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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE FSICA DE SO CARLOS
NIRTON CRISTI SILVA VIEIRA
Sensores e biossensores baseados em
transistores de efeito de campo utilizando
filmes automontados nanoestruturados
So Carlos
2012
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NIRTON CRISTI SILVA VIEIRA
Sensores e biossensores baseados em
transistores de efeito de campo utilizando
filmes automontados nanoestruturados
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Fsica do Instituto de Fsica de So Carlos da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.
rea de Concentrao: Fsica Aplicada
Orientador: Prof. Francisco Eduardo
Gontijo Guimares
Verso Corrigida
(Verso original disponvel na Unidade que aloja o Programa)
So Carlos
2012
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AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio de Biblioteca e Informao do IFSC, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Vieira, Nirton Cristi Silva
Sensores e biossensores baseados em transistores de efeito de campo utilizando filmes automontados nanoestruturados / Nirton Cristi Silva Vieira; orientador Francisco Eduardo Gontijo Guimares - verso corrigida -- So Carlos, 2012.
120 p. Tese (Doutorado - Programa de Ps-Graduao em
Fsica Aplicada) -- Instituto de Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo, 2012.
1. Fsica de materiais e dispositivos semicondutores. 2. Biossensores. 3. Filmes automontados. I. Guimares , Francisco Eduardo Gontijo, orient. II. Ttulo.
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Dedico esta tese aos meus pais: Antnio E. Vieira (Toninho) e Leila A. S Vieira. Dois
grandes guerreiros e incentivadores de todos os meus sonhos!
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AGRADECIMENTOS
Aproveito a oportunidade para agradecer aqueles que, passando por minha vida, tornaram
possvel a realizao deste trabalho. A todos, meu muito obrigado!
A Exu, senhor e guardio dos caminhos, que os abriu para que tudo comeasse, sobretudo
esse trabalho.
A todos os Orixs: Ogum, Oxssi, Omolu, Ossain, Osumar, Nan, Oxum, Ob, Iyew, Oy,
Logun, Ayr, Iemanj, Xango, Ibeji, Irko, Oxal (e a outros que possa ter esquecido) por me
derem sade e fora de vontade para vencer todos os meus obstculos.
Ao Ser Supremo, cheio de bondade que me deu vida.
minha av que sempre me deu carinho e amor, e nada me cobrou a no ser um dia o retorno
para casa.
Ao meu pai Toninho, exemplo de carter e dedicao, que desde cedo me mostrou a nobreza
do trabalho. Voc pode no ter estudado como muitos, mas o senhor sempre ser meu doutor
na arte da vida!
minha me Leila, por toda a sua dedicao e carinho. Me, a senhora sem dvida se
esforou o mximo para nos criar, sempre lutando para nos proporcionar as melhores
oportunidades.
minha irm Vanessa, pelo carinho, amor e compreenso. Valeu mana! Nunca me
esquecerei de que em dias difceis voc abdicou de um ano de sua vida escolar em prol de
meus estudos.
minha Tia Llian pelo amor, carinho e pacincia em minha criao, principalmente na
infncia.
Kssia e Rosngela pelo carinho, pacincia e por participar de minha criao.
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A todos os meus familiares, sobretudo a Kelly, Ketinha, Kimberly, Manu, Jlia, Cheron, Tio
Joo, pelo carinho e grande apoio.
Minha namorada Maria Gabriela, pelo amor, carinho e compreenso nos momentos
difceis. Valeu linda!
Ao grande amigo Jos dos Reis que teve a coragem (rsrsrs) de ser meu fiador durante a
graduao. Cara, sem voc tudo ia parar ali. Valeu mesmo!
Aos todos os meus professores, desde as Tias Beatriz e Ana Maria, minhas primeiras
professoras.
Aos colegas do ensino fundamental, mdio, graduao e ps-graduao pelos momentos
agradveis que nunca mais voltaro, a no ser na lembrana.
Aos professores e amigos Carlos Bernardes e Piotr Trzesniak, pelo incentivo, amizade e por
todos os conselhos desde a graduao. Valeu pessoal! Tudo comeou com incentivo de vocs.
Ao professor Dr. Francisco Eduardo Gontijo Guimares. Muito obrigado por sua orientao
acadmica, amizade, pacincia e por dividir comigo essa jornada. Aprendi muito nesse
perodo.
Aos demais professores do IFSC que contriburam direta ou indiretamente com esse trabalho,
em especial ao professor Dr. Valtencir Zucolotto, pela pacincia nas discusses sobre a tese e
trabalhos cientficos, o que contribui muito com minha formao.
Ao professor Dr. Valmor Mastelaro e seu aluno de Dr. Waldir Avansi do grupo de
Crescimento de Cristais e Materiais Cermicos do IFSC-USP, por ceder as amostras de
pentxido de vandio.
Ao professor Dr. Ernesto Chaves Pereira da UFSCAR por permitir a utilizao de seu
laboratrio.
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Aos amigos da repblica Nego Teia ou Casa das lamentaes (hehehe!): Vivas, Edson,
Alfredo, Aldo, Douglas e DJ J, por dividirem momentos inesquecveis de convivncia.
Quantas histrias esse convvio nos proporcionou e ainda proporcionar. Foi um prazer fazer
parte da vida de vocs!
Aos colegas de sala que se tornaram grandes amigos: Mike, Angelo, Fernando, Gustavo,
Moema e Kleber, pela grande amizade e por dividirem comigo o conhecimento e vrias
histrias durante todo esse tempo.
minha primeira aluna de iniciao, Alessandra Figueiredo, exemplo de dedicao, presteza,
colaborao, amizade e boa convivncia.
Aos colegas do IFSC: Washington, Alexandre Maciel, Bruno, Chico, Waldir, Gabriela,
Rodrigo (Jesus), Dilleys e outros que possa ter esquecido.
Aos amigos do Grupo de Fotnica, Jonathas e pH (Paulo Henrique). Medi voc muito nessa
tese cara (rsrsrs)!
Aos demais colegas do grupo de alunos e ex-alunos do professor Chico: Tsutae, Danilo,
Regina, Vitor, Aroldo, Francisco, Celio Borges, Patrcia, Dani e Borrero, que compartilharam
comigo aprendizado e diversas comemoraes.
Ao Gustavo nunca vai, quando vai no toca por me ajudar a terminar a tese colocando o
ponto final (kkkkk).
Aos tcnicos do grupo de Semicondutores, Aroldo e Carlo e aos tcnicos do grupo Polmeros
Nbio e Bertho, que sempre estiveram dispostos a ajudar, ensinar e contribuir de forma
significante para esse trabalho. Tambm pelas discusses futebolsticas ao longo desses anos.
secretaria de ps-graduao do IFSC, pela competncia, bom atendimento e cordialidade.
Ao secretrio do grupo de Semicondutores, Daniel, e s secretrias do grupo de Polmeros R
e Simone pela cordialidade e auxlio.
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s bibliotecrias do IFSC, principalmente a Neusa, pela cordialidade e pelo grande auxlio na
correo da tese de forma rpida e eficiente.
Ao CNPq, pelo suporte financeiro.
Por fim, a todos que, com seus conhecimentos, incentivos e crticas colaboraram para o
desenvolvimento desse trabalho.
Valeu!
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O Candombl sobrevive at hoje porque no quer convencer as pessoas de uma verdade absoluta, ao contrrio da maioria das religies. (Pierre Fatumbi Verger)
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RESUMO
NIRTON, N. C. S. Sensores e biossensores baseados em transistores de feito de campo
utilizando filmes automontados nanoestruturados. 2011. 120p. Tese (Doutorado em Cincias)
Instituto de Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo. So Carlos, 2011.
O transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET) um dispositivo
alternativo ao tradicional transistor de efeito de campo seletivo a ons (ISFET). A grande
vantagem desse dispositivo se refere ao seu fcil processamento, ou seja, se restringe somente
a manipulao do eletrodo de porta, evitando processos convencionais de microeletrnica.
Neste sentido, sensores inicos e biossensores podem ser facilmente implementados
combinando materiais de reconhecimento qumico e/ou biolgico. Por sua vez, a tcnica de
fabricao de filmes finos camada por camada (layer-by-layer, LbL) se mostra verstil para
manipulao de diversos tipos de materiais em nvel molecular. Materiais orgnicos e
inorgnicos podem ser automontados em substratos slidos por meio da simples adsoro
eletrosttica formando compsitos com propriedades nicas com o objetivo de serem
aplicados em sensores ou biossensores. Neste trabalho, o conceito de dispositivo SEGFET foi
combinado com a tcnica LbL por meio da manipulao de materiais orgnicos
(polieletrlitos, dendrmeros e polianilina) e inorgnicos (TiO2 e V2O5) nanoparticulados a
fim de se obter novos sensores de pH e biossensores para a deteco de glicose e uria, dois
importantes analitos de interesse clnico. Numa primeira etapa, diferentes filmes LbL foram
produzidos, caracterizados e testados como camada sensvel (porta estendida) em dispositivos
SEGFETs. Todos os sistemas estudados se mostraram promissores como sensores de pH, ou
seja, com uma sensibilidade prxima do valor terico sugerido pela equao de Nernst (59,15
mV.pH-1
). Esses resultados podem ser atribudos natureza anfotrica do material da ltima
camada no filme LbL. Numa segunda etapa, as enzima glicose oxidase (GOx) e urease foram
convenientemente imobilizadas nos filmes LbL. Pelo fato dessas enzimas gerarem ou
consumirem prtons durante a catlise da reao, os filmes LbL modificados enzimaticamente
foram utilizados em biossensores de glicose e uria, apresentando eficiente deteco. Assim, a
unio de dispositivos SEGFET com a tcnica de automontagem se mostrou promissora para
construo de sensores e biossensores eficientes e de baixo custo.
Palavras chave: Transistor de efeito de campo. Filmes automontados. SEGFET
Nanopartculas. Biossensor.
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ABSTRACT
NIRTON, N. C. S. Sensors and biosensors based on field-effect transistors using
nanostructured self-assembled films. 2011. 120p. Tese (Doutorado em Cincias) Instituto de
Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo. So Carlos, 2011.
Separative extended gate field-effect transistor (SEGFET) device is an alternative to the
conventional ion-sensitive field-effect transistor (ISFET). The great advantage of SEGFET
refers to its easy processing, i.e., it is limited under only manipulation of the gate electrode,
avoiding the conventional microelectronic processes. In this way, ion sensors and biosensors
can be easily implemented combining chemical and/or biological recognition materials. In
turn, the layer-by-layer (LbL) technique shows be versatile for handling various types of
materials at molecular level. In this thesis, the concept of SEGFET device was combined with
the LbL technique through the manipulation of organic (polyelectrolytes, dendrimers and poly
(aniline)) and inorganic materials (TiO2 and V2O5 nanoparticles) in order to get new pH
sensors and biosensors for the detection of glucose and urea, two important analytes of
clinical interest. In a first step, different LbL films were produced, characterized and tested as
the sensitive layer (extended gate) in SEGFETs devices. All studied systems were promissing
as pH sensors, i.e., with a sensitivity close to the theoretical value suggested by Nernst
equation (59.15 mV.pH-1). These results can be attributed to the amphoteric nature of the
material in the last layer of the LbL films. In a second step, glucose oxidase (GOx) and urease
enzymes were conveniently immobilized onto LbL films. Because these enzymes generate or
consume protons during catalysis of the reaction, the enzymatically modified LbL films were
used in biosensors for glucose and urea, with efficient detection. Thus, the union of SEGFET
devices with the LbL technique is promising to building up efficient and low-cost sensors and
biosensors.
Keywords: Field-effect transistor. Self-assembled films. SEGFET. Nanoparticles. Biosensor.
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SUMRIO
1 Introduo ....................................................................... 19
1.1 Proposta da tese ....................................................................................................... 24
2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 27 2.1 O MOSFET e o ISFET .............................................................................................. 27
2.2 O EGFET e o SEGFET ............................................................................................. 32
2.3 O EnFET ................................................................................................................... 35
3 Filmes automontados camada por camada (LbL) ....... 39
3.1 Tcnica de automontagem camada por camada (LbL) .............................................. 39
3.2 Tcnica de automontagem assistida por spin (SA-LbL) ............................................. 41
3.3 Sensores e biossensores de efeito de campo utilizando automontagem ................... 42
4 Materiais e mtodos ....................................................... 45
4.1 Materiais sensveis a ons ......................................................................................... 45
4.1.1 xido de ndio dopado com estanho (ITO) ................................................................ 45
4.1.2 Polianilina nanoparticulada (PANI-N) ........................................................................ 46
4.1.3 Nanopartculas de dixido de titnio (TiO2-Np) .......................................................... 48
4.1.4 Nanoestruturas (1D) de pentxido de vandio (V2O5) ............................................... 48
4.2 Materiais utilizados como contra ons ........................................................................ 49
4.3 Crescimento dos filmes automontados ...................................................................... 50
4.4 As enzimas glicose oxidase e urease ........................................................................ 52
4.4.1 Mtodo de imobilizao enzimtica ........................................................................... 53
4.5 Limpeza dos substratos ............................................................................................ 54
4.6 Tcnicas de caracterizao utilizadas ....................................................................... 54
4.7 Configurao experimental do dispositivo SEGFET .................................................. 55
4.7.1 Calibrao do sistema de medida ............................................................................. 57
5 SEGFET funcionalizado com (PPID/NiTsPc) ................ 61
5.1 Caracterizao dos filmes (PPID/NiTsPc) ................................................................. 61
5.2 Aplicao em sensores de pH ................................................................................... 64
5.3 Aplicao em biossensores de glicose ...................................................................... 66
5.4 Consideraes finais do captulo ............................................................................... 73
6 SEGFET (PVS/PANI-N) ................................................... 75
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6.1 Caracterizao da polianilina..................................................................................... 75
6.2 Caracterizao dos filmes (PVS/PANI-N) .................................................................. 77
6.3 Aplicao em sensores de pH ................................................................................... 79
6.4 Aplicao em biossensores de uria ......................................................................... 82
6.5 Consideraes finais do captulo ............................................................................... 84
7 SEGFET (PPID/TiO2-Np) ................................................. 85
7.1 Caracterizao dos filmes (PPID/TiO2-Np) ................................................................ 85
7.2 Aplicao em sensores de pH ................................................................................... 87
7.3 Aplicao em biossensores de glicose ...................................................................... 90
7.4 Consideraes finais do captulo ............................................................................... 91
8 SEGFET composto por nanoestruturas 1D de
pentxido de vandio ............................................................ 93
8.1 Caracterizao das nanoestruturas ........................................................................... 93
8.2 Aplicao em sensores de pH ................................................................................... 95
8.3 Filmes automontados (PAH/V2O5-nanobastes) ........................................................ 97
8.3.1 Aplicao dos filmes (PAH/V2O5-nanobastes) em sensores de pH .......................... 99
8.3.2 Aplicao dos filmes (PAH/V2O5-Ne) em biossensores de uria ............................. 101
8.4 Consideraes finais do captulo ............................................................................. 102
9 Consideraes finais e perspectivas ......................... 103
Referncias .......................................................................... 105
APNDICE A Produo cientfica e tecnolgica ........... 119
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1 INTRODUO
A pesquisa em sensores e biossensores possui um forte carter multidisciplinar,
envolvendo reas da Fsica, Qumica, Cincia dos Materiais e Biologia. Um sensor um
dispositivo que mede certa grandeza fsica ou qumica e a converte em um sinal mensurvel
(1). Por outro lado, segundo a Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (IUPAC), um
biossensor definido com um dispositivo integrado transdutor-receptor, que capaz de
fornecer informao analtica especfica quantitativa ou semi-quantitativa, utilizando um
elemento de reconhecimento biolgico(2).
O primeiro biossensor foi desenvolvido por Clark e Lions em 1962, o qual ficou
conhecido como "eletrodo enzimtico" (3). Desde ento, um notvel progresso foi alcanado
quanto ao desenvolvimento de biossensores para a determinao e anlise de diversas
substncias (4). Em especial, destaca-se o desenvolvimento e aprimoramento dos biossensores
amperomtricos, potenciomtricos, pticos, piezoeltricos e calorimtricos (4).
Biossensores amperomtricos baseiam-se em reaes de transferncia de eltrons
(oxi-reduo) entre o material biocataltico e o analito, com um eletrodo de trabalho (o qual
contem o material biolgico imobilizado) polarizado a uma tenso pr-determinada em
relao a um eletrodo de referncia (5).
O primeiro biossensor amperomtrico foi
desenvolvido por Updike e Hicks (6) em 1967 para a medida de glicose, onde se fazia uso do
eletrodo enzimtico desenvolvido por Clark e Lions (3).
Por sua vez, os biossensores pticos baseiam-se na determinao das mudanas de
absoro de luz entre os reagentes e produtos da reao biologicamente catalisada, ou na
medida da emisso de luz por um processo luminescente (7). A forma mais comum envolve o
uso de tiras colorimtricas, as quais contm enzimas oxi-redutases (um tipo de material de
reconhecimento biolgico) e uma substncia capaz de mudar suas propriedades pticas em
resposta a uma mudana nas condies do meio (cromforo). O produto gerado na reao
entre a enzima e o analito (na maioria das vezes H2O2) oxida o cromgeno e a absorbncia do
composto formado proporcional concentrao do analito a ser determinada (7).
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20 Captulo 1 Introduo
Os biossensores piezoeltricos contm materiais biolgicos imobilizados em cristais
que do origem a uma tenso em resposta a uma vibrao externa. Dessa forma, funcionam
como transdutores do sinal eltrico produzido em sua interface (8). Como a variao da
frequncia proporcional variao de massa do material adsorvido, tal variao pode ser
determinada por circuitos eletrnicos e relacionada com a concentrao de um determinado
analito. O principal inconveniente dos biossensores piezoeltricos a interferncia da
umidade atmosfrica na medida e a dificuldade em us-los para a determinao de analitos em
soluo. Entretanto, biossensores piezoeltricos so relativamente baratos, pequenos e
proporcionam uma resposta rpida (8).
Muitas reaes que so catalisadas enzimaticamente so exotrmicas, ou seja, geram
calor. Dessa forma, os biossensores calorimtricos baseiam-se na medida da variao de
temperatura entre a entrada e a sada de uma pequena coluna contendo um biocatalisador
imobilizado (9). Tal medida efetuada atravs de termistores, um tipo de resistor usado para
medir mudanas de temperatura baseado em variaes de sua resistncia. A principal
vantagem de um biossensor calorimtrico sua ampla aplicabilidade em processos
biotecnolgicos ou de interesse clnico. Porm, existe a dificuldade de se manter a
temperatura do biocatalisador constante, fato que pode levar desnaturao do mesmo,
afetando assim o funcionamento do biossensor (9).
Os biossensores potenciomtricos so dispositivos que compreendem eletrodos de
vidro, sensores baseados na interface metal-xido ou eletrodos on-seletivos nos quais so
imobilizados os biocatalisadores (10). Nesse tipo de biossensor, a gerao de prtons altera o
potencial do meio reacional, criando uma diferena de potencial entre o eletrodo
biologicamente modificado e um eletrodo de referncia (10).
Como j exposto anteriormente, em sensores ou biossensores, uma grandeza fsica ou
qumica est relacionada direta ou indiretamente com a concentrao da substncia a qual se
deseja determinar (analito). Entre as grandezas utilizadas para quantificar analitos em
sensores ou biossensores, destaca-se o potencial hidrogeninico (pH), uma vez que diversos
processos bioqumicos dependem do seu valor ou resultam na liberao ou consumo de
prtons (10). O pH uma grandeza fsico-qumica que indica a acidez ou alcalinidade de uma
soluo aquosa. Matematicamente, definido como sendo o cologartimo decimal da
atividade de ons hidrognio (H+), ou seja (11):
10-log [ ]HpH (1.1)
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Captulo 1 Introduo 21
Para solues diludas (menores que 0,1 M), o valor do coeficiente de atividade se
aproxima de 1, ou seja, os valores da atividade se aproximam dos valores da concentrao,
assim, a equao 1.1 pode ser escrita como (11):
10-log [ ]pH H (1.2)
A determinao clssica do valor do pH realizada de duas maneiras distintas: (I)
adio de um cromforo ou tira indicativa contendo uma substncia imobilizada que muda de
colorao conforme o pH da soluo; (II) atravs de potenciometria utilizando-se o eletrodo
padro de hidrognio ou o eletrodo de vidro combinado com um eletrodo de referncia, este
ltimo, conhecido tambm como pH-metro (11).
Os mtodos supracitados so frequentemente utilizados em laboratrios de pesquisa
e ensino, principalmente o pH-metro. Contudo, novas tecnologias tm sido desenvolvidas
para a determinao do pH (11). Dentre essas tecnologias, Bergveld introduziu o conceito de
efeito de campo para a determinao da atividade inica em ambiente qumico, apresentando
comunidade cientifica o transistor de efeito de campo sensvel a ons (ISFET, do ingls ion-
sensitive field-effect transistor) (12-13). Um ISFET um sensor inico muito semelhante a
um dispositivo MOSFET (transistor de efeito de campo metal-xido-semicondutor, do ingls
metal oxide semiconductor field-effect transistor). A diferena bsica entre os dispositivos se
refere a no existncia do eletrodo metlico de porta (ou gate) no ISFET, sendo este
substitudo por um eletrodo de referncia contido em uma soluo (14). A Figura 1.1 ilustra o
diagrama esquemtico de um MOSFET e de um ISFET (14). No MOSFET a quantidade de
portadores no canal entre os eletrodos fonte e dreno controlada por uma pequena tenso
aplicada porta. Por outro lado, no ISFET, o potencial na superfcie do filme xido se altera
devido concentrao inica da soluo, modulando a quantidade de portadores no canal do
dispositivo.
Utilizado amplamente como sensor inico, principalmente para a determinao de
ons H+, o ISFET tambm pode ser utilizado como plataforma ativa em biossensores. A
combinao da deposio de filmes ultrafinos e a posterior imobilizao de materiais de
origem biolgica (enzimas, por exemplo) sobre o material que compe a porta de um ISFET
permite esta opo (15). Neste caso, a reao catalisada pelo material biolgico responsvel
pela alterao do potencial na porta do dispositivo via mudana de pH local, sendo esta
alterao proporcional concentrao do analito a ser determinado.
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22 Captulo 1 Introduo
Figura 1.1 Diagrama esquemtico de um MOSFET (a) e de um ISFET (b). Adaptado da referncia (14).
A grande vantagem da aplicao de ISFETs como sensores ou biossensores a
possibilidade do uso da microeletrnica na sua produo, o que possibilita sua confeco e
miniaturizao em larga escala. Em contrapartida, um inconveniente em ISFETs a
dificuldade de isolamento do FET do meio reacional, o que pode influenciar no desempenho
do dispositivo em virtude de alguma contaminao inica e a dificuldade de imobilizao de
biomolculas em um suporte de dimenses bastante reduzidas.
Neste sentido, um sistema elegante para isolamento do FET foi proposto por Van der
Spiegel et. al. (16) e aprimorado por Chi e colaboradores (17). Trata-se do transistor de efeito
de campo de porta estendida (EGFET, do ingls extended gate field-effect transistor), que
formado por uma camada sensvel estendida ou conectada a um dispositivo de alta
impedncia, geralmente um MOSFET, amplificador operacional (OP) ou ainda amplificador
de instrumentao (AI) (16-18). Vale ressaltar que, algumas vezes, o EGFET recebe a
denominao de transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET,
separative extended gate field-effect transistor). Essa nova denominao advm do fato de a
camada sensvel (ou porta estendida) estar separada do chip que contm o MOSFET (19). A
Figura 1.2 ilustra a configurao de um SEGFET. De forma anloga a um ISFET, uma
alterao do potencial na superfcie da membra ou camada sensvel, modula o sinal de sada
do dispositivo; que pode ser a corrente dreno-fonte de um MOSFET ou a tenso de sada de
um amplificador operacional ou de instrumentao (17-19).
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Captulo 1 Introduo 23
Figura 1.2 Diagrama esquemtico de um SEGFET. G, S e D representam, respectivamente, os eletrodos porta,
fonte e dreno, de um MOSFET comercial.
Diferentes tcnicas tm sido utilizadas para a obteno de filmes finos sensveis ao
pH. xidos ou nitretos metlicos tm sido sintetizados com esse objetivo por sputtering (17,
20), sol-gel (21-22), oxidao andica (23) e deposio qumica a partir do vapor (CVD) (24).
Neste contexto, as tcnicas de construo de filmes por spin coating ou via deposio camada
por camada, LbL (layer by layer), representam metodologias simples e de baixo custo que
tm como propriedade combinar e controlar a deposio de diversos tipos de materiais em
nvel molecular (25). Materiais orgnicos (19, 26), inorgnicos (26) e at mesmo
biomolculas (27) podem ser combinados, resultando em muticompsitos com propriedades
distintas, automontados em diferentes tipos e tamanhos de substratos (25). Atravs da unio
de tcnicas de deposio de filmes ultrafinos por automontagem com o conceito de SEGFET,
novos sistemas podem ser facilmente implementados como sensores de pH e posteriormente
como biossensores.
Neste sentido, no presente trabalho, sensores e biossensores baseados em um
dispositivo SEGFET foram obtidos atravs da construo de filmes automontados sensveis a
variaes de pH. Materiais nanoestruturados foram combinados e depositados na forma de
filmes finos automontados a fim de melhorar o desempenho do dispositivo. A proposta ou
objetivo da tese bem como sua organizao descrita a seguir.
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24 Captulo 1 Introduo
1.1 PROPOSTA DA TESE
Os principais objetivos dessa tese so:
I. Construo de um dispositivo SEGFET universal: construir um dispositivo
SEGFET simples que seja adequado a diferentes plataformas de sensoriamento e
que permita a aquisio rpida e precisa do sinal atravs de um computador.
II. Fabricao e caracterizao de filmes automontados nanoestruturados:
preparar filmes automontados contendo materiais nanoestruturados sensveis ao
pH, funcionalizar a superfcie de substratos de ITO (xido de ndio dopado com
estanho, indium tin-doped oxide) com filmes automontados e caracterizar os
sistemas automontados por tcnicas espectroscpicas e de microscopia eletrnica.
III. Aplicao dos filmes automontados como sensores de pH: Aplicar os filmes
automontados como porta estendida em dispositivos SEGFETs a fim de se obter
novos sensores de pH.
IV. Imobilizao de enzimas nos filmes automontados: imobilizar as enzimas
glicose oxidase (GOx) e urease, que so especficas na catlise de glicose e uria,
respectivamente, nos filmes automontados visando obteno de biossensores
baseados em dispositivos SEGFETs.
Quatro sistemas foram propostos e implementados hora como sensores de pH, hora
como biossensores de glicose ou uria. No primeiro sistema, filmes comerciais de ITO foram
funcionalizados com filmes automontados contendo dendrmeros de poli(propileno imina)
(PPID), uma macromolcula porosa, e metaloftalocianina tetrasulfonada de nquel (NiTsPc),
um composto organometlico amplamente utilizado em sensores. O sistema ITO-
(PPID/NiTsPc) foi aplicado como SEGFET sensor de pH e, atravs da imobilizao da
enzima GOx, como biossensor para determinao de glicose.
No segundo sistema, a polianilina foi sintetizada em sua forma nanoparticulada
(PANI-N) visando melhorar a solubilidade do polmero. Filmes automontados de PANI-N em
conjunto com o polmero poli (cido vinil sulfnico) (PVS) foram fabricados em substratos de
vidro recoberto com ouro (Au) e empregados como membranas sensveis ao pH em
SEGFETs. Atravs da imobilizao da enzima urease, o mesmo sistema foi empregado como
biossensor para deteco de uria.
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Captulo 1 Introduo 25
O terceiro sistema baseado em filmes automontados contendo nanopartculas
comerciais de dixido de titnio (TiO2-Np) e dendrmeros PPID. Automontados em substratos
de vidro recoberto com Au, o sistema (PPID/TiO2-Np) foi implementado como sensor de pH
e biossensor de glicose atravs da imobilizao da enzima GOx.
Por fim, numa primeira etapa, nanoestruturas unidimensionais (1D) de pentxido de
vandio, com diferentes formas, foram depositas diretamente em substratos de Au por spin-
coating e utilizadas como sensores de pH. Ainda, as nanoestruturas foram combinadas na
forma de filmes automontados utilizando o polmero poli (alilamina hidroclorada) (PAH)
como contra-on e tambm aplicadas como sensores de pH. Biossensores para determinao
de uria foram construdos utilizando a nova plataforma automontada como suporte para
imobilizao da enzima urease.
A tese est organizada da seguinte forma: o Captulo 2 exibe uma reviso sobre
sensores baseados em transistores de efeito de campo, enfatizando sua operao. Em especial
o ISFET, o SEGFET e o EnFET (FET enzimtico) so descritos em detalhes. O Captulo 3
descreve a tcnica de automontagem convencional e a tcnica de automontagem assistida por
spin, ambas utilizadas nesse trabalho. Sensores e biossensores de efeito de campo baseados na
tcnica LbL tambm so abordados no Captulo 3. Os materiais utilizados no trabalho, bem
como as tcnicas de caracterizao e a configurao experimental do dispositivo SEGFET so
apresentados no Captulo 4. Os Captulos de 5 a 8 so destinados aos resultados e discusses
dos quatros sistemas estudados. Vale ressaltar que esses captulos foram escritos como
trabalhos individuais. Por fim, as consideraes finais e sugestes para possveis trabalhos
futuros so apresentadas no Captulo 9.
-
26 Captulo 1 Introduo
-
2 SENSORES BASEADOS NO CONCEITO DE EFEITO DE CAMPO
A idia de se controlar a condutividade em semicondutores via campo eltrico,
proposta e patenteada por Lilienfeld em 1928, abriu caminho para a fabricao do MOSFET
nos laboratrios Bell em 1960 (28). Este fato revolucionou a indstria eletrnica tornando
possvel o desenvolvimento dos demais circuitos integrados. Um pouco mais tarde, Bergveld
expandiu o conceito de MOSFET para o campo bioqumico apresentando comunidade
cientfica o ISFET. Tal dispositivo permitia monitorar a atividade inica em meio fisiolgico
devido ao campo eltrico produzido na porta do dispositivo pelos ons em soluo (12-13).
A proposta de Bergveld levou ao desenvolvimento de uma srie de dispositivos
baseados em efeito de campo (FED, field effect devices) (14-15, 29). Seja com o intuito de
medir a atividade de ons em ambientes qumicos ou para aplicao como biossensores
baseados em efeito de campo (BioFEDs) (14-15, 29). Dentre esses dispositivos, destaca-se o
prprio (ISFET) (14), sua derivao, isto , o SEGFET (19) e o sensor capacitivo eletrlito-
isolante-semicondutor (EIS, electrolyte-insulator-semiconductor) (30). Nesses dispositivos, o
potencial na superfcie do material isolante (camada ou menbrana sensvel) da porta alterado
pela concentrao inica da soluo, controlando assim o sinal de sada do mesmo.
O princpio de funcionamento de um FED ou BioFED norteado por vrios
conceitos bsicos de Fsica e Qumica. Os aspectos relevantes referentes a esses sistemas, bem
como o princpio de operao de alguns FEDs, objetivo de estudo desse trabalho, abordado
na sequncia.
2.1 O MOSFET E O ISFET
O transistor de efeito de campo metal-xido-semicondutor ou simplesmente
transistor MOS, composto por um substrato semicondutor dopado (geralmente silcio, Si)
-
28 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
com regies denominadas fonte e dreno (31). Essas regies so dopadas com portadores de
carga contrria carga do substrato e a regio entre a fonte e o dreno denominada canal do
transistor. O portador de carga majoritrio do canal (eltrons ou buracos) classifica o tipo do
transistor MOS (31). Quando os portadores do canal so eltrons (dopagem negativa), o
MOSFET recebe a denominao de N-MOS. Em contrapartida, se os portadores do canal
forem buracos (dopagem positiva), o MOSFET denominado P-MOS (31). A Figura 2.1
ilustra esquematicamente a estrutura de um MOSFET tipo N.
Figura 2.1 Corte em seco transversal de um transistor N-MOS.
A operao do MOSFET baseada no controle da corrente eltrica entre os eletrodos
dreno e fonte (IDS) em funo de uma tenso aplicada no eletrodo de porta (VGS). Uma
diferena de potencial entre a fonte e o dreno (VDS) cria uma corrente de eltrons no canal.
Essa corrente depende da resistncia do canal, a qual varia de acordo com a quantidade de
impurezas nos eletrodos fonte e dreno (31). O comprimento do canal (L), sua largura (W), a
capacitncia do xido de porta (COx) e a mobilidade dos portadores do canal (), tambm so
parmetros que influenciam IDS (31). Outra caracterstica do MOSFET a altssima
impedncia da porta devido presena de uma camada isolante entre o eletrodo metlico e o
canal, o que impossibilita qualquer drenagem de corrente via porta.
Uma tenso VGS positiva atrair eltrons para a regio do canal uma vez que o
substrato est dopado positivamente, ou seja, a variao de VGS modula a quantidade de
portadores (nesse caso, eltrons) no canal. Quando a quantidade de portadores ditadas por VGS
for suficiente, uma tenso VDS levar ao escoamento de uma corrente no canal. Esse valor de
-
Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 29
VGS necessrio que haja corrente no canal recebe o nome de tenso de limiar (VT) e expressa
segundo a equao abaixo (14):
- - 2M Si SS Ox BT f
Ox
Q Q QV
q C
(2.1)
O primeiro termo reflete a diferena de funo trabalho entre o metal do eletrodo de
porta M e a funo trabalho do silcio Si, sendo q a carga elementar. O segundo termo, por
sua vez, se se refere ao acmulo de cargas na superfcie do silcio QSS, na interface xido-
silcio QOx e na regio de depleo do silcio QB. O terceiro termo 2f o potencial de Fermi,
sendo dependente do nvel de dopagem do silcio (14).
Variando-se o valor de VDS, IDS aumenta segundo a equao (14, 31):
2
- - 2
DSDS Ox GS T DS
VWI C V V V
L
(2.2)
A equao 2.2 vlida para VDS VGS - VT, conhecida como regio de triodo (31).
Ainda, aumentando-se VDS, o MOSFET passa a operar em uma regio conhecida como regio
de saturao. Nessa condio, ocorre o estrangulamento do canal, ou seja, atinge-se um ponto
de mxima corrente. Na regio de saturao, IDS varia segundo a equao (31):
2
-
2
GS T
DS Ox
V VWI C
L (2.3)
Em suma, pode-se concluir que VGS modula a quantidade de portadores no canal e
VDS responsvel pela operao do MOSFET na regio de triodo ou na regio de saturao.
A Figura 2.2 ilustra as curvas caractersticas de um MOSFET. A Figura 2.2a ilustra como a
corrente IDS de um MOSFET tipo N varia em funo da tenso entre os eletrodos dreno e
fonte (VDS) para VGS > VT. J a Figura 2.2b ilustra como IDS varia em funo de VGS para VDS
VGS VT. Nessa curva, a tenso de limiar VT obtida a partir da extrapolao no eixo das
abscissas (31).
-
30 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
VGS
4
VGS
3
VGS
2
VGS
1
I DS / A
VDS
/ V
(a)
(b)
I DS / A
VGS
/ VV
T
Figura 2.2 Famlia de curvas caractersticas IDS x VDS de um MOSFET tipo N (a) e curva IDS x VGS para um
pequeno valor de VDS (b).
Um ISFET, por sua vez, consiste na modificao ou adaptao de um MOSFET. O
processo de fabricao de ambos os dispositivos o mesmo, ou seja, as etapas de
processamento de circuitos integrados. Contudo, o eletrodo de porta no existe mais no
ISFET, sendo substitudo por um eletrodo de referncia contido em uma soluo eletroltica e
em contato com o xido da regio de porta (14). Figura 2.3 ilustra esquematicamente a
estrutura de um ISFET.
-
Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 31
Figura 2.3 Esquema ilustrativo da estrutura de um ISFET. O eletrodo porta de um MOSFET substitudo por
um eletrodo de referncia contido na soluo eletroltica que est em contato com o material
isolante.
O princpio de operao de um ISFET o mesmo de um MOSFET. Porm, o efeito
de campo no mais causado por um potencial externo no eletrodo de porta, e sim devido a
uma mudana de concentrao inica da soluo, geralmente concentrao de ons H+
, o que
causa a alterao do potencial na interface eletrlito-xido. Essa alterao do potencial
regida pelo modelo de stio de ligao (site binding) (32-33). O modelo sugere que a
superfcie dos xidos anfotricos (A) apresentam espcies qumicas em trs formas distintas:
negativas ( -AO ), neutras ( AOH ) e positivas ( +2AOH ). Dessa forma, as seguintes reaes de
ligao ocorrem da superfcie do xido (membrana sensvel). (32-33):
+ +
2AOH AOH + H (2.4)
- +AOH AO + H (2.5)
A corrente entre os eletrodos dreno-fonte do ISFET modulada pelo potencial na
superfcie () do xido, sendo a relao deste e o pH da soluo dada pela seguinte equao
(14, 22):
-
32 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
2,3 ( - )
1pzc
kTp pH
q
(2.6)
onde q a carga elementar, k a constante de Boltzmann, T a temperatura absoluta, um
parmetro que reflete a sensibilidade qumica do material da porta sendo dependente da
densidade superficial de grupos hidroxilas (OH) e da reatividade de superfcie e pHpzc o valor
de pH de carga zero.
Baseando-se nas equaes do MOSFET, o comportamento de VT de um ISFET ser
dependente tambm do potencial no eletrodo de referncia (ERef.), do potencial superficial de
dipolo em virtude da soluo (Sol.), e do potencial de superfcie na interface xido-eletrlito
(). Dessa forma, VT varia no mais como a equao 2.1 e sim segundo a equao abaixo
(14):
Re . .
- - - 2Si SS Ox BT f Sol f
Ox
Q Q QV E
q C
(2.7)
O xido de silcio (SiO2) foi o primeiro material utilizado como camada sensvel a
ons em dispositivos ISFETs (12-13). Contudo, o SiO2 apresenta uma sensibilidade em torno
de 38 mV.pH-1
(14, 34), ou seja, aqum do valor terico sugerido pela equao de Nernst
(59,15 mV.pH-1
, a 25
oC) (14). Aps o SiO2, diversos xidos ou nitretos metlicos foram
introduzidos como materiais sensveis ao pH. Dentre eles, destacam-se o nitreto de silcio
(Si3N4) (35), o xido de alumnio (Al2O3) (36), o xido de tntalo (Ta2O5) (37) e o xido de
estanho (SnO2) (38), materiais que geralmente apresentarem uma sensibilidade Nernstiana
variaes de pH.
2.2 O EGFET E O SEGFET
O EGFET foi proposto primeiramente por Van der Spiegel e colaboradores em 1983
e trata-se de uma modificao do ISFET convencional (16). O EGFET formado por uma
camada ou membrana sensvel, a qual estendida at o eletrodo de porta de um MOSFET ou
conectada a um amplificador operacional (16). No primeiro caso, tanto a membrana sensvel
quanto o MOSFET so construdas no mesmo substrato ou chip (Figura 2.4) (16). Por outro
-
Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 33
lado, o aprimoramento do dispositivo EGFET proposto por Chi et. al., utiliza uma membrana
sensvel conectada a um MOSFET comercial (Figura 2.5) (17). Agora, a membrana e o
MOSFET no esto contidos no mesmo chip, sendo mais conveniente, denominar o
dispositivo de SEGFET (EGFET com membrana separada) (17).
O funcionamento de um dispositivo EGFET/SEGFET o mesmo de um ISFET, ou
seja, modulao da corrente dreno-fonte via alterao do potencial de superfcie na camada
sensvel. Portanto, as equaes que descrevem o comportamento eltrico de um ISFET so as
mesmas para o EGFET/SEGFET (17, 19, 22).
Figura 2.4 Estrutura do dispositivo EGFET proposto por Van der Spiegel. A membrana sensvel e o MOSFET
esto contidos no mesmo substrato ou chip (16).
Figura 2.5 Estrutura do dispositivo SEGFET proposto por Chi. A membrana sensvel conectada a um
MOSFET comercial (17).
-
34 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
A configurao de um SEGFET possui algumas vantagens em relao a dispositivos
ISFETs: o processo de medida simples, a imobilizao de biomolculas facilitada e o
dispositivo comercial pode ser reaproveitado para a aplicao em dispositivos descartveis
(17, 19). Tais vantagens permitem que novos materiais possam ser testados como membranas
sensveis ao pH de maneira simples e rpida. Assim, a pesquisa em dispositivos SEGFETs se
concentra no teste de novos materiais e na otimizao do processo de fabricao dos mesmos
visando obter novas membranas sensveis. A Tabela 2.1 resume os materiais comumente
utilizados como camada sensvel em dispositivos SEGFETs. Observa-se que existe uma gama
de materiais utilizados obtidos por diferentes tcnicas.
Devido alta sensibilidade ao pH apresentada por ISFETs e SEGFETs, esses
dispositivos tm sido utilizados como biossensores. Neste caso, um material biolgico
(geralmente uma enzima) imobilizado na camada sensvel, dando forma a um transistor de
efeito de campo enzimtico (EnFET, do ingls enzyme field-effect transistor) (39). Neste
contexto, novos biossensores baseados no conceito de efeito de campo podem ser facilmente
construdos.
A fcil manipulao de um SEGFET, comparativamente a um ISFET, torna esse tipo
de dispositivo mais atrativo para a aplicao em biossensores, tendo em vista que a
manipulao do dispositivo se restringe somente na modificao do gate estendido com o
material biolgico sem a necessidade de etapas de microprocessamento. Uma abordagem
acerca dos FETs enzimticos, especialmente aqueles baseados na configurao SEGFET
abordado em sequncia.
-
Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 35
Tabela 2.1 Materiais comumente utilizados como camada sensvel em dispositivos SEGFETs.
Material Frmula
Qumica
Mtodo de
Fabricao
Sensibilidade
(mV.pH-1
)
Referncia Ano
xido Misto de Vandio/
Tungstnio
V2O5/WO3 Sol-gel 68 (40) 2011
xido de Estanho dopado
com Flor
SnO2:F Comercial 50 (41) 2010
xido de Vandio V2O5 Sol-gel 58,1 (21) 2009
xido de Titnio TiO2 Sol-gel 58,73 (42) 2009
Nitreto de Rutnio RuN 58,03 (43) 2009
xido de Alumnio Al2O3 Anodizao 56 (23) 2006
xido de Zinco ZnO Sol-gel 38 (22) 2005
Nanotubos de silcio Si CVD 58,3 (44) 2005
xido de ndio dopado com
estanho
In2O3:Sn Comercial 58 (18) 2001
Nitreto de titnio TiN Sputtering 57 (45) 2001
xido de estanho SnO2 Sputtering 58 (17) 2000
2.3 O ENFET
A unio entre a especificidade de sistemas biolgicos com transistores de efeito de
campo deu origem a uma ferramenta verstil para ser utilizada em anlises clnicas. O
transistor de efeito de campo enzimtico baseado na imobilizao de uma enzima que
produz ou consome prtons durante a catlise de um analito especfico, alterando assim o pH
prximo da camada sensvel que est acoplada a um dispositivo de efeito de campo (46).
A idia de unio entre enzimas e ISFETs foi proposta pela primeira vez em 1976 por
Janata e Moss (47). Contudo, a realizao prtica de um EnFET veio quatro anos mais tarde,
quando Caras e Janata construram um EnFET para a determinao de penicilina (48). A
-
36 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
partir de ento, uma srie de EnFETs foram produzidos para determinao de diversas
substncias (39). Tanto sustncias de interesse clnico como glicose (49), uria (50),
creatinina (51) e acetilcolina (52), bem como sustncias de interesse ambiental como fenis
(53) e pesticidas (54), podem ser determinadas por EnFETs. Ainda, a combinao de enzimas
com o conceito de efeito de campo abriu caminho para o desenvolvimento de uma srie de
dispositivos biolgicos de efeito de campo para diversas aplicaes tecnolgicas (29, 55). Um
EnFET clssico, ou seja, o qual utiliza a configurao de um ISFET, ilustrado
esquematicamente na Figura 2.6.
Figura 2.6 Estrutura de dispositivo EnFET clssico. Enzimas so imobilizadas na camada sensvel ao pH.
Como em qualquer biossensor, o mtodo de imobilizao da enzima constitui uma
etapa fundamental na construo de um EnFET. Diversos mtodos para imobilizao
enzimtica esto presentes na literatura (56). Os mtodos mais utilizados se do atravs do
encapsulamento da enzima em matrizes ou microcpsulas polimricas ou atravs de ligaes
fsicas ou qumicas da enzima ao suporte (56).
A imobilizao de uma enzima via encapsulamento consiste em confinar a enzima em
um polmero insolvel ou em uma microcpsula polimrica. Neste sistema criada uma
membrana seletiva que impede que as enzimas (molculas grandes) se difundam atravs da
membrana, enquanto que molculas pequenas como analitos e produtos podem difundir
facilmente.
Soldatkin et. al. desenvolveram um EnFET para determinao de creatinina
imobilizando a enzima creatinina deiminase (CD) em uma matriz de poli (lcool vinlico)
depositada na camada sensvel de um ISFET composta por Si3N4 (51). A vantagem desse
mtodo que a enzima no reage quimicamente com o suporte, no comprometendo assim
-
Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo 37
seu stio ativo. Porm, a difuso dos elementos atravs da membrana pode ser um problema,
visto que a velocidade de difuso pode comprometer o tempo de resposta do biossensor.
A adsoro de uma enzima mtodo de imobilizao mais utilizado devido a sua
simplicidade. Alm disso, o mtodo que menos inibe a atividade ou causa desnaturao da
protena (57). Neste caso, a enzima imobilizada em um suporte slido, onde esto
envolvidas ligaes de baixa energia como ligaes de hidrognio, inicas ou foras de van
der Waals (57). Siqueira Junior e colaboradores construram um biossensor para deteco de
penicilina baseado em uma estrutura de efeito de campo capacitiva funcionalizada com filmes
multicamadas de dendrmeros e nanotubos de carbono (58). Assim, um elegante BioFED foi
obtido atravs da simples adsoro da enzima penicilinase nas multicamadas
dendrmero/nanotubos (58). Apesar da simplicidade, a adsoro de protenas para o projeto de
biossensores pode levar a uma baixa estabilidade operacional, uma vez que o biocatalisador
pode ser lixiviado do eletrodo com o tempo, comprometendo assim, o bom funcionamento do
dispositivo (57).
A imobilizao covalente de uma enzima envolve a ligao efetiva entre a enzima e
o suporte atravs da ativao prvia de grupos reativos presentes no mesmo. Desta forma, os
suportes devem possuir grupos funcionais que possam ser ativados. A ativao do suporte, na
maioria das vezes, consiste em silanizao, reaes com carbodiiminas e glutaraldedo. As
enzimas so ligadas matriz atravs de grupos funcionais presentes em seus aminocidos
(56). Contudo, deve-se ter o cuidado para no se comprometer o stio ativo da enzima ao se
efetivar a ligao, pois isto comprometeria sua atividade cataltica. O emprego do mtodo de
ligao covalente para o preparo de biossensores pode levar a uma melhor estabilidade
operacional, uma vez que a enzima ligada irreversivelmente matriz.
Em EnFETs, observa-se uma preferncia pela modificao da camada sensvel com
agentes silanos, principalmente o 3-aminopropiltrietoxisilano (3-ATPS), tendo em vista que a
camada no possui grupos funcionais para a ligao covalente direta da enzima (52, 59-63).
Neste caso, o xido da camada sensvel primeiramente modificado com 3-ATPS e o
acoplamento da enzima se d ento com o auxlio do glutaraldedo (GA), um agente de
entrecruzamento amplamente utilizado em processos de imobilizao enzimtica (52, 59-63).
A Figura 2.7 ilustra detalhadamente o processo de modificao da superfcie de um xido
com 3 ATPS e GA seguido do processo de imobilizao enzimtica.
Alternativamente silanizao, a tcnica de preparao de filmes por automontagem
camada por camada pode ser utilizada para a modificao ou a funcionalizao de superfcies
-
38 Captulo 2 Sensores baseados no conceito de efeito de campo
e/ou substratos condutores visando a imobilizao de enzimas. Detalhes dessa tcnica bem
como a uma adaptao da mesma com a tcnica de spin-coating so detalhados na sequncia.
Figura 2.7 Ilustrao do processo de modificao da camada sensvel de um ISFET com 3 ATPS (a) e
ativao com GA (b) seguido do processo de imobilizao covalente na enzima (c).
-
3 FILMES AUTOMONTADOS CAMADA POR CAMADA (LBL)
No presente trabalho, utilizamos filmes automontados como porta estendida em
dispositivos SEGFETs. Os filmes foram automontados alternando-se as camadas de materiais
diferentes por dipping ou spin coating. Detalhes das tcnicas bem como a diferena entre elas
so apresentados neste captulo.
3.1 TCNICA DE AUTOMONTAGEM CAMADA POR CAMADA (LBL)
A tcnica de automontagem camada por camada via dipping coating ou
simplesmente LbL se caracteriza pela simplicidade do aparato experimental utilizado na
construo dos filmes. A princpio, necessita-se apenas de bqueres e solues contendo os
materiais a serem automontados. Diversos materiais carregados com cargas opostas podem
ser combinados, resultando em filmes multicamadas com propriedades que podem ser
distintas e nicas quando comparados aos materiais precursores (25).
Baseado na automontagem atravs de ligaes qumicas (26), Iler et. al. propuseram
construir filmes multicamadas por adsoro fsica em 1966 quando automontaram
multicamadas de partculas coloidais (26). Entretanto, a tcnica LbL ganhou notoriedade com
os trabalhos de Decher, Lvov e colaboradores (64-66). A partir de ento, a tcnica LbL passou
a ser empregada em diversos ramos da cincia (25), incluindo a manipulao de materiais em
escala nanomtrica (67-69), a construo de sensores (69-70) e biossensores (71-72). A
Figura 3.1 ilustra o esquema de um filme LbL na qual as cores diferentes correspondem
materiais carregados com cargas opostas. As etapas do processo de fabricao do mesmo
filme so ilustradas na Figura 3.2.
-
40 Captulo 3 Filmes automontados camada por camada (LbL)
Figura 3.1 Representao esquemtica de um filme obtido pela tcnica de automontagem camada por camada.
Figura 3.2 Representao esquemtica da tcnica de automontagem camada por camada.
Um substrato slido convenientemente carregado inserido por certo perodo de
tempo em uma soluo contendo o material carregado positivamente (poliction), por
exemplo, que adsorve ao substrato (etapa 1). O substrato passa por um processo de lavagem
para remoo do excesso de material ou material fracamente adsorvido (etapa 2). Uma
monocamada automontada ento formada. Em seguida, o substrato pr-recoberto
positivamente inserido na soluo contendo o material negativo ou polinion (etapa 3). De
forma semelhante etapa de lavagem anterior, o material em excesso ou no absorvido
removido (etapa 4), resultando em uma bicamada poliction/polinion. Vale ressaltar, que
etapas intermedirias de secagem no ambiente ou com fluxo de gs nitrognio (N2) podem
-
Captulo 3 Filmes automontados camada por camada (LbL) 41
estar presentes no processamento de filmes LbL. A repetio do processo descrito
anteriormente permite a obteno de filmes com o nmero de bicamadas desejadas (25).
O monitoramento clssico do processo de crescimento de um filme LbL realizado
por espectroscopia de absoro UV-Vis (25) medindo-se a banda de absoro de um dos
eletrlitos (19) ou por meio da medida da massa do material adsorvido com auxlio de uma
microbalana de cristal de quartzo (73). Condies como o tempo de adsoro, pH da soluo,
concentrao do polieletrlito e fora inica, influenciam as propriedades de deposio e as
caractersticas do filme. Dessa forma, essas condies devem ser cuidadosamente estudadas a
fim de se otimizar o processo de automontagem (19).
3.2 TCNICA DE AUTOMONTAGEM ASSISTIDA POR SPIN (SA-LBL)
Apesar das vantagens potenciais oferecidas pela tcnica LbL convencional via
dipping, a tcnica se limita a solues aquosas e a dependncia de solubilidade dos materiais
envolvidos no processo e no controle preciso dos parmetros utilizados no crescimento do
filme. Neste sentido, Cho e colaboradores propuseram uma alternativa tcnica LbL
combinando a mesma com a tcnica de spin-coating (74). Trata-se da tcnica de
automontagem camada por camada assistida por spin (SA-LbL, do ingls spin-assisted layer
by layer) (74-75). Essa tcnica de obteno de filmes consiste na deposio de algumas gotas
da soluo policatinica sobre o substrato e na subsequente rotao por determinado perodo
de tempo suficiente para secagem. O mesmo procedimento repetido para a deposio da
camada de polinion, resultado assim em uma bicamada (Figura 3.3). O processo repetido
para o nmero de bicamadas desejado (74-75).
De acordo com a literatura (75), filmes fabricados com a tcnica SA-LbL so mais
espessos, porm menos rugosos que filmes produzidos pela tcnica convencional, em virtude
da rpida eliminao do solvente (gua) no processo de rotao. Molculas de gua podem
pr-adsorver ao substrato no caso da tcnica convencional, bloqueando o polieletrlito; fato
que compromete o recobrimento total da superfcie (75).
-
42 Captulo 3 Filmes automontados camada por camada (LbL)
Figura 3.3 Representao esquemtica da tcnica de automontagem camada por camada assistida por spin
(SA-LbL). A repetio do processo permite obter filmes multicamadas.
A diferena bsica entre a tcnica convencional LbL e a tcnica SA-LbL se refere
aos mecanismos de adsoro do material ao substrato. No caso convencional, as cadeias do
polieletrlito se difundem para o substrato via interaes eletrostticas ou atravs de
interaes secundrias (ligaes de hidrognio, interaes hidrofbicas e de Van der Waals),
organizando-se sobre o substrato. A retirada do excesso de material se passa na etapa de
lavagem. Por outro lado, no processo SA-LbL, ocorre a adsoro de material sobre o substrato
enquanto a soluo est sobre o mesmo e tambm durante a sua eliminao devido ao
processo spin atravs da alta velocidade de rotao em um curto perodo de tempo. O rpido
processo de secagem da soluo faz aumentar a concentrao do polieletrlito na superfcie de
deposio e, consequentemente, a sua adsoro (74).
3.3 SENSORES E BIOSSENSORES DE EFEITO DE CAMPO UTILIZANDO
AUTOMONTAGEM
Livov e colaboradores demostraram que biomolculas podem ser automontadas pela
tcnica LbL preservando uma alta atividade aps a imobilizao (27, 76). Neste contexto,
filmes LbL contendo materiais biolgicos podem ser facilmente aplicados em biossensores.
Alm disso, a tcnica LbL permite funcionalizao de substratos de modo que sistemas
adequados possam ser construdos na ltima camada para a imobilizao covalente de
enzimas (77). A fcil combinao de diversos materiais permitida pela tcnica LbL abre ento
caminho para um vasto campo de aplicaes tecnolgicas. Logo, a unio da tcnica LbL com
-
Captulo 3 Filmes automontados camada por camada (LbL) 43
o conceito de efeito de campo promissora para a obteno de MOSFETs e circuitos
integrados.
Cui e colaboradores aplicaram mtodos convencionais de microeletrnica
combinados com automontagem de nanopartculas de SnO2 ou In2O3 e SiO2 para obter a
camada ativa e a camada isolante, respectivamente, de um MOSFET (78-79). Apesar da baixa
mobilidade de portadores quando comparados aos transistores convencionais, a abordagem
apresentada por Cui se mostrou promissora para fabricao de MOSFETs a baixo custo (78,
79).
Filmes finos de PANI e nanopartculas de SiO2 foram combinados via LbL por Liu
et. al. e aplicados como ISFET e EnFET para deteco do neurotransmissor acetilcolina (80).
Devido as suas propriedades semicondutoras, a PANI atua como o material semicondutor do
canal do transistor, enquanto que as nanopartculas de SiO2 como dieltrico de porta. Em uma
estratgia semelhante, Xue, trabalhando no mesmo grupo de Liu, utilizaram nanotubos de
carbono alternativamente PANI (81). O ltimo sistema apresentou uma maior mobilidade
dos portadores e da mesma forma foi aplicado como EnFET para a deteco de acetilcolina
(82).
Com os trabalhos citados anteriormente, cerca de quarenta dispositivos ISFETs
foram construdos no mesmo substrato (80). Contudo, a tcnica LbL parece ser mais adequada
para aplicao em dispositivos de efeito de campo que operam com estruturas separadas,
como o SEGFET e o EIS, em virtude de etapas de microprocessamento no estarem presentes
durante a fabricao do dispositivo. Portanto, o processo de fabricao se restringe a simples
manipulao da camada sensvel (19, 69, 83). Neste sentido, Siqueira Junior e colaboradores
funcionalizaram uma estrutura EIS formada por Ta2O5 com dendrmeros PAMAM e
nanotubos de carbono (84). Altamente sensvel a variaes de pH (54,5 mV.pH-1
) o sistema
foi aplicado como biossensor para deteco de penicilina (58). Por sua vez, Fernandes et. al.
funcionalizaram a superfcie de ITO com filmes LbL contendo dendrmeros PPID e
ftalocianina tetrasulfonada de nquel (NiTsPc). O sistema PPID/NiTsPc foi aplicado como
SEGFET sensor de pH com potencial aplicao em biossensores (EnFETs) (19).
-
44 Captulo 3 Filmes automontados camada por camada (LbL)
-
4 MATERIAIS E MTODOS
Neste captulo sero apresentados os materiais utilizados no trabalho, a tcnica de
sntese e automontagem dos mesmos, bem como as tcnicas de caracterizao dos filmes LbL.
A configurao experimental do dispositivo SEGFET utilizado como sensor de pH e
biossensor ou EnFET para deteco de glicose e uria tambm descrita em detalhes.
4.1 MATERIAIS SENSVEIS A ONS
Quatro materiais diferentes foram utilizados como camada sensvel nos dispositivos
SEGFET: o xido de ndio dopado com estanho (ITO), nanopartculas de polianilina (PANI-
N), nanopartculas esfricas de dixido de titnio (TiO2-Np) e nanoestruturas unidimensionais
de pentxido de vandio. A escolha dos materiais foi baseada em suas propriedades
anfotricas, ou seja, propriedade de doar ou aceitar prtons, princpio bsico para deteco de
pH. Devido grande rea superficial, materiais obtidos em escala nanomtrica podem
potencializar o desempenho do dispositivo sob o ponto de vista de suas propriedades fsico-
qumicas quando as mesmas so comparadas ao volume.
4.1.1 XIDO DE NDIO DOPADO COM ESTANHO (ITO)
O xido de ndio dopado com estanho (ITO) o xido condutor transparente mais
utilizado e relatado na literatura como eletrodo (85). Ele constitudo de uma mistura de
xido de ndio (In2O3) e xido de estanho (SnO2), geralmente em propores de 90% e 10%,
respectivamente. O ITO exibe uma baixa resistividade eltrica (10-4
-10-6
.cm), lacuna de
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46 Captulo 4 Materiais e mtodos
energia relativamente pequena (Eg = 3,3 eV), alm de apresentar boa estabilidade fsico-
qumica e morfologia superficial.
Por ser um xido anftero (ou anfiprtico), o ITO pode se comportar como cido ou
base dependendo do meio reacional. Este fato levou a aplicao desse material como camada
sensvel em dispositivos EGFETs (18). Devido a sua alta condutividade, o ITO tambm pode
atuar como um metal nesses dispositivos, fazendo parte, neste caso, da interface metlica da
juno metal-xido da porta estendida do dispositivo em substituio ao alumnio (59). Ainda,
no que tange a aplicao em biossensores, trabalhos indicam que protenas podem ser
covalentemente imobilizadas na superfcie do xido atravs de reaes de esterificao entre
o grupo OH da superfcie do ITO e os grupos carboxlicos presentes nas molculas proteicas
(86, 87). A presena de grupos OH na superfcie do ITO tambm facilita a adsoro dos
grupos carboxlicos e/ou grupos amina atravs de ligaes de hidrognio ou podem ser
ativados atravs de reaes com cloreto cianrico, ligando covalentemente as enzimas ao ITO
(86, 87).
4.1.2 POLIANILINA NANOPARTICULADA (PANI-N)
A polianilina (PANI) o polmero semicondutor mais conhecido e utilizado pela
comunidade cientfica. Devido sua estabilidade qumica, baixo custo de processamento,
fcil sntese e possibilidade de controle sobre propriedades eltricas via dopagem reversvel
da cadeia polimrica (88), a PANI tem sido aplicada em um vasto campo da cincia (89)
especialmente em sensores qumicos (90), diodos emissores de luz (91) e biossensores (92).
A frmula qumica geral da PANI ilustrada na Figura 4.1 na qual Y representa o
estado de oxidao e X o grau de polimerizao. Atravs de uma reao reversvel redox, a
estrutura da PANI pode apresentar trs estados de oxidao distintos: pernigranilina, onde a
PANI se encontra totalmente oxidada (y = 0); esmeraldina onde a cadeia polimrica est
parcialmente oxidada (Y = 0,5) ou leucoesmeraldina, com o polmero totalmente reduzido y =
1 (93). A PANI pode existir na forma condutora, como sal de esmeraldina. Neste caso, a
alterao da cadeia se d pela protonao da estrutura de esmeraldina ou pela oxidao parcial
da leucoesmeraldina (93).
-
Captulo 4 Materiais e mtodos 47
Figura 4.1 Formula qumica geral da polianilina (PANI).
Uma das aplicaes mais interessantes da polianilina se refere sua aplicao como
material ativo em sensores (94-96). No caso especfico de sensores de pH, o mecanismo
referente a sensibilidade se deve afinidade dos ons H+ do eletrlito com os grupamentos
amina presentes na estrutura da PANI, o que altera a densidade de carga na superfcie do
polmero (97). No entanto, o processamento da polianilina na forma de filmes finos para a
aplicao em sensores limitada devido baixa solubilidade apresentada pelo polmero em
meio aquoso. Visando melhorar o processamento, a PANI vem sendo sintetizada sua forma
nanoparticulada via polimerizao interfacial (98-99). A tcnica consiste na polimerizao
dos reagentes na interface entre duas fases lquidas imiscveis. Para obteno da PANI em sua
forma condutora, geralmente opta-se por solubilizar a anilina em um solvente orgnico e o
dopante juntamente com o agente oxidante em gua (98-99).
A estratgia descrita anteriormente foi utilizada nesse trabalho com o intuito de
melhorar a solubilidade do polmero visando a formao de filmes automontados. Para tal,
antes da sntese, os monmeros de anilina (Sigma Aldrich) foram duplamente destilados,
armazenados a baixa temperatura (5 C) e protegidos da luz. O processamento via
polimerizao interfacial (98-100) se deu na reao do monmero (1 mL) dissolvido em
clorofrmio (50 mL) (fase orgnica) com o oxidante (persulfato de amnio) e o dopante (HCl)
misturados em uma fase aquosa (285 mg de persulfato de amnio dissolvidos em 50 mL de
HCl a 1M). A fase aquosa foi cuidadosamente adicionada fase orgnica com o auxlio de um
basto de vidro. Com o passar do tempo observa-se a formao de uma colorao verde
escura na interface entre as duas fases indicando a formao da polianilina no seu estado
dopado. Depois de trs horas, a sntese se deu por completa. A PANI-N formada foi filtrada e
lavada com HCl (1 M) a fim de se remover o excesso de reagentes. O produto final foi seco
vcuo por 24 h a 40 C. Por fim, A PANI-N foi solubilizada/dispersada a 1 g.L-1
em soluo
aquosa, ajustando-se o valor do pH para 5 com adio de HCl (1M).
-
48 Captulo 4 Materiais e mtodos
4.1.3 NANOPARTCULAS DE DIXIDO DE TITNIO (TIO2-NP)
O dixido de titnio ou titnia (TiO2) um xido metlico de transio muito
interessante devido alta estabilidade qumica e fcil preparao (101). O TiO2 pode existir
em trs formas alotrpicas: bruquita, rutila e anatase (101), sendo as duas ltimas as mais
aplicadas no campo tecnolgico, seja em fotocatlise, clulas solares ou dispositivos
eletrocrmicos (102).
Devido as suas propriedades anfotricas, o TiO2 tambm tem sido utilizado como
camada sensvel em sensores de pH (42, 103-104). Para esse propsito, tcnicas como o
sputtering (103), sol-gel (42) e deposio qumica a partir da fase vapor (CVD) (104)
geralmente so utilizadas. Como dito anteriormente, a tcnica LbL permite a combinao de
matrias orgnicos e inorgnicos e neste sentido, nanopartculas de TiO2 podem ser
automontadas via LbL (67-68,105). Kommireddy e colaboradores automontaram
nanopartculas de TiO2 com poli(estireno sulfonado) e aplicaram o sistema PSS/TiO2 para
fixao de clulas tronco (106). Priya et. al. automontaram um sistema semelhante e
aplicaram o sistema para a fotodegradao de rodamina B sob ao de luz ultravioleta (107).
O TiO2 possui ponto isoeltrico em torno de pH 6 (107), dessa forma, fica fcil a
construo de filmes LbL utilizando tanto polieletrlitos positivos quanto negativos. Assim,
optamos neste trabalho por fabricar filmes LbL contendo nanopartculas comerciais de TiO2
(TiO2-Np) (Sigma Aldrich, 100% anatase) utilizando o dendrmero poli (propileno imina)
(PPID) como poliction no processo de automontagem.
4.1.4 NANOESTRUTURAS 1D DE PENTXIDO DE VANDIO (V2O5)
O pentxido de vandio, um composto qumico com a frmula V2O5 o composto
mais estvel e comum de vandio. No estado slido possui colorao marrom/amarelo. Ao
contrrio da maioria dos xidos metlicos, o V2O5 exibe uma boa solubilidade em gua. Com
propriedades fsico-qumicas interessantes, o V2O5 exibe um vasto potencial de aplicao
tecnolgica e neste sentido tem sido aplicado como material cataltico (108), em dispositivos
eletrocrmicos (109), catodo para baterias (110) e sensores (21, 111).
Recentemente, materiais nanoestruturados unidimensionais (1D), como nanofios,
-
Captulo 4 Materiais e mtodos 49
nanofitas e nanotubos, tm atrado o interesse de diversos pesquisadores devido s suas
propriedades no convencionais quando comparados ao mesmo material em volume (112).
No obstante, diversas estratgias so utilizadas para sntese do V2O5 1D. Recentemente,
Avansi et. al. descreveram uma rota de sntese hidrotermal, com apenas um passo para sntese
de nanoestruturas de V2O5.nH2O (113). Tal tcnica permite um rigoroso controle da
morfologia, da dopagem e da estrutura cristalina do xido pela modificao das condies de
sntese hidrotermal (113).
Visando aplicaes tecnolgicas, nanoestruturas de V2O5.nH2O sintetizadas sob
condies hidrotermais nos foram cedidas pelo Prof. Valmor Mastelaro e seu ex-aluno de
doutorado Dr. Waldir Avansi do grupo de Crescimento de Cristais e Materiais Cermicos do
IFSC-USP. A sntese hidrotermal foi baseada na dissoluo do p micromtrico de V2O5
(Alfa Aesar, 99.995% de pureza) em gua deionizada com a adio de perxido de hidrognio
(H2O2). A soluo formada foi ento submetida ao tratamento hidrotermal.
Visando obter diferentes tipos de nanoestruturas de V2O5.nH2O, o tratamento foi
realizado em diferentes temperaturas (160, 180 e 200) durante o mesmo tempo de sntese
(24h) (113). Mais detalhes dessa sntese e uma caracterizao completa dos materiais podem
ser obtidos nas referncias de Avansi e colaboradores (113, 114).
4.2 MATERIAIS UTILIZADOS COMO CONTRA ONS
Polmeros com cargas positivas ou negativas so chamados polieletrlitos (ou ainda
macroons ou polions). Polieletrlitos podem ser polinions ou polictions e geralmente so
solveis em gua. Muitos so os materiais que podem ser empregados na construo de filmes
automontados (25). Entre os polictions mais utilizados destacam-se o poli(cloreto de
alilamina) ou poli (alilamina hidroclorada) (PAH), o poli(etileno imina) (PEI) e poli(cloreto
de dialildimetilamnia) (PDAC). Por sua vez, os polinions mais utilizados compreendem o
poli(cido vinil sulfnico) (PVS), o poli estireno sulfonado (PSS) e o poli(cido acrlico)
(PAA) (25).
Utilizamos nesse trabalho, o PVS como polinion e o PAH como poliction para
obteno de filmes automontados com a polianilina nanoparticulada e com as nanoestruturas
de pentxido de vandio, respectivamente. Contudo, alternativamente ao convencional,
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50 Captulo 4 Materiais e mtodos
utilizamos o dendrmero poli(propileno imina) (PPID) para a fabricao de filmes LbL com
nanopartculas de TiO2 ou com metaloftalocianina tetrasulfonada de nquel (NiTsPc). Esta
ltima escolhida devido s suas propriedades de deteco, uma vez que NiTsPc pode atuar
como uma enzima artificial devido s suas propriedades catalticas (115), alm de apresentar
seletividade inica (116). Por sua vez, macromolculas com arquitetura dendrtica
representaram um recente avano da qumica nanoscpica (117). O emprego de tais materiais
para o projeto de sistemas nanotecnolgicos tem atrado a ateno da comunidade cientfica
pelo fato desses materiais apresentarem propriedades no convencionais quando comparados
aos polmeros lineares ou ramificados, como, elevada rea superficial e um grande nmero de
grupos funcionais na periferia da macromolcula, ideais para imobilizao de protenas (77,
118). O dendrmero PPID nos foi cedido pelo professor Dr. Alvaro Antonio Alencar de
Queiroz da Universidade Federal de Itajub e detalhes da sntese desse polmero esto
relatados na literatura (19).
4.3 CRESCIMENTO DOS FILMES AUTOMONTADOS
Quatro sistemas distintos foram automontados e utilizados como membranas
sensveis ao pH. Abaixo so descritos os procedimentos para o crescimentos das bicamadas
dos sistemas estudados
ITO-(PPID/NiTsPc)
Utilizamos substratos de ITO obtidos da empresa Delta-technologies como substrato
sensor de pH. Os filmes de ITO foram funcionalizados a estrutura automontada PPID/NiTsPc
visando a imobilizao de enzimas e uma superfcie mais ativa. Para tal, os substratos de ITO
(ou quartzo para estudo espectroscpico do crescimento dos filmes) foram imersos por 5
minutos em uma soluo policatinica de PPID a 1 g.L-1
, imersos em gua ultrapura para
remoo do excesso de material e secos com fluxo de N2. Em seguida, os substratos
previamente recobertos com uma monocamada positiva de PPID foram imersos em uma
soluo aninica de NiTsPc a 0,5 g.L-1
durante 3 minutos, imersos em gua ultrapura e secos
da mesma maneira com fluxo de N2. O nmero desejado de bicamadas de (PPID/NiTsPc)
alcanado repetindo-se o ciclo descrito acima.
-
Captulo 4 Materiais e mtodos 51
Au-(PVS/PANI-N)
Para a formao dos filmes automontados (PVS/PANI-N), os substratos (quartzo ou
vidro recoberto com Au) foram imersos na soluo policatinica de PANI-N (1 g.L-1
) por 5
minutos, lavados em soluo de pH 5 e secos com N2. Aps formao de uma monocamada
de PANI-N, os substratos foram imersos na soluo polianinica de PVS (1 g.L-1
) lavados em
gua-ultrapura e secos tambm com N2. Os filmes automontados contendo PANI-N foram
aplicados como sensores de pH e posteriormente como biossensores para a determinao de
uria atravs da funcionalizao dos mesmos com a enzima urease.
Au-(PPID/TiO2-Np)
As multicamadas de (PPID/TiO2-Np) foram depositadas sobre substratos de quartzo
para o monitoramento espectroscpico do crescimento ou sobre filmes de vidro recoberto com
Au para aplicao como sensores ou biossensores. O crescimento se deu atravs da imerso
dos substratos na soluo policatinica de PPID (1 mg.mL-1
, pH = 8,0) durante 5 min, seguido
de lavagem em soluo aquosa de mesmo pH e secagem com fluxo de N2. Em seguida os
substratos j recobertos com uma monocamada de PPID foram imersos na disperso aninica
de TiO2-Np (0.25 mg.mL-1
, pH = 8) durante 10 min, imersos na soluo de lavagem e por fim
secos com fluxo de N2. O sistema (PPID/ TiO2-Np) foi utilizado como camada sensvel em
um SEGFET sensor de pH e como biossensor para deteco de glicose atravs da
imobilizao da enzima glicose oxidase nos mesmos.
Au-V2O5.nH2O e Au-(PAH/V2O5-nanobastes)
Diferentes nanoestruturas 1D de V2O5.nH2O foram depositadas via spin coating em
substratos de vidro recoberto com Au e aplicadas diretamente com camada sensvel ao pH.
Uma parte da soluo (100 L) das nanoestruturas solubilizadas a 1 mg.mL-1
foram
diretamente depositadas sobre os substratos utilizando uma rotao de 3000 rpm durante um
tempo de 1 min.
Nanobastes de V2O5.nH2O tambm foram automontados utilizando o polmero
PAH como contra-on. A tcnica de automontagem utilizada nessa parte do trabalho consistiu
em deposies alternadas de PAH e nanobastes de V2O5 pela tcnica SA-LbL descrita na
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52 Captulo 4 Materiais e mtodos
seco 3.2. Para esse propsito, 100 L da soluo de PAH e da soluo de nanobastes de
V2O5.nH2O, ambas a 1 mg.mL-1
, foram alternadamente depositadas em substratos de vidro
recoberto com Au. O tempo de 1 min a uma rotao de 3000 rpm foram utilizados para
secagem das camadas. Para um nmero desejado de bicamadas (PAH/V2O5-nanobastes),
repete-se o procedimento descrito acima. Por fim, o sistema (PAH/V2O5-nanobastes) foi
ativado com urease e aplicado como biossensor para deteco de uria.
4.4 AS ENZIMAS GLICOSE OXIDASE E UREASE
Enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes qumicas sendo
fundamentais para qualquer processo bioqumico a nvel fisiolgico ou biotecnolgico (119).
Apresentando uma extraordinria eficincia cataltica e um alto grau de especificidade por
seus substratos, tais biocatalisadores so utilizadas imobilizadas em suportes adequados em
dispositivos biossensores. Neste trabalho, foram construdos biossensores para deteco de
glicose e uria, dois importantes hemometablitos de interesse clnico a partir da imobilizao
dessas enzimas na porta estendida de dispositivos SEGFETs.
Especificamente, a glicose oxidase (GOx, EC 1.1.3.4) uma enzima da classe das
oxi-redutases que catalisa a oxidao da -D-glicose pelo oxignio molecular em glucono--
lactona, o qual subsequente e espontaneamente, se hidrolisa em gluconato, gerando nessa
hidrlise perxido de hidrognio e prtons, segundo a reao abaixo (49):
2 2 2- - cos GOxD gli e O gluconato H H O (4.1)
Os prtons resultantes da oxidao da glicose provocam uma alterao do pH local,
podendo ento ser utilizados como parmetro de medida para biossensores baseados na
deteco de mudanas de pH (EnFETs), como o SEGFET.
Por sua vez, a urease (EC 3.5.1.5) uma enzima que catalisa a hidrlise da uria
(CO(NH2)2) em dixido de carbono e amnia, gerando hidroxilas OH- como produto
reacional, segundo a reao (120):
2 2 2 2 4( ) 3 2 2ureaseCO NH H O CO NH OH (4.2)
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Captulo 4 Materiais e mtodos 53
Baseado na reao acima, observa-se uma variao de pH em virtude dos produtos
da reao catalisada pela enzima urease. Isto , haver uma diminuio na concentrao de
ons de H+ da soluo de medida devido ao equilbrio cido-base com os produtos da reao
enzimtica, especificamente hidroxilas OH-, portanto, ao contrrio de EnFET de glicose,
haver um aumento no valor do pH local.
4.4.1 MTODO DE IMOBILIZAO ENZIMTICA
O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tem sido importante por
proporcionar a reutilizao das enzimas, aumentar a estabilidade, reduzir custos e aumentar,
em alguns casos, a atividade enzimtica. Esses fatores dependem principalmente da escolha
apropriada do suporte e dos reagentes utilizados no processo de imobilizao (56).
O glutaraldedo, em funo de suas propriedades bifuncionais, tem sido um dos
reagentes mais empregados na imobilizao de enzimas devido formao de ligaes
covalentes entre a enzima e o suporte, conferindo enzima maior estabilidade (121). Por sua
vez, dendrmero PPID bem como o polmero linear PAH, podem ser considerados suportes
ideais para imobilizao de enzimas em virtude do grande percentual de grupos amina
disponveis em suas estruturas, particularmente na periferia da macromolcula (77, 118).
Neste sentido, optou-se pelo mtodo de imobilizao atravs de entrecruzamento da enzima
com o suporte, baseado em trabalhos anteriores realizados em nosso grupo de pesquisa (121).
Para a GOx, uma mistura de 50 mg dessa enzima, 20 mg de albumina do soro bovino
(BSA) e 400 L de GA (2,5% em gua) foram diludos em 1 mL de tampo fosfato (pH 7.0).
No caso da urease, a mistura enzimtica continha 25 mg de urease, 10 mg de BSA e 400 L
de GA (2,5% em gua) tambm diludas em 1 mL de tampo fosfato (pH 6.5). O processo de
imobilizao se completa a partir da adio de 10 L da soluo enzimtica sobre uma rea de
5 mm x 5 mm da porta estendida do SEGFET. Aps a adio soluo, o eletrodo foi seco a
vcuo por 1 hora a 25C. As medidas de biossensoriamento foram realizadas no mesmo dia
em que se processava a imobilizao das enzimas, a no ser em casos do estudo operacional
do biossensor ao longo do tempo.
-
54 Captulo 4 Materiais e mtodos
4.5 LIMPEZA DOS SUBSTRATOS
Os filmes utilizados como porta estendida em dispositivos SEGFET foram
automontados em substratos de quartzo para estudo do crescimento e em substratos
condutores (ITO e vidro recoberto Au) para utilizao com sensores de pH e biossensores.
Filmes de Au com espessura de 120 nm foram preparados pela tcnica de evaporao em
substratos de vidro BK7. Antes da deposio do Au, 30 nm de Cr foi evaporado a fim de se
conferir maior aderncia para o filme de Au.
A limpeza dos substratos de quartzo foi realizada a partir da imerso dos mesmos em
uma soluo de permanganato de potssio (KMnO4) a 0,5 g.L-1
por 24 horas seguido de
lavagem em gua ultrapura em abundncia. Aps a lavagem, os substratos foram imersos em
uma soluo de H2O2 (1:20, v/v) por 2 horas, novamente lavados os com gua ultrapura e
secos com fluxo de N2. O procedimento descrito anteriormente proporciona condies
favorveis de hidrofilizao da superfcie do quartzo para deposio da primeira monocamada
automontada.
Para a limpeza dos substratos condutores, foi utilizada a estratgia proposta por Kim
e colaboradores (122) com algumas adaptaes. Para tal, os substratos de ITO foram imersos
em acetona e agitados em ultra-som por 15 min. Aps serem lavados com gua ultrapura, os
substratos de ITO foram mergulhados em uma soluo de HNO3: HCl: H2O (1:3:20) (gua
rgia diluda) por 10 min e em seguida num bquer contendo gua ultrapura novamente. O
procedimento para limpeza dos substratos de Au foi o mesmo, contudo, o tempo de
tratamento em gua rgia diluda foi de apenas 1 minuto. O procedimento de Kim et. a.l (122)
proporciona a formao de ilhas e um aumento da rugosidade dos substratos, proporcionando
uma melhor adeso de filmes polimricos sobre os mesmos.
4.6 TCNICAS DE CARACTERIZAO UTILIZADAS
Diversas tcnicas de caraterizao foram utilizadas nesse trabalho. O crescimento
dos filmes automontados foi caracterizado por espectroscopia ultravioleta- visvel (UV-Vis).
Espectroscopia na regio do infravermelho com transformada de Fourier foi utilizada para
-
Captulo 4 Materiais e mtodos 55
confirmar a estrutura dos materiais sintetizados. A morfologia das amostras e dos filmes
obtidos foi analisada por microscopia eletrnica de varredura com ganho de emisso de
campo (MEV-FEG) (em parceria com Prof. Dr. Ernesto Chaves Pereira da UFSCAR) e por
microscopia eletrnica de transmisso (TEM) (em parceria com o Prof. Dr. Valmor Mastelaro
e seu ex-aluno de doutorado Dr. Waldir Avansi). A Tabela 4.1 resume as tcnicas utilizadas
para caracterizao dos materiais, a anlise envolvida e o modelo dos equipamentos.
Tabela 4.1 Tcnicas utilizadas para caracterizao dos materiais sintetizados e/ou dos filmes LbL.
Tcnica Equipamento Anlise
Microscopia eletrnica de Varredura
com canho de emisso de campo
(MEV-FEG)
Microscpio Zeiss VP
Supra 35
Caracterizao morfolgica dos
filmes LbL e da PANI-N
Microscopia eletrnica de transmisso
(TEM)
Microscpio JEOL JEM
3010 URP
Tamanho mdio e morfologia das
nanoestruturas de V2O5
Difrao de raios-X (XRD) Difratmetro Rigaku
DMax 2500 PC
Caracterizao cristalogrfica das
nanoestruturas de V2O5
Espectroscopia eletrnica UV-Vis Espectrofotmetro
Hitachi U-2900
Monitoramento do crescimento
dos filmes LbL
Espectroscopia vibracional FTIR Espectrmetro Nicolet
Nexus 470
Caracterizao estrutura da
polianilina
Perfilometria Perfilmetro
VEECO Dektak 150
Espessura dos filmes LbL
4.7 CONFIGURAO EXPERIMENTAL DO DISPOSITIVO SEGFET
No presente trabalho, SEGFETs foram construdos a partir de trs dispositivos
comerciais distintos, mas que possuem uma alta impedncia de entrada: um MOSFET (17,
19), um amplificador operacional (AO) (17, 69) ou ainda um amplificador de instrumentao
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56 Captulo 4 Materiais e mtodos
(18) (AI). A alta impedncia de entrada um requisito necessrio para que o sistema no gere
nem drene corrente do pequeno sinal a ser medido.
Aps experimentar todas as possveis configuraes de um SEGFET, optou-se por
utilizar a configurao baseada no amplificador de instrumentao AD620 por duas razes:
evitar o uso de uma fonte adicional de corrente para medidas dinmicas em um SEGFET
base de MOSFET e, a maior estabilidade operacional desse dispositivo quando comparado
como amplificador operacional. Alm disso, o dispositivo AD620 requer apenas um resistor
externo para ampliar o sinal em at mil vezes, caso fosse necessrio. Portanto, sistema de
medida (SEGFET) utilizado constitudo de um AI AD620 operando como um seguidor de
tenso de altssima impedncia de entrada e de um eletrodo de referncia de prata/cloreto de
prata (Ag/AgCl) utilizado para manter uma tenso de referncia constante. Dessa maneira, a
tenso de entrada igual tenso de sada no AI.
Apesar de a literatura sugerir que um SEGFET pode ser formado por uma camada
sensvel conectada a um amplificador operacional (17) ou a um amplificador de
instrumentao (18), vale ressaltar que essa configurao pode no ser interpretada como um
SEGFET, uma vez que o eletrodo no est conectado diretamente a um MOSFET, mas
basicamente a um circuito de leitura que naturalmente contm FETs. Essa configurao
semelhante a um potencial de circuito aberto (OCP, open circuit potential). Contudo, baseado
na literatura (17-18), optou-se por denominar o dispositivo utilizado no presente trabalho de
SEGFET.
O eletrodo de trabalho e camada sensvel ao pH foram imersos em diferentes
solues tampo. Medidas da tenso de sada no AI em funo do tempo foram realizadas
utilizando um multmetro Keithley 195A a fim de determinar a sensibilidade ao pH dos filmes
obtidos. A Figura 4.2 ilustra o amplificador AD620 e o multmetro Keithley utilizado. A
Figura 4.3 apresenta o esquema utilizado nas medidas do SEGFET e dos biossensores.
Os dados exp