Nina Pihler Diplomsko delo -...
Transcript of Nina Pihler Diplomsko delo -...
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
Nina Pihler
MORFOMETRIČNA ANALIZA JETER MOČERILA
(Proteus anguinus anguinus)
Diplomsko delo
Ljubljana, 2014
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
Dvopredmetni učitelj biologije in gospodinjstva
Nina Pihler
Mentorica: doc. dr. Liljana Bizjak Mali
MORFOMETRIČNA ANALIZA JETER MOČERILA
(Proteus anguinus anguinus)
Diplomsko delo
Ljubljana, 2014
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva. Opravljeno je
bilo na Katedri za zoologijo, v skupini za Funkcionalno morfologijo vretenčarjev Oddelka za
biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija Pedagoške fakultete je potrdila temo in naslov diplomskega dela ter za
mentorico imenovala doc. dr. Lilijano Bizjak Mali.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Nada Žnidaršič
Član: prof. dr. Boris Bulog
Član: doc. dr. Nada Žnidaršič
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne
knjižnice Pedagoške fakultete.
Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Nina Pihler
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
KLJU ČNA DOKUMENTACIJA (KDI)
ŠD Du1
DK UDK 597.92(043.2)=163.6
KG Morfometrija/jetra/pigmentne celice/jamska dvoživka/Proteus anguinus anguinus
AV PIHLER, Nina
SA BIZJAK MALI, Lilijana
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta
LI 2014
IN MORFOMETRIČNA ANALIZA JETER PRI MOČERILU
TD Diplomska naloga
IJ sl/en
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Du1
DC UDK 597.92(043.2)=163.6
CX Morphometry/liver/pigment cells/cave amphibian/Proteus anguinus anguinus
AU PIHLER, Nina
AA BIZJAK MALI, Lilijana
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB University of Ljubljana, Faculty of Education
PY 2014
TI MORPHOMETRIC ANALYSIS OF PROTEUS'S LIVER
DT Graduation thesis
LA sl/en
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
ZAHVALA
Posebna zahvala gre najprej moji mentorici doc. dr. Lilijani Bizjak Mali, ki mi je svetovala in
dajala napotke, ki so me uspešno pripeljali do cilja. Ves čas mi je nudila strokovno pomoč in
prijazno podporo.
Zahvaljujem se doc. dr. Alešu Kladniku in tehniški sodelavki Katji Zdešar Kotnik za pomoč
in nasvete pri statistični obdelavi podatkov.
Zahvaljujem se profesorju doc. dr. Iztoku Tomažiču za strokovne nasvete v povezavi z
diplomo ter za prijazno podporo.
Zahvaljujem se svoji družini, še posebej mami in očetu, ki sta mi omogočila študij, me pri tem
spodbujala in razumela.
Zahvaljujem se tudi partnerju za vso moralno in drugo pomoč ter podporo in razumevanje.
Nazadnje pa se zahvaljujem vsem, ki so mi na kakršenkoli način pomagali, me spodbujali in
nudili podporo pri pisanju diplomske naloge.
Hvala.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
POVZETEK
Morfometrično analizo smo naredili na vzorcih jeter osmih osebkov bele podvrste močerila
(Proteus anguinus anguinus). Z mrežnim testnim sistemom smo ocenili volumenske gostote
hepatocitov, pigmentnih celic, krvnih celic in ostalih struktur v jetrih kontrolnih osebkov ter
jih primerjali s stradanimi osebki (krajši in daljši čas stradanja) in osebki iz zimske sezone. Za
statistično analizo rezultatov smo uporabili neparametrični Kruskal-Wallisov test in Dunnov
primerjalni test. Ugotovili smo, da se volumenska gostota pigmentnih celic v jetrih stradanih
osebkov statistično značilno poveča in je najvišja pri osebkih, stradanih 18 mesecev.
Volumenska gostota pigmentnih celic se statistično značilno poveča tudi pri zimskih osebkih,
vendar je nižja kot pri osebkih, stradanih 18 mesecev in je primerljiva z osebki, stradanimi en
do štiri mesece. Delež krvnih celic in ostalih struktur v jetrih se s stradanjem bistveno ne
spreminja, prav tako ni bistvenih sprememb v zimskem obdobju.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
ABSTRACT
Morphometric analysis has been done on liver samples of eight specimens of the white
subspecies of the Proteus (Proteus anguinus anguinus). With a net test system, we have
evaluated volumetric density of hephatocytes, pigment cells, blood cells, and other structures
in the liver of control specimens and compared them with starved specimens (shorter and
longer period of food deprivation) and with specimens from the winter season. Using non-
parametric Kruskal-Wallis and Dunn’s Comparative tests, we found statistically significant
increases in the volumetric density of pigment cells in the liver of starved specimens with the
highest levels in the specimens that were starved for 18 months. The volumetric density is
also increased in the liver of specimens observed in the winter time, but it is lower than in the
liver of the specimens that were starved for 18 months and comparable to the specimens that
were starved from one to four months. No statistically significant differences were found in
the proportion of blood cells and other structures in the livers of starved or winter time
specimens.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC
H Hepatociti
PC Pigmentne celice
KC Krvne celice
S Sinusoidi
Vh Volumenska gostota hepatocitov
Vpc Volumenska gostota pigmentnih celic
Vkc Volumenska gostota krvnih celic
Vostalo Skupna volumenska gostota sinusoidov, krvnih žil in žolčnih vodov
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
KAZALO
1 UVOD ............................................................................................................................................. 1
2 PREGLED LITERATURE ............................................................................................................. 2
2.1 ŽIVLJENJSKI PROSTOR MOČERILA ................................................................................ 2
2.2 ZGRADBA JETER MOČERILA ........................................................................................... 2
3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ..................................................................................................... 6
4 MATERIALI IN METODE DELA ................................................................................................. 7
4.1 MORFOMETRIČNA ANALIZA ........................................................................................... 8
4.1.1 Volumenska gostota ........................................................................................................ 9
4.2 STATISTIČNA ANALIZA................................................................................................... 10
5 REZULTATI ................................................................................................................................. 11
5.1 RAZMERJE KOMPARTMENTOV V JETRIH MOČERILA ............................................. 11
5.2 PRIMERJAVA VOLUMENSKIH GOSTOT KOMPARTMENTOV V JETRIH KONTROLNIH IN STRADANIH OSEBKOV ................................................................................ 13
5.2.1 Volumenska gostota hepatocitov pri kontrolnih in stradanih osebkih ........................... 13
5.2.2 Volumenska gostota pigmentnih celic pri kontrolnih in stradanih osebkih................... 14
5.2.3 Volumenska gostota krvnih celic in ostalih struktur pri kontrolnih in stradanih osebkih…....................................................................................................................................... 17
5.3 PRIMERJAVA VOLUMENSKIH GOSTOT KOMPARTMENTOV V JETRIH OSEBKOV POLETNE IN ZIMSKE SEZONE .................................................................................................... 20
5.3.1 Volumenska gostota hepatocitov osebkov poletne in zimske sezone ........................... 20
5.3.2 Volumenska gostota pigmentnih celic osebkov poletne in zimske sezone ................... 21
5.3.3 Volumenska gostota krvnih celic in ostalih struktur osebkov poletne in zimske sezone….. ...................................................................................................................................... 23
6 DISKUSIJA IN SKLEPI ............................................................................................................... 26
7 LITERATURA .............................................................................................................................. 28
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Podatki o poskusnih živalih. ............................................................................................ 8
Preglednica 2: Volumenske gostote kompartmentov v jetrih bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus). .............................................................................................................................................. 12
Preglednica 3: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumenske gostote hepatocitov (kontrolni in stradani osebki). ............................................................................................................... 14
Preglednica 4: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto pigmentnih celic (kontrolni in stradani osebki). ............................................................................................................... 16
Preglednica 5: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto krvnih celic (kontrolni in stradani osebki). ............................................................................................................... 18
Preglednica 6: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto ostalih struktur (kontrolni in stradani osebki). ............................................................................................................... 19
Preglednica 7: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumenske gostote hepatocitov osebkov poletne in zimske sezone ......................................................................................................... 21
Preglednica 8: Kruskal-Wallisov in Dunnov test za volumenske gostote pigmentnih celic osebkov poletne in zimske sezone. ...................................................................................................................... 22
Preglednica 9: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto krvnih celic osebkov polene in zimske sezone .......................................................................................................... 24
Preglednica 10: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto ostalih struktur v jetrih osebkov polene in zimske sezone ................................................................................................ 25
KAZALO SLIK
Slika 1: Močeril ali človeška ribica (Proteus anguinus anguinus) (Foto: Domin Dalessi, 2012; Speleološki laboratorij Oddelka za biologijo). ........................................................................................ 1
Slika 2: Zgradba jeter močerila (Proteus anguinus anguinus), parafinska rezina, trikromno barvanje .. 3
Slika 3: Testni mrežni sistem A540 v programu ImageJ......................................................................... 9
Slika 4: Primerjava volumenskih gostot hepatocitov v jetrih hranjenih in stradanih osebkov. ............. 13
Slika 5: Primerjava volumenskih gostot pigmentnih celic v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov. ... 15
Slika 6: Primerjava volumenskih gostot krvnih celic v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov. ........... 17
Slika 7: Primerjava volumenskih gostot ostalih kompartmentov v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov. ................................................................................................................................................. 19
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
Slika 8: Primerjava volumenskih gostot hepatocitov v jetrih poletnih in zimskih osebkov. ................. 20
Slika 9: Primerjava volumenskih gostot pigmentnih celic v jetrih poletnih in zimskih osebkov. ......... 22
Slika 10: Primerjava volumenskih gostot krvnih celic v jetrih poletnih in zimskih osebkov. .............. 24
Slika 11: Primerjava volumenskih gostot ostalih struktur v jetrih poletnih in zimskih osebkov. ......... 25
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
1
1 UVOD
Močeril ali človeška ribica (Proteus anguinus; Laurenti, 1765) naseljuje podzemeljske vode
dinarskega krasa in je edini troglobiontski (izključno jamski) vretenčar v Evropi. Je
neotenična jamska dvoživka, ki vse življenje ohranja larvalne znake, kot so zunanje škrge,
škržne reže, koža z mnogimi larvalnimi značilnostmi in tipični visceralni skelet (Slika 1).
Zaradi izključno jamskega okolja ima razvite raznovrstne prilagoditve na jamsko okolje. Te
prilagoditve so fiziološke (upočasnjen metabolizem, zmožnost stradanja), čutilne
(specializacije čutilnih organov, elektrorecepcija in magnetorecepcija), razvojne (počasen
razvoj do spolne zrelosti) in vedenjske. Močeril je dobro prilagojen na skromne vire hrane;
upočasnjen metabolizem in energijsko bogate zaloge v jetrih mu omogočajo, da lahko preživi
dolga obdobja brez hranjenja (Aljančič idr., 1993; Bulog idr., 2000; Bizjak Mali, Sepčić in
Bulog, 2013).
Slika 1: Močeril ali človeška ribica (Proteus anguinus anguinus) (Foto: Domin Dalessi, 2012;
Speleološki laboratorij Oddelka za biologijo).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
2
2 PREGLED LITERATURE
2.1 ŽIVLJENSKI PROSTOR MO ČERILA
Poznavanje jamskega okolja lahko razjasni biološke prilagoditve močerila (Proteus anguinus)
na jamsko okolje. Vse posebnosti takšnega okolja izhajajo iz osnovnega dejstva, da je kraška
jama bolj ali manj zaprt prostor. Klimatske razmere so dokaj nespremenljive, dotok snovi in
živali od površja je otežen in v takšnih okoljih prevladuje večna tema. Temperatura se v
jamah večinoma ujema s približno povprečno letno temperaturo okolice in se le malokrat
spreminja. Prav tako je nespremenljiva in zelo visoka tudi vlažnost zraka, kar omogoča, da
živali niso izpostavljene izsuševanju v primerjavi z zunaj živečimi živalmi. Ena izmed
največjih prilagoditev, na katero se morajo živali, ki živijo v jamskem okolju, prilagoditi, je
hranjenje. Hrano v jamsko okolje prinašajo vode, ki prihajajo po različnih poteh površja. Te
vode pa zraven raznih živali in hranljivih snovi prinašajo tudi veliko odplak in nevarnih snovi,
zaradi katerih je življenje živali v jamskem okolju vedno bolj ogroženo. Ker v jamskem
okolju prihaja do pomanjkanja hrane, se je močeril prilagodil z upočasnjenim metabolizmom
in odpornostjo proti stradanju. Tako lahko močeril preživi brez hrane več mesecev, let
(Aljančič idr., 1993).
2.2 ZGRADBA JETER MO ČERILA
Močerilova jetra so obsežna in zapolnjujejo velik del trebušne votline. Tako kot pri vseh
vretenčarjih so jetra tudi pri močerilu pomemben presnovni in tudi skladiščni organ. Zaradi
bogate zaloge glikogena in maščob v jetrnih celicah imajo jetra pomembno vlogo v
energijsko-varčni metabolni strategiji in prilagoditvi na pomanjkanje hrane v jamskem okolju
(Bizjak Mali, 2003; Bizjak Mali idr., 2013).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
3
Jetra močerila so zgrajena iz jetrnih celic ali hepatocitov, ki so urejeni v hepatične plošče iz
ene ali več plasti celic, ki ločujejo sosednje krvne sinusoide (Slika 2). Med hepatociti so
obsežni otočki pigmentnih celic, ki vsebujejo melanin, železo in lipofuscin (Prelovšek, 1999;
Bulog idr., 2000; Prelovšek, Bizjak Mali, Bulog, 2008). V stromi iz vezivnega tkiva so krvne
žile in žolčni vodi. Posebnost jeter močerila so še intersticijska hemopoetska mesta ter tanjša
perihepatična granulocitopoetska plast pod vezivno kapsulo (Lapanja, 2010).
Slika 2: Zgradba jeter močerila (Proteus anguinus anguinus), parafinska rezina, Trikromno
barvanje
PC – skupek pigmentnih celic; H – hepatociti; KC – krvne celice intersticijskega hemopoetskega mesta; S – krvni sinusoid.
PC
H
KC
S
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
4
2.2.1 PIGMENTNE CELICE V JETRIH MOČERILA
Za jetra dvoživk in plazilcev so značilne pigmentne celice, ki so v vezivnem tkivu portalnih
kanalov, okoli sinusoidov in v Dissejevem prostoru. Pigmentne celice so pri nižjih
vretenčarjih zastopane tudi v ostalih notranjih organih, kot so vranica, ledvice, pljuča, srce,
gonade in tvorijo tako imenovani ekstrakutaneustni pigmentni sistem (v Barni idr., 1999;
Agius in Roberts, 2003; Gallone idr., 2007).
Večina avtorjev danes opisuje pigmentne celice v jetrih dvoživk in plazilcev kot Kupfferjeve
celice, ki vsebujejo različne količine melanina in drugih struktur (Agius in Roberts, 2003).
Kupfferjeve celice so nekateri avtorji opisovali kot celice, ki so sposobne fagocitirati melanin,
same pa naj ne bi imele melanosintetske sposobnosti (v Prelovšek, 2002). Skozi več let se je
ugotavljal točen pomen in delovanje Kupfferjevih celic in tako so v osemdesetih in
devetdesetih letih 20. stoletja dokazali, da je zastopanost melanina v Kupfferjevih celicah pri
dvoživkah in plazilcih posledica sposobnosti producirati melanosome in sintetizirati melanin
(v Prelovšek, 2002). Melanosinteza je potrjena tudi za pigmentne celice v jetrih močerila
(Prelovšek, 2002; Prelovšek in Bulog, 2003). Razen melanina so v pigmentnih celicah jeter
dvoživk in tudi močerila še železovi pigmenti v obliki hemosiderina in pogosto tudi
lipofuscin, ki je produkt razgradnje endogenega materiala.
Pigmentni sistem v jetrih nižjih vretenčarjev ima zaščitno funkcijo, saj lahko melanin veže
proste superoksidne anione ter tako organizem ščiti pred lipoperoksidacjo in s tem pred
poškodbo membran, veže in akumulira lahko številne strupene snovi, shranjuje številne ione
in druge snovi ter ima pomembno vlogo pri vzdrževanju homeostaze, detoksifikaciji in
ekskreciji (v Prelovšek, 2002). Melanin je alternativa encimom antioksidantnega sistema.
Pomen železovih pigmentov je predvsem shranjevanje železa, ki mora biti po potrebi znova
na razpolago (v Prelovšek, 2002).
V jetrih močerila (Proteus anguinus) so pigmentne celice številne in se združujejo v večje
pigmentne skupke (Prelovšek idr., 2008). Primerjalna študija jeter močerila in sorodnega
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
5
nektura (Necturus maculosus) je pokazala, da je delež pigmentnih skupkov podoben v jetrih
obeh podvrst močerila (P. a. anguinus in P. a. parkelj) in zavzema 16,5 ± 5 % jetrnega tkiva,
pri nekturu pa je pigmentnih skupkov bistveno manj (3,5 ± 1,1 %) (Prelovšek idr., 2008).
Avtorji opisujejo tudi razlike na histološkem in ultrastrukturnem nivoju med obema rodovoma
iz družine močerilarjev (Proteus vs. Necturus). Velike razlike med obema rodovoma so tudi v
vsebnosti pigmentov. Pigmentne celice v jetrih nektura vključujejo predvsem melanin in malo
železa, medtem ko so pri močerilu pomembno mesto akumulacije železa. Železo v jetrih
močerila se najverjetneje nalaga zaradi nizke presnove in dolgoživosti osebka. Akumulirano
železo je po drugi strani pomembna prilagoditev na jamsko okolje, saj je razpoložljivost hrane
v jamskem okolju majhna in nekontinuirana (Prelovšek idr., 2008).
Delež pigmentnih skupkov v jetrih dvoživk se razlikuje med različnimi vrstami organizmov,
tudi med predstavniki iste vrste, kar je odvisno od fiziološkega stanja živali, starosti,
stradanja, okvare tkiva, metabolizma, hibernacije, hipoksije (Agius in Roberts, 2003; v
Prelovšek idr., 2008). Prav tako na prisotnost pigmentnih skupkov vpliva okolje (v Agius in
Roberts, 2003; Prelovšek idr., 2008).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
6
3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
Namen naloge je oceniti relativne volumne hepatocitov, pigmentnih celic, krvnih celic,
sinusoidov, žolčnih vodov in žil oziroma kompartmentov v jetrih bele podvrste močerila
(Proteus anguinus anguinus). Zanima nas, če je volumenska gostota kompartmentov odvisna
od prehranjenosti osebka in tudi sezone. Volumenska gostota je najpogosteje uporabljena
spremenljivka, saj jo je preprosto določiti, prav tako tudi prispeva koristne osnovne
informacije o notranji zgradbi organa.
Pričakujemo razlike v volumenskih deležih kompartmentov v jetrih kontrolnih in stradanih
osebkov močerila in tudi med osebki iz različnih sezon. Predvidevamo, da bodo očitne razlike
predvsem v volumenski gostoti pigmentnih skupkov, ki bodo višje pri stradanih osebkih, saj
je stradanje eden od dejavnikov, ki vpliva na pigmentiranost v jetrih poikilotermnih
vretenčarjev. Višjo volumensko gostoto pigmentnih celic pričakujemo tudi pri osebkih iz
zimskega obdobja, saj je v tem obdobju razpoložljivost hrane v jamskem okolju še nižja kot
sicer.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
7
4 MATERIALI IN METODE DELA
Morfometrično analizo smo naredili na histoloških preparatih jeter osmih osebkov bele
podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus). Živali so bile žrtvovane za potrebe raziskav
skupine za Funkcionalno morfologijo vretenčarjev na Oddelku za biologijo Biotehniške
fakultete, Univerze v Ljubljani, njihova tkiva pa so bila fiksirana in arhivirana.
Osebki močerila so bili izlovljeni na treh različnih lokacijah (Preglednica 1). Šest osebkov je
bilo izlovljenih v Planinski jami (Postojna, Slovenija), en v Kompoljski jami (Dobrepolje,
Slovenija) in en na Otovškem bregu (Otovec, Slovenija). Vsi osebki so bile samice, telesne
dolžine od 222 mm do 270 mm in teže od 11,4 g do 24,6 g. Do žrtvovanja so bile vzdržane v
speleološkem laboratoriju na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Ljubljana, v
akvarijih z vodnimi filtrirnimi črpalkami, pri temperaturi 10 °C in stalni temi. Polovica
osebkov je bila v poskusih stradanja, od teh dva osebka (P132, P137) v poskusu stradanja za
dolžino od enega meseca do štirih mesecev in dva osebka (P147, P177) v poskusu stradanja
za dolžino osemnajstih mesecev. Dva osebka (P129, P130) sta bila hranjena enkrat tedensko s
postranicami (Crustacea: Amphipoda). Dva osebka (P152 in P158) sta bila izlovljena in
žrtvovana v zimskem obdobju.
Osebke smo razdelili v naslednje vzorčne skupine (Preglednica 1):
• kontrolni osebki, ki so bili hranjeni enkrat tedensko (P129 in P130),
• osebki, stradani od enega meseca do štirih mesecev (P132 in P137),
• osebki, stradani osemnajst mesecev (P147 in P177),
• osebki iz zimske sezone (P152 in P158).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
8
Preglednica 1: Podatki o poskusnih živalih
EVIDENČNA
ŠTEVILKA
LOKALITETA
SPOL
DATUM
ŽRTVOVANJA
DOLŽINA
OSEBKA
[mm]
MASA
OSEBKA
[g]
Kontrolni osebki
P129 Planinska jama Samica 9. 6. 1998 239 /
P130 Planinska jama Samica 9. 6. 1998
268 23,5
Zimski osebki
P152 Kompoljska jama Samica 30. 1. 2001
260 16,9
P158 Otovški breg Samica 6. 1. 2003
260 24,6
Stradani osebki
P132* Planinska jama Samica 19. 1. 1999 226 17,0
P137* Planinska jama Samica 14. 4. 1999 222 /
P147** Planinska jama Samica 12. 4. 2000 270 18,8
P177** Planinska jama Samica 19. 5. 2005 250 11,4
Opomba: * ena do štiri mesece stradani osebki, ** osemnajst mesecev stradani osebki.
4.1 MORFOMETRI ČNA ANALIZA
Za morfometrično analizo smo uporabili 5 µm debele histološke rezine jeter osmih osebkov
bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus). Vsi vzorci so bili iz mediane regije jeter.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
9
S svetlobnim mikroskopom OPTON-Axioskop Zeiss, opremljenim z digitalno kamero Leica
DFC290 HD, smo poslikali dvajset naključnih mest pri 100-kratni povečavi. Za zajemanje
slik smo uporabili računalniški program Leica LAS 4. S pomočjo prosto dostopnega programa
Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) smo slike analizirali z mrežnim sistemom A540 (Weibel,
1978; Kališnik, 2002).
4.1.1 Volumenska gostota
Prostorninska ali volumenska gostota (Vv) je relativna stereološka spremenljivka, ki pove,
kolikšen delež vsebujočega prostora zavzema proučevana struktura (Kališnik, 2002).
Volumensko gostoto (Vv) določenega kompartmenta znotraj jeter smo ocenili iz točkovne
gostote v presečni ravni:
1. Sliko jetrnega tkiva smo prekrili s testnim mrežnim sistemom. Glede na velikost
opazovanih struktur smo izbrali mrežni sistem A540, ki je vključeval 540 točk (27x20)
(Slika 3).
2. Prešteli smo presečišča (Pf) za vsak posamezni kompartment jeter.
3. Volumensko gostoto (Vv) smo izračunali tako, da smo število zadetkov na izbrani
strukturi (Pf) delili s številom vseh testnih točk znotraj testnega polja (Pt):
Vv=Pf/Pt.
Slika 3: Testni mrežni sistem A540 v programu ImageJ
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
10
4.2 STATISTIČNA ANALIZA
Podatke, pridobljene s programom ImageJ, smo vstavili v MS Excelovo tabelo in izračunali
volumensko gostoto posameznih kompartmentov (heparociti, pigmentne celice, krvne celice
in ostalo) v jetrih močerila.
Statistično analizo rezultatov smo naredili v programu GraphPad Prism 6.01 za Windows
(GraphPad Software, ZDA). Za ugotavljanje statistično značilnih razlik med posameznimi
kompartmenti različnih osebkov močerila smo uporabili neparametrični Kruskal-Wallisov test
in Dunnov primerjalni test. Vrednosti v grafih so podane kot mediane z interkvartili.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
11
5 REZULTATI
V jetrih bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus) smo ocenili volumenske gostote
hepatocitov, pigmentnih celic, krvnih celic, sinusoidov, žil in žolčnih vodov pri kontrolnih
osebkih in jih primerjali z vzorci jeter stradanih in zimskih osebkov. Sinusoide, krvne žile in
žolčne vode v nadaljevanju obravnavamo kot ostale strukture.
5.1 RAZMERJE KOMPARTMENTOV V JETRIH MO ČERILA
Iz Preglednice 2 je razvidno, da je v jetrih močerila največ hepatocitov, in sicer 67,5 ± 6,5
% (minimalno 63 %, maksimalno 72 %). Sledijo pigmentne celice s 22,5 ± 6 % (minimalno
18 %, maksimalno 28 %). Najnižji je delež krvnih celic in ostalih struktur (5,5 ± 1 % za
krvne celice in 4,5 ± 2,5 % za ostale strukture).
Podobno razmerje v prid hepatocitov zasledimo pri zimskih osebkih (P152 in P158) in
osebkih, stradanih od enega meseca do štirih mesecev (P132 in P137) (Preglednica 2). Pri
zimskih osebkih je delež hepatocitov 56,5 ± 5,5 % (minimalno 55 %, maksimalno 58 %), pri
osebkih, stradanih krajši čas, pa 55 ± 9,5 % (minimalno 53 %, maksimalno 57 %), torej v
obeh primerih nižji kot pri kontrolnih osebkih. Delež pigmentnih celic je v obeh skupinah
podoben in nekoliko višji kot pri kontroli, in sicer 29 ± 5,5 % (minimalno 27 %, maksimalno
32 %) (Preglednica 2).
V jetrih osebkov, stradanih osemnajst mesecev, je delež pigmentnih celic najvišji, in sicer 54
± 5 % (minimalno 47 %, maksimalno 61 %), delež hepatocitov pa najnižji (35 ± 5 %;
minimalno 27 %, maksimalno 43 %) (Preglednica 2).
Delež krvnih celic in ostalih struktur pri zimskih in stradanih osebkih ni bistveno drugačen
od kontrole (Preglednica 2).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
12
Preglednica 2: Volumenske gostote kompartmentov v jetrih bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus).
OSEBEK ARITMETI ČNA SREDINA (M) STANDARDNI ODKLON (SD)
Vh Vpc Vkc Ostalo Vh Vpc Vkc Ostalo
Kontrolni osebki
P129 0,72 0,18 0,06 0,04 0,06± 0,06± 0,01± 0,03±
P130 0,63 0,27 0,05 0,05 0,07± 0,06± 0,01± 0,02±
Zimski osebki
P152 0,55 0,27 0,06 0,12 0,04± 0,04± 0,02± 0,02±
P158 0,58 0,31 0,07 0,04 0,07± 0,05± 0,01± 0,03±
Stradani osebki
P132* 0,53 0,32 0,07 0,08 0,13± 0,05± 0,02± 0,02±
P137* 0,57 0,27 0,12 0,04 0,06± 0,03± 0,03± 0,02±
P147** 0,43 0,47 0,05 0,05 0,05± 0,05± 0,01± 0,02±
P177** 0,27 0,61 0,05 0,07 0,05± 0,05± 0,02± 0,02±
Opomba: * ena do štiri mesece stradani osebki, ** osemnajst mesecev stradani osebki. P129 in P130 sta
kontrolna/poletna osebka; P152 in P158 sta zimska osebka.
Legenda: Vh – hepatociti, Vpc – pigmentne celice, Vkc – krvne celice, Ostalo – sinusoid , žile, žolčni vodi
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
13
5.2 PRIMERJAVA VOLUMENSKIH GOSTOT KOMPARTMENTOV V JETRIH KONTROLNIH IN STRADANIH OSEBKOV
5.2.1 Volumenska gostota hepatocitov pri kontrolnih in stradanih osebkih
Volumenska gostota hepatocitov je najvišja v jetrih kontrolnih osebkov (P129 in P130) (Slika
4). Pri stradanih osebkih (P132, P137, P147 in P177) je volumenski delež hepatocitov nižji v
primerjavi s kontrolo, in je najnižji pri osemnajst mesecev stradanih osebkih (P147 in P177)
(Slika 4). Izrazite statistično značilne razlike so med kontrolo in osemnajst mesecev
stradanimi osebki (P129, P130 vs. P147, P177), (p ˂ 0,0001) (Preglednica. 3). Med kontrolo
in ena do štiri mesece stradanimi se izkazuje razlika samo z enim kontrolnim osebkom (P129
vs. P132 in P137) (Preglednica 3). Med osebki znotraj vzorčnih skupin ni statistično značilnih
razlik (P129 vs. P130, P132 vs. P137, P147 vs. P177) (Preglednica 3).
Slika 4: Primerjava volumenskih gostot hepatocitov v jetrih hranjenih in stradanih osebkov.
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137, en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177,
osemnajst mesecev stradana osebka.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
14
Preglednica 3: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumenske gostote hepatocitov (kontrolni in stradani osebki).
Kruskal-Wallis test
P value < 0.0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 6
Kruskal-Wallis statistic 99,04
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 21,75 No Ns
P129 vs. P132 41,49 Yes **
P129 vs. P137 39,6 Yes **
P129 vs. P147 73,7 Yes ****
P129 vs. P177 94,63 Yes ****
P130 vs. P132 19,74 No Ns
P130 vs. P137 17,85 No Ns
P130 vs. P147 51,95 Yes ****
P130 vs. P177 72,88 Yes ****
P132 vs. P137 -1,888 No Ns
P132 vs. P147 32,21 No Ns
P132 vs. P177 53,14 Yes ****
P137 vs. P147 34,1 Yes *
P137 vs. P177 55,03 Yes ****
P147 vs. P177 20,93 No Ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik..
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137 en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177 osemnajst mesecev stradana osebka.
5.2.2 Volumenska gostota pigmentnih celic pri kontrolnih in stradanih osebkih
Pri kontrolnih osebkih (P129 in P130) je volumenska gostota pigmentnih celic nižja kot pri
stradanih osebkih (Slika 5). Pri en mesec stradanih osebkih (P132 in P137) je volumenska
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
15
gostota nekoliko višja od kontrolnih, izrazito pa je povišana pri osemnajst mesecev stradanih
osebkih (P147 in P177). Razlike v volumenski gostoti pigmentnih celic so statistično značilne
med kontrolnimi in osemnajst mesecev stradanimi osebki (p ˂ 0,0001) (Preglednica 4) ter
med osebki, stradanimi krajši in daljši čas (P132 in P137 vs. P147 in P177) (Preglednica 4).
Med kontrolo in en mesec do štiri mesece stradanima osebkoma ni značilnih razlik
(Preglednica 4), razen v primeru kontrole P129 in en mesec stradanim osebkom P132. Iz
Dunnovega primerjalnega testa (Preglednica 4) je razvidno, da med osebki znotraj vzorčnih
skupin ni statistično značilnih razlik (P129 vs. P130; P132 vs. P137; P147 vs. P177)
(Preglednica 4).
Slika 5: Primerjava volumenskih gostot pigmentnih celic v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov.
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137 en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177
osemnajst mesecev stradana osebka.
pigmentne celice
vol.
go
sto
ta
P129 P130 P132 P137 P147 P1770.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
16
Preglednica 4: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto pigmentnih celic (kontrolni in stradani osebki).
Kruskal-Wallis test
P value < 0.0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 6
Kruskal-Wallis statistic 99,04
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 -26,83 No Ns
P129 vs. P132 -45,1 Yes ***
P129 vs. P137 -26,75 No Ns
P129 vs. P147 -74,43 Yes ****
P129 vs. P177 -94,2 Yes ****
P130 vs. P132 -18,28 No Ns
P130 vs. P137 0,075 No Ns
P130 vs. P147 -47,6 Yes ***
P130 vs. P177 -67,38 Yes ****
P132 vs. P137 18,35 No Ns
P132 vs. P147 -29,33 No Ns
P132 vs. P177 -49,1 Yes ***
P137 vs. P147 -47,68 Yes ***
P137 vs. P177 -67,45 Yes ****
P147 vs. P177 -19,78 No Ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik..
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137 en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177 osemnajst mesecev stradana osebka.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
17
5.2.3 Volumenska gostota krvnih celic in ostalih struktur pri kontrolnih in
stradanih osebkih
Med kontrolnimi osebki ni bistvenih razlik v volumenski gostoti krvnih celic (Slika 6),
izstopa samo osebek P137. Volumenska gostota krvnih celic v jetrih osebka P137 se
statistično značilno razlikuje (p ˂ 0,0001) od volumenske gostote pri kontroli (P137 vs. P129
in P130) ter od obeh osebkov, stradanih osemnajst mesecev (P137 vs. P147 in P177)
(Preglednica 5). Med osebki znotraj vzorčne skupine ni statistično značilnih razlik, prav tako
ni statistično značilnih razlik med kontrolo in osebki, stradanimi osemnajst mesecev
(Preglednica 5). Prav tako ni bistvenih razlik v volumenski gostoti ostalih struktur med
kontrolnimi in stradanimi osebki (Slika 7 in Preglednica 6), izstopa osebek P177. Statistično
značilne razlike (p ˂ 0,0003) v volumenski gostoti ostalih struktur so med obema osemnajst
mesecev stradanima osebkoma (P147 vs. P177) in v primeru kontrole P129 in osemnajst
mesecev stradanim osebkom P177 (Preglednica 6).
Slika 6: Primerjava volumenskih gostot krvnih celic v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov.
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137 en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177 osemnajst mesecev stradana osebka.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
18
Preglednica 5: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto krvnih celic (kontrolni in stradani osebki).
Kruskal-Wallis test
P value < 0.0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 6
Kruskal-Wallis statistic 60,9
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 22,78 No Ns
P129 vs. P132 -16,38 No Ns
P129 vs. P137 -45,8 Yes ***
P129 vs. P147 17,13 No Ns
P129 vs. P177 22,43 No Ns
P130 vs. P132 -39,15 Yes **
P130 vs. P137 -68,58 Yes ****
P130 vs. P147 -5,65 No Ns
P130 vs. P177 -0,35 No Ns
P132 vs. P137 -29,43 No Ns
P132 vs. P147 33,5 Yes *
P132 vs. P177 38,8 Yes **
P137 vs. P147 62,93 Yes ****
P137 vs. P177 68,23 Yes ****
P147 vs. P177 5,3 No Ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik..
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in p137 en mesec do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177 osemnajst mesecev stradana osebka.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
19
Slika 7: Primerjava volumenskih gostot ostalih kompartmentov v jetrih kontrolnih in stradanih osebkov.
P129 in P130, hranjena osebka; P132 in P137 en do štiri mesece stradana osebka; P147 in P177 osemnajst
mesecev stradana osebka.
Preglednica 6: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto ostalih struktur (kontrolni in stradani osebki).
Kruskal-Wallis test
P value < 0,0003
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ***
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 6
Kruskal-Wallis statistic 23,58
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 -14,43 No Ns
P129 vs. P132 -14,63 No Ns
P129 vs. P137 -2,425 No Ns
P129 vs. P147 0,675 No Ns
P129 vs. P177 -43,9 Yes ***
P130 vs. P132 -0,2 No Ns
P130 vs. P137 12 No Ns
P130 vs. P147 15,1 No Ns
P130 vs. P177 -29,48 No Ns
P132 vs. P137 12,2 No Ns
P132 vs. P147 15,3 No Ns
P132 vs. P177 -29,28 No Ns
P137 vs. P147 3,1 No Ns
P137 vs. P177 -41,48 Yes **
P147 vs. P177 -44,58 Yes ***
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik..
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
20
5.3 PRIMERJAVA VOLUMENSKIH GOSTOT KOMPARTMENTOV V JETRIH OSEBKOV POLETNE IN ZIMSKE SEZONE
5.3.1 Volumenska gostota hepatocitov osebkov poletne in zimske sezone
Volumenska gostota hepatocitov je pri poletnih osebkih (P129 in P130) višja kot pri zimskih
osebkih (P152 in P158) (Slika 8). Iz Dunnovega primerjalnega testa je razvidno, da med
osebki znotraj vzorčnih skupin (med poletnimi in zimskimi osebki) ni statistično značilnih
razlik (P129 vs. P130 in P152 vs. P158) (Preglednica 7). Razlike v volumenski gostoti
hepatocit so statistično značilne (p ˂ 0,0001) le med poletnim osebkom P129 in obema
zimskima osebkoma P152 in P158 (Preglednica 7).
Slika 8: Primerjava volumenskih gostot hepatocitov v jetrih poletnih in zimskih osebkov.
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
21
Preglednica 7: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumenske gostote hepatocitov osebkov poletne in zimske sezone
Kruskal-Wallis test
P value < 0,0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 4
Kruskal-Wallis statistic 40,46
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 -14,43 No Ns
P129 vs. P152 42,35 Yes ****
P129 vs. P158 37,50 Yes ****
P130 vs. P152 20,60 Yes *
P130 vs. P158 15,75 No Ns
P152 vs. P158 -4,850 No Ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik.
5.3.2 Volumenska gostota pigmentnih celic osebkov poletne in zimske sezone
Do statistično značilnih razlik v volumenski gostoti pigmentnih celic prihaja le med poletnim
osebkom P129 in obema zimskima osebkoma P152 in P158 (Slika 9 in Preglednica 8). Iz
Dunnovega primerjalnega testa (Preglednica 8) je razvidno, da med osebki znotraj vzorčnih
skupin (P129 vs. P130 in P152 vs. P158) ni statistično značilnih razlik, kot tudi ne med
poletnim osebkom P130 in obema zimskima osebkoma (P152 in P158).
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
22
Slika 9: Primerjava volumenskih gostot pigmentnih celic v jetrih poletnih in zimskih osebkov.
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Preglednica 8: Kruskal-Wallisov in Dunnov test za volumenske gostote pigmentnih celic osebkov poletne in zimske sezone.
Kruskal-Wallis test
P value < 0,0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 4
Kruskal-Wallis statistic 32,84
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 -14,43 No Ns
P152 vs. P129 26,63 Yes **
P158 vs. P129 41,15 Yes ****
P152 vs. P130 -0,5000 No Ns
P158 vs. P130 14,03 No Ns
P158 vs. P152 14,53 No Ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik..
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
23
5.3.3 Volumenska gostota krvnih celic in ostalih struktur osebkov poletne in zimske sezone
Pri volumenski gostoti krvnih celic v jetrih poletnih in zimskih osebkov ne prihaja do
statistično značilnih razlik (Slika 10 in Preglednica 9), razen v primeru poletnega osebka P130
in zimskega osebka P158 (p ˂ 0,0002) (Preglednica 9).
V volumenski gostoti v ostalih strukturah v jetrih izstopa le zimski osebek P152 (Slika 11),
pri katerem je volumenska gostota ostalih struktur statistično značilno različna (p ˂ 0,0001)
od obeh poletnih osebkov P129 in P130 ( P152 vs. P129 in P130) (Preglednica 10). Med
ostalimi osebki ni statistično značilnih razlik.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
24
Slika 10: Primerjava volumenskih gostot krvnih celic v jetrih poletnih in zimskih osebkov.
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Preglednica 9: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto krvnih celic osebkov poletne in zimske sezone
Kruskal-Wallis test
P value < 0,0002
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ***
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 4
Kruskal-Wallis statistic 19,36
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 17,33 No ns
P129 vs. P152 0,0 No ns
P129 vs. P158 -14,93 No ns
P130 vs. P152 -17,33 No ns
P130 vs. P158 -32,25 Yes ****
P152 vs. P158 -14,93 No ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik. P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
25
Slika 11: Primerjava volumenskih gostot ostalih struktur v jetrih poletnih in zimskih osebkov.
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Preglednica 10: Kruskal-Wallisov in Dunnov primerjalni test za volumensko gostoto ostalih struktur v jetrih osebkov poletne in zimske sezone
Kruskal-Wallis test
P value < 0,0001
Exact or approximate P value? Approximate
P value summary ****
Do the medians vary signif. (P < 0.05) Yes
Number of groups 4
Kruskal-Wallis statistic 44,83
Dunn's multiple comparisons test Mean rank diff. Significant? Summary
P129 vs. P130 -6,975 No ns
P129 vs. P152 -39,95 Yes ****
P129 vs. P158 4,325 No ns
P130 vs. P152 -32,98 Yes ****
P130 vs. P158 11,30 No ns
P152 vs. P158 -14,93 No ns
Opomba: ns – ni statistično značilnih razlik. Z zvezdico je izražena stopnja statistično značilnih razlik.
P129 in P130, poleta sezona; P152 in P158, zimska sezona.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
26
6 DISKUSIJA IN SKLEPI
V diplomskem delu smo ocenili volumensko gostoto posameznih kompartmentov v jetrih bele
podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus) in rezultate primerjali z vzorci jeter stradanih
osebkov in osebkov iz zimske sezone. Zanimalo nas je, če prehranjenost osebkov in letna
sezona vplivata na volumensko gostoto kompartmentov v jetrih.
Volumenski delež hepatocitov v jetrih močerila je 67,5 ± 6,5 %, pigmentnih celic 22,5 ± 6 %,
krvnih celic 5,5 ± % in ostalih struktur 4,5 ± 2,5 %. Delež pigmentnih celic je primerljiv z
rezultati, opisanimi v Prelovšek idr. (2008). V raziskavi so primerjali delež pigmentnih celic v
jetrih obeh podvrst močerila (P. a.s anguinus in P. a. parkelj) in pri sorodnem nekturu
(Necturus maculosus). Avtorji ugotavljajo, da so pigmentne celice v jetrih močerila
številčnejše in združene v večje pigmentne skupke kot pri nekturu. V jetrih bele podvrste
močerila zavzemajo pigmentne celice 15,4 ± 3 %, pri črni podvrsti je ta odstotek nekoliko
višji, in sicer 17,7 ± 6,5 %. Pri sorodnem nekturju je delež pigmentnih celic v primerjavi z
belo in črno podvrsto močerila bistveno nižji, in sicer od 3,5 ± 1.1 % .
Iz rezultatov naše analize je razvidno, da se od vseh kompartmentov v jetrih močerila najbolj
spreminjata volumenski gostoti hepatocitov in pigmentnih celic. Pri stradanih osebkih se
volumenska gostota hepatocitov zniža, kar sovpada z zmanjšanjem velikosti hepatocitov, ki jo
opisuje Bizjak Mali (2013) za jetra stradanih osebkov močerila, saj stradanje privede do
porabe glikogena in maščobnih rezerv v hepatocitih. Zmanjšanje velikosti hepatocitov med
stradanjem opisujejo tudi za druge dvoživke (v Bizjak Mali, 2013) in tudi za sesalce (Belloni
idr., 1988). V jetrih 24 ur stradanih podgan se povprečni volumen hepatocitov zmanjša za 25
% (Belloni idr., 1988). V našem primeru se volumenski delež hepatocitov v jetrih stradanih
osebkov zmanjša za 18,5 % pri krajši čas stradanih ter za 47,4 % pri stradanih daljše časovno
obdobje.
Volumenska gostota pigmentnih celic se v jetrih stradanih osebkov močerila statistično
značilno poveča. Največji delež pigmentnih skupkov v jetrih so imeli osebki, stradani
osemnajst mesecev, in sicer kar 31,5 % več v primerjavi s kontrolnimi osebki. Povečanje
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
27
pigmentiranosti v jetrih dvoživk je značilno za obdobje hibernacije, med stradanjem, v
jesensko-zimskem obdobju (Barni idr., 1999), kar razlagajo z znižanjem metabolne aktivnosti
jeter. Pigmentne celice naj bi v zimskem času nadomestile hepatocite, ki so v tem letnem času
hipoaktivne. Pigmentne celice so pravzaprav tkivni makrofagi, ki so udeleženi pri aktivni
fagocitozi različnih tkivnih materialov (na primer celičnih razbitin, melanina, zrn
hemosiderina, lupufuscinskih ostankov in tudi lipidnih kapelj) (Agius in Roberts, 2003).
Njihovo pojavljanje je medvrstno variabilno, prav tako tudi med osebki iste vrste. Dejavniki,
ki vplivajo na pojavnost pigmentnih celic v jetrih, so zelo raznoliki, kot na primer
metabolizem železa in hemoglobina, različni imunski odzivi, stradanje, temperatura okolja,
hipoksija, velikost in starost osebka (Corsaro idr., 1990; Barni idr., 1999).
Ugotavljamo tudi, da ni statistično značilnih razlik v volumenski gostoti krvnih celic in
ostalih struktur med kontrolnimi in stradanimi. Statistično značilna razlika je sicer izražena
individualno znotraj vzorčnih skupin tako v primeru krvnih celic kot tudi ostalih struktur,
vendar je lahko vzrok napaka pri morfometrični analizi.
Primerjali smo tudi vzorce jeter osebkov poletne in zimske sezone ter ugotovili, da imajo
osebki iz zimske sezone statistično značilno nižji volumenski delež hepatocitov in večji delež
pigmentnih celic v primerjavi z osebki poletne sezone. Glede na nekatere raziskave je
pigmentiranost v jetrih dvoživk najvišja v jesensko-zimskem času in najnižja v pomladno-
poletnem času (Corsaro idr., 1990). Delež pigmentnih skupkov v jetrih zimskih osebkov
močerila je primerljiv z deležem v jetrih osebkov, stradanih krajši čas, in bistveno nižji kot pri
osebkih, stradanih osemnajst mesecev.
Potrdimo lahko, da stradanje vpliva na razmerje kompartmentov v jetrih močerila. Pri
osebkih, izpostavljenih stradanju v laboratorijskih pogojih in tudi osebkih iz zimske sezone,
se delež pigmentnih celic v jetrih statistično značilno poviša, delež hepatocitov pa se zniža.
Čeprav je bil vzorec osebkov v naši raziskavi relativno majhen, naši rezultati izkazujejo vpliv
prehranjenosti na pigmentiranost v jetrih močerila. Vsekakor rezultati niso zanemarljivi in
predstavljajo dober uvod v bolj obširno raziskavo vpliva različnih dejavnikov na
pigmentiranost jeter močerila.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
28
7 LITERATURA
Agius, C. in Roberts, R. J. (2003). Melano–macrophage centers and their role in fish
pathology. J Fish Diseases, 26, 499–509.
Aljanič, M., Bulg, B., Krajnc, A., Josipovič, D., Sket, B. in Skoberne, P. (1993). Proteus
skrivnostni vladar kraške teme. Ljubljana: Vitrum.
Barni, S., Bertone, V., Celeta, A.C., Bottiroli, G., Bernini, F. in Gerzeli, G. (1990). Increase in
liver pigmentation during natural hibernation in some amphibians. J Anat, 195: 19–25.
Belloni, A.S., Rebuffat, P., Gottardo, G., Meneghelli, V., Coi, A., Mazzocchi, G. in
Nussdorfer, G. G. (1988). A morphometric study of the effects of short-term starvation on
rat hepatocytes. J. Submiceosc. Cytol. Pathol., 20 (4), 751–757.
Bizjak Mali L. (2003). Vpliv stradanja na ultrastrukturo hepatocitov močerila (Proteus
anguinus, Amphibia, Urodela) (Doktorska disertacija). Biotehniška fakulteta, Univerza v
Ljubljani.
Bizjak Mali, L., Sepčić, K. in Bulog, B. (2013). Long-Term Starvation in Cave Salamander
Effects on Liver Ultrastructure and Energy Reserve Mobilization. J Morphol, 274, 887–
900.
Bulog, B., Bizjak Mali, L., Kos, M., Mihajl, K., Prelovšek, P. M. in Aljaničič, G. (2000).
Biology and functional morphology of Proteus anguinus (Amphibia, Caudata). Acta
biologica slovenica 43 (3), 85–102.
Corsaro, C., Scalia, M., Sinatra, F. in Sichel, G. (1990). Circannual rhythm of the melanin content in frog liver (Rana esculenta L.). Pigment cell research 3(2), 120–122.
Gallone, A., Sagliono, A., Guida, G., Ito, S., Wakamastu, K., Capozzi, V., Perna, G., Zanna,
P. in Cicero, R. (2007). The melanogenic sytem of the liver pigmented machrophages of
Rana esculenta L. – Tyrosinase activity. Histology and Histopatholgy, 22, 1065–1075.
Henninger, J.M. in Beresford, W.A. (1990). Is it coincidence that iron and melanin coexist in
hepatic and other melanomacrophages? Histology and Histopatholgy, 5, 457–459.
Kališnik, M. 2002. Temelji stereologije. Tretja predelana izdaja. Društvo za stereologijo in
kvantitativno analizo slike, Ljubljana.
Pihler, N. Morfometrična analiza jeter močerila (Proteus anguinus anguinus). Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2014.
29
Lapanja, N. (2010). Hemopoetska mesta v ledvicah in jetrih močerilarjev (Amphibia:
Proteidae) (Diplomsko delo). Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani Prelovšek, P.
M. (1999). Morfološka analiza jeter pri močerilu (Diplomsko delo). Biotehniška
fakulteta, Univerza v Ljubljani.
Prelovšek, P. M. (2002). Histokemijska in ultrastrukturna analiza pigmentnih celic v jetrih
močerila (Proteus anguinus, Amphibia: Urodela) (Magistrsko delo). Medicinska
fakulteta. Univerza v Ljubljani.
Prelovšek, P. M. in Bulog B. (2003). Biogenesis of Melanosomes in Kupffer Cells of Proteus
anguinus (Urodela, Amphibia). Pigment Cell Res 16, 345.
Prelovšek, P. M., Bizjak Mali, L. in Bulog, B. (2008). Hepatic pigment cell of Proteidae
(amphibia, Urodela): A comparative histochemical and ultrastructural study. Animal
Biology, 58, 245–256.
Weibel E. R., Stäubli W., Gnfagi H. R. in Hess F. A. (1969). Correlated morphometric and
biochemical studies on the liver cell. I. Morphometric model, stereologic methods, and
normal morphometric data for rat liver. J Cell Biol 42, 68–91.
ImageJ (b. d.). Image Processing and Analysis in Java. Pridobljeno s:
http://rsb.info.nih.gov/ij/