetrazolium-klorid segiacutetseacutegeacutevel jeleniacutetettek meg) kideruumllt hogy az α1 alegyseacuteg mRNS

csak interneuronokban volt jelen (11aacutebra AndashD) eacutes ezeket az idegsejteket a patkaacuteny

hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak minden reacutetegeacuteben megfigyeltuumlk Az NO receptor α2

alegyseacuteg mRNS viszont hiaacutenyzott az interneuronokboacutel eacutes kizaacuteroacutelag piramissejtekben

volt jelen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban (11aacutebra E F) A kiacuteseacuterleteket egerekben is

elveacutegeztuumlk eacutes azonos eredmeacutenyre jutottunk

83

11 Aacutebra Az NOsGC α1 eacutes α2 alegyseacutegek mRNS eloszaacutesa a hippokampusz CA1

teruumlleteacuten

A feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken a keacutet alegyseacuteg elkuumlloumlnuumllő mRNS jeloumlleacutese laacutethatoacute

patkaacuteny hippokampuszban A sense proacutebaacutek nem adtak jelet sem az NOsGC α1 (A) sem

pedig az α2 (F) alegyseacuteg eseteacuteben Az α1 alegyseacuteg kizaacuteroacutelag interneuronokban volt

kimutathatoacute a stratum radiatum (B) stratum pyramidale (C) eacutes stratum oriensalveus

(D) reacutetegekben Ezzel szemben az α2 alegyseacuteg csak a piramissejtekben volt jelen (E) A

leiacuterttal egyező jeloumlleacutes figyelhető meg egeacuterben is (nincs bemutatva) r str radiatum p

str pyramidale o str oriens Leacutepteacutek 50 microm

VI3 Az NOsGC α1 alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute az interneuronokban eacutes azok

terminaacutelisaiban de hiaacutenyzik a piramissejtekből

Tekintve hogy mRNS szinten az NOsGC α1 alegyseacuteg csak az interneuronokban

fordult elő beaacutegyazaacutes előtti immunperoxidaacutez festeacutest veacutegeztuumlnk az α1 alegyseacuteg

feheacuterjeacutejeacutenek kimutataacutesaacutera hogy megtalaacutehatoacute-e az interneuronok terminaacutelisaiban is

84

85

12 Aacutebra Feacuteny- eacutes elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken beaacutegyazaacutes előtti

immunperoxidaacutez reakcioacute jeleniacuteti meg az NOsGC eloszlaacutesaacutet egeacuterben eacutes patkaacutenyban

A Feacutenymikroszkoacutepos felveacuteteleken az NOsGC α1 alegyseacuteg aacuteltalaacutenos eloszlaacutesa figyelhető

meg a hippokampusz reacutetegeiben (o str oriens p str pyramidale r str radiatum l-

m str lacunosum-moleculare) B C Tuumlkoumlrkeacutep kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute felveacutetelek

mutatjaacutek hogy a metszetek felsziacuteneacuten ketteacutevaacutegott interneuronok (nyiacutelhegyek) mind az α1

(B) mind pedig a β1 (C) alegyseacutegeacutet kifejezik az NO-receptornak A feheacuter nyiacutelhegyek β1

alegyseacuteget kifejező a metszet felsziacuteneacutehez koumlzel elhelyezkedő piramissejt-dendritekre

mutatnak D E Nagyobb nagyiacutetaacutesuacute felveacutetelen joacutel laacutethatoacute hogy az α1 alegyseacuteg jelen van

a piramissejtek (csillagokkal jeloumllve) kosarakat keacutepző terminaacutelisokban (nyiacutelhegyek)

mind egeacuterben (D) mind pedig patkaacutenyban (E) F-K Az elektronmikroszkoacutepos

felveacuteteleken α1 alegyseacuteget kifejező terminaacutelisok figyelhetők meg melyek szinapszisokat

leacutetesiacutetenek a piramissejtek sejttesteacuten (s F I ) dendritjein (d G J ) eacutes axon-iniciaacutelis

szakaszain (a H K a jellegzetes membraacuten-alatti soumlteacutet saacutevot feheacuter nyiacutelhegyek jeloumllik)

egeacuterben (FndashH ) eacutes patkaacutenyban (IndashK ) Leacutepteacutek A 50 microm B C 25 microm D E 10 microm Fndash

K 250 nm

Azt is megvizsgaacuteltuk vajon a heterodimer maacutesik alegyseacutege a β1 alegyseacuteg is

megtalaacutelhatoacute ezekben a sejtekben A festődeacutesi mintaacutezat egeacuterben eacutes patkaacutenyban azonos

volt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy az mRNS eloszlaacutesaacutehoz hasonloacutean az α1

alegyseacuteg feheacuterje a hippokampusz alveus - stratum lacunosum-moleculare tengelyen

szaacutemos interneuronban erősen jelen volt (12 aacutebra A) Alkalmankeacutent gyengeacutebben

festődő interneuronokat is eacuteszleltuumlnk Az interneuronok legerősebben festődő teruumlletei a

sejttest a proximaacutelis dendrit eacutes az axonok voltak Feacutenymikroszkoacuteposan a stratum

pyramidale-ban a piramissejtek koumlruumll kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutesre emleacutekeztető jeloumlleacutest

kaptunk mindkeacutet fajban (12 aacutebra D E) Ezt megerősiacutetendő elektronmikroszkoacuteppal

vizsaacuteltuk meg az immunperoxidaacutez festett metszeteket Ennek soraacuten veacuteletlenszerűen

gyűjtoumltt terminaacutelisokat rekontruaacuteltunk az egeacuter hippokampuszban eacutes azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus terminaacutelisoknak legalaacutebb ~79-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel

2023 1824 eacutes 2329 a 3 egeacuterben) (12 aacutebra F) az AIS terminaacutelisoknak pedig legalaacutebb

42-a (mediaacuten szaacutezaleacutek az alaacutebbi araacutenyokboacutel 1021 421 eacutes 819 a 3 egeacuterben) (12

aacutebra H) volt pozitiacutev az NOsGC α1 alegyseacutegre Ezenkiacutevuumll mindhaacuterom egeacuterben szaacutemos

86

dendritikus szimmetrikus szinapszist leacutetesiacutető terminaacutelist is talaacuteltunk ami erős

pozitivitaacutest mutatott az α1 alegyseacutegre (12 aacutebra G) Hasonloacutean az egeacuter

hippokampuszhoz a rekonstrukcioacute soraacuten patkaacutenyban is szaacutemos α1 alegyseacuteg pozitiacutev

szomatikus (12 aacutebra I) dendritikus (J) eacutes AIS (K) terminaacutelist talaacuteltunk Ezentuacutel

patkaacutenyban a β1 alegyseacuteg eloszlaacutesaacutet is megvizsgaacuteltuk elektronmikroszkoacutepos szinten eacutes

ahogy vaacuterhatoacute is volt szaacutemos GABAerg terminaacutelis pozitivitaacutest mutatott β1 alegyseacutegre

(nincs bemutatva) Ezek az eredmeacutenyek megerősiacutetetteacutek hogy ezek a GABAerg

terminaacutelisok kifejeznek α1β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű NO receptort eacutes elhelyezkedeacutesűkből

kifolyoacutelag alkalmasak a piramissejtekből eacuterkező retrograacuted NO jelaacutetvitel detektaacutelaacutesaacutera

Az α1 alegyseacuteg mindig heterodimert keacutepez a β1 alegyseacuteggel Megvizsgaacuteltuk leacuteteznek-e

olyan interneuronok melyek esetleg nagy mennyiseacutegben kifejezik a β1 alegyseacuteget α1

alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk a patkaacuteny hippokampusz

interneuronjain az α1 eacutes β1 alegyseacuteg koumlzoumltt (12 aacutebra B C)

Mivel mindkeacutet antitest nyuacutelban keacuteszuumllt iacutegy a direkt kolokalizaacutecioacute nem

megvaloacutesiacutethatoacute eacuteppen ezeacutert az uacutegy nevezett ldquotuumlkoumlrkeacutep-moacutedszertrdquo (Kosaka et al 1985)

hasznaacuteltuk mely soraacuten az egyik metszet felsziacuteneacuten feacutelbevaacutegott sejtek vizsgaacutelhatoacutek a

szomszeacutedos metszeten Ennek megfelelően az egyik metszetet α1 alegyseacuteg ellenes a

szomszeacutedos metszetet pedig β1 alegyseacuteg ellenes antitesttel inkubaacuteltuk A vaacutertnak

megfelelően a β1 alegyseacuteg mind a piramissejteket (főkeacutent dendritek) (Burette et al

2002a Ding et al 2004) mind interneuronokat (főleg sejttestek proximaacutelis dendritek

eacutes terminaacutelisok) miacuteg az α1 alegyseacuteg ellenes antitest csak interneuronokat jeloumllt Azt

talaacuteltuk hogy gyakorlatilag az α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok mind β1 alegyseacuteg

pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2727 4142 3437 eacutes 1819) eacutes fordiacutetva a β1

alegyseacuteg pozitiacutev interneuronok α1 alegyseacuteg pozitiacutevak is voltak (neacutegy patkaacutenyboacutel 2829

4143 3940 eacutes 1617 neacutehaacuteny aacutel-negatiacutev sejt előfordulhat a metszetekben az α1

alegyseacuteg bdquoszolubilisrdquo azaz nem lehorgonyzott termeacuteszeteacuteből kifolyoacutelag vagy abboacutel

eredően hogy a metszetkeacutesziacuteteacutes koumlzben a sejttestek egy kisebb-nagyobb darabja

elveszhet) Amellett hogy az α1 alegyseacuteg ellenes antitest specificitaacutesaacutet ezzel igazoltuk

ezek az eredmeacutenyek azt is sugalljaacutek hogy mivel nincs β1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron

α1 alegyseacuteg neacutelkuumll ezeacutert nincs olyan interneuron ami csak α2β1 alegyseacutegoumlsszeteacutetelű

receptort tartalmazna ami oumlsszhangban van az in situ hibridizaacutecioacutes eredmeacutenyeinkkel

miszerint α2 alegyseacuteg mRNS hiaacutenyzott az interneuronokboacutel

87

VI4 Mind a periszomatikus mind a dendritikus GABAerg neuronok

tartalmaznak NOsGC α1 alegyseacuteget

Ahogy koraacutebbi kiacuteseacuterleteinkből maacuter laacutethatoacute volt az NOsGC α1 alegyseacuteg mRNS-e

szaacutemos interneuronban kifejeződoumltt eacutes feheacuterje szinten is szaacutemos α1 eacutes β1 alegyseacuteget

tartalmazoacute interneuron festődoumltt de koraacutentsem az oumlsszes Ennek eacuterdekeacuteben kvantitatiacutev

immunfluoreszcens vizsgaacutelatokat veacutegeztuumlnk hogy megaacutellapiacutetsuk hogy nagyobb

interneuron csoportok mint a CCK- PV- nNOS- vagy SOM-pozitiacutev periszomatikus

vagy dendritikus interneuronok (laacutesd a III34 alfejezetet) tartalmazzaacutek-e ezt az NO

receptort Habaacuter nincs adat az oumlsszes felsorolt sejtjeloumllő anyag direkt kolokalizaacutecioacutejaacutera a

patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban indirekt megfigyeleacutesek alapjaacuten gyakorlatilag ez

a neacutegy sejtmarker kuumlloumlnboumlző aacutet nem lapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet alkot (Freund

2003 Freund and Buzsaacuteki 1996 Jinno and Kosaka 2000 2002 2004 2006 Seress et

al 2005) Az aacuteltalaacutenos festődeacutesi mintaacutezat ezekre a sejtjeloumllő anyagokra hasonloacute volt a

koraacutebban leiacutertakhoz Az NOsGC α1 alegyseacuteg elleni immunfluoreszcens jel megfelelt a

koraacutebban immunperoxidaacutez (DAB) moacutedszerrel kapott festődeacutesnek (laacutesd a fenti

fejezeteket) Sejtmag festeacutest nem tapasztaltunk Az α1 alegyseacuteg festeacuteseacuteneacutel kuumlloumlnboumlző

immunfluoreszcens intenzitaacutesuacute jelet kaptunk azonban azt nem vizsgaacuteltuk hogy az α1

jelintenzitaacutes eacutes a kuumlloumlnboumlző interneuron markerek korrelaacutelnak-e egymaacutessal Veacutekony

axonszerű nyuacutelvaacutenyokat szinteacuten megfigyeltuumlnk a neuropil koumlruumll az immunfluoreszcens

festeacutessel is (13 aacutebra) A patkaacuteny dorzaacutelis hippokampusz CA1-ben jeloumllt

interneuronjainak veacuteletlenszerű mintaveacutetelezeacutese eacutes vizsgaacutelata utaacuten (reacuteszletes leiacuteraacutes a

V12 alfejezetben talaacutelhatoacute) a koumlvetkező median araacutenyokat kaptuk (zaacuteroacutejelben egy adott

kolokalizaacutecioacutera tesztelt sejtek szaacutema talaacutelhatoacute a haacuterom patkaacutenyboacutel illetve az egyes

aacutellatokboacutel szaacutermazoacute szaacutezaleacutekos eacuterteacutekek kuumlloumln-kuumlloumln) az oumlsszes vizsgaacutelt NOsGC α1

pozitiacutev sejt koumlzuumll ~21 (n =1383 23 15 eacutes 21) volt CCK pozitiacutev (13A) 40 (n=

1527 38 41 eacutes 40) volt PV pozitiacutev (13B) 11 (n = 1322 11 10 eacutes 20) nNOS

(13C) eacutes 7 (n = 1599 4 7 eacutes 7) SOM pozitiacutev volt (13F) Az interneuron jeloumllő

anyagok oldalaacuteroacutel vizsgaacutelva az NOsGC α1 pozitiacutev sejteket a koumlvetekző araacutenyokat

kaptuk a CCK interneuronok ~68-a (n=432 68 45 eacutes 80) a PV interneuronok

~74-a (n= 771 74 74 eacutes 90) az nNOS interneuronok ~20-a (n=756 18 20 eacutes

34) eacutes a SOM interneuronok ~32-a (n=264 37 32 eacutes 31) volt α1 pozitiacutev

88

89

13 Aacutebra Az NOsGC α1 alegyseacutegeacutenek immunfluoreszcens kolokalizaacutecioacuteja kuumlloumlnboumlző

interneuronmarkerekkel a patkaacuteny hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacuteban

A fluoreszcens mikroszkoacutepos felveacuteteleken laacutethatoacute hogy az NOsGC α1 alegyseacutege reacuteszben

kifejeződik a CCK (A) PV (B) nNOS (C) vagy SOM (F ) pozitiacutev interneuronokban D

Az nNOS eacutes a SPR jeloumlleacutes ugyancsak reacuteszben aacutetfed azonban a CB1R eacutes az nNOS soha

nem volt egyuumltt kimutathatoacute (E) A nyiacutelhegyek markereket egyuumlttesen kifejező sejteket

jeloumllnek az uumlres nyiacutelhegyek a nem kolokalizaacuteloacute sejteket mutatjaacutek Leacutepteacutek 50 microm

Habaacuter direkt eacutes indirekt adatok azt sugalltaacutek hogy ez a neacutegy interneuron jeloumllő

anyag csak elhanyagolhatoacute meacuterteacutekű kolokalizaacutecioacutet mutat keveacutes informaacutecioacute aacutellt

rendelkezeacutesre az nNOS eacutes a CCK pozitiacutev interneuronok koumlzoumltt fennaacutelloacute esetleges

kolokalizaacutecioacutera Tekintve hogy gyakorlatilag minden CCK pozitiacutev interneuron CB1

cannabinoid receptor pozitiacutev is (Haacutejos et al 2000 Katona et al 1999) ezeacutert CB1

receptor-nNOS kettős immunfluoreszcens festeacutessel teszteltuumlk a lehetseacuteges

kolokalizaacutecioacutet (13 aacutebra E) de a veacuteletlenszerű minta elemzeacutese soraacuten nem talaacuteltunk

kettősen jeloumllt sejteket (n = 206 CB1-positiacutev sejt oumlsszesen haacuterom patkaacutenyboacutel) Vruwink

eacutes mtsai (Vruwink et al 2001) eredmeacutenyei alapjaacuten felteacutetelezhető volt hogy reciprok

keacutemiai oumlsszekoumltteteacutes van keacutet gaacutetloacute haacuteloacutezat koumlzt az agykeacuteregben Az egyik populaacutecioacute P-

anyag receptor (SPR) eacutes nNOS pozitiacutev volt miacuteg a maacutesik P-anyag eacutes NOsGC

pozitivitaacutest mutatott Eredmeacutenyeik alapjaacuten a nagyagykeacuteregben 94-95-os aacutetfedeacutes

mutatkozott mindkeacutet iraacutenyban az nNOS eacutes SPR pozitiacutev sejtek koumlzoumltt Eacuteppen ezeacutert azt is

megvizsgaacuteltuk ugyanilyen erős aacutetfedeacutes van-e a hippokampusz nNOS eacutes SPR tartalmuacute

sejtjei koumlzt Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a hippokampuszban ez az aacutetfedeacutes messze

elteacuter az agykeacutereghez keacutepest szaacutem szerint a vizsgaacutelt SPR pozitiacutev sejtek ~47-a (n= 709

47 41 eacutes 50) volt nNOS tartalmuacute miacuteg az nNOS pozitiacutev sejtek ~43-a (n= 654 43

37 eacutes 68) bizonyult SPR tartalmuacutenak (13 aacutebra D)

VI5 Az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalom eacutes bizonyos interneuron tiacutepusok sejttest

meacuterete koumlzti korrelaacutecioacute

Sok esetben egy idegsejt funkcioacuteja vagy metabolikus aacutellapota oumlsszhangban van a

sejttesteacutenek meacutereteacutevel ezeacutert megvizsgaacuteltuk hogy a kuumlloumlnboumlző interneuronok meacuterete

90

korrelaacutel-e az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmaacuteval Megmeacutertuumlk az adott sziacutenben megjeloumllt

interneuronok keresztmetszeti teruumlleteacutet eacutes keacutet csoportra osztottuk az adatokat az

alapjaacuten hogy tartalmazott-e α1 alegyseacuteget A CCK eacutes SOM sejtek eseteacuteben nem

talaacuteltunk korrelaacutecioacutet az α1 tartalom eacutes sejtestuumlk meacuteretuumlk koumlzt Eacuterdekes azonban hogy

azok a PV interneuronok melyek NOsGC α1 pozitiacutevak is voltak szignifikaacutensan

nagyobb keresztmetszeti teruumllettel rendelkeztek (aacutetlagosan 16475microm2) mint az NOsGC

α1 negatiacutev PV interneuronok (aacutetlagosan 13644 microm2) vagyis a teruumlletuumlk ~ 21-kal volt

nagyobb (p lt 0001) (Ha azt vesszuumlk hogy hipotetikusan a sejtek goumlmb alakuacuteak akkor

ez a teruumlletkuumlloumlnbseacuteg 33 kuumlloumlnbseacuteget okozna a sejtek teacuterfogataacuteban) Az nNOS pozitiacutev

interneuronok eseteacuteben az α1 alegyseacuteget tartalmazoacutek keresztmetszeti teruumllete

szignifikaacutensan kisebb volt (aacutetlagosan 12113microm2) az α1-negatiacutev nNOS-pozitiacutev

interneuronokeacutenaacutel (aacutetlagosan 13181microm2) ami 8-kal kisebb teruumlletet jelent ( p lt 001)

(Ismeacutet goumlmb alakuacute sejteket felteacutetelezve ez 12 kuumlloumlnbseacuteget jelent a sejtek

teacuterfogataacuteban)

VI6 NMDA indukaacutelta cGMP termeleacutes a tuacuteleacutelő hippokampusz CA1 reacutegioacutejaacutenak

GABAerg terminaacutelisaiban

Az eddig ismertetett eredmeacutenyekből megtudtuk hogy a hippokampaacutelis

GABAerg terminaacutelisok rendelkeznek NO receptorral a piramissejtek pedig keacutepesek

szinaptikusan a nitrogeacuten-monoxid előaacutelliacutetaacutesaacutera Azonban kiacutevaacutencsiak voltunk arra hogy

a kalcium aacuteltal beindiacutethatoacute szinaptikus NO szinteacutezishez hogyan jut megfelelően magas

kalcium koncentraacutecioacute egy egyeacutebkeacutent gaacutetloacute posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteba

Keacutezenfekvőnek tűnt tesztelni hogy ugyanaz az NMDA receptor ami a serkentő

szinapszisokban elveacutegzi ezt a feladatot rendelkezeacutesre aacutell-e itt is

Ezeacutert tuacuteleacutelő szeleteket keacutesziacutetettuumlnk egeacuter dorzaacutelis hippokampuszokboacutel eacutes

moacutedosiacutetott mesterseacuteges agy-gerincvelői folyadeacutekban (mACSF) inkubaacuteltuk őket ami

foszfodieacuteszteraacutez gaacutetloacutekat (hogy megelőzzuumlk a cGMP hidroliacuteziseacutet) eacutes L-arginint (az

nNOS szubsztraacutetjaacutet) tartalmazott a szuumlkseacuteges ionokon eacutes gluumlkoacutezon kiacutevuumll Fixaacutelaacutest

koumlvetően a cGMP termeleacutest immunfluoreszcens moacutedszerrel tettuumlk laacutethatoacutevaacute cGMP

ellenes antitest segiacutetseacutegeacutevel

91

14 Aacutebra NMDA-indukaacutelt cGMP

termeleacutes akut tuacuteleacutelő hippokampaacutelis

szeletben

AndashI Az első oszlop a teljes

hippokampuszban mutatja a jeloumlleacutest

a maacutesodik oszlop a CA1 a harmadik

oszlop pedig a CA3ab reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacutet jeleniacuteti meg

kinagyiacutetva A A CA3ab reacutegioacuteban

jeloumllt neacutehaacuteny kosaacuter-terminaacutelistoacutel

eltekintve a kontroll metszetekben

nem volt eacuteszlelhető cGMP termeleacutes

B A nitrogeacuten-monoxid-donor SNP

minden reacutegioacuteban megemelte a

cGMP-szintet de a kosaacuter-

terminaacutelisok csak az Ammon-

szarvban jeloumllődtek a gyrus

dentatusban nem Figyelemre meacuteltoacute

hogy a CA3ab reacutegioacuteban az SNP

erősebb cGMP-jelet indukaacutelt mint

az NMDA-kezeleacutes C 5 microM NMDA

adaacutesa reacutegioacutefuumlggő hataacutest vaacuteltott ki

erős cGMP termeleacutest indukaacutelt a

CA1CA3c reacutegioacutekban miacuteg a gyrus

dentatusban nem volt jeloumllt

terminaacutelis D Az NMDAR-gaacutetloacute

MK-801 eacutes D-AP5 teljesen kiveacutedteacutek

az NMDA hataacutesaacutet de nem

vaacuteltoztattaacutek meg a CA3ab reacutegioacuteban

a jeloumlleacutest E A posztszinaptikus

feszuumlltseacutegfuumlggő kalciumcsatornaacutek

(L- eacutes R-tiacutepusuacute) gaacutetlaacutesa eacuterintetlenuumll

92

hagyta az NMDA hataacutesaacutet F G Az NO-receptor gaacutetloacute ODQ eacutes az nNOS gaacutetloacute L-NAME

is megakadaacutelyozta az NMDA-indukaacutelt cGMP-termeleacutest H I nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatboacutel

keacutesziacutetett szeletben nem volt kimutathatoacute cGMP-jeloumlleacutes eacutes az NMDA adaacutesa sem volt

hataacutessal a cGMP-termeleacutesre A szeletben laacutethatoacute elszoacutert fluoreszcens jelet minden

esetben eacuteraacutetmetszetek adtaacutek J A gyrus dentatus szemcsesejt reacutetege kontroll

koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt SNP illetve NMDA adagolaacutes hataacutesaacutera Nem indukaacutelt cGMP

termeleacutest egyik koumlruumllmeacuteny sem K GAD65 eacutes cGMP kettős immunjeloumlleacutes a CA1 reacutegioacute

piramissejt-reacutetegeacuteben Leacutepteacutek I első oszlop 1 mm (A-I első oszlopaira vonatkozoacutean) I

harmadik oszlop 10 microm (A-I maacutesodik eacutes harmadik oszlopaira eacutes J-K sorokra

vonatkozoacutean)

A kontroll szeletekben (n=20 10 egeacuterből) idegi alapaktivitaacutes aacuteltal indukaacutelt

cGMP jel csak neacutehaacuteny interneuron szoacutemaacuteban eacutes dendritben volt megfigyelhető A

kosaacutersejt-terminaacutelis festeacutes teljesen hiaacutenyzott a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteboacutel miacuteg

gyenge eacutes ritkaacuten előforduloacute kosaacutersejt-terminaacutelis szerű jelet figyeltuumlnk meg a CA3ab

pyramissejt reacutetegeacuteben (14 aacutebra A) Kettős immunfluoreszcens moacutedszer hasznaacutelataacuteval

megaacutellapiacutetottuk hogy ezek a terminaacutelisok valoacuteban GABAergek (aacutetlagplusmn SD 965plusmn27

volt GAD65 pozitiacutev n=118 4 szelet 2 egeacuter) A maacutesik oldalroacutel vizsgaacutelva a

kolokalizaacutecioacutet pedig 389plusmn27 -a a GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt-terminaacutelisoknak volt

cGMP immunreaktiacutev CA3ab reacutegioacuteban (15 aacutebra A n=330 4 szelet 2 egeacuter) Egyaacuteltalaacuten

nem kaptunk kosaacuter-terminaacutelis szerű jelet a gyrus dentatusban Habaacuter kiacuteseacuterleteink soraacuten a

CA1 reacutegioacutera koncentraacuteltunk a CA3c reacutegioacute minden kiacuteseacuterletben azonos festődeacutesi

mintaacutezatot mutatott Neacutehaacuteny gliasejt jeloumlleacutest minden hippokampaacutelis reacutegioacuteban meg

lehetett figyelni minden bizonnyal annak eredmeacutenyekeacutent hogy az asztrogliaacutek mind NO

szenzitiacutev mind NO inszenzitiacutev guanilaacutet-ciklaacutezt is kifejeznek (de Vente and Steinbusch

1992 Teunissen et al 2001)

Egy NO donor nitroprusszid-naacutetrium (SNP 200 μM 10 percre) hozzaacuteadaacutesaacutera

hatalmas cGMP szint noumlvekedeacutest tapasztaltunk a legtoumlbb idegi elemben A legerősebb

jelintenzitaacutest a CA1 eacutes CA3 kosaacutersejt terminaacutelisaiban kaptuk (14 aacutebra B) a gyrus

dentatus kosaacutersejt terminaacutelisai (14 aacutebra J) azonban jeloumlletlenek maradtak (5 szelet 2

egeacuter)

Ezt koumlvetően 5 μM NMDA-aacutet adtunk 3 percre a kontroll szeletekhez (14 aacutebra

C) ami jelentős reacutegioacute-specifikus cGMP halmozoacutedaacutest eredmeacutenyezett (27 szelet 10

93

egeacuter) A stratum radiatumban eacutes oriensben megfigyelt erős homogeacuten neuropil festődeacutes

mellett hataacuterozott cGMP jel-erősoumldeacutest tapasztaltunk a CA1 kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Amennyiben az 5 μM NMDA-aacutet csak 30 maacutesodpercig adagoltuk a szelet felső

50mikromeacutetereacuteben maacuter erősen jeloumllt terminaacutelisokat kaptunk A cGMP jeloumllt

terminaacutelisok valoacuteban GABAerg terminaacutelisok voltak a CA1 piramissejt reacutetegeacuteben (14

aacutebra K) mivel kettős immunfluoreszcens kiacuteseacuterleteink soraacuten a cGMP jeloumllt terminaacutelisok

963plusmn06-a bizonyult GAD65 pozitiacutevnak (n=375 9 szelet 3 egeacuter) ami 573plusmn06

GAD65 pozitiacutev terminaacutelisnak felelt meg a CA1 reacutegioacuteban (n= 513 9 szelet 3 egeacuter)

Nem tapasztaltunk festődeacutest a stratum lacunosum-moleculareban a stratum

radiatumban viszont jelentős cGMP halmozoacutedaacutest figyeltuumlnk meg mely keveacutesbeacute

intenziacutev jelet adott mint a piramissejt-reacuteteg terminaacutelisai eacutes gyakran GAD65 enzimet is

kifejeztek Voltak azonban olyan cGMP jeloumllt profilok a strata radiatum eacutes oriensben

amelyek nem festődtek GAD65-re valoacutesziacutenűleg ezek serkentő kapcsolatok eacutesvagy

gliaacutelis nyuacutelvaacutenyok A CA3ab reacutegioacuteban a cGMP szintje vaacuteltozatlan maradt az NMDA

adagolaacutesa utaacuten eacutes tovaacutebbra is a GABAerg terminaacutelisokra szoriacutetkozott a jel (956plusmn25

volt GAD65 pozitiacutev n=201 9 szelet 3 egeacuter) Ez az araacuteny 398plusmn28-nak felel meg az

oumlsszes GAD65 pozitiacutev kosaacutersejt terminaacutelist tekintve a CA3ab reacutegioacuteban (n=290 4 szelet

2 egeacuter 15 aacutebra A) Roumlviden oumlsszefoglalva nem talaacuteltunk cGMP jeloumllt kosaacutersejt

terminaacutelist a gyrus dentatusban sem NMDA adagolaacutes előtt sem utaacutena (14 aacutebra J) a

CA3ab reacutegioacuteban talaacuteltunk neacutehaacuteny gyengeacuten jeloumllt kosaacutersejt terminaacutelist a kontroll

szeletekben de az NMDA adagolaacutesaacutenak semmi hataacutesa nem volt a jel intenzitaacutesaacutera vagy

sűrűseacutegeacutere (389-roacutel 398-ra vaacuteltozott) A CA1 eacutes CA3c reacutegioacutekban azonban markaacutens

vaacuteltozaacutest tapasztaltaltunk NMDA hataacutesaacutera a cGMP jeloumllt GABAerg axonok

tekinteteacuteben (az eredeti 0-roacutel 573-ra nőtt a jeloumllt terminaacutelisok szaacutema a CA1-ben) A

jeloumllt terminaacutelisok intenzitaacutesa is joacuteval erősebbnek bizonyult a CA3ab terminaacutelisaival

oumlsszehasonliacutetva

Kompetitiacutev (D-AP5 50μM) eacutes non-kompetitiacutev (MK-801 50μM) NMDA

receptor antagonistaacuteval toumlrteacutenő előkezeleacutes kiveacutedte a CA1 reacutegioacuteban az NMDA cGMP-re

gyakorolt hataacutesaacutet miacuteg semi hataacutessal sem volt a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisaira ami arra

utal hogy csak a CA1 eacutes nem a CA3ab kosaacutersejt terminaacutelisai szabaacutelyozhatoacutek NMDA

indukaacutelta NO termeleacutessel (n=4 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra D)

94

15 Aacutebra NMDA-receptor alegyseacutegek eloszlaacutesaacutenak vizsgaacutelata eacutes kolokalizaacutecioacuteja a

kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaival

95

A Kontroll eacutes NMDA-indukaacutelt cGMP-immunjeloumllt CA1 eacutes CA3ab kosaacuterterminaacutelisok

GAD65 tartalmaacutenak vizsgaacutelata A CA1 reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt a GAD65

tartalmuacute terminaacutelisok nem tartalmaztak cGMP-t miacuteg NMDA hataacutesaacutera toumlbbseacuteguumlk

erősen immunpozitiacutev lett (n=513 GAD pozitiacutev terminaacutelis n=375 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) A CA3ab reacutegioacuteban kontroll koumlruumllmeacutenyek koumlzoumltt neacutehaacuteny

gyengeacuten jeloumllt cGMP-pozitiacutev terminaacutelis megfigyelhető volt (n=330 GADpozitiacutev n=118

cGMP pozitiacutev terminaacutelis 2 aacutellatboacutel meacuterve) azonban NMDA adagolaacutesaacutera itt nem

vaacuteltozott a jeloumlleacutes meacuterteacuteke eacutes erősseacutege sem (n=290 GAD pozitiacutev eacutes n=201 cGMP pozitiacutev

terminaacutelis 3 aacutellatboacutel meacuterve) B A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute

meacutereacutesek azt mutatjaacutek hogy az NMDA receptorok (a GluN1 alegyseacuteg alapjaacuten)

besűrűsoumldnek a GABAerg gaacutetloacute szinapszisokban (129-szer nagyobb receptor sűrűseacuteg)

a nem szinaptikus sejttest membraacutennal oumlsszehasonliacutetva A receptor jeloumlleacutes a serkentő

szinapszisokban volt a legsűrűbb (97-szerese a GABAerg szinapszisokban meacutert

eacuterteacuteknek) C A beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany NMDA-receptor jeloumlleacutes posztszinaptikus

membraacutenhoz viszonyiacutetott eloszlaacutesa azt mutatta hogy a GABAerg szinapszisokban az

NMDA-receptorok a posztszinaptikus membraacutenhoz asszociaacuteloacutednak Preszinaptikus

NMDA-receptorok jelenleacuteteacutere nincs bizonyiacuteteacutek DndashF A GluN1 GluN2A eacutes GluN2B

receptor alegyseacutegek piramissejtek sejttest-membraacutenjaacuten meacutert immunarany sűrűseacutege

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekből Mindhaacuterom alegyseacuteg eseteacuteben a haacutetteacuter jeloumlleacutes (az

E-oldalon neacutezve) elhanyagolhatoacutenak bizonyult miacuteg a sejtplazma felőli P-oldal eseteacuteben

az immunarany jel beduacutesulaacutesaacutet figyeltuumlnk meg a GABAerg szinapszisokban (Gaacutetloacute szin)

a szomszeacutedos nem szinaptikus membraacuten (Extraszin membraacuten) feluumlletekhez keacutepest G A

fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletekben immunarannyal jeloumllt NMDA receptor alegyseacutegek

beduacutesulaacutest mutatnak a sejttesten leacutetesiacutetett teljesen rekonstruaacutelt GABAerg

szinapszisokban Az agykeacutergi piramissejtekre specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egeacuterben

hiaacutenyzott a szinaptikus GluN1 jeloumlleacutes

H I Az NMDA receptor alegyseacutegek szaacutezaleacutekos kolokalizaacutecioacuteja kombinaacutelt

immunarany-immunperoxidaacutez kiacuteseacuterletekből szaacutermazoacute sorozatmetszetek teljesen

rekonstruaacutelt parvalbumin (PV) eacutes vezikulaacuteris glutamaacutet-transzporter 3 (vGLuT3)

tartalmuacute terminaacutelisainak szinapszisaiban Roumlvidiacuteteacutes Beaacutegy előtti imm= Beaacutegyazaacutes

előtti immunreakcioacute

96

Azeacutert hogy kizaacuterjuk annak a lehetőseacutegeacutet hogy feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium

csatornaacutek hozzaacutejaacuterulnak az NMDA indukaacutelta hataacuteshoz gaacutetoltuk a posztszinaptikusan

elhelyezkedő L- eacutes R-tiacutepusuacute kalcium csatronaacutekat (20μM nifedipin + 100nM SNX482)

Az 5μM NMDA adagolaacutesaacutera bekoumlvetkező hataacutes mit sem vaacuteltozott (a kettős

immunfluoreszcens meacutereacutesekből szaacutermazoacute araacutenyok azonosak voltak) ami azt sugallja

hogy az NMDA receptorok műkoumldeacutese szuumlkseacuteges eacutes eleacutegseacuteges felteacuteteacutele az NO-cGMP

jelpaacutelya beindiacutetaacutesaacutehoz (n=10 szelet 2 egeacuter 14 aacutebra E) Az NMDA okozta hataacutes

szinteacuten teljesen kiveacutedhető volt ha nNOS gaacutetloacuteval (L-NAME 100μM n=5 szelet 3

egeacuter) vagy NO receptor gaacutetloacuteval (ODQ 20μM n=14 szelet 5 egeacuter 14 aacutebra G F)

előinkubaacuteltuk a szeleteket

Megvizsgaacuteltuk a tovaacutebbiakban azt is hogy a piramissejtek eacutes interneuronok

spontaacuten akcioacutes potenciaacutel generaacutelaacutesa mennyiben jaacuterult hozzaacute az NMDA hataacutesaacutehoz ezeacutert

a kiacuteseacuterletsorozatot megismeacuteteltuumlk olyan magneacuteziummentes ACSF-ben amibe 1μM

tetrodotoxint (TTX) tettuumlnk de eredmeacutenyek teljesen azonosak lettek Hogy bizonyiacutetsuk

az nNOS kizaacuteroacutelagos szerepeacutet a kiacuteseacuterleteinkben nNOS geacutenkiuumltoumltt egerekből is

keacutesziacutetettuumlnk tuacuteleacutelő szeleteket (14 aacutebra H-I) Minden idegi cGMP festeacutes eltűnt a

kontroll (n=8 szelet 4 egeacuter) eacutes az NMDA kezelt szeletekből is (n=9 szelet 4 egeacuter) a

hippokampusz minden reacutegioacutejaacuteban Megmaradt a cGMP jel azonban az erekben az

nNOS geacutenkiuumltoumltt aacutellatban is az endoteliaacutelisan talaacutelhatoacute eNOS aktivitaacutesnak

koumlszoumlnhetően Eredmeacutenyeink azt sugalljaacutek hogy a legvaloacutesziacutenűbb mechanizmus az

NMDA receptorokon keresztuumlli lokaacutelis kalcium beaacuteramlaacutes ami nNOS-fuumlggő cGMP

termeleacutest vaacutelt ki a hippokampaacutelis CA1 eacutes CA3c reacutegioacute GABAerg terminaacutelisaiban Habaacuter

ebben a munkaacuteban a GABAerg szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk eacuterdemes megemliacuteteni

hogy az NMDA-indukaacutelta cGMP termeleacutes jelen volt a CA1 stratum radiatum

neuropiljeacuteben miacuteg hiaacutenyzott a stratum lacunosum-moleculareacuteboacutel Eacuterdekes hogy ebben

a keacutet reacutegioacuteban az LTP eacutes LTD leacutetrejoumltteacutehez szuumlkseacuteges felteacutetelek jellemzően kuumlloumlnboumlzők

(Takahashi and Magee 2009 Xu et al 2010) amit reacuteszben megmagyaraacutezhat a fent

emliacutetett NO-jelaacutetvitelbeacuteli kuumlloumlnbseacuteg Technikai oldalroacutel neacutezve a koraacutebbi NMDA

receptor agonista vagy antagonista adaacutesaacuteval jaacuteroacute elektrofizioloacutegiai eacutes farmakoloacutegiai

kiacuteseacuterletek eacutertelmezeacuteseacuteneacutel figyelembe kell venni egyreacuteszt a GABAerg szinaptikus

aacuteramokban leacutetrejoumlvő maacutesreacuteszt a haacuteloacutezati aktivitaacutesban bekoumlvetkező indirekt hataacutesaacutet az

NMDA-NO-cGMP jelaacutetviteli uacutetvonalnak

97

VI7 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisokban

kifejeződik az NMDA-receptor GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutege

A fenti kiacuteseacuterletek azt sugalltaacutek hogy az NMDA receptoroknak koumlzel kell lenniuumlk a

GABAerg szinapszisokhoz Eacuteppen ezeacutert kvantitatiacutev beaacutegyazaacutes utaacuteni immunarany

jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegre olyan antitestekkel amik bizonyiacutetottan

specifikus jeloumlleacutest adnak (reacuteszletes leiacuteraacutes az V3 fejezetben talaacutelhatoacute) A piramissejtek

tuumlskeacuteiről joacutel ismert hogy kifejeződnek bennuumlk ezek az alegyseacutegek (laacutesd a III631

alfejezetben) amit mi is

megerősiacutetettuumlnk (16

aacutebra A-C jobb oldali

oszlop)

16 aacutebra Az NMDA

receptor alegyseacutegek a

CA1 piramissejtek

sejttesteacutere eacuterkező szi-

napszisok posztszinap-

tikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

helyezkednek el

Az elektron-

mikroszkoacutepos aacutebraacutekon

beaacutegyazaacutes utaacuteni

immunarany moacutedszerrel

jeloumllt NMDA receptor

alegyseacutegek laacutethatoacutek

(fekete szemcseacutek) AndashC

A GluN1 GluN2A eacutes

GluN2B alegyseacutegek

mind a GABAerg

(baloldali aacutebra) mind a

glutamaacuteterg (jobboldali

98

aacutebra) szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban felduacutesulnak azonban jelentős

mennyiseacutegi kuumlloumlnbseacuteg tapasztalhatoacute koumlzoumlttuumlk D Ugyanazon szinapszis

sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute szomszeacutedos metszetek GluN2B eacutes GluN2A immunjeloumlleacutese

(ezuumlst intenzifikaacutelt arany szemcseacutek) Az aacutebra alsoacute feleacuten laacutethatoacute szinapszisban mindkeacutet

receptor alegyseacuteg megtalaacutelhatoacute (nyilak) miacuteg a maacutesik szinapszisban csak a GluN2A

alegyseacuteg jeloumllődoumltt (nyiacutelhegyek) E Ugyanazon szinapszis sorozatmetszeteiből szaacutermazoacute

szomszeacutedos metszetek GluN2B-GluN1-GluN2A immunarany jeloumlleacutese (nyilak)

Roumlvidiacuteteacutesek t terminaacutelis s piramissejt-sejttest sp tuumlske-fej Leacutepteacutek 100 nm

Ezen feluumll a GluN1 2A eacutes a 2B alegyseacuteg egyeacutertelműen megtalaacutelhatoacute volt a

piramissejtek sejtesteacutere eacuterkező GABAerg szinapszisok posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacutejaacuteban

(16 aacutebra A-C bal oldali oszlop) Az immunarany jel aacutetlagos taacutevolsaacutega a

posztszinaptikus membraacutentoacutel amit a szinapszis siacutekjaacutera merőlegesen meacutertuumlnk 363 nm-

nek adoacutedott az intracellulaacuteris oldalon (mediaacuten 0-128 interkvartilis taacutevolsaacuteg laacutesd meacuteg

15aacutebra C Az aranyszemcseacutek 728-a posztszinaptikus eacutes 272-a volt a szinaptikus

reacutesben n=104 aranyszemcse) ami azt mutatja hogy az NMDA receptorok a GABAerg

szinapszisokban is posztszinaptikusan helyezkednek el Nem talaacuteltunk preszinaptikus

jelet Ezt koumlvetően ezzel a teljesen kvantitatiacutev moacutedszerrel megbecsuumlltuumlk a serkentő eacutes

periszomatikus gaacutetloacute szinapszisok NMDA receptor sűrűseacutegeacutet A GluN1 alegyseacuteg

immunarany sűrűseacutegeacutet meacutertuumlk mivel az minden NMDA receptorban egyformaacuten van

jelen Veacuteletlenszerű mintaacutet vettuumlnk a periszomatikus GABAerg (n=54 szinapszis 2

egeacuterből) eacutes a dendritikus tuumlske szinapszisokboacutel (a stratum radiatumboacutel n=98 szinapszis

2 egeacuter) A GABAerg szinapszisokban az NMDA receptor sűrűseacutege 973plusmn134-szer

kisebb volt mint a tuumlske szinapszisokban (GABAerg 255plusmn013 tuumlske 2484plusmn471

aranyszemcseμm 15 aacutebra B) Mindazonaacuteltal a GABAerg szinapszisok 18-szor

nagyobbak mint a tuumlske szinapszisok (Nyiacuteri et al 2001 Racca et al 2000) iacutegy az

NMDA receptorok becsuumllt szaacutema csak 54plusmn075-szor kevesebb a GABAerg

szinapszisokban Neacutehaacuteny NMDA receptort extraszinaptikusan is talaacuteltunk a

piramissejtek sejttesteacuten (0198plusmn003 aranyszemcseμm 15aacutebra B) Azeacutert hogy

koumlzvetlenuumll bizonyiacutetsuk hogy a kuumlloumlnboumlző NMDA receptor alegyseacutegek egyazon

szinapszisban is megtalaacutelhatoacutek az alegyseacutegeket ugyanazon szinapszis egymaacutest koumlvető

metszetein lokalizaacuteltuk (reacuteszletek az V3 fejezetben talaacutelhatoacutek) Azt talaacuteltuk hogy a

GluN1-2A GluN1-2B eacutes GluN2A-2B alegyseacutegek gyakran kolokalizaacuteltak (16 aacutebra D-

99

E) Ezentuacutel a haacuterom kuumlloumlnboumlző alegyseacuteget ugyanazon szinapszisban is kimutattuk (16

aacutebra E) Eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy egyazon GABAerg szinapszis mind

GluN2A mind GluN2B alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NMDA receptort hasznosiacutet

posztszinaptikusan

VI8 A CA1 piramissejtekre eacuterkező periszomatikus GABAerg szinapszisok nagy

reacutesze mindhaacuterom NMDA receptor alegyseacuteggel rendelkezik- kvantitatiacutev adatok

Ahhoz hogy megvizsgaacuteljuk hogy a GABAerg szinapszisok milyen araacutenyban

tartalmaznak NMDA receptorokat nagyszaacutemuacute rekonstruaacutelt szinapszisra van szuumlkseacuteg

ezeacutert SDS-kezelt fagyasztva toumlrt replika immunjeloumlleacutest veacutegeztuumlnk A piramissejtek

sejttesteacutenek felsziacuteneacuten teljes szinaptikus aktiacutev zoacutenaacutek taacuterulnak fel ahogy a

plazmamembraacuten lipid kettős reacutetege ketteacutebe toumlrik az extracellulaacuteris (E)-oldalra eacutes a

protoplazmatikus (P)-oldalra

Egy a GABAA receptor (GABAAR) β3 alegyseacuteg C-terminaacutelis veacutege ellen

keacutesziacutetett antitest a P-oldal intramembraacuten feheacuterjeacuteinek (IMP) sűrű csoportjaacutet jeloumllte

(Kasugai et al 2010) A GABAerg szinapszisokban nagy a helyi GABAAR alegyseacuteg

immunarany sűrűseacuteg ezeacutert egy ezen alapuloacute nem elfogult koumlruumllhataacuteroloacute moacutedszerrel

hataacuteroztuk meg a veacutelt GABAerg szinapszisok hataacuteraacutet (reacuteszletes leiacuteraacutes a V101

alfejezetben talaacutelhatoacute 8 aacutebra) Ezt koumlvetően GABAAR eacutes NMDAR alegyseacutegek elleni

kettős immunarany jeloumlleacutes segiacutetseacutegeacutevel megbecsuumlltuumlk az NMDA receptor alegyseacuteget

tartalmazoacute GABAerg szinapszisok minimum araacutenyaacutet Mindegyik NMDA receptor

alegyseacuteg ellenes antitest erős jeloumlleacutest adott a piramissejt tuumlskeacuteken (17 aacutebra A-C

beteacutetek) de asszociaacuteloacutedott a GABAAR tartalmuacute szomatikus szinapszisokkal is (17 aacutebra

A-D) Az antitest haacutetteacuterjeloumlleacuteseacutet a szomatikus E-oldalon meacutertuumlk eacutes elhanyagolhatoacute

meacuterteacutekűnek bizonyult (031plusmn008 aranyszemcseμm2 a GluN1 esteacuteben 079plusmn016

aranyszemcseμm2 a GluN2A eacutes 055plusmn018 aranyszemcseμm

2 a GluN2B alegyseacuteg

eseteacuteben) Az NMDAR jelsűrűseacuteg a GABAA receptor-duacutes teruumlleteken (GABAerg

szinapszisokban) azonban 2980plusmn685 aranyszemcseμm2 (n=82 szinapszis 3 egeacuter) volt

a GluN1 4777plusmn677 aranyszemcseμm2 (n=48 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2A eacutes

4583plusmn1158 aranyszemcseμm2 (n=44 szinapszis 2 egeacuter) a GluN2B immunarany

reakcioacute eseteacuteben

100

17 aacutebra A fagyasztva-toumlrt replika kiacuteseacuterletek alapjaacuten az NMDA-receptor jeloumlleacutes a

posztszinaptikus GABAAR jeloumlleacutessel egyuumltt fordul elő

Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacutekon replika immunarany reakcioacuteboacutel szaacutermazoacute CA1

piramissejtek sejttesteacuten elhelyezkedő GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldala

laacutethatoacute (az aacutebraacuten szuumlrke vonallal hataacuterolva) AndashC Kettős immunarany jeloumlleacutes a

GABAAR β3 alegyseacuteg (10nm aranyszemcseacutek) eacutes az NMDA receptor alegyseacutegek (5 nm

aranyszemcseacutek az aacutebraacuten nyiacutellal jeloumllve) ellen Joacutel laacutethatoacute a GluN1 (A) GluN2A (B) eacutes

GluN2B (C) alegyseacutegek erőteljes asszociaacutecioacuteja a GABAerg szinaptikus teruumlletekhez A

beteacutet aacutebraacutekon felteacutetelezett piramissejt tuumlskeacuteken levő NMDA receptor alegyseacuteg jeloumlleacutesek

laacutethatoacutek Leacutepteacutek 100nm D Az elektronmikroszkoacutepos aacutebraacuten az NMDA receptorok eacutes

GABAAR szoros egyuumlttaacutellaacutesa figyelhető meg egy piramissejt sejttest-feluumlleteacuten leacutevő oumlt

101

kuumlloumlnaacutelloacute szinapszis-asszociaacutelt teruumlleten Az IMP csoportosulaacutesok szoacutervaacutenyosan

helyezkednek el a piramissejt egeacutesz plazma felőli P-oldalaacuten Keacutet kisebb extracellulaacuteris

E-oldal toumlreacutes laacutethatoacute a replikaacuten keacutekkel jeloumllve A GABAAR immunarany jeloumlleacutes (az

aacutebraacuten zoumlld gyűrűkkel jeloumllve) felduacutesul az IMP csoportosulaacutesok menteacuten A GABAAR helyi

sűrűseacuteg-eloszlaacutesa alapjaacuten elfogultsaacuteg neacutelkuumll hataacuteroztuk meg a szinaptikus teruumlleteket

(az aacutebraacuten halvaacutenyzoumlld teruumlletkeacutent laacutethatoacute szuumlrke vonallal hataacuterolva) Ezt koumlvetően

figyeltuumlk meg a GluN1 alegyseacuteg elhelyezkedeacuteseacutet (piros gyűrűkkel hataacuterolva) Veacutegezetuumll

a GluN1 alegyseacuteg immunarany sűrűseacuteg-eloszlaacutesaacutet meacutertuumlk meg szinaptikus eacutes

szinapszison kiacutevuumlli sejttest felsziacuteneken Leacutepteacutek 200 nm

Maacuteskeacuteppen fogalmazva a szinaptikus NMDAR sűrűseacuteg a meacutert haacutetteacuter-jeloumlleacutes

9906-szorosa a GluN1 6278-szorosa a GluN2A eacutes 9479-szorosa volt a GluN2B

immunreakcioacute eseteacuteben (15 aacutebra D-F) Ennek megfelelően azt talaacuteltuk hogy a

szomatikus GABAerg szinapszisok 662plusmn68-a (n=82) volt GluN1 pozitiacutev

655plusmn111-a (n=48) volt GluN2A eacutes 705plusmn96-a (n=44) volt GluN2B pozitiacutev (15

aacutebra G) eacutes a szinaptikus receptorsűrűseacuteg minden egyes szinapszis esteacuteben meghaladta

a haacutetteacuter meacuterteacutekeacutenek 30-szorosaacutet Az egy szinapszisban leacutevő aacutetlagos NMDAR

aranyszemcse szaacutem az NMDAR pozitiacutev szinapszisokban 302plusmn051

aranyszemcseszinapszis volt a GluN1 521plusmn095 a GluN2A eacutes 441plusmn054

aranyszemcseszinapszis a GluN2B eseteacuteben (17 aacutebra) A meacutereacutesi eredmeacutenyeink kisseacute

alulbecsuumllhetik a teacutenyleges szinaptikus NMDAR sűrűseacuteget a toumlbbi membraacutennal

oumlsszehasonliacutetva mert a nagy sűrűseacutegű GABAAR jeloumlleacutes akadaacutelyozhatja az NMDAR-

asszociaacutelt immunarany reacuteszecskeacutek hozzaacutefeacutereacuteseacutet a szinapszishoz (Reacuteszletes leiacuteraacutes a V10

fejezetben talaacutelhatoacute) Az aranyszemcseacutek szaacutema eacutes a szinaptikus teruumllet szignifikaacutens

pozitiacutev korrelaacutecioacutet mutatott minden alegyseacuteg-jeloumlleacutes eseteacuteben (Spearman-R korrelaacutecioacute

r=03652 p=000074 a GluN1 eseteacuteben r=05002 p=000029 a GluN2A eseteacuteben

r=04018 p=00069 a GluN2B eseteacuteben) vagyis mineacutel nagyobb egy szinapszis annaacutel

toumlbb NMDAR alegyseacuteget tartalmazott Az aranyszemcseacutek sűrűseacutege viszont nem

vaacuteltozott a szinaptikus teruumllettel (Spearman-R korrelaacutecioacute r=-00031 p=09781 a GluN1

eseteacuteben r=01357 p=03576 a GluN2A eseteacuteben r=- 02923 p=00542 a GluN2B

eseteacuteben) Nem talaacuteltunk szinaptikus GluN1-re jeloumllt aranyszemcseacuteket a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuten a piramissejt specifikus GluN1 geacutenkiuumltoumltt egerekben (15 aacutebra G n=34

102

szinapszis 2 egeacuter) Az interneuronok dendrittoumlrzseacutere eacuterkező glutamaacuteterg szinapszisok

viszont intenziacuteven jeloumllődtek ezekben az egerekben (nincs aacutebra) azt mutatva hogy a

szomatikus jel hiaacutenya nem technikai okokboacutel eredt a geacutenkiuumltoumltt aacutellatokban ugyanis csak

a piramissejtekből hiaacutenyzott a GluN1 feheacuterje az interneuronokboacutel nem

Tekintve hogy elektrofizioloacutegiai kiacuteseacuterletek maacuter mutattaacutek hogy

extraszinaptikusan is vannak NMDA receptorok (reacuteszletes kifejteacutes a III632

alfejezetben talaacutelhatoacute) megvizsgaacuteltuk az extraszinaptikus sejttest membraacutenokat is Az

extraszinaptikus NMDAR sűrűseacuteg 676plusmn172 910plusmn151 eacutes 265plusmn066

aranyszemcseμm2 volt a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni immunreakcioacuteban kuumlloumln-

kuumlloumln Ez a sűrűseacuteg 449-szor 541-szor eacutes 1762-szor volt alacsonyabb a szinaptikus

sűrűseacutegekneacutel de meacuteg mindig 2205-szor 1202-szor eacutes 549-szor nagyobb a hatter

festődeacutesneacutel a GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegek elleni reakcioacutekban egyenkeacutent (15 aacutebra D-

F) Ezek az NMDA receptorok talaacuten (pl aktivitaacutesfuumlggő moacutedon) keacutesőbb a GABAerg

szinapszisokba keruumllnek vagy asszociaacuteloacutednak lipid-tutaj feheacuterjeacutekkel amik az NMDA

receptorok internalizaacutecioacutejaacutet vezeacuterlik (Swanwick et al 2009)

Oumlsszefoglalva a CA1 piramissejtekre eacuterkező szomatikus GABAerg szinapszisok

legalaacutebb keacutetharmada tartalmaz NMDA receptor alegyseacutegeket a felnőtt

hippokampuszban

VI9 Mindkeacutet kosaacutersejt-tiacutepus aacuteltal keacutepzett szinapszisban megtalaacutelhatoacutek a

posztszinaptikus NMDA receptorok

Azeacutert hogy meghataacuterozzuk az NMDAR pozitiacutev GABAerg szinapszisok

eredeteacutet eacutes hogy tovaacutebb erősiacutetsuumlk hogy kizaacuteroacutelag posztszinaptikusak az NMDA

receptorok beaacutegyazaacutes előtti immunarany kiacuteseacuterleteket veacutegeztuumlnk GluN1 2A eacutes 2B

alegyseacuteg ellen a CA1 hippokampaacutelis reacutegioacuteban Minden alegyseacuteg festeacutes

posztszinaptikusan helyezkedett el a szomatikus GABAerg szinapszisokban (18 aacutebra)

GABAerg terminaacutelisok nem festődtek A szomatikus GABAerg szinapszisokban meacutert

aranyszemcseacutek lineaacuteris sűrűseacutege a GluN1 reakcioacuteban 0520 aranyszemcseμm volt miacuteg

az extraszinaptikus jeloumlleacutes joacuteval alacsonyabb volt (0058 aranyszemcseμm) Ez az

eredmeacuteny-most meacuteg egy moacutedszer hasznaacutelataacuteval- tovaacutebb megerősiacuteti hogy az NMDA

receptorok specifikusan a GABAerg szinapszisokkal asszociaacuteloacutednak

103

104

18 Aacutebra Az NMDA-receptorok eacutes az nNOS egyuumltt fejeződnek ki a kosaacutersejtek

terminaacutelisaiban

AndashC A beaacutegyazaacutes előtti GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegek elleni

immunreakcioacutekboacutel szaacutermazoacute elektronmikroszkoacutepos felveacuteteleken a sejttestre eacuterkező

GABAerg szinapszisokban kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan elhelyezkedő NMDA-receptor

jeloumlleacutes laacutethatoacute Et glutamaacuteterg terminaacutelis It GABAerg terminaacutelis Ps piramissejt

sejtteste Leacutepteacutek (C-ben) AndashC 200 nm DndashK Beaacutegyazaacutes előtti kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez reakcioacutekboacutel szaacutermazoacute felveacutetelek Sorozat- (D F H) eacutes egyes-(IndashK)

metszeteken laacutethatoacute hogy mind a PV- mind pedig a vGluT3CCK-pozitiacutev (soumlteacutet

csapadeacutek) kosaacutersejt-terminaacutelisok szinapszisai posztszinaptikusan kifejezik a GluN1 2A

eacutes 2B alegyseacutegeket (aranyszemcseacutek nyilakkal jeloumllve) E Sorozatmetszeteken laacutethatoacute

hogy az nNOS posztszinaptikusan van jelen mind a PV- (E) mind pedig a vGluT3-

pozitiacutev terminaacutelisok szinapszisaiban Leacutepteacutek (K-ban) DndashK 250 nm

Ezt koumlvetően immunarany-immunperoxidaacutez kettős jeloumlleacutest veacutegeztuumlnk NMDAR-

parvalbumin (PV) eacutes NMDAR- vezikulaacuteris glutamaacutet transzporter 3 (vGluT3) ellen Az

utoacutebbiroacutel joacutel ismert hogy az interneuronok koumlzuumll kizaacuteroacutelag a kolecisztokinin (CCK)-

tartalmuacuteakban talaacutelhatoacute meg a hippokampuszban (laacutesd III342 alfejezet Somogyi et

al 2004) eacutes koumlruumll-beluumll 90-aacutet jeloumlli meg CCK-pozitiacutev kosaacuterterminaacutelisoknak a CA1

reacutegioacuteban (nem publikaacutelt megfigyeleacutes) A hippokampuszban nincs aacutetfedeacutes a PV- eacutes

CCK-tartalmuacute interneuron populaacutecioacutek koumlzt Azt talaacuteltuk hogy a PV pozitiacutev

terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett szinapszisok 426-a (n=47 szinapszis 2 egeacuterből) volt jeloumllt

GluN1alegyseacutegre 364 (n=33 2 egeacuter) GluN2A alegyseacutegre eacutes 306 (n=36 2 egeacuter)

volt jeloumllt GluN2B alegyseacutegre (18 aacutebra D H J 15 aacutebra H) A vGluT3 pozitiacutev

terminaacutelisok szinapszisai eseteacuteben 610 (n=41 2 egeacuter) volt pozitiacutev GluN1-re 429

(n=28 2 egeacuter) GluN2A-ra eacutes 379 (n=29 2 egeacuter) GluN2B-re (18 aacutebra F I K 15

aacutebra I) Habaacuter a munkaacutenk soraacuten a szomatikus szinapszisokra foacutekuszaacuteltunk neacutehaacuteny

dendritikus gaacutetloacute szinapszis szinteacuten pozitiacutev volt NMDAR alegyseacutegekre (nem mutatjuk)

Mivel az nNOS eacutes az NMDA receptor antitestek mind nyuacutelban keacuteszuumlltek iacutegy

nincs megbiacutezhatoacute moacutedszer arra hogy direkt kolokalizaacuteljuk ezeket az antitesteket Ennek

elleneacutere az a teacuteny az nNOS eacutes az NMDA receptor jelen volt a kosaacutersejt-

105

szinapszisokban (majdnem azonos araacutenyban reacuteszletes kifejteacutes a VII6 fejezetben

talaacutelhatoacute) szinteacuten erősen azt sugallja hogy kolokalizaacuteloacutednak a szomatikus GABAerg

szinapszisok posztszinaptikus kompartmentjeacuteben

106

VII MEGBESZEacuteLEacuteS

Eacutertekezeacutesem legfontosabb eredmeacutenyei a koumlvetkezők

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

VII1 Szinapszis specifikus NO termeleacutes a GABAerg szinapszisokban

A hippokampaacutelis piramissejtekről joacutel ismert hogy kifejeznek nNOS-t eacutes leiacutertaacutek

a serkentő szinapszisok posztszinaptikus denzitaacutesaacutehoz viszonyiacutetott pontos

elhelyezkedeacuteseacutet is (laacutesd III51 alfejezetben) Feltehetően azeacutert nem volt adat az nNOS

107

GABAerg szinapszokban valoacute elhelyezkedeacuteseacuteről mert a serkentő szinapszisok

hosszuacutetaacutevuacute plaszticitaacutesaacuteban betoumlltoumltt szerepe toumlbb figyelmet nyert (laacutesd III572

alfejezet) illetve azeacutert is mert az nNOS jel csak nagyon gyengeacuten fixaacutelt szoumlveten

mutathatoacute ki beaacutegyazaacutes előtti kiacuteseacuterletekben (laacutesd V2 fejezet) A hippokampaacutelis CA1

piramissejtek kuumlloumlnboumlző tiacutepusuacute interneuronok aacuteltal szabaacutelyozoacutednak (laacutesd a III34

alfejezetben) melyek a piramissejtek kuumlloumlnboumlző domeacutenjeit ceacutelozzaacutek Kvantitatiacutev

eredmeacutenyeink eacutes a kolokalizaacutecioacutes kiacuteseacuterletek arra engednek koumlvetkeztetni hogy a

kosaacutersejtek (mind a PV mind CCKvGluT3 tiacutepusuacute) aacuteltal keacutepzett szinapszisok nagy

reacutesze nNOS tartalmuacute egeacuterben eacutes patkaacutenyban is Hasonloacutean az AIS szinapszisok

melyeket a kandelaacuteber-sejtek keacutepeznek eacutes szaacutemos dendritikus szinapszis is nNOS

pozitiacutev volt A NO szaacutemaacutera a membraacutenok szabadon aacutetjaacuterhatoacutek meacutegis a NO jel csak paacuter

mikromeacuteterig detektaacutelhatoacute a termelődeacutes helyeacutetől (Iino 2006 Namiki et al 2005) Ezek

a tulajdonsaacutegok azt sugalljaacutek hogy a NO jelaacutetvitel nemcsak hateacutekony eacutes gyors vaacutelaszra

keacutepes hanem szinapszis specifikus is (laacutesd a III53 alfejezetben) Eredmeacutenyeink

szerint az nNOS nagy felduacutesulaacutest mutatott a GABAerg szinapszisokban (a

posztszinaptikus membraacutenban) a szomszeacutedos nem-szinaptikus membraacuten domeacutenekkel

oumlsszehasonliacutetva eacutes az interneuron terminaacutelisok melyek ezeket a szinapszisokat

alkotjaacutek tartalmaztak NO receptor NOsGC-t

Az nNOS akkor keacutepes NO termeleacutesre ha L-arginin eacutes oxigeacuten jelenleacuteteacuteben a

megemelkedett intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute hataacutesaacutera a kalcium-kalmodulin azt

aktivaacutelja (Bredt eacutes Snyder 1990 Lee eacutes Stull 1998) A serkentő szinapszisokban ezt a

lokaacutelis kalcium koncentraacutecioacutet szinaptikus NMDA receptorok eacutes egyeacuteb feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek tartjaacutek fenn Eddig nem igazoltaacutek olyan kalcium csatornaacutek jelenleacuteteacutet

a GABAerg szinapszisokban amik kellően magas kalcium szintet biztosiacutetanaacutenak a

GABAerg szinapszisok posztszinaptikus oldalaacuten egeacuteszen lokaacutelisan Mindez nem is

meglepő tekintve hogy ezek beduacutesulaacutesa igen valoacutesziacutenűtlennek tűnt egy gaacutetloacute

szinapszisban Az L- eacutes T-tiacutepusuacute feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek jelen vannak ezen

szinapszisok koumlruumll a dendriteken eacutes a periszomatikus membraacutenokon (Kaacuteli eacutes Freund

2005 Magee et al 1998) Ezek a csatornaacutek mind dendritikus mind visszaterjedő

akcioacutes potenciaacutel hataacutesaacutera aktivaacuteloacutedhatnak megemelve a sejten beluumlli kalcium

koncetraacutecioacutejaacutet Amikor azonban az NMDA-adagolaacutes hataacutesaacutet vizsgaacuteltuk a

feszuumlltseacutegfuumlggő kalcium-csatornaacutek gaacutetlaacutesa egyaacuteltalaacuten nem befolyaacutesolta a cGMP-jeloumlleacutest

108

(14 aacutebra E VI6 fejezet) iacutegy kicsi a valoacutesziacutenűseacutege hogy szerepet jaacutetszanaacutenak az

nNOS aktivaacutelaacutesaacuteban Bizonyos irodalmi adatok alapjaacuten az nNOS metabotroacutep

receptorokon keresztuumll intracellulaacuteris kalcium forraacutesboacutel is aktivaacutelhatoacute a mAchR

(kifejezetten M1M3) aktivaacutecioacutejaacutet vizsgaacuteltaacutek (Hu eacutes el-Fakahany 1993 Mathes eacutes

Thompson 1996) raacuteadaacutesul az M1M3 receptorok a piramissejtek teljes

szomatodendritikus tengelyeacuten megtalaacutelhatoacutek (Levey 1996 Levey et al 1995

Yamasaki et al 2010) valamint a mGluR5 aktivaacutecioacuteja hozhatoacute meacuteg oumlsszefuumlggeacutesbe

nNOS aktivaacutelaacutessal ami viszont leacutenyegesen kisebb mennyiseacutegben van jelen a (tuumlskeacuten

kiacutevuumlli) szomatodendritikus reacutegioacuteban (Lujaacuten et al 1997) Maacutes kutatoacutecsoportok szerint

azonban az nNOS kizaacuteroacutelag extracellulaacuteris forraacutesboacutel aktivaacutelhatoacute (Alagarsamy et al

1994 Muir et al 2010) Sajaacutet kiacuteseacuterleteink a metabotroacutep receptorok ingerleacuteseacutere ez

utoacutebbit tudtaacutek megerősiacuteteni a hippokampuszra neacutezve ugyanis sem a mAchR agonista

karbachol sem a mGluR5 agonista DHPG kuumlloumlnboumlző koncetraacutecioacutekban eacutes ideig

alkalmazva sem volt keacutepes az NO jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacutera (nem publikaacutelt adatok) A

lehetseacuteges kalcium forraacutesokat megvizsgaacutelva tehaacutet kizaacuteroacutelag az NMDA receptorok

aktivaacutelaacutesa tudta elindiacutetani az NO szinteacuteziseacutet (reacuteszletesen laacutesd VII5 eacutes VII6

fejezetben)

VII2 Sejttiacutepus specifikus NOsGC alegyseacuteg expresszioacutek eacutes asszociaacutecioacutejuk nNOS-

sal

Az NOsGC alegyseacutegek mRNS eloszlaacutesaacutet 8 napos patkaacuteny hippokampuszban kis

felbontaacutessal maacuter leiacutertaacutek eszerint gyenge α1 eacutes erősebb α2 eacutes β1 alegyseacuteg mintaacutezat volt

megfigyelhető (Gibb eacutes Garthwaite 2001) Felnőtt patkaacutenyokban ugyancsak kis

nagyiacutetaacutessal fennmaradt a nagy kuumlloumlnbseacuteg az α1 eacutes α2 alegyseacuteg festődeacuteseacuteben (Pifarreacute et

al 2007) Eredmeacutenyeink elsőkeacutent taacutertaacutek fel nagy felbontaacutessal sejtes szinten az α

alegyseacutegek elhelyezkedeacuteseacutet a hippokampuszban valamint az α1 eacutes α2 alegyseacuteg

festődeacuteseacutenek szeacutetvaacutelaacutesaacutet immunhisztokeacutemiai moacutedszerrel Kimutattuk hogy miacuteg az α1β1

alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű receptor csak interneuronokban fejeződik ki addig az α2β1

komplex csak piramissejtekre korlaacutetozoacutedik mind egeacuterben mind patkaacutenyban

Eredmeacutenyuumlnk miszerint gyakorlatilag minden α1 alegyseacuteg pozitiacutev interneuron pozitiacutev

volt β1 alegyseacutegre eacutes fordiacutetva nemcsak igazolja az antitestek specificitaacutesaacutet de

109

immunhisztokeacutemiai bizonyiacuteteacutekot szolgaacuteltat arra hogy nincs olyan interneuron ami csak

α2 tartalmuacute NOsGC-t fejezne ki A legtoumlbb periszomatikus axon terminaacutelis kifejezett

NOsGC α1 alegyseacuteget ami nagyban valoacutesziacutenűsiacuteti hogy mindkeacutet tiacutepusuacute szomatikus

gaacutetloacute szinapszis jeloumllődoumltt ezekben az aacutellatokban Raacuteadaacutesul sok axo-axonikus terminaacutelis

is tartalmazott NOsGC-t Ezek az adatok joacutel illeszkednek a periszomatikus szinapszisok

nNOS jeloumlleacuteseacuteneacutel tapasztaltakhoz ami azt sugallja hogy az NO szintaacutez eacutes az NO

receptor kifejeződeacutese a szinapszis keacutet oldalaacuten egybeesik A dendritikus eacutes

periszomatikus GABAerg terminaacutelisok NOsGC jeloumllődeacutese egeacuterben eacutes patkaacutenyban

megerősiacuteti hogy az NO jel detektaacutelhatoacute ezekben a terminaacutelisokban

Habaacuter a keacutet α alegyseacuteg elsődleges szerkezete jelentősen csak a regulaacutetoros

domeacutenben teacuter el egymaacutestoacutel eddig a keacutet izoforma- α1β1 eacutes α2β1- koumlzt semmilyen

funkcionaacutelisan relevaacutens kuumlloumlnbseacuteget sem mutattak ki a regulaacutecioacutes tulajdonsaacutegaik

szubsztraacutet affinitaacutesuk katalitikus aktivitaacutesuk vagy NO szenzitivitaacutesuk tekinteteacuteben (

laacutesd a III54 alfejezetben Russwurm et al 1998) Egy fontos kuumlloumlnbseacuteg azonban a keacutet

α alegyseacuteg koumlzt hogy szelektiacutev a szubcellulaacuteris ceacutelelemuumlk Uacutej eredmeacutenyek azt mutatjaacutek

hogy miacuteg az α1β1 izoforma citoplazmatikus addig az α2β1 izoforma lehorgonyzoacutedik a

PDZ-domeacutent hodozoacute PSD-95 feheacuterjeacutehez (Russwurm et al 2001) ami a serkentő

posztszinaptikus denzitaacutes egyik alkotoacuteja Tovaacutebbi adatokboacutel az is kideruumll hogy

valoacutejaacuteban a PSD-95 az NOcGMP kaszkaacuted szinte minden elemeacutevel keacutepes koumllcsoumlnhatni

beleeacutertve az nNOS-t is (Brenman et al 1996 Koesling et al 2004 Russwurm eacutes

Koesling 2002) Eacuteppen ezeacutert azt gondoljuk hogy a hippokampaacutelis piramissejtek

serkentő szinapszisaiban a PSD-95 koumlti az NOsGC α2β1-t az nNOS-sal eacutes az NMDA

receptorral egyuumltt a posztszinaptikus oldalon miacuteg preszinaptikusan az α2β1 egyeacuteb PDZ-

domeacuten tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutehez koumltődhet mint peacuteldaacuteul a szinapszis-asszociaacutelt

protein-97 (Muumlller et al 1995) Habaacuter a piramissejtekre eacuterkező GABAerg

szinapszisokban meacuteg nem figyeltek meg PSD-95 feheacuterjeacutet toumlbb PDZ-domeacuten tartalmuacute

horgonyzoacute feheacuterjeacutet mint a glutamaacutet-receptor-koumllcsoumlnhatoacute proteint (GRIP1) vagy a

szinaptikus aacutellvaacutenyzoacute molekula (SSCAM) sikeruumllt kimutatni (Charych et al 2004

Hirao et al 1998 Kittler et al 2004 Sumita et al 2007) Ezek tehaacutet horgonyzoacuteik

lehetnek az nNOS molekulaacuteknak a GABAerg szinapszisokban ahova akaacuter meacuteg az

NOsGC α2β1 izoforma is bekoumltődhet Ahogy a munkaacutenkboacutel is kideruumllt az α1β1 izoforma

pedig a szinapszisok preszinaptikus oldalaacuten vagyis csak a GABAerg terminaacutelisokban

110

volt jelen Spekulaacutecioacutekeacutent azt is felteacutetelezhetjuumlk hogy mivel az interneuronokon

veacutegződő serkentő szinapszisokban szinteacuten talaacutelhatoacute PSD-95 (El-Husseini et al 2000)

az α2 alegyseacuteg azonban hiaacutenyzik az interneuronokboacutel iacutegy az interneuronok serkentő

szinapszisaiboacutel hiaacutenyozhat a szinaptikus plaszticitaacutes ezen formaacuteja

VII3 Az nNOS eacutes NOsGC koumlzvetiacutetette jelaacutetvitel a periszomatikus eacutes a dendritikus

GABAerg sejtek szinapszisai szaacutemaacutera is eleacuterhető de nem egyforma meacuterteacutekben

Az in situ hibridizaacutecioacutes eacutes immunhisztokeacutemiai adatok azt mutattaacutek hogy nem

minden interneuron volt egyformaacuten pozitiacutev NOsGC α1 alegyseacutegre Megvizsgaacutelva neacutegy

ritkaacuten aacutetlapoloacutedoacute interneuron populaacutecioacutet a fluoreszcens meacutereacuteseink azt mutattaacutek hogy

miacuteg a periszomatikus CCK eacutes PV pozitiacutev interneuronok nagy reacutesze kifejez NOsGC-t

addig a dendriteket ceacutelzoacute SOM eacutes nNOS pozitiacutev interneuronok kevesebb mint

egyharmada tartalmazott NOsGC-t Azt is kimutattuk hogy a CCK pozitiacutev kosaacutersejtek

amiket CB1 receptor ellenes immunreakcioacute segiacutetseacutegeacutevel azonosiacutetottunk sosem fednek

aacutet az nNOS tartalmuacute interneuronok populaacutecioacutejaacuteval a CA1 teruumlleteacuten Az NOsGC

kimutataacutesa ezen interneuronok egy bizonyos reacuteszeacuteben nem felteacutetlenuumll jelenti azt hogy

az NOsGC tartalom tovaacutebbi alpopulaacutecioacutekra osztanaacute ezeket az interneuron tiacutepusokat

Sokkal inkaacutebb egy dinamikusan vaacuteltozoacute aacutellapotfuumlggő tulajdonsaacutega lehet az NOsGC

tartalom ezeknek a sejteknek Mindazonaacuteltal eacuterdekes hogy szignifikaacutens korrelaacutecioacute

mutatkozott a PV vagy nNOS pozitiacutev sejttestek meacuterete eacutes NOsGCα1 tartalma koumlzoumltt

ami arra utal hogy az NOsGC jelenleacutete alapvető metabolikus kuumlloumlnbseacutegekkel van

kapcsolatban meacuteg egy adott interneuron populaacutecioacuten beluumll is (az ok-okozati oumlsszefuumlggeacutes

egyelőre bizonyiacutetaacutesra vaacuter) Oumlsszegezve eredmeacutenyeink megmutattaacutek hogy az NO

jelaacutetvitel molekulaacuteris alkotoacuteelemei jelen vannak a hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisok nagy reacuteszeacuteben eacutes kuumlloumlnboumlzik a glutamaacuteterg szinapszisokban talaacuteltakhoz

keacutepest Ez a molekulaacuteris kuumlloumlnbseacuteg lehetőveacute teszi a gaacutetloacute eacutes serkentő szinaptikus

plaszticitaacutes szelektiacutev eacutes kuumlloumlnboumlző manipulaacutecioacutejaacutet ami remeacutenyt adhat a joumlvőben olyan

idegrendszeri megbetegedeacutesek farmakoteraacutepiaacutejaacuteban melyek a serkenteacutes eacutes a gaacutetlaacutes

egyensuacutelyaacutenak felborulaacutesaacuteval jaacuternak az agykeacuteregben

111

VII4 Az NO lehetseacuteges hataacutesai a neurotranszmitter felszabadulaacutesra

Az NOsGC-eacuten keresztuumll leacutetrejoumlvő cGMP szinteacutezis a meghataacuterozoacute leacutepeacutes a NO

jelaacutetvitel szempontjaacuteboacutel az agyban (Boulton et al 1994 Makhinson et al 2006

Monfort et al 2002) Szubkortikaacutelis teruumlleteken a NO-NOsGC-cGMP uacutetvonal szerepeacutet

a GABAerg neurotranszmisszioacute serkenteacuteseacuteben (Klyachko et al 2001 Kraus eacutes Prast

2002 Li et al 2004) eacutes gaacutetlaacutesaacuteban (Ozaki et al 2000) is kimutattaacutek A hippokampusz

GABAerg szinapszisairoacutel egyetlen adat aacutell rendelkezeacutesuumlnkre amikor is a CCK (eacutes

CB1R) tartalmuacute kosaacutersejtek DSI jelenseacutegeacutet vizsgaacutelva az NO az eCB-okkal

egyuumlttműkoumldoumltt a GABAerg jelaacutetvitel gaacutetlaacutesaacutet eredmeacutenyezve (Makara et al 2007) A

hippokampusz toumlbbi interneuronjaacutenak NO szabaacutelyozaacutesaacuteroacutel egyelőre nincs adat A

cGMP legfontosabb ceacutelelemei (reacuteszletesen laacutesd a III56 alfejezetben) (1) a CNG

csatornaacutek melyek koumlzuumll neacutehaacutenyat maacuter kimutattak hippokampaacutelis interneuronokban

(Kingston et al 1996 Loumlrincz et al 2002 Maccaferri eacutes McBain 1996) (2) a cGMP-

fuumlggő foszfodieacuteszteraacutezok (PDE) szinteacuten kimutathatoacutek interneuronokban eacutes (3) a PKG

enzimek ami valoacutesziacutenűleg szinteacuten megtalaacutelhatoacute interneuronokban (de Vente et al

2001 Feil et al 2005 Kleppisch et al 1999) A PKGII a paraventrikulaacuteris magban

NO-cGMP-fuumlggő moacutedon a GABAerg transzmisszioacute noumlvekedeacuteseacutet okozta (Li et al

2004) A PDE-k hataacutesai sokreacutetűek lehetnek visszahathatnak a cGMP bontaacutesaacutera cGMP

fuumlggő moacutedon kihathatnak a cAMP lebontaacutesaacutera eacutes a cAMP-fuumlggő PDE-k is fokozhatjaacutek

a cGMP lebontaacutesaacutet A cGMP-cAMP egyensuacutely eltolaacutesa is kihat a neurotranszmisszioacutera

Habaacuter a ceacutelelemek megleacutete toumlbbnyire igazolt a hippokampuszban interneuron tiacutepus

terminaacutelis populaacutecioacutes szintű eloszlaacutesuk nem ismert

Az agyban aacuteltalaacutenosan a NO hataacutesa kisseacute ellentmondaacutesos mind a GABAerg

jelaacutetvitel gaacutetlaacutesa mind serkenteacutese ismert Erre toumlbb magyaraacutezat is lehetseacuteges vagy a

kiacuteseacuterleteket nem veacutegezteacutek megfelelő NO koncentraacutecioacute mellett ami nem meglepő

ismerve a mostansaacuteg napvilaacutegot laacutetott valoacutes fizioloacutegiaacutes NO koncentraacutecioacutekat (laacutesd a

III53 alfejezetben) vagy pedig lehet egyeacuteb bioloacutegiai magyaraacutezata is Utoacutebbira peacutelda

lehet hogy a koraacutebban emliacutetett ceacutelelemek kuumlloumlnboumlző kombinaacutecioacutei a terminaacutelis

populaacutecioacutekban akaacuter ellenteacutetes hataacutest is kifejthetnek a GABAerg transzmisszioacutera A

hippokampuszban ndash ahol az NO-eCB koumllcsoumlnhataacutesaacutet maacuter leiacutertaacutek ndash egy nemreacutegiben

publikaacutelt cikkből kideruumllt hogy ha a kainaacutet receptorok oumlnmagukban helyezkedtek el a

112

preszinaptikus terminaacutelison akkor aktivaacutecioacutejuk a transzmisszioacute serkenteacuteseacutet amikor

CB1 receptorokkal egyuumltt fejeződtek ki akkor annak gaacutetlaacutesaacutet okozzaacutek (Lourenccedilo et al

2010) Paacuterhuzamot vonva a periszomatikus kosaacutersejtekkel elkeacutepzelhetőnek tartom

hogy a PV kosaacutersejtek terminaacutelisaiban a NO noumlvelneacute a GABA felszabadulaacutesaacutet a CCK-

CB1 kosaacuter terminaacutelisokban pedig a NO az eCB rendszerrel egyuumlttműkoumldve

csoumlkkenteneacute azt Ez funkcionaacutelis szempontboacutel is megaacutellnaacute a helyeacutet hiszen a CCK

kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel adott esetben (faacutezis-előretoloacutedaacutes) mindenkeacuteppen meg kell

szabadulni (a keacutet paacutelya erősiacuteti egymaacutest) miacuteg az ldquooacuteraműrdquo PV kosaacutersejtek gaacutetlaacutesaacutetoacutel

semmikeacuteppen sem erősiacuteteacutesuumlk pedig veacutelemeacutenyem szerint segiacuteteneacute az oszcillaacutecioacutekban

betoumlltoumltt szerepuumlket Egy ilyen ldquoJanusrdquo szabaacutelyozaacutesra szinteacuten elkeacutepzelhető egy PDE-

hipoteacutezis a kuumlloumlnboumlző PDE-k a jelaacutetvitel serkenteacuteseacutet eacutes gaacutetlaacutesaacutet is okozhatjaacutek Ha egy

ilyen szeacutetvaacutelaacutes teacutenyleg leacutetezne annak klinikai koumlvetkezmeacutenyei is lehetneacutenek hiszen a

legtoumlbb PDE-nak specifikus gaacutetloacuteszere is van raacuteadaacutesul ezek maacutes indikaacutecioacuteval maacuter

forgalomban leacutevő gyoacutegyszerek (sziacuteveleacutegtelenseacuteg erektilis zavarok)

VII5 NMDA indukaacutelta NO jelaacutetvitel a hippokampusz GABAerg szinapszisaiban

Az NMDA receptorok eacutes a kalciumfuumlggő nNOS egyuumltt van lehorgonyozva a

glutamaacuteterg szinapszisokban ami biztosiacutetja hogy az nNOS műkoumldeacutese aktivitaacutesfuumlggő

moacutedon koumlvetkezzen be Eredmeacutenyeink alapjaacuten a nNOS a piramissejtek sejttesteacutere

eacuterkező GABAerg szinapszisokban is kifejeződik Bizonyos periszomatikus

szinapszisokban a NO a szinaptikus transzmisszioacutet is keacutepes befolyaacutesolni (laacutesd előbb

(Makara et al 2007) Azt is kimutattuk hogy az NMDA receptorok felelősek lehetnek

az nNOS beindiacutetaacutesaacuteeacutert a GABAerg szinapszisokban eacutes ennek koumlvetkezmeacutenyekeacutent

keletkezik is cGMP a GABAerg terminaacutelisokban Radioimmunoassay segiacutetseacutegeacutevel maacutes

kutatoacutecsoportok kimutattaacutek hogy miacuteg NMDA (300 μM) adagolaacutesa hatalmas cGMP

noumlvekedeacutessel jaacuter a vad tiacutepusuacute egeacuter CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutejaacuteban addig nem

figyelhető meg cGMP szint noumlvekedeacutes az NOsGC α1-- egeacuter ugyanezen agyteruumlleteacuten

(Taqatqeh et al 2009) Tekintve hogy kiacuteseacuterleteinkben az NOsGC α1 alegyseacuteg tartalmuacute

NO receptor kizaacuteroacutelag GABAerg interneuronokban volt kimutathatoacute ezen az

agyteruumlleten a fenti eredmeacutenyek azt sugalljaacutek hogy az NMDA kivaacuteltotta cGMP

felhalmozoacutedaacutes elsősorban a GABAerg interneuronokban toumlrteacutent Valoacuteban azt talaacuteltuk

113

hogy a hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletekhez adagolt mindoumlssze 5μM NMDA massziacutev

cGMP halmozoacutedaacutest indukaacutelt a kosaacutersejtek axonterminaacutelisaiban Valoacutesziacutenűtlen azonban

hogy ez a hataacutes direkt moacutedon az interneuronok dendritjein leacutevő NMDA receptorokon

keresztuumll joumltt volna leacutetre mert a hataacutes vaacuteltozatlan maradt mikor tetrodotoxin (TTX)

segiacutetseacutegeacutevel gaacutetoltuk az akcioacutes potenciaacutelok terjedeacuteseacutet ami termeacuteszetesen eacuterintette az

interneuronokat is Tovaacutebbaacute kimutattaacutek hogy valoacutesziacutenűtlen hogy 10μM-naacutel kevesebb

NMDA NO termeleacutest vaacuteltson ki az nNOS pozitiacutev interneuronokboacutel Amikor 100μM

NMDA-val leacutetre is hoztaacutek az NO termeleacutest ezen interneuronokban a TTX akkor is

keacutepes volt kiveacutedeni ezt a hataacutest (Lovick et al 1999) Ez megerősiacuteti hogy

valoacutesziacutenűtlen hogy kiacuteseacuterleteink soraacuten az 5μM NMDA adagolaacutesaacutenak baacutermilyen hataacutesa

lett volna az interneuronok NO termeleacuteseacutere TTX jelenleacuteteacuteben A feszuumlltseacutegfuumlggő

kalcium csatornaacutek gaacutetlaacutesa sem befolyaacutesolta az NMDA aacuteltal leacutetrehozott hataacutest ami azt

sugallja hogy az NMDA receptorokon keresztuumlli kalcium beaacuteramlaacutes hateacutekony volt

Raacuteadaacutesul eacutelettani kiacuteseacuterletek alapjaacuten a NO koncentraacutecioacuteja 1 nM (vagy az alatti) eacuterteacuteket

vesz fel a termelődeacutes helyeacuten eacutes gyorsan csoumlkken a szinapszis koumlruumll a szoumlvet magas NO

elnyelőkeacutepesseacutege miatt (Hall eacutes Garthwaite 2009) Iacutegy tehaacutet valoacutesziacutenűtlen hogy a NO a

termelődeacutes helyeacutetől szaacutemiacutetott 1-15 mikromeacuteteren tuacutel keacutepes lenne befolyaacutesolni a helyi

jelaacutetvitelt az axon terminaacutelisokban Az NMDA indukaacutelta cGMP felhalmozoacutedaacutes teljesen

kiveacutedhető volt NMDAR nNOS vagy NOsGC gaacutetloacutek előinkubaacutelaacutesaacuteval eacutes teljesen

hiaacutenyzott az nNOS -- egerekből Ezen eredmeacutenyek arra utalnak hogy az NMDA

receptorok melyeket koumlzvetlenuumll a szomatikus GABAerg szinapszisokban talaacuteltunk

felelősek az nNOS-NO-NOsGC-cGMP kaszkaacuted beindiacutetaacutesaacuteeacutert Habaacuter munkaacutenkban a

CA1 hippokampaacutelis reacutegioacutera foacutekuszaacuteltunk eredmeacutenyeink azt mutattaacutek hogy a

szinapszisok NO-fuumlggő szabaacutelyozaacutesa kuumlloumlnboumlzőkeacuteppen műkoumldik a hippokampusz egyes

reacutegioacuteiban A NO donor minden Ammon-szarvi teruumlleten keacutepes volt a cGMP jel

emeleacuteseacutere a gyrus dentatusban azonban nem ami valoacutesziacutenűleg a szemcsesejtek

speciaacutelis fizioloacutegiai tulajdonsaacutegainak eacutes ebből koumlvetkező szerepuumlknek koumlszoumlnhető (laacutesd

a III32 eacutes III33 alfejezetekben) Mindamellett feltűnő kuumlloumlnbseacutegek voltak az

Ammon szarv kuumlloumlnboumlző reacutegioacutei koumlzoumltt is A CA1 eacutes CA3c kosaacutersejt terminaacutelisaiban

nem volt nNOS-cGMP alapaktivitaacutes de massziacutevan aktivaacutelhatoacute volt NMDA

adagolaacutesaacuteval miacuteg a CA3ab reacutegioacute kosaacutersejt terminaacutelisai rendelkeztek neacutemi cGMP

aktivitaacutessal de NMDA adaacutesaacuteval maacuter nem lehetett tovaacutebbi noumlvekedeacutest eleacuterni Annak

114

hogy a CA3ab eacutes CA3c piramissejtek morfoloacutegiai kuumlloumlnbseacutegeinek (laacutesd a III32 eacutes

III33 alfejezetekben) van-e jelentőseacutege a jelenseacutegben nem tisztaacutezott Oumlnmagaacuteban nem

magyaraacutezhatja a reacutegioacutek koumlzti kuumlloumlnbseacuteget az NMDA receptorok kuumlloumlnboumlző NMDA

koumlteacutesi affinitaacutesa mivel a CA3c ebben nem kuumlloumlnboumlzik a toumlbbi CA3 reacutegioacutetoacutel eacutes az

NMDA koumlteacutes a gyrus dentatusban is erős (Monaghan eacutes Cotman 1985) Ezek a

regionaacutelis kuumlloumlnbseacutegek megfigyelhetők voltak a TTX tartalmuacute magneacutezium-mentes

oldat alkalmazaacutesaacutenaacutel is ami azt mutatja hogy valoacutesziacutenűleg nem az NMDA receptorok

feszuumlltseacuteg-eacuterzeacutekenyseacutegeacuteben volt kuumlloumlnbseacuteg az egyes reacutegioacutekban Egy koraacutebbi

tanulmaacutenyban nagy teacuterbeli felbontaacutesuacute NMDA mikroinjektaacutelaacutest veacutegeztek a

hippokampaacutelis principaacutelis sejtek sejttestei mellett eacutes a keletkező NO koncentraacutecioacutejaacutet a

koumlzvetlen koumlzeleacuteben meacuterteacutek mikroszenzor segiacutetseacutegeacutevel (Ledo et al 2004) Ezekben a

kiacuteseacuterletekben a hippokampusz kuumlloumlnboumlző reacutegioacuteiban meacutert NO koncentraacutecioacute joacutel korrelaacutelt

az aacuteltalunk NMDA-val kivaacuteltott reacutegioacutespecifikus cGMP termelődeacutessel Eredmeacutenyeink

azt sugalljaacutek hogy azok a meacutert kuumlloumlnbseacutegek joacutereacuteszt a periszomatikus GABAerg

szinapszisokban leacutetrejoumlvő massziacutev nNOS-cGMP kaszkaacuted aktivaacutecioacutejaacuteboacutel szaacutermaznak

mivel a mikroszenzor a periszomatikus reacutegioacuteban volt eacutes a glutamaacuteterg terminaacutelisok

nagy reacutesze toumlbb tiacutez mikromeacuteterre talaacutelhatoacute innen a stratum radiatumban

VII6 Az NMDAR eacutes az nNOS kolokalizaacutel a GABAerg szinapszisokban

Ahogy az eredmeacutenyekneacutel olvashatoacute a szomatikus GABAerg szinapszisok 75-

a tartalmazott nNOS enzimet posztszinaptikusan miacuteg 79-a a terminaacutelisaiknak NO

receptor tartalmuacute (NOsGC α1β1) volt Tovaacutebbaacute ezen GABAerg terminaacutelisok 57-a

cGMP termeleacutest mutat NMDA adagolaacutesaacutera eacutes legalaacutebb 66-a ezeknek a

szinapszisoknak kifejezi az NMDA receptor GluN1 2A eacutes 2B alegyseacutegeacutet

posztszinaptikusan Ezen alegyseacutegek eloszlaacutesa nem kuumlloumlnboumlzoumltt a kuumlloumlnboumlző

kosaacutersejtek szinapszisaiban ami arra utal hogy az NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP

uacutetvonal a legtoumlbb ha nem az oumlsszes GABAerg szinapszisban megtalaacutelhatoacute (19 aacutebra) A

kalciumfuumlggő nNOS 05-1 μM kalcium hataacutesaacutera kezd NO termeleacutesbe (Lee eacutes Stull

1998) A glutamaacuteterg szinapszisokban ekkora meacuterteacutekű kalciumszint noumlvekedeacutes a

funkcionaacutelisan koumltoumltt NMDA receptorokon keresztuumll joumln leacutetre (Brenman eacutes Bredt

1997) Az NMDA receptorok eacutes az nNOS posztszinaptikus asszociaacutecioacuteja biztosiacutetja

115

hogy a NO termelődeacutese a szinapszisokban teacuterben korlaacutetozottan eacutes aktivitaacutes fuumlggő

moacutedon joumlhessen leacutetre ami nagyban noumlveli az informaacutecioacute feldolgozoacute kapacitaacutest eacutes a

teacuterbeli szelektivitaacutest Ez kuumlloumlnoumlsen fontos lehet a GABAerg interneuronok aacuteltal keacutepzett

szinapszisokban mert ezen neuronok alapvető szerepet jaacutetszanak a populaacutecioacutes kisuumlleacutesi

mintaacutezatok szabaacutelyozaacutesaacuteban a hippokampuszban (Freund 2003) Habaacuter becsleacuteseink

alapjaacuten koumlruumllbeluumll oumltszoumlr kevesebb NMDA receptor van a GABAerg szinapszisokban a

glutamaacuteterg szinapszisokhoz keacutepest kinetikai meacutereacutesek alapjaacuten ez toumlbb mint eleacutegseacuteges

ahhoz hogy preszinaptikusan cGMP felhalmozoacutedaacutest okozzon koumlszoumlnhetően a NO-jel

nagyon hateacutekony detektaacutecioacutejaacutenak eacutes amplifikaacutecioacutejaacutenak (laacutesd a III54 alfejezetben

(Garthwaite 2008) Mind az nNOS mind az NMDA receptorok PDZ-tartalmuacute

feheacuterjeacutekhez vannak lehorgonyozva a glutamaacuteterg szinapszisok posztszinaptikus

denzitaacutesaacutehoz Mindemellett a ldquoSynaptic Scaffolding Moleculerdquo (SSCAM) PDZ-domeacuten

tartalmuacute horgonyzoacute feheacuterjeacutet azonkiacutevuumll hogy megtalaacuteltaacutek hippokampaacutelis GABAerg

szinapszisokban is (laacutesd VII2 fejezetben (Sumita et al 2007) kimutattaacutek az NMDA

receptor alegyseacutegekkel valoacute interakcioacutejaacutet is (Hirao et al 1998) Koumlvetkezeacuteskeacuteppen ezek

a feheacuterjeacutek felelősek lehetnek az NMDA receptorok eacutes nNOS egyuumlttes lehorgonyzaacutesaacuteeacutert

a GABAerg szinapszisokban

A GABAerg szinapszisokban elhelyezkedő NMDA receptorok az NO rendszer

aktivaacutelaacutesaacuten kiacutevuumll fontos szerepet jaacutetszhatnak a GABAA receptorok szinaptikus

szintjeacutenek aktivitaacutesfuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban is (Muir et al 2010)

NMDA receptor koumlzvetiacutetette aacuteramokat maacuter reacutegoacuteta leiacutertak a piramissejtek

szoacutemaacutejaacuteboacutel toumlrteacutenő elvezeteacutes soraacuten eacutes elektrofizioloacutegiai meacutereacutesek alapjaacuten az NMDA

receptorok toumlbb mint egyharmada a serkentő szinapszisokon kiacutevuumll helyezkedik el (laacutesd

a III632 alfejezetben) Eredmeacutenyeinkkel egyeteacuterteacutesben a leguacutejabb eredmeacutenyek

alapjaacuten a sejttesten a GluN1 alegyseacuteg mellett GluN2A eacutes GluN2B oumlsszeteacutetelű NMDA

receptorok is vannak (Harris eacutes Pettit 2007) Bebizonyiacutetottuk hogy a GABAerg

szinapszisok mindhaacuterom NMDAR alegyseacuteget kifejezik mindamellett azt is kimutattuk

hogy egy reacuteszuumlk ldquovaloacutebanrdquo extraszinaptikus A piramissejtek sejttesteacutere nem eacuterkeznek

glutamaacuteterg szinapszisok (Megiacuteas et al 2001) ami tovaacutebb erősiacuteti hogy ezek a

receptorok extraszinaptikusak

116

19 Aacutebra Az NMDAR-nNOS jelpaacutelya felteacutetelezett uacutetvonalaacutenak sematikus aacutebraacuteja a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisokban

Az aacutebraacuten egy szinapszis sematikus vaacutezlata laacutethatoacute A posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban

helyezkednek el az NMDA receptorok melyeket felteacutetelezhetően a GABAerg

szinapszisokban is megtalaacutelhatoacute glutamaacutet-receptor horgonyzoacute feheacuterjeacutek (pl GRIP1

SSCAM) kapcsoljaacutek oumlssze a membraacuten alatt talaacutelhatoacute nNOS molekulaacutekkal Az nNOS

Ca2+

-kalmodulinnal toumlrteacutenő aktivaacutecioacutejaacuteval joumln leacutetre a nitrogeacuten-monoxid termeleacutes mely

a preszinaptikus receptoraacuten az α1β1 alegyseacuteg oumlsszeteacutetelű NOsGC-eacuten hatva cGMP

termeleacuteshez vezet A cGMP aacuteltal iraacutenyiacutetott maacutesodlagos jelaacutetviteli uacutetvonalak minden

bizonnyal befolyaacutesoljaacutek a terminaacutelisban leacutetrejoumlvő neurotranszmisszioacutet A kezdeti leacutepeacutes

vagyis az NMDA receptorok aktivaacutecioacuteja szaacutemos forraacutesboacutel szaacutermazhat bdquotuacutelcsorduloacuterdquo

vagy asztrocita eredetű glutamaacutetboacutel eacutesvagy a GABAerg terminaacutelisok

aszpartaacutetglutamaacutet uumlriacuteteacuteseacuteből

117

VII7 Lehetseacuteges mechanizmusok a GABAerg szinapszisokban leacutevő NMDA

receptorok aktivaacutelaacutesaacutera

A leghataacutesosabb endogeacuten NMDA receptor ligand a glutamaacutet eacutes az aszpartaacutet A

hippokampaacutelis CCK-tartalmuacute kosaacutersejtek kifejeznek vGluT3 tiacutepusuacute vezikulaacuteris

glutamaacutet transzportert (Somogyi et al 2004) Megfigyelteacutek hogy a halloacuterendszerben a

haacuteloacutezat műkoumldeacuteseacutenek szempontjaacuteboacutel alapvető a vGluT3 tartalmuacute GABAerg

terminaacutelisok egyuumlttes glutamaacutet uumlriacuteteacutese (Noh et al 2010) Meglepő moacutedon

hippokampaacutelis GABAerg terminaacutelisokroacutel kimutattaacutek hogy keacutepesek vezikulaacuterisan

aszpartaacutetot uumlriacuteteni (Gundersen et al 2004) Az eddigi egyetlen ismert vezikulaacuteris

aszpartaacutet transzportert is sikeruumllt maacuter kimutatni hippokampaacutelis szinaptikus vezikulaacutekon

(Miyaji et al 2008) Iacutegy az aszpartaacutet eacutesvagy glutamaacutet ami a GABAerg

terminaacutelisokboacutel uumlruumllt keacutepes lehet aktivaacutelni a GABAerg szinapszisban leacutevő NMDA

receptorokat Habaacuter a gyrus dentatus-ban mutattak maacuter ki NMDA receptorokat

szomatikus szimmetrikus eacutes aszimmetrikus szinapszisokban eacutes immuncitokeacutemiai

bizonyiacuteteacutekot is talaacuteltak GABAerg terminaacutelisokboacutel toumlrteacutenő aszpartaacutet uumlriacuteteacutesre (Gundersen

et al 2004) az NO koumlzvetiacutetette szabaacutelyozaacutes minden bizonnyal elteacuterő itt mivel nem

tapasztaltunk cGMP jelet a gyrus dentatus kosaacutersejt terminaacutelisaiban

Egy maacutesik lehetseacuteges mechanizmus az NMDA receptorok aktivaacutelaacutesaacutera az

asztrocitaacutekboacutel toumlrteacutenő glutamaacutet uumlriacuteteacutes A periszomatikus GABAerg interneuronok

ismeacutetlődő ingerleacuteseacutevel kalcium hullaacutemokat lehet kivaacuteltani a szomszeacutedos asztrocitaacutekban

GABAB receptorok aktivaacutecioacutejaacuten keresztuumll Ennek eredmeacutenyekeacutent az asztrocitaacutek

glutamaacutetot uumlriacutetenek mely keacutepes vaacuteltoztatni a gaacutetloacute posztszinaptikus aacuteramokat Ezt a

hataacutest ionotroacutep glutamaacutet receptor antagonistaacuteval gaacutetolni lehetett (Kang et al 1998)

Annak eacuterdekeacuteben hogy hateacutekonyan lehessen beindiacutetani az NMDAR-nNOS-cGMP

uacutetvonalat a GABAerg szinapszisokban a glutamaacutet vagy aszpartaacutet jelnek egybe kell

esnie a piramissejt membraacuten depolarizaacutecioacutejaacuteval amit legnagyobb valoacutesziacutenűseacuteggel egy

akcioacutes potenciaacutel ideacutez elő Dendritikus vagy visszaterjedő akcioacutes potenciaacutelok mind

hataacutessal lehetnek a taacutevolabbi GABAerg szinapszisokra is Ez a mechanizmus- az

asztrocita haacuteloacutezat aktivaacutecioacutes aacutellapota aacuteltal befolyaacutesolva-lehetőveacute teszi a GABAerg

transzmisszioacute befolyaacutesolaacutesaacutet mind a piramissejt mind az afferens interneuron

aktivitaacutesaacutenak fuumlggveacutenyeacuteben

118

VII8 A NO rendszer funkcionaacutelis oumlsszehasonliacutetaacutesa az endokannabinoid

rendszerrel a GABAerg szinapszisokban

Felmeruumll a keacuterdeacutes hogy mieacutert leacutetezik keacutet retrograacuted rendszer a GABAerg

szinapszisokban egymaacutessal paacuterhuzamosan Miben maacutes a nitrogeacuten-monoxid jelaacutetvitel a

maacuter joacutel ismert endokannabinoid jelaacutetvitelhez keacutepest Ezekre a keacuterdeacutesekre proacutebaacutelok

vaacutelaszt adni neacutemely ponton azonban csak hipoteacutezisemre hagyatkozhatok

Elsőre is szembeoumltlő kuumlloumlnbseacuteg a keacutet retrograacuted jel szinapszis populaacutecioacutek koumlzoumltti

megoszlaacutesa Miacuteg az eCB jelaacutetvitel kizaacuteroacutelag a CCK tartalmuacute interneurok szaacutemaacutera eacuterhető

el addig a NO jelaacutetvitel az interneuronok szinapszisaiban joacuteval aacuteltalaacutenosabb

mechanizmusnak tűnik

Koumlvetkező kuumlloumlnbseacuteg a jelpaacutelya aktivaacutelaacutesaacuteban hogy miacuteg az NO szinteacutezise

NMDA-receptorokhoz koumltoumltt (feszuumllseacutegfuumlggő kalcium csatornaacutek blokkolaacutesa nem

vaacuteltoztatta a cGMP felhalmozoacutedaacutesaacutet eacutes a metabotroacutep receptrok aktivaacutelaacutesa sem vaacuteltott ki

NO szinteacutezist laacutesd a VII1 alfejezetben) addig az eCB szinteacutezise szaacutemos inger hataacutesaacutera

(IC eacutes EC kalcium-szint noumlvekedeacutesen keresztuumll egyaraacutent illetve metabotroacutep

receptorokon kalcium-fuumlggetlen uacutetvonalon is laacutesd a III42 alfejezetben) veacutegbemehet

Ha a kalciumfuumlggő eCB szinteacutezist vesszuumlk az oumlsszehasonliacutetaacutes alapjaacuteul akkor irodalmi

adatok alapjaacuten az eCB szinteacutezis 4 microM koumlruumlli intracellulaacuteris kalcium koncentraacutecioacute mellett

indul meg (Wang eacutes Zucker 2001) miacuteg az NO szinteacutezis kalciumigeacutenye ~05-1 microM

(Bredt eacutes Snyder 1990) vagyis sokkal kisebb ingeruumllet mellett is kialakul az NO

hataacutesa A szintetizaacuteloacute enzimek elhelyezkedeacutese is fontos kuumlloumlnbseacuteget mutat a DGLα

sosem talaacutelhatoacute a szinapszisban az mindig periszinaptikus miacuteg az nNOS szorosan

makromolekulaacuteris komplexbe van koumltve a teljes jelaacutetviteli apparaacutetussal a szinapszisban

iacutegy az nNOS szaacutemaacutera a kisebb NMDA receptor aktivaacutecioacute is lokaacutelisan elegendő

kalciumot biztosiacutet a szinteacutezishez NMDA receptor aktivaacutecioacuteval sejtkultuacuteraacuteban sikeruumllt

eCB szinteacutezist eacutes DSI-t (helyesebben NMDA-eCB-STD-t laacutesd a III422 alfejezetben)

kivaacuteltani a gaacutetloacute szinapszisokban de csak olyan magas NMDA koncetraacutecioacuteval ami

maximum egy glutamaacuteterg szinapszisban fordulhat elő alacsonyabb koncetraacutecioacuteval

pedig nem sikeruumllt DSI-t (NMDA-eCB-STD-t) kivaacuteltani (Ohno-Shosaku et al 2007) A

keacutet retrograacuted jel hatoacutetaacutevolsaacutega is meghataacuterozoacute Az eCB-ok 20 microm beluumll is keacutepesek meacuteg

szabaacutelyozni a koumlrnyezetuumlkben leacutevő szinapszisokat (hetroszinapsztikus modulaacutecioacute laacutesd a

119

III424 alfejezetben) miacuteg a NO hataacutesa szinapszis-specifikusnak tekinthető a

maximaacutelis 1-2 microm terjedeacutessel

Ezek alapjaacuten felteacutetelezhető hogy a keacutet jelpaacutelya maacutes funkcioacute ellaacutetaacutesaacutera

specializaacuteloacutedott a GABAerg szinapszisokban A eCB-CB1R jelaacutetvitel a preszinaptikus

GABAerg aktivitaacutestoacutel fuumlggetlenuumll a posztszinaptikus piramissejt aktivitaacutesaacutenak

megfelelően a depolarizaacutecioacute magas kalcium-szint eacutes az eCB heteroszinaptikus

terjedeacutese miatt toumlbb szinapszisban egyuumlttesen beindul (ami a faacutezis-előretoloacutedaacutes

kialakulaacutesaacutet eredmeacutenyezheti) Ezzel szemben az NMDA receptorok koincidencia

detektor tulajdonsaacutega miatt a NO rendszer aktivaacutelaacutesa csak a pre- eacutes posztszinaptikus

sejt vagy a haacuteloacutezati aktivitaacutesra reagaacuteloacute gliasejt eacutes posztszinaptikus sejt egyuumlttes

aktivaacutecioacuteja soraacuten lokaacutelis kalciumszint noumlvekedeacutessel eacutes szinapszis-specifikusan alakul

ki sokkal pontosabb szabaacutelyozaacutest teacuteve lehetőveacute a pre- eacutes posztszinaptikus sejt

kommunikaacutecioacutejaacuteban

120

VIII KOumlVETKEZTETEacuteSEK

Eacutertekezeacutesem koumlvetkezteteacutesei az alaacutebbiak

(1) a hippokampaacutelis piramissejtekben az nNOS asszociaacuteloacutedik a kuumlloumlnboumlző -mind PV

mind CCKvGluT3 kosaacutersejtek aacuteltal keacutepzett- GABAerg szinapszisok posztszinaptikus

aktiacutev zoacutenaacutejaacuteval

(2) a NO receptora az NOsGC megtalaacutelhatoacute az interneuronoknak mind a szomato-

dendritikus mind az axon terminaacutelis kompartmentjeacuteben

(3) NOsGC α1β1 kizaacuteroacutelag az interneuronokban fejeződik ki miacuteg α2β1 alegyseacuteg

kompoziacutecioacute piramissejtekben talaacutelhatoacute

(4) NMDA adagolaacutesa hataacuterozott cGMP noumlvekedeacutest okozott a GABAerg kosaacutersejt

terminaacutelisokban NMDAR- nNOS- eacutes NOsGC-fuumlggő moacutedon specifikusan a

hippokampusz CA1 eacutes CA3c reacutegioacutejaacuteban ezzel szemben a CA3ab eseteacuteben a cGMP

halmozoacutedaacutes NMDAR fuumlggetlen moacutedon toumlrteacutenik

(5) az NMDAR GluN1 GluN2A eacutes GluN2B alegyseacutegei felduacutesulaacutest mutattak a

GABAerg szinapszisokban eacutes kizaacuteroacutelag posztszinaptikusan helyezkedtek el

(6) a szomatikus GABAerg szinapszisok legalaacutebb keacutetharmada tartalmazott NMDA

receptort -mindhaacuterom vizsgaacutelt alegyseacuteget- tized akkora sűrűseacutegben mint a glutamaacuteterg

szinapszisok

(7) mind a PV mind a CCKvGluT3 tartalmuacute kosaacutersejt terminaacutelisok aacuteltal keacutepzett

szinapszisok tartalmaztak NMDA receptorokat

Eredmeacutenyeink tuumlkreacuteben a CA1 piramissejtek periszomatikus GABAerg

szinapszisaiban kifejeződő NMDA receptorok helyi aktivaacutecioacuteja keacutepes megfelelő

mennyiseacutegű kalciumot biztosiacutetani az nNOS aktivaacutelaacutesaacutehoz Koumlvetkezeacuteskeacuteppen az

NMDAR-nNOS-NO-NOsGC-cGMP jelpaacutelya hateacutekony aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozoacuteja

lehet ezen szinapszisok neurotranszmisszioacutejaacutenak

121

IX OumlSSZEFOGLALAacuteS

A nitrogeacuten monoxid (NO) fontos szerepet jaacutetszik a neuronok szinaptikus

plaszticitaacutesaacuteban eacutes a retrograacuted jelaacutetvitelben Szintetizaacuteloacute enzime az idegsejtekben a

neuronalis NO szintaacutez (nNOS) Receptora a NO szenzitiacutev guanilaacutet ciklaacutez (NOsGC) az

agyban keacutet funkcionaacutelis alegyseacutegoumlsszeteacutetellel van jelen α1β1 eacutes α2β1 heterodimerkeacutent

Első kiacuteseacuterletsorozatunkban vizsgaacuteltuk hogy a retrograacuted NO jelaacutetviteli uacutetvonal elemei

jelen lehetnek-e a glutamaacuteterg szinapszisokon kiacutevuumll a GABAergekben is Munkaacutenkban

elsőkeacutent mutattuk ki hogy a nNOS megtalaacutelhatoacute a piramissejteken veacutegződő GABAerg

terminaacutelisok szinapszisaiban is Leiacutertuk hogy az NOsGC α1-alegyseacutegeacutet csak

interneuronok fejezik ki piramissejtek nem iacutegy feltehetően az előbbiek α1β1- miacuteg

utoacutebbiak α2β1-alegyseacuteg-oumlsszeteacutetelű NO-receptort hasznaacutelnak Kombinaacutelt immunarany-

immunperoxidaacutez moacutedszerrel azt talaacuteltuk hogy a PV eacutes CCK pozitiacutev sejtek

terminaacutelisaiban is jelen van az α1 alegyseacuteg Az eredmeacutenyeink igazoljaacutek hogy a

piramissejtekre eacuterkező GABAerg szinapszisok rendelkeznek a retrogaacuted NO jelaacutetviteli

uacutetvonal molekulaacuteris elemeivel

Az NO termelődeacuteseacutehez posztszinaptikus kalcium-jelre van szuumlkseacuteg mely a

glutamaacuteterg szinapszisokban NMDAR-aktivaacutecioacute uacutetjaacuten joumln leacutetre Maacutesodik

kiacuteseacuterletsorozatunkban arra kerestuumlk a vaacutelaszt vajon a GABAerg szinapszisokban

beindiacutethatja-e az NMDAR aktivaacutecioacuteja az nNOS műkoumldeacuteseacutet eacutes megtaacutelalhatoacuteak-e ezen

receptorok a GABAerg szinapszisokban is Hippokampaacutelis tuacuteleacutelő szeletben NMDA

adagolaacutesra jelentős cGMP termeleacutest figyeltuumlnk meg a GABAerg terminaacutelisokban ami

eltűnt a NO rendszer blokkoloacuteival eacutes hiaacutenyzott az nNOS geacutenkiuumltoumltt egeacuterből Fagyasztva

toumlreacuteses replika immunarany technikaacuteval eacutes beaacutegyazaacutes-utaacuteni immunhisztokeacutemiaacuteval

kimutattuk hogy a szomatikus GABAerg szinapszisok 23-a tartalmaz NMDAR-okat a

posztszinaptikus aktiacutev zoacutenaacuteban eacutes ezekben a szinapszisokban koumlzel 10-szer kisebb

NMDA-R sűrűseacuteget talaacuteltunk a serkentő szinapszisokhoz keacutepest

Koumlvetkezeacuteskeacuteppen a hippokampaacutelis kosaacutersejt terminaacutelisok szinapszisaiban jelen

vannak az NMDAR-ok eacutes aktivaacutecioacutejuk NO koumlzvetiacutetette cGMP termeleacuteshez vezet a

ezekben terminaacutelisokban Az aacuteltalunk leiacutert jelaacutetviteli uacutetvonal szerepet jaacutetszhat a

piramissejtek GABAerg bemeneteacutenek aktivitaacutes-fuumlggő szabaacutelyozaacutesaacuteban

122

SUMMARY

Nitric oxide (NO) plays an important role in synaptic plasticity and retrograde

signaling In neurons the synthetizing enzyme of NO is the neuronal nitric oxide

synthase (nNOS) Its receptor the NO-sensitive guanylate cyclase (NOsGC) is present

in the brain with two functional subunit composition as α1β1 and α2β1 heterodimers

In the first series of experiments we examined whether the molecular elements

of the retrograde NO signaling pathway are present not only in glutamatergic but also

in GABAergic synapses We showed for the first time that nNOS is also present in

GABAerg synapses on pyramidal cells We described that the α1-subunit of NOsGC is

present only in interneurons but not in pyramidal cells suggesting that the former

express α1β1 NO receptors while pyramidal cells express α2β1 subunits Using the

combined immunogold-immunoperoxidase technique we found that both PV and CCK

positive boutons express NO receptors Our results prove that GABAergic synapses on

pyramidal cells possess the molecular machinery for retrograde nitric-oxide signaling

The release of NO requires postsynaptic calcium elevation that is achieved via

NMDA receptors in glutamatergic synapses In the second series of experiments we

investigated whether activation of NMDA receptors could lead to the production of NO

in GABAergic synapses as well and whether NMDA receptors are also present in these

synapses We observed a significant cGMP production in GABAergic terminals after

NMDA application in in vitro hippocampal slice preparations that was absent when co-

applied with NO-system blockers or in slices from nNOS knockout animals Using

freeze-fracture replica labeling and postembedding immunogold labeling we found that

23 of somatic GABAergic synapses express NMDA receptors in the postsynaptic

active zone and the density of these receptors in these synapses was one order of

magnitude smaller than in the glutamatergic synapses

In conclusion the synapses of hippocampal basket terminals express NMDA

receptors postsynaptically the activation of which leads to presynaptic cGMP

production via the synthesis of NO This retrograde signaling pathway could play an

important role in the activity-dependent regulation of GABAergic input of pyramidal

cells

123

X IRODALOMJEGYZEacuteK

Abe M M Fukaya T Yagi M Mishina M Watanabe and K Sakimura 2004

NMDA receptor GluRepsilonNR2 subunits are essential for postsynaptic

localization and protein stability of GluRzeta1NR1 subunit J Neurosci v 24

p 7292-304

Abercrombie M 1946 Estimation of nuclear population from microtome sections

Anat Rec v 94 p 239-47

Acsaacutedy L A Kamondi A Siacutek T Freund and G Buzsaacuteki 1998 GABAergic cells are

the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus J

Neurosci v 18 p 3386-403

Acsaacutedy L and S Kaacuteli 2007 Models structure function the transformation of cortical

signals in the dentate gyrus Prog Brain Res v 163 p 577-99

Akashi K T Kakizaki H Kamiya M Fukaya M Yamasaki M Abe R Natsume

M Watanabe and K Sakimura 2009 NMDA receptor GluN2B (GluR epsilon

2NR2B) subunit is crucial for channel function postsynaptic macromolecular

organization and actin cytoskeleton at hippocampal CA3 synapses J Neurosci

v 29 p 10869-82

Alagarsamy S G Lonart and K M Johnson 1994 Regulation of nitric oxide

synthase activity in cortical slices by excitatory amino acids and calcium J

Neurosci Res v 38 p 648-53

Alderton W K C E Cooper and R G Knowles 2001 Nitric oxide synthases

structure function and inhibition Biochem J v 357 p 593-615

Amaral DG Witter MP Hippocampal formation In Paxinos G szerkesztő The rat

nervous system 2 kiadaacutes San Diego Academic Press 1995433-495

Armstrong C E Krook-Magnuson and I Soltesz 2012 Neurogliaform and Ivy Cells

A Major Family of nNOS Expressing GABAergic Neurons Front Neural

Circuits v 6 p 23

Auld D S and R Robitaille 2003 Glial cells and neurotransmission an inclusive

view of synaptic function Neuron v 40 p 389-400

124

Bang M L and S Owczarek 2013 A matter of balance role of neurexin and

neuroligin at the synapse Neurochem Res v 38 p 1174-89

Bellamy T C J Wood D A Goodwin and J Garthwaite 2000 Rapid

desensitization of the nitric oxide receptor soluble guanylyl cyclase underlies

diversity of cellular cGMP responses Proc Natl Acad Sci U S A v 97 p 2928-

33

Bergmann O and J Friseacuten 2013 Neuroscience Why adults need new brain cells

Science v 340 p 695-6

Blackshaw S M J Eliasson A Sawa C C Watkins D Krug A Gupta T Arai R

J Ferrante and S H Snyder 2003 Species strain and developmental variations

in hippocampal neuronal and endothelial nitric oxide synthase clarify

discrepancies in nitric oxide-dependent synaptic plasticity Neuroscience v 119

p 979-90

Blahos J and R J Wenthold 1996 Relationship between N-methyl-D-aspartate

receptor NR1 splice variants and NR2 subunits J Biol Chem v 271 p 15669-

74

Blottner D 1999 Nitric oxide and target-organ control in the autonomic nervous

system anatomical distribution spatiotemporal signaling and neuroeffector

maintenance J Neurosci Res v 58 p 139-51

Blundell J C A Blaiss M R Etherton F Espinosa K Tabuchi C Walz M F

Bolliger T C Suumldhof and C M Powell 2010 Neuroligin-1 deletion results in

impaired spatial memory and increased repetitive behavior J Neurosci v 30 p

2115-29

Blundell J K Tabuchi M F Bolliger C A Blaiss N Brose X Liu T C Suumldhof

and C M Powell 2009 Increased anxiety-like behavior in mice lacking the

inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2 Genes Brain Behav v

8 p 114-26

Bon C L and J Garthwaite 2003 On the role of nitric oxide in hippocampal long-

term potentiation J Neurosci v 23 p 1941-8

Bottos A A Rissone F Bussolino and M Arese 2011 Neurexins and neuroligins

synapses look out of the nervous system Cell Mol Life Sci v 68 p 2655-66

125

Boulton C L A J Irving E Southam B Potier J Garthwaite and G L

Collingridge 1994 The nitric oxide--cyclic GMP pathway and synaptic

depression in rat hippocampal slices Eur J Neurosci v 6 p 1528-35

Bredt D and S Snyder 1990 Isolation of nitric oxide synthetase a calmodulin-

requiring enzyme Proc Natl Acad Sci U S A v 87 p 682-5

Brenman J and D Bredt 1997 Synaptic signaling by nitric oxide Curr Opin

Neurobiol v 7 p 374-8

Brenman J E D S Chao S H Gee A W McGee S E Craven D R Santillano Z

Wu F Huang H Xia M F Peters S C Froehner and D S Bredt 1996

Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95

and alpha1-syntrophin mediated by PDZ domains Cell v 84 p 757-67

Budreck E C O B Kwon J H Jung S Baudouin A Thommen H S Kim Y

Fukazawa H Harada K Tabuchi R Shigemoto P Scheiffele and J H Kim

2013 Neuroligin-1 controls synaptic abundance of NMDA-type glutamate

receptors through extracellular coupling Proc Natl Acad Sci U S A v 110 p

725-30

Burette A U Zabel R J Weinberg H H Schmidt and J G Valtschanoff 2002b

Synaptic localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the

hippocampus J Neurosci v 22 p 8961-70

Burgunder J M and P T Cheung 1994 Expression of soluble guanylyl cyclase gene

in adult rat brain Eur J Neurosci v 6 p 211-7

Buzsaacuteki G 1986 Hippocampal sharp waves their origin and significance Brain Res

v 398 p 242-52

Buzsaacuteki G 1989 Two-stage model of memory trace formation a role for noisy

brain states Neuroscience v 31 p 551-70

Chang Y and D Gottlieb 1988 Characterization of the proteins purified with

monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase J Neurosci v 8 p

2123-30

Charych E I W Yu R Li D R Serwanski C P Miralles X Li B Y Yang N

Pinal R Walikonis and A L De Blas 2004 A four PDZ domain-containing

splice variant form of GRIP1 is localized in GABAergic and glutamatergic

synapses in the brain J Biol Chem v 279 p 38978-90

126

Chazot P L and F A Stephenson 1997 Molecular dissection of native mammalian

forebrain NMDA receptors containing the NR1 C2 exon direct demonstration

of NMDA receptors comprising NR1 NR2A and NR2B subunits within the

same complex J Neurochem v 69 p 2138-44

Chevaleyre V and P E Castillo 2003 Heterosynaptic LTD of hippocampal

GABAergic synapses a novel role of endocannabinoids in regulating

excitability Neuron v 38 p 461-72

Csicsvari J B Jamieson K D Wise and G Buzsaacuteki 2003 Mechanisms of gamma

oscillations in the hippocampus of the behaving rat Neuron v 37 p 311-22

Daff S 2010 NO synthase structures and mechanisms Nitric Oxide v 23 p 1-11

de Vente J E Asan S Gambaryan M Markerink-van Ittersum H Axer K Gallatz

S M Lohmann and M Palkovits 2001 Localization of cGMP-dependent

protein kinase type II in rat brain Neuroscience v 108 p 27-49

de Vente J and H Steinbusch 1992 On the stimulation of soluble and particulate

guanylate cyclase in the rat brain and the involvement of nitric oxide as studied

by cGMP immunocytochemistry Acta Histochem v 92 p 13-38

de Vente J H Steinbusch and J Schipper 1987 A new approach to

immunocytochemistry of 35-cyclic guanosine monophosphate preparation

specificity and initial application of a new antiserum against formaldehyde-

fixed 35-cyclic guanosine monophosphate Neuroscience v 22 p 361-73

Ding J D A Burette P I Nedvetsky H H Schmidt and R J Weinberg 2004

Distribution of soluble guanylyl cyclase in the rat brain J Comp Neurol v 472

p 437-48

Dingledine R K Borges D Bowie and S F Traynelis 1999 The glutamate receptor

ion channels Pharmacol Rev v 51 p 7-61

Domek-Łopacińska K and J B Strosznajder 2005 Cyclic GMP metabolism and its

role in brain physiology J Physiol Pharmacol v 56 Suppl 2 p 15-34

Doyle C C Houmllscher M J Rowan and R Anwyl 1996 The selective neuronal NO

synthase inhibitor 7-nitro-indazole blocks both long-term potentiation and

depotentiation of field EPSPs in rat hippocampal CA1 in vivo J Neurosci v 16

p 418-24

Drachman D A 2005 Do we have brain to spare Neurology v 64 p 2004-5

127

East S and J Garthwaite 1991 NMDA receptor activation in rat hippocampus

induces cyclic GMP formation through the L-arginine-nitric oxide pathway

Neurosci Lett v 123 p 17-9

Edwards T M and N S Rickard 2007 New perspectives on the mechanisms through

which nitric oxide may affect learning and memory processes Neurosci

Biobehav Rev v 31 p 413-25

El-Husseini A E E Schnell D M Chetkovich R A Nicoll and D S Bredt 2000

PSD-95 involvement in maturation of excitatory synapses Science v 290 p

1364-8

Etherton M C Foumlldy M Sharma K Tabuchi X Liu M Shamloo R C Malenka

and T C Suumldhof 2011 Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation

differentially alters hippocampal and cortical synaptic function Proc Natl Acad

Sci U S A v 108 p 13764-9

Feil S P Zimmermann A Knorn S Brummer J Schlossmann F Hofmann and R

Feil 2005 Distribution of cGMP-dependent protein kinase type I and its

isoforms in the mouse brain and retina Neuroscience v 135 p 863-8

Fellin T O Pascual S Gobbo T Pozzan P G Haydon and G Carmignoto 2004

Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of

extrasynaptic NMDA receptors Neuron v 43 p 729-43

Freund J A M Brandmaier L Lewejohann I Kirste M Kritzler A Kruumlger N

Sachser U Lindenberger and G Kempermann 2013 Emergence of

individuality in genetically identical mice Science v 340 p 756-9

Freund T F 2003 Interneuron Diversity series Rhythm and mood in perisomatic

inhibition Trends Neurosci v 26 p 489-95

Freund T F and M Antal 1988 GABA-containing neurons in the septum control

inhibitory interneurons in the hippocampus Nature v 336 p 170-3

Freund T F and G Buzsaacuteki 1996 Interneurons of the hippocampus Hippocampus v

6 p 347-470

Freund T F and A I Gulyaacutes 1997 Inhibitory control of GABAergic interneurons in

the hippocampus Can J Physiol Pharmacol v 75 p 479-87

Freund T F and I Katona 2007 Perisomatic inhibition Neuron v 56 p 33-42

128

Friebe A E Mergia O Dangel A Lange and D Koesling 2007 Fatal

gastrointestinal obstruction and hypertension in mice lacking nitric oxide-

sensitive guanylyl cyclase Proc Natl Acad Sci U S A v 104 p 7699-704

Fuentealba P R Begum M Capogna S Jinno L F Maacuterton J Csicsvari A

Thomson P Somogyi and T Klausberger 2008 Ivy cells a population of

nitric-oxide-producing slow-spiking GABAergic neurons and their involvement

in hippocampal network activity Neuron v 57 p 917-29

Fukaya M A Kato C Lovett S Tonegawa and M Watanabe 2003 Retention of

NMDA receptor NR2 subunits in the lumen of endoplasmic reticulum in

targeted NR1 knockout mice Proc Natl Acad Sci U S A v 100 p 4855-60

Foumlrstermann U H H Schmidt J S Pollock H Sheng J A Mitchell T D Warner

M Nakane and F Murad 1991 Isoforms of nitric oxide synthase

Characterization and purification from different cell types Biochem Pharmacol

v 42 p 1849-57

Garthwaite J 2008 Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission Eur J

Neurosci v 27 p 2783-802

Garthwaite J G Garthwaite R Palmer and S Moncada 1989 NMDA receptor

activation induces nitric oxide synthesis from arginine in rat brain slices Eur J

Pharmacol v 172 p 413-6

Gibb B J and J Garthwaite 2001 Subunits of the nitric oxide receptor soluble

guanylyl cyclase expressed in rat brain Eur J Neurosci v 13 p 539-44

Goebel-Goody S M K D Davies R M Alvestad Linger R K Freund and M D

Browning 2009 Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-

aspartate receptors in adult hippocampal slices Neuroscience v 158 p 1446-

59

Gulyaacutes A I R Miles A Siacutek K Toacuteth N Tamamaki and T F Freund 1993

Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release

site Nature v 366 p 683-7

Gundersen V A Holten and J Storm-Mathisen 2004 GABAergic synapses in

hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors quantitative

immunogold evidence for co-transmission Mol Cell Neurosci v 26 p 156-65

129

Hall C and J Garthwaite 2009 What is the real physiological NO concentration in

vivo Nitric Oxide v 21 p 92-103

Hardingham G E and H Bading 2003 The Yin and Yang of NMDA receptor

signalling Trends Neurosci v 26 p 81-9

Harris A Z and D L Pettit 2007 Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form

stable and uniform pools in rat hippocampal slices J Physiol v 584 p 509-19

Hawkins R D H Son and O Arancio 1998 Nitric oxide as a retrograde messenger

during long-term potentiation in hippocampus Prog Brain Res v 118 p 155-

72

Hirao K Y Hata N Ide M Takeuchi M Irie I Yao M Deguchi A Toyoda T

Sudhof and Y Takai 1998 A novel multiple PDZ domain-containing molecule

interacting with N-methyl-D-aspartate receptors and neuronal cell adhesion

proteins J Biol Chem v 273 p 21105-10

Hu J and E E el-Fakahany 1993 Role of intercellular and intracellular

communication by nitric oxide in coupling of muscarinic receptors to activation

of guanylate cyclase in neuronal cells J Neurochem v 61 p 578-85

Hunt D L and P E Castillo 2012 Synaptic plasticity of NMDA receptors

mechanisms and functional implications Curr Opin Neurobiol v 22 p 496-

508

Haacutejos N I Katona S S Naiem K MacKie C Ledent I Mody and T F Freund

2000 Cannabinoids inhibit hippocampal GABAergic transmission and network

oscillations Eur J Neurosci v 12 p 3239-49

Haacutejos N J Paacutelhalmi E O Mann B Neacutemeth O Paulsen and T F Freund 2004

Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal

gamma oscillations in vitro J Neurosci v 24 p 9127-37

Iino M 2006 Ca2+-dependent inositol 145-trisphosphate and nitric oxide signaling

in cerebellar neurons J Pharmacol Sci v 100 p 538-44

Ito I K Futai H Katagiri M Watanabe K Sakimura M Mishina and H Sugiyama

1997 Synapse-selective impairment of NMDA receptor functions in mice

lacking NMDA receptor epsilon 1 or epsilon 2 subunit J Physiol v 500 ( Pt 2)

p 401-8

130

Iwasato T A Datwani A Wolf H Nishiyama Y Taguchi S Tonegawa T Knoumlpfel

R Erzurumlu and S Itohara 2000 Cortex-restricted disruption of NMDAR1

impairs neuronal patterns in the barrel cortex Nature v 406 p 726-31

Jinno S and T Kosaka 2000 Colocalization of parvalbumin and somatostatin-like

immunoreactivity in the mouse hippocampus quantitative analysis with optical

dissector J Comp Neurol v 428 p 377-88

Jinno S and T Kosaka 2002 Patterns of expression of calcium binding proteins and

neuronal nitric oxide synthase in different populations of hippocampal

GABAergic neurons in mice J Comp Neurol v 449 p 1-25

Jinno S and T Kosaka 2004 Patterns of colocalization of neuronal nitric oxide

synthase and somatostatin-like immunoreactivity in the mouse hippocampus

quantitative analysis with optical disector Neuroscience v 124 p 797-808

Jinno S and T Kosaka 2006 Cellular architecture of the mouse hippocampus a

quantitative aspect of chemically defined GABAergic neurons with stereology

Neurosci Res v 56 p 229-45

Kaacuteli Sz eacutes Acsaacutedy L A hippocampuszfuumlggő memoacuteria neurobioloacutegiai alapjai In Pleacuteh

Cs-Kovaacutecs Gy-Gulyaacutes B (szerk) Kognitiacutev Igedtudomaacuteny Osiris Kiadoacute

Budapest 2003 360-384

Kang J L Jiang S Goldman and M Nedergaard 1998 Astrocyte-mediated

potentiation of inhibitory synaptic transmission Nat Neurosci v 1 p 683-92

Kano M T Ohno-Shosaku Y Hashimotodani M Uchigashima and M Watanabe

2009 Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission Physiol Rev

v 89 p 309-80

Kasugai Y J D Swinny J D B Roberts Y Dalezios Y Fukazawa W Sieghart R

Shigemoto and P Somogyi 2010 Quantitative localisation of synaptic and

extrasynaptic GABAA receptor subunits on hippocampal pyramidal cells by

freeze-fracture replica immunolabelling European Journal of Neuroscience

Katona I and T F Freund 2008 Endocannabinoid signaling as a synaptic circuit

breaker in neurological disease Nat Med v 14 p 923-30

Katona I B Sperlaacutegh A Siacutek A Kaumlfalvi E S Vizi K Mackie and T F Freund

1999 Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA

131

release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J Neurosci v

19 p 4544-58

Katona I G M Urbaacuten M Wallace C Ledent K M Jung D Piomelli K Mackie

and T F Freund 2006 Molecular composition of the endocannabinoid system

at glutamatergic synapses J Neurosci v 26 p 5628-37

Kennedy M B 2000 Signal-processing machines at the postsynaptic density Science

v 290 p 750-4

Kingston P A F Zufall and C J Barnstable 1996 Rat hippocampal neurons express

genes for both rod retinal and olfactory cyclic nucleotide-gated channels novel

targets for cAMPcGMP function Proc Natl Acad Sci U S A v 93 p 10440-5

Kittler J T I L Arancibia-Carcamo and S J Moss 2004 Association of GRIP1 with

a GABA(A) receptor associated protein suggests a role for GRIP1 at inhibitory

synapses Biochem Pharmacol v 68 p 1649-54

Klausberger T L F Marton J ONeill J H Huck Y Dalezios P Fuentealba W Y

Suen E Papp T Kaneko M Watanabe J Csicsvari and P Somogyi 2005

Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing

GABAergic neurons in hippocampal network oscillations J Neurosci v 25 p

9782-93

Klausberger T and P Somogyi 2008 Neuronal diversity and temporal dynamics the

unity of hippocampal circuit operations Science v 321 p 53-7

Kleppisch T A Pfeifer P Klatt P Ruth A Montkowski R Faumlssler and F

Hofmann 1999 Long-term potentiation in the hippocampal CA1 region of mice

lacking cGMP-dependent kinases is normal and susceptible to inhibition of

nitric oxide synthase J Neurosci v 19 p 48-55

Klyachko V A G P Ahern and M B Jackson 2001 cGMP-mediated facilitation in

nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization Neuron v

31 p 1015-25

Kobiałka M and W A Gorczyca 2000 Particulate guanylyl cyclases multiple

mechanisms of activation Acta Biochim Pol v 47 p 517-28

Koesling D M Russwurm E Mergia F Mullershausen and A Friebe 2004 Nitric

oxide-sensitive guanylyl cyclase structure and regulation Neurochem Int v 45

p 813-9

132

Kosaka T K Kosaka K Tateishi Y Hamaoka N Yanaihara J Y Wu and K

Hama 1985 GABAergic neurons containing CCK-8-like andor VIP-like

immunoreactivities in the rat hippocampus and dentate gyrus J Comp Neurol v

239 p 420-30

Kraus M M and H Prast 2002 Involvement of nitric oxide cyclic GMP and

phosphodiesterase 5 in excitatory amino acid and GABA release in the nucleus

accumbens evoked by activation of the hippocampal fimbria Neuroscience v

112 p 331-43

Krumenacker J S K A Hanafy and F Murad 2004 Regulation of nitric oxide and

soluble guanylyl cyclase Brain Res Bull v 62 p 505-15

Kaacuteli S and T F Freund 2005 Distinct properties of two major excitatory inputs to

hippocampal pyramidal cells a computational study Eur J Neurosci v 22 p

2027-48

Koumlhr G 2006 NMDA receptor function subunit composition versus spatial

distribution Cell Tissue Res v 326 p 439-46

Lau C G and R S Zukin 2007 NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and

neuropsychiatric disorders Nat Rev Neurosci v 8 p 413-26

Laube B J Kuhse and H Betz 1998 Evidence for a tetrameric structure of

recombinant NMDA receptors J Neurosci v 18 p 2954-61

Lauri S E Z A Bortolotto D Bleakman P L Ornstein D Lodge J T Isaac and G

L Collingridge 2001 A critical role of a facilitatory presynaptic kainate

receptor in mossy fiber LTP Neuron v 32 p 697-709

Ledo A J Frade R Barbosa and J Laranjinha 2004 Nitric oxide in brain diffusion

targets and concentration dynamics in hippocampal subregions Mol Aspects

Med v 25 p 75-89

Lee S and J Stull 1998 Calmodulin-dependent regulation of inducible and neuronal

nitric-oxide synthase J Biol Chem v 273 p 27430-7

Levey A I 1996 Muscarinic acetylcholine receptor expression in memory circuits

implications for treatment of Alzheimer disease Proc Natl Acad Sci U S A v

93 p 13541-6

Levey A I S M Edmunds V Koliatsos R G Wiley and C J Heilman 1995

Expression of m1-m4 muscarinic acetylcholine receptor proteins in rat

133

hippocampus and regulation by cholinergic innervation J Neurosci v 15 p

4077-92

Li D P S R Chen T F Finnegan and H L Pan 2004 Signalling pathway of nitric

oxide in synaptic GABA release in the rat paraventricular nucleus J Physiol v

554 p 100-10

Lorente de Noacute R (1934) Studies on the structure of the cerebral cortex ndash II

Continuation of the study of the ammonic system J Psychol Neurol 46113-177

Lourenccedilo J A Cannich M Carta F Coussen C Mulle and G Marsicano 2010

Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at

GABAergic synapses Nat Neurosci v 13 p 197-204

Lovick T L Brown and B Key 1999 Neurovascular relationships in hippocampal

slices physiological and anatomical studies of mechanisms underlying flow-

metabolism coupling in intraparenchymal microvessels Neuroscience v 92 p

47-60

Lujaacuten R J D Roberts R Shigemoto H Ohishi and P Somogyi 1997 Differential

plasma membrane distribution of metabotropic glutamate receptors mGluR1

alpha mGluR2 and mGluR5 relative to neurotransmitter release sites J Chem

Neuroanat v 13 p 219-41

Loumlrincz A T Notomi G Tamaacutes R Shigemoto and Z Nusser 2002 Polarized and

compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites Nat

Neurosci v 5 p 1185-93

Maccaferri G and C J McBain 1996 The hyperpolarization-activated current (Ih)

and its contribution to pacemaker activity in rat CA1 hippocampal stratum

oriens-alveus interneurones J Physiol v 497 ( Pt 1) p 119-30

Magee J D Hoffman C Colbert and D Johnston 1998 Electrical and calcium

signaling in dendrites of hippocampal pyramidal neurons Annu Rev Physiol v

60 p 327-46

Makara J I Katona G Nyiacuteri B Neacutemeth C Ledent M Watanabe J de Vente T

Freund and N Haacutejos 2007 Involvement of nitric oxide in depolarization-

induced suppression of inhibition in hippocampal pyramidal cells during

activation of cholinergic receptors J Neurosci v 27 p 10211-22

134

Makhinson M P Opazo H J Carlisle B Godsil S G Grant and T J ODell 2006

A novel role for cyclic guanosine 35monophosphate signaling in synaptic

plasticity a selective suppressor of protein kinase A-dependent forms of long-

term potentiation Neuroscience v 140 p 415-31

Mathes C and S H Thompson 1996 The nitric oxidecGMP pathway couples

muscarinic receptors to the activation of Ca2+ influx J Neurosci v 16 p 1702-

9

Megiacuteas M Z Emri T F Freund and A I Gulyaacutes 2001 Total number and

distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1

pyramidal cells Neuroscience v 102 p 527-40

Mergia E A Friebe O Dangel M Russwurm and D Koesling 2006 Spare guanylyl

cyclase NO receptors ensure high NO sensitivity in the vascular system J Clin

Invest v 116 p 1731-7

Miyaji T N Echigo M Hiasa S Senoh H Omote and Y Moriyama 2008

Identification of a vesicular aspartate transporter Proc Natl Acad Sci U S A v

105 p 11720-4

Monaghan D and C Cotman 1985 Distribution of N-methyl-D-aspartate-sensitive L-

[3H]glutamate-binding sites in rat brain J Neurosci v 5 p 2909-19

Monfort P M D Muntildeoz E Kosenko and V Felipo 2002 Long-term potentiation in

hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase

cGMP-dependent protein kinase and cGMP-degrading phosphodiesterase J

Neurosci v 22 p 10116-22

Monyer H R Sprengel R Schoepfer A Herb M Higuchi H Lomeli N Burnashev

B Sakmann and P Seeburg 1992 Heteromeric NMDA receptors molecular

and functional distinction of subtypes Science v 256 p 1217-21

Muir J I L Arancibia-Carcamo A F MacAskill K R Smith L D Griffin and J T

Kittler 2010 NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and

clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the γ2 subunit Proc Natl

Acad Sci U S A v 107 p 16679-84

Muumlller B M U Kistner R W Veh C Cases-Langhoff B Becker E D

Gundelfinger and C C Garner 1995 Molecular characterization and spatial

distribution of SAP97 a novel presynaptic protein homologous to SAP90 and

135

the Drosophila discs-large tumor suppressor protein J Neurosci v 15 p 2354-

66

Namiki S S Kakizawa K Hirose and M Iino 2005 NO signalling decodes

frequency of neuronal activity and generates synapse-specific plasticity in

mouse cerebellum J Physiol v 566 p 849-63

Nicoll R A and K W Roche 2013 Long-term potentiation Peeling the onion

Neuropharmacology

Noh J R Seal J Garver R Edwards and K Kandler 2010 Glutamate co-release at

GABAglycinergic synapses is crucial for the refinement of an inhibitory map

Nat Neurosci v 13 p 232-8

Nyilas R B Dudok G M Urbaacuten K Mackie M Watanabe B F Cravatt T F

Freund and I Katona 2008 Enzymatic machinery for endocannabinoid

biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J

Neurosci v 28 p 1058-63

Nyiacuteri G C Csereacutep E Szabadits K Mackie and T Freund 2005 CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience v 136 p 811-22

Nyiacuteri G T Freund and P Somogyi 2001 Input-dependent synaptic targeting of

alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal

pyramidal cells of the rat Eur J Neurosci v 13 p 428-42

Ohno-Shosaku T Y Hashimotodani M Ano S Takeda H Tsubokawa and M

Kano 2007 Endocannabinoid signalling triggered by NMDA receptor-mediated

calcium entry into rat hippocampal neurons J Physiol v 584 p 407-18

Ohno-Shosaku T S Sawada and M Kano 2000 Heterosynaptic expression of

depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) in rat hippocampal

cultures Neurosci Res v 36 p 67-71

Ozaki M I Shibuya N Kabashima T Isse J Noguchi Y Ueta Y Inoue A

Shigematsu and H Yamashita 2000 Preferential potentiation by nitric oxide of

spontaneous inhibitory postsynaptic currents in rat supraoptic neurones J

Neuroendocrinol v 12 p 273-81

Paoletti P 2011 Molecular basis of NMDA receptor functional diversity Eur J

Neurosci v 33 p 1351-65

136

Papadia S and G E Hardingham 2007 The dichotomy of NMDA receptor signaling

Neuroscientist v 13 p 572-9

Pifarreacute P A Garciacutea and G Mengod 2007 Species differences in the localization of

soluble guanylyl cyclase subunits in monkey and rat brain J Comp Neurol v

500 p 942-57

Prast H and A Philippu 2001 Nitric oxide as modulator of neuronal function Prog

Neurobiol v 64 p 51-68

Peacuterez-Otantildeo I and M D Ehlers 2004 Learning from NMDA receptor trafficking

clues to the development and maturation of glutamatergic synapses

Neurosignals v 13 p 175-89

OrsquoKeefe J Nadel L The Hippocampus as a Cognitive Map Oxford University Press

1978103-140

Racca C F Stephenson P Streit J Roberts and P Somogyi 2000 NMDA receptor

content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area J

Neurosci v 20 p 2512-22

Ramoacuten y Cajal S (1893) Estructura del asta de Ammon y fascia dentata Ann Soc Esp

Hist Nat 22

Ramoacuten y Cajal S (1911) Histologie de systeme nerveux de IrsquoHomme et des vertebres

tomme II Paris Malonie

Riou M D Stroebel J M Edwardson and P Paoletti 2012 An alternating GluN1-2-

1-2 subunit arrangement in mature NMDA receptors PLoS One v 7 p e35134

Rozen S and H Skaletsky 2000 Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers Methods Mol Biol v 132 p 365-86

Roumlhlich Paacutel Szoumlvettan Semmelweis Kiadoacute 2006

Russwurm M S Behrends C Harteneck and D Koesling 1998 Functional

properties of a naturally occurring isoform of soluble guanylyl cyclase Biochem

J v 335 ( Pt 1) p 125-30

Russwurm M and D Koesling 2002 Isoforms of NO-sensitive guanylyl cyclase Mol

Cell Biochem v 230 p 159-64

Russwurm M N Wittau and D Koesling 2001 Guanylyl cyclasePSD-95

interaction targeting of the nitric oxide-sensitive alpha2beta1 guanylyl cyclase

to synaptic membranes J Biol Chem v 276 p 44647-52

137

Ryan T J R D Emes S G Grant and N H Komiyama 2008 Evolution of NMDA

receptor cytoplasmic interaction domains implications for organisation of

synaptic signalling complexes BMC Neurosci v 9 p 6

Schelshorn D W A Schneider W Kuschinsky D Weber C Kruumlger T Dittgen H

F Buumlrgers F Sabouri N Gassler A Bach and M H Maurer 2009

Expression of hemoglobin in rodent neurons J Cereb Blood Flow Metab v 29

p 585-95

Schlossmann J and F Hofmann 2005 cGMP-dependent protein kinases in drug

discovery Drug Discov Today v 10 p 627-34

Schnell S A W A Staines and M W Wessendorf 1999 Reduction of lipofuscin-

like autofluorescence in fluorescently labeled tissue J Histochem Cytochem v

47 p 719-30

Seress L H Abrahaacutem A Hajnal H Lin and S Totterdell 2005 NOS-positive local

circuit neurons are exclusively axo-dendritic cells both in the neo- and archi-

cortex of the rat brain Brain Res v 1056 p 183-90

Sik A M Penttonen A Ylinen and G Buzsaacuteki 1995 Hippocampal CA1

interneurons an in vivo intracellular labeling study J Neurosci v 15 p 6651-

65

Sik A A Ylinen M Penttonen and G Buzsaacuteki 1994 Inhibitory CA1-CA3-hilar

region feedback in the hippocampus Science v 265 p 1722-4

Sobolevsky A I M P Rosconi and E Gouaux 2009 X-ray structure symmetry and

mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor Nature v 462 p 745-56

Somogyi J A Baude Y Omori H Shimizu S El Mestikawy M Fukaya R

Shigemoto M Watanabe and P Somogyi 2004 GABAergic basket cells

expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3

(VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat

Eur J Neurosci v 19 p 552-69

Standaert D G G B Landwehrmeyer J A Kerner J B Penney and A B Young

1996 Expression of NMDAR2D glutamate receptor subunit mRNA in

neurochemically identified interneurons in the rat neostriatum neocortex and

hippocampus Brain Res Mol Brain Res v 42 p 89-102

138

Stuehr D J Santolini Z Wang C Wei and S Adak 2004 Update on mechanism

and catalytic regulation in the NO synthases J Biol Chem v 279 p 36167-70

Sumita K Y Sato J Iida A Kawata M Hamano S Hirabayashi K Ohno E Peles

and Y Hata 2007 Synaptic scaffolding molecule (S-SCAM) membrane-

associated guanylate kinase with inverted organization (MAGI)-2 is associated

with cell adhesion molecules at inhibitory synapses in rat hippocampal neurons

J Neurochem v 100 p 154-66

Swanwick C M Shapiro Z Yi K Chang and R Wenthold 2009 NMDA receptors

interact with flotillin-1 and -2 lipid raft-associated proteins FEBS Lett v 583

p 1226-30

Tabuchi K J Blundell M R Etherton R E Hammer X Liu C M Powell and T

C Suumldhof 2007 A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases

inhibitory synaptic transmission in mice Science v 318 p 71-6

Takahashi H and J Magee 2009 Pathway interactions and synaptic plasticity in the

dendritic tuft regions of CA1 pyramidal neurons Neuron v 62 p 102-11

Tamaacutes G A Lorincz A Simon and J Szabadics 2003 Identified sources and targets

of slow inhibition in the neocortex Science v 299 p 1902-5

Tanaka J M Markerink-van Ittersum H Steinbusch and J De Vente 1997 Nitric

oxide-mediated cGMP synthesis in oligodendrocytes in the developing rat

brain Glia v 19 p 286-97

Tao H W and M Poo 2001 Retrograde signaling at central synapses Proc Natl Acad

Sci U S A v 98 p 11009-15

Taqatqeh F E Mergia A Neitz U Eysel D Koesling and T Mittmann 2009 More

than a retrograde messenger nitric oxide needs two cGMP pathways to induce

hippocampal long-term potentiation J Neurosci v 29 p 9344-50

Teunissen C H Steinbusch M Markerink-van Ittersum D Koesling and J de Vente

2001 Presence of soluble and particulate guanylyl cyclase in the same

hippocampal astrocytes Brain Res v 891 p 206-12

Tochio H Y K Mok Q Zhang H M Kan D S Bredt and M Zhang 2000

Formation of nNOSPSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger

structure from the nNOS PDZ domain J Mol Biol v 303 p 359-70

139

Toth K G Suares J J Lawrence E Philips-Tansey and C J McBain 2000

Differential mechanisms of transmission at three types of mossy fiber synapse J

Neurosci v 20 p 8279-89

Tovar K and G Westbrook 2002 Mobile NMDA receptors at hippocampal

synapses Neuron v 34 p 255-64

Toacuteth K Z Borhegyi and T F Freund 1993 Postsynaptic targets of GABAergic

hippocampal neurons in the medial septum-diagonal band of broca complex J

Neurosci v 13 p 3712-24

Valtschanoff J G and R J Weinberg 2001 Laminar organization of the NMDA

receptor complex within the postsynaptic density J Neurosci v 21 p 1211-7

Van Staveren W C H W Steinbusch M Markerink-Van Ittersum D R Repaske

M F Goy J Kotera K Omori J A Beavo and J De Vente 2003 mRNA

expression patterns of the cGMP-hydrolyzing phosphodiesterases types 2 5 and

9 during development of the rat brain J Comp Neurol v 467 p 566-80

Vruwink M H H Schmidt R J Weinberg and A Burette 2001 Substance P and

nitric oxide signaling in cerebral cortex anatomical evidence for reciprocal

signaling between two classes of interneurons J Comp Neurol v 441 p 288-

301

Wang J and R S Zucker 2001 Photolysis-induced suppression of inhibition in rat

hippocampal CA1 pyramidal neurons J Physiol v 533 p 757-63

Watanabe M M Fukaya K Sakimura T Manabe M Mishina and Y Inoue 1998

Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum

(mossy fibre-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield Eur J

Neurosci v 10 p 478-87

Watanabe M Y Inoue K Sakimura and M Mishina 1993 Distinct distributions of

five N-methyl-D-aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J

Comp Neurol v 338 p 377-90

Wendland B F E Schweizer T A Ryan M Nakane F Murad R H Scheller and

R W Tsien 1994 Existence of nitric oxide synthase in rat hippocampal

pyramidal cells Proc Natl Acad Sci U S A v 91 p 2151-5

Wilson R I and R A Nicoll 2001 Endogenous cannabinoids mediate retrograde

signalling at hippocampal synapses Nature v 410 p 588-92

140

Wood K C A M Batchelor K Bartus K L Harris G Garthwaite J Vernon and J

Garthwaite 2011 Picomolar nitric oxide signals from central neurons recorded

using ultrasensitive detector cells J Biol Chem v 286 p 43172-81

Xu J R Chen J Zhang and C Chen 2010 Endocannabinoids differentially modulate

synaptic plasticity in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons PLoS One v 5

p e10306

Yamasaki M M Matsui and M Watanabe 2010 Preferential localization of

muscarinic M1 receptor on dendritic shaft and spine of cortical pyramidal cells

and its anatomical evidence for volume transmission J Neurosci v 30 p 4408-

18

Zhang X L Z Y Zhou J Winterer W Muumlller and P K Stanton 2006 NMDA-

dependent but not group I metabotropic glutamate receptor-dependent long-

term depression at Schaffer collateral-CA1 synapses is associated with long-

term reduction of release from the rapidly recycling presynaptic vesicle pool J

Neurosci v 26 p 10270-80

141

XI SAJAacuteT KOumlZLEMEacuteNYEK JEGYZEacuteKE

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent első szerzős koumlzlemeacutenyek

Szabadits E Csereacutep C Szőnyi A Fukazawa Y Shigemoto R Watanabe M Itohara

S Freund TF and Nyiri G (2011) NMDA receptors in hippocampal

GABAergic synapses and their role in nitric oxide signaling J Neurosci

31(16)5893-5904

Szabadits E Csereacutep C Ludaacutenyi A Katona I Gracia-Llanes J Freund TF Nyiacuteri G

(2007) Hippocampal GABAergic synapses possess the molecular machinery for

retrograde nitric oxide signaling J Neurosci 27(30)8101-11 Megosztott

elsőszerzőseacuteg

Az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent nem első szerzős koumlzlemeacutenyek

Csereacutep C Szabadits E Szőnyi A Watanabe M Freund TF Nyiri G (2012) NMDA

Receptors in GABAergic Synapses during Postnatal Development PLoS ONE

7(5)e37753

Csereacutep C Szőnyi A Veres JM Neacutemeth B Szabadits E de Vente J Haacutejos N Freund

TF and Nyiri G (2011) Nitric oxide signaling modulates synaptic transmission

during early postnatal development Cerebral Cortex 212065-2074

Egyeacuteb ndash nem az eacutertekezeacutes teacutemaacutejaacuteban megjelent ndash koumlzlemeacutenyek

Nyiri G Cserep C Szabadits E Mackie K Freund TF (2005) CB1 cannabinoid

receptors are enriched in the perisynaptic annulus and on preterminal segments

of hippocampal GABAergic axons Neuroscience 136(3)811-22

Nyiri G Szabadits E Cserep C Mackie K Shigemoto R Freund TF (2005) GABA(B)

and CB1 cannabinoid receptor expression identifies two types of septal

cholinergic neurons Eur J Neurosci 213034-3042

142

XII KOumlSZOumlNETNYILVAacuteNIacuteTAacuteS

Szeretneacutem megkoumlszoumlnni a kitartoacute taacutemogataacutest eacutes a segiacutetseacuteget eacutedesanyaacutemnak

nagymamaacutemnak eacutes feacuterjemnek mert neacutelkuumlluumlk nem joumlhetett volna leacutetre ez az eacutertekezeacutes

A tudomaacutenyos munkaacuteval kapcsolatos szemleacuteletbeli eacutes moraacutelis neveleacutest eacutes hasznos

tudomaacutenyos tanaacutecsaikat nagyon koumlszoumlnoumlm Prof Freund Tamaacutes laborvezetőnek eacutes Dr

Nyiri Gaacutebor teacutemavezetőmnek Ezenkiacutevuumll szeretneacutem megkoumlszoumlnni az Agykeacutereg

kutatoacutecsoport minden tagjaacutenak a sok eacuteves segiacutetseacuteget eacutes hogy emberileg is olyan

koumlrnyezetben dolgozhattam ami azt gondolom paacuteratlan