NGUYỄ N TI ẾN D ŨNG NGHI ÊN CỨU PHÂN TÍCH M ỘT SỐ HỢP CHẤT ... (336).pdf · nghi...
60
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC NGUYỄN TIẾN DŨNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - năm 2012
Transcript of NGUYỄ N TI ẾN D ŨNG NGHI ÊN CỨU PHÂN TÍCH M ỘT SỐ HỢP CHẤT ... (336).pdf · nghi...
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN HOÁ HỌC
NGUYỄN TIẾN DŨNG
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN HOÁ HỌC
NGUYỄN TIẾN DŨNG
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR
Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCHMã số: CH. 1001190
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VĂN TUYẾN
Hà Nội - năm 2012
Lêi c¶m ¬n!§Ó hoµn thµnh ch¬ng tr×nh cao häc vµ viÕt luËn v¨n nµy, t«i ®· nhËn ®îc
sù híng dÉn, gióp ®ì vµ gãp ý nhiÖt t×nh cña quý thÇy c« trêng §¹i häc Khoa
häc Tù nhiªn - §¹i häc Quèc gia Hµ néi vµ ViÖn hãa häc - ViÖn Khoa häc vµ C«ng
nghÖ ViÖt nam.
T«i xin göi lêi biÕt ¬n s©u s¾c ®Õn Phã Gi¸o s - TiÕn sÜ NguyÔn V¨n TuyÕn
- ViÖn trëng - Trëng phßng Hãa dîc - ViÖn hãa häc - ViÖn Khoa häc vµ C«ng
nghÖ ViÖt nam ®· giµnh rÊt nhiÒu thêi gian vµ t©m huyÕt híng dÉn nghiªn cøu vµ
gióp t«i hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp.
T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c c« chó vµ anh chÞ tËp thÓ phßng Hãa dîc,
Phßng thÝ nghiÖm Khèi phæ - ViÖn hãa häc - ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt
nam ®· t¹o mäi ®iÒu kiÖn ®Ó t«i häc tËp vµ hoµn thµnh tèt luËn v¨n nµy.
§ång thêi t«i còng xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c thÇy c« gi¸o Khoa Hãa häc -
Trêng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn - §¹i häc Quèc gia Hµ néi, ngêi th©n vµ b¹n
bÌ v× sù gióp ®ì quý b¸u, tËn t×nh trong qu¸ tr×nh t«i häc tËp vµ nghiªn cøu t¹i
Khoa hãa häc - Trêng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn - §¹i häc Quèc gia Hµ néi.
T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n sù tµi trî cña ®Ò tµi c¬ b¶n thuéc ch¬ng tr×nh hîp
t¸c FWO-NAFOSTED (m· sè: 01/2010) ®· hç trî kinh phÝ ®Ó hoµn thµnh luËn
v¨n nµy.
MÆc dï t«i ®· cã nhiÒu cè g¾ng hoµn thiÖn luËn v¨n b»ng tÊt c¶ sù nhiÖt t×nh
vµ n¨ng lùc cña m×nh, tuy nhiªn kh«ng thÓ tr¸nh khái nh÷ng thiÕu sãt, rÊt mong
nhËn ®îc nh÷ng ®ãng gãp quÝ b¸u cña quÝ thÇy c« vµ c¸c b¹n.
Hµ néi ngµy 12 th¸ng 12 n¨m 2012
Häc viªn
NguyÔn TiÕn Dòng
MỤC LỤCDANH MỤC CÁC CÁC HÌNH .............................................................................................. i
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .................................................................................................... ii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 2
1.1. BETA LACTAM ........................................................................................................ 2
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM .................................................................................... 3
1.2.1. Phản ứng Staudinger............................................................................................. 3
1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể............................................... 4
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ........................................................ 7
1.3.1. Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ...................................... 7
1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ................................... 8
1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại......................... 8
1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR .................................................. 9
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ........................................................... 17
1.4.1. Khái niệm........................................................................................................... 17
1.4.2. Phân loại............................................................................................................. 17
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo.............................................................................. 17
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo............................................................................ 18
1.4.5. DETECTOR DAD.............................................................................................. 19
1.4.6. DETECTOR MS ................................................................................................ 20
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM............................................................................................ 22
2.1. Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................ 22
2.1.1. Các phương pháp tổng hợp hữu cơ...................................................................... 22
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất. .......................................................................................... 22
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng.23
2.1.4. Các phương pháp phân tích cấu trúc. .................................................................. 23
2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactam ................................................................................. 25
2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................................ 25
2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine .................................................................................... 26
2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam........................................................................ 27
2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f ....... 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 31
3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM ............................................................. 31
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM............................................ 32
3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a ............................................................. 32
3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b............................................................ 33
3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c.............................................................. 33
3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d ............................................................. 34
3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e.............................................................. 35
3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e.............................................................. 35
3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS ...................... 37
3.3.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu..................................... 37
3.3.2. Khảo sát phổ MS................................................................................................ 40
3.3.3. Khảo sát chương trình dung môi cho quá trình sắc ký ......................................... 41
3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký................................................... 43
KẾT LUẬN ......................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................... 49
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 51
i
DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam............................................................................3
Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1-phenylbutan-1-ol.........................................................................................10
Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1-phenylbutan-1-ol.........................................................................................10
Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA............12
Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp..............................13
Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel .................................................................................14Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray .....14
Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B..................................................................16
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS.............................................................................18
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang .............................................................19
Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). ....20Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ..........................................................................32
Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ..........................................................................33
Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c ..........................................................................33
Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ..........................................................................34Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e ..........................................................................35
Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f...........................................................................35
Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a .....................................................37
Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b .....................................................38
Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c......................................................38Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d ...................................................38
Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive....................................40
Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ..................................40
Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ...............42
Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ...............42Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ...............42
Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ....................................................................43
Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) .................................................. 44Hình 3.18. Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) .................................................. 44Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b....................................................................45
Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c ....................................................................46
Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d....................................................................47
ii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger ...............................................................................3
Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger....................................................................4
Sơ đồ 1.3. Con đường hình thành β –lactam.............................................................5
Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactam .....................................................6
Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactam ......................................................6
Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene.............................................7
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ..........................................26
Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imin ........................................................................26
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam ...........................................................27
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ..........................................31
Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b ..................................................................32
iii
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Ký hiệu Chú thích
1 SKPB Sắc ký phân bố
2 SKPD Sắc ký pha đảo
3 SKPT Sắc ký pha thuận
4 HPLC High-performance liquid chromatography
5 MS Mass spectrometry
6 NMR Nuclear magnetic resonance
iv
1
MỞ ĐẦU
Với sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinh
không còn sử dụng được hoặc phổ tác dụng hẹp lại do khả năng kháng thuốc của
vi khuẩn. Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng không
mong muốn cho người bệnh.
Azetidin-2-ones (β-lactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan
trọng [9] và ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu cơ [13]. Để tạo ra
những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chưa bị vi khuẩn kháng lại, thì
việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactam mới là một việc làm rất quan trọng.
Mặt khác, như ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học
(đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau
và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy
việc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm
giảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị.
Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc
và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactams, thu được từ phản
ứng tổng hợp theo phương pháp Staudinger, bằng các phương pháp hiện đại như
HPLC-MS và NMR.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BETA LACTAM
β-lactam được phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và được chia thành
4 nhóm:
· β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.
o β-lactam có chứa vòng thiazolidine được gọi tên là penams (A)
o β-lactam có chứa vòng pyrrolidine được gọi tên là carbapenams (B)
o β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng được gọi tên là oxapenams
hoặc clavams (C)
· β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:
o β-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro được gọi tên là penems
(D)
o β-lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole được gọi tên là
carbapenems (E)
· β-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chưa bão hòa:
o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine được gọi tên là
cephems (G)
o β-lactam có chứa vòng 1,2,3,4-tetrahydro pyridin được gọi tên là
carbacephems (H)
o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-oxazine được gọi tên là
oxacephems (I)
· β-lactam không kết hợp với bất kỳ một vòng nào đư ợc gọi tên là
monobactams
3
Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam
Hợp chất chứa vòng β-lactam được ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm
thuốc kháng sinh.
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM
Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan
trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian
trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phương pháp tổng hợp β-lactam đã được phát
triển như: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm
carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].
1.2.1. Phản ứng Staudinger
Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức
imine, là phương pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi
được phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã được nghiên cứu
thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập
thể. Nó được áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1).
Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất cho quá
trình tổng hợp β –lactam [14].
Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger
4
1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể
Cơ chế của phản ứng Staudinger được đưa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả
tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống
(LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế. Quá trình tấn
công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine
vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2).
Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger
Hợp chất trung gian này đã được phát hiện và đặc trưng bởi quang phổ IR
[22]. Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra đồng
thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong đó
nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis. Khi nhóm thế trên carbon sp2 của
imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dương, hợp chất trung gian zwitterioncó
thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo ra sản phẩm
trans-β-lactam (9). Tỷ lệ tương đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóa
học lập thể của phản ứng ketene/imine.
Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion
và đóng vòng conrotatory [25]. Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chất
hai bước của quá trình và chứng minh một số điểm tương đồng với mô hình đề
xuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18].
Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thích
kết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình được mô tả bởi Hegedus và
chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam. Con
5
đường được đề xuất cho sự hình thành β –lactam được mô tả dưới đây (Sơ đồ
1.3).
Sơ đồ 1.3. Con đường hình thành β –lactam
Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thường cho tấn công exo là ưu
thế. Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hưởng bởi bản chất của các
ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng
đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2). Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ
cis/trans của sản phẩm β –lactam. Các tác giả đề xuất [9], bước đóng vòng có
thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate
nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho
ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng
(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ
electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1
và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –
lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ
trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tương tự thực
hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có
ảnh hưởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản
ứng Staudinge [21].
Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hưởng bởi tính chất của dung môi, các
dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi
dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene
6
được hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hưởng đến độ
chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa
ketene và tác nhân imine ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tương
tự như nhiệt độ [19].
Một phương pháp rất hiệu quả để thu được trans- β -lactam được phát
triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) như một anion
xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl
clorua béo [28].
Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam
Việc sử dụng sorbyl clorua (16) như một một tiền chất của
butadienylketene thu được một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể
không đối quang. Khi phản ứng Staudinger được thực hiện với N-aryl imine, thu
được chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu được chủ
yếu là cis- β –lactam (Sơ đồ 1.5)[24].
Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactam
7
Việc chọn lọc trans cũng thu được trong phản ứng Staudinger giữa imine
và vinylketene chứa một γ – heteroatom. Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng
đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3-
vinyl - β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23].
Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các
phương pháp vật lý và hóa học. Thông thường, sự tách được thực hiện sau khi
chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối
quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách
bằng cách trực tiếp. Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách được bằng
các phương pháp kết tinh chọn lọc, phương pháp sắc ký hoặc phương pháp
NMR.
1.3.1. Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym
Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định. Dựa
vào tính chất này, người ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một
trong hai đối quang trong hỗn hợp. Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic
của este bằng enzym pig liver estease. Dưới tác dụng của enzym này, chỉ có
đồng phân S được thủy phân. Nhờ đó mà người ta tách được hai đồng phân này
ra khỏi nhau.
8
1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ
Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một
tâm bất đối thường không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản
ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản
phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách được bằng các phương pháp hóa
lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách được
đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai
đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau
bằng phương pháp kết tinh. Phương pháp này vẫn được sử dụng hiệu quả để
tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau.
Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm
bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ
khác. Các đồng phân “dia” nhận được có thể tách ra bằng các phương pháp hóa
lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ được loại bỏ, thu được các
đồng phân đối quang tinh khiết.
1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại
Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các
phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối
trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn với
9
tâm bất đối của cột. Đối quang có tương tác yếu sẽ được rửa giải nhanh nhờ pha
động, kết quả là hai đối quang được tách ra khỏi nhau. Phương pháp này thường
được sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng. Nếu
phản ứng nhận được hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B
(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang được
xác định theo công thức:
% er % er
% er % er
enantiom A enantiom Bee
enantiom A enantiom B
-=
+
% as % as
% as % as
di teroisomerA di teroisomerBde
di teroisomerA di teroisomerB
-=
+
1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR
Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nó
không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏ
hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ
độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên tử
hydro trong từ trường.
Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân
“dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có
mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu
trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng
phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ
nhỏ.
a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher
Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ
không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín
hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường. Để phân biệt được hai
cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất
nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp
chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của
hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau
đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đưa ra được cấu hình của
chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-
10
1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để
tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây.
Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este
Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi
tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ
dịch chuyển về phía trường thấp. Như vậy, người ta có thể xác định được cấu
hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu.
Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và
(R)-1-phenylbutan-1-ol
Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1-
phenylbutan-1-ol
11
Ngoài axit R-Mosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một số
tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,
amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ như các tác nhân bổ trợ sau.
b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)
Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân
hữu dụng nhất, cho phép xác định nhanh tỷ lệ của các đồng phân lập thể. Khi có
mặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trường tạo ra
phổ không tương đương. Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của
chất CSA tạo ra các tương tác với các tâm bazơ. Ưu điểm của của phương pháp
này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất
với tác nhân bổ trợ nên hạn chế được quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử
dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lượng nhỏ.
Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân
bổ trợ CSA, kết quả do tương tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành
phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang được tách biệt trong từ
trường. Nghiên cứu của phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin
khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt
được trong từ trường, nhưng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu
của metyl, metin được tách ra. Dựa vào phổ này, người ta có thể xác định được
tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin.
12
Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA
c). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3)
Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm
bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong
phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo
thành có một số proton được tách ra trong từ trường và chuyển về trường thấp.
Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc
vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3.
Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1-
axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt
được trong từ trường. Tuy nhiên, khi được tạo phức với tác nhân chuyển dịch
Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet
có cường độ tương đương nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụ
thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch.
Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1-
axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều được tách ra và có độ
13
chuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển
dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối
với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 được chuyển
dịch về phía trường cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Như vậy, có thể phân
biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1-
axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển
dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5).
Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp
1.3.5. X-ray tinh thể
a. Giới thiệu chung
Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định cấu
trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phương trình Bragg, người ta tính toán
độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục
tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây
dựng nên tế bào cơ sở.
Phương trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ
Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2
Số lượng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng
g/cm3)
Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ
phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngược
lại (-h,-k,-l). Cường độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) được tính toán nhờ
cường độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2).
14
Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel
Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ được tính toán bằng
công thức:
ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-2p(hx + ky + lz)}] / V
Bằng cách đo cường độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,l
khi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ở
trên, người ta sẽ tính toán được mật độ electron tại mọi điểm trong không gian
của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng được bản đồ mật độ điện tích của phân
tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cấu
trúc không gian ba chiều của phân tử. Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất
hữu cơ bằng phương pháp X-ray phân tử có thể được tóm tắt như sau:
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray
b. Xác định cấu hình tuyệt đối
Phương pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình
tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất
thường. Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-ray
tinh thể người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ
số R.
H,K,L
-H,-K,-L
15
Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia
X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc này
Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của
cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướng
ngược lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối.
Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàm
thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được
so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá
trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá
trị này bằng phương pháp thống kê.
Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có
cường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử
mà chưa so sánh được những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được
sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lượng lớn. Phương pháp X-ray tinh có thể sử
dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi.
Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, người ta có
thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với
một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt
đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết được chọn để nghiên cứu trong
phương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơn
tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng
phân tích X-ray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết
với chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đưa nhóm nguyên tử nặng như halogen (Cl,
Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho phép xác định cấu hình tuyệt
đối của chất đó nhờ phương pháp Bijvoet ở trên.
Ví dụ hidroxy lacton chưa biết cấu hình tuyệt đối được chuyển thành este
với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia. Trong trường hợp chất tạo thành
thu được dưới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton được
16
xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thông
qua phân tích phổ X-ray.
1.3.6. Phổ CD
Phương pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng
Cotton, cơ sở của phương pháp này là nghiên cứu bước chuyển ở trung tâm bất
đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn. Việc xác định phổ CD
rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có
những hợp chất có bước chuyển n---->π* và π---->π* (có nhóm mang màu) mới
đo được hiệu ứng Cotton. Trong trường hợp chất cần nghiên cứu không có bước
chuyển n---->π* và π---->π* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân
tử. Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ được thực hiện nhờ so
sánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tương tự
đã biết về cấu hình tuyệt đối. Như vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúc
tương đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần
nghiên cứu.
Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, người ta phải so sánh
hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết
trước cấu hình tuyệt đối. Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chất
flavan A chưa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD
là tương tự nhau nhưng có chiều ngược nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là
ngược so với B.
Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B
Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu
đã biết việc phân tích phổ CD cho phép xác định được cấu hình tuyệt đối của
cacbon bất đối trong phần mang màu này.
17
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.4.1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột
là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với
các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và
phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách
các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các
hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh
vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…
1.4.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta
chia HPLC thành 4 loại:
· Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
· Sắc ký phân bố (partition chromatography).
· Sắc ký ion (ion chromatography).
· Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa
pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase
chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dụng nhiều hơn cả.
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được
gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
· Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →
sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).
18
· Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded
phase chromatography)
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều
ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên
dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối
với hợp chất phân tích.
o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người
ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết
và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc
dạng này.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực
hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl)
còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra
còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm
alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các
loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
· Hòa tan mẫu phân tích.
· Phù hợp với đầu dò.
· Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
· Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
· Tinh khiết dùng cho sắc ký.
19
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý
thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế
cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. Trong
đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng
rửa giải.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích
và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính base
của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn
lên khả năng phân tách của sắc ký.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc
dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong
nước.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế
độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương
trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.4.5. DETECTOR DAD
Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện
nay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm
silicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 –
0,050 mm.
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang
Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ
thống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện
được tích – 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện
phóng điện. Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng
điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.
20
a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng,
c) đường quang phản xạ nhiều lần
Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell).
1.4.6. DETECTOR MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên
cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó
dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện
trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh
hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion
thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao,
QKLӋW�ÿӝ�FDR��FiF�FKҩW�NKҧR�ViW�SKҧL�ӣ�WUҥQJ�WKiL�NKt��YұQ�WӕF�GzQJ�FKҧ\�QKӓ��
trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi
tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Điều này
gây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa
hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ.
Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian
gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm
tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được
nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột
phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Ionization – API).
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển
ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng
trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục
(continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt
(thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự
ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích
21
nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta
có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy
theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
* Phun mù điện tử (ESI).
* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI).
* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều
hơn cả.
c. Các loại đầu dò khối phổ
Có các loại tổng quát sau:
* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection)
- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magnetic
sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.
- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn
cong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao.
* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)
- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter)
- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)
* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass
spectrometry)
* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).
Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian
bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi
Fourierđược sử dụng nhiều hơn cả
22
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị.
2.1.1. Các phương pháp tổng hợp hữu cơ.
Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phương pháp khác tại
phòng thí nghiệm Hoá dược- Viện Hoá học- Viện Khoa học & Công nghệ Việt
Nam.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất.
Nguyên liệu đầu: phenol, m-clophenol, este 2-brom metylaxetat,
benzylamin, p-brom benzandehit….
Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat,
nước.
Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc.
Các chất xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng được mua của hãng
Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).
Bột silica gel cho sắc kí cột kích thước 0,01÷0,02 mm (Merck), bông y tế
dùng nhồi cột.
Bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm tráng sẵn Art. 5554 DC – Alufolien
Kiesel 60 F254 , dày 0,2 mm, kích thước 20 x 20 cm (Merck).
Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bản
mỏng.
Bình cầu phản ứng 250 ml, con khuấy từ, máy khuấy từ, giá kẹp bình
phản ứng.
Phễu chiết 250 ml, cốc mỏ vịt, natri sunfat để làm khô.
23
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản
phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm với giá trị Rf khác nhau, màu sắc và
sự phát quang khác nhau…. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy
ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng… dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các
giá trị Rf tương ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc
vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được
dung môi hay hỗn hợp dung môi để các chất tách ra xa khỏi nhau (Rf khác xa
nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất.
Quy trình chạy sắc kí lớp mỏng:
Cho chất lên bản sắc kí: Hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung
môi dùng để điều chiết sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quá
đặc. Dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên trên bản mỏng sao cho các vệt
chấm phải tròn, gọn và các mép bên của bản mỏng 0,5 cm; cách chân bản mỏng
0,7 cm. Các vết chất cách nhau 0,5 cm. Chiều cao bản mỏng 7 cm.
Tiến hành sắc kí lớp mỏng:
Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và
lắc kỹ. Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi. Lượng dung
môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất.
Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một
góc 15°. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến
dung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó
hiện sắc phổ dưới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện.
2.1.4. Các phương pháp phân tích cấu trúc.
Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành
các phương pháp sau:
24
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp
của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Khoa học
& Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu
được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi CDCl3 và TMS
là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện
Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- MÁY HPLC
+ Hóa chất, thiết bị dùng cho máy HPLC
Dung môi: Kênh A: H2O (PA); Kênh B: Metanol (PA)
Pha tĩnh: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi octadecylsilayl
silica gel (C18)
Thiết bị:LC-MSD Agilent 1100 Series (USA)
+ Đặt điều kiện cho hệ thống
Detector DAD: đặt ở bước sóng 260nm.
Detector MS:
- Source: ESI- Capilary: 3000V; 17nA- End Plate Offset: 500V; 435nA
- Dry Gas: 5,0 l/min- Dry Temp: 325 ºC- Skimmer: 40.0V
- Cap Exit: 200.0V- Polarity: Positive
Flow: 0,25 ml/min
Stop time: 30 min
25
Thể tích tiêm: 20 – 50 µl (tùy vào lượng mẫu)
MinGradient pha động
Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3%B %B %B
056
1015161730
520205070100100100
15303050
100100100100
20306080
100100100100
2.2. Tổng hợp các hợp chất β-lactam
2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic
Hỗn hợp của phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) và Na2CO3 (5,1 mmol)
được đun hồi lưu ở 140oC, trong thời gian 10 phút. Sau đó thêm este 2-brom
metyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lưu ở 140oC, trong khoảng 4h. Hỗn
hợp sau phản ứng được cho thêm dung dịch HCl 10% đến môi trường axit, sau
đó thêm dung dịch NaHCO3 đến môi trường trung tính và được chiết ba lần
bằng CH2Cl2. Dịch chiết CH2Cl2 được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung
môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô 2a, sau đó thêm 8 ml NaOH 1N và 8
ml MeOH/H2O (1:1), tiếp tục đun hồi lưu ở 140oC trong 24h. Hỗn hợp sau phản
ứng được chiết bằng CH2Cl2, dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ
dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được làm sạch
bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc (9:1) thu được axit
3a hiệu suất 70%. Axit 3a là các chất rắn màu trắng có điểm chảy là 98-100oC.
Dung dịch của hỗn hợp gồmaxit 3a (0,36 mmol), (COCl)2(1,8 mmol) và
0,1 ml DMF trong 5ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ thường trong 24h. Kết
thúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH2Cl2ở áp suất thấp thu được sản phẩm 2-
phenoxy clorua axetat 4a.
26
Dẫn xuất 2-(m-clo phenoxy) clorua axetat 4b được tổng hợp tương tự như
4a. Nguyên liệu đầu là m-clophenol 1b, thu được axit 3b với hiệu xuất 50%,
điểm nóng chảy tương ứng là 108-110oC.
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic
2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine
Dung dịch của benzylamin(18,7 mmol) 6a, p-brom benzanđehit (18,7
mmol) 7a và Na2SO4 (37,4 mmol) được đun hồi lưu ở 50-60oC trong dung môi
CH2Cl2, trong thời gian 4h. Hỗn hợp sau phản ứng được chiết hai lần bằng
CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được các
dẫn xuất imine 8a, được sử dụng ngay cho phản ứng tiếp theo.
Dẫn xuất imine 8b được tổng hợp tương tự như 8a. Nguyên liệu đầu là 6a
và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.
Dẫn xuất imine 8c được tổng hợp tương tự như 8a. Nguyên liệu đầu là 6b
và dẫn xuất p-metoxy benzanđehit 7b.
Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine
27
2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam
Hợp chất 4a (0,75 mmol) được hòa tan vào 5 ml toluen sau đó dung môi
toluen được cất loại ở áp suất thấp để loại bỏ (COCl)2 còn dư, tiếp theo làm lạnh
và thêm Et3N (1,125 mmol) thu được dẫn xuất ketene 5a, sau đó cho thêm chất
8a (0,75 mmol)và dung môi CH2Cl2(5 ml), đun hồi lưu ở 55oC trong 24h. Hỗn
hợp sau phản ứng được chiết hai lần bằng CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và
loại bỏ dung môi ở áp suất thấp. Sau đó làm sạch bằng cột silica gel với hệ dung
môi hexan và EtOAc (9:1) thu được dẫn xuất 9a với hiệu suất 73%.
Dẫn xuất 9b được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và
8a, thu được với hiệu suất 67%.
Dẫn xuất 9ccũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là
4b và 8b, thu được với hiệu suất 69%.
Dẫn xuất 9dcũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là
4a và 8b, thu được với hiệu suất 71%.
Dẫn xuất 9e được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và
8c, thu được với hiệu suất 68%.
Dẫn xuất 9f cũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là
4a và 8c, thu được với hiệu suất 65%.
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam
28
2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f
Các chất sau khi được tổng hợp, được đo phổ cộng hưởng từ proton 1H-
NMR (500 MHz) và cacbon 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy cộng
hưởng từ hạt nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức).
a). Hợp chất 9a: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 105-106oC
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,41 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’);
7,31-7,34 (3H, m, H-4’’, H-2’’’, H-6’’’); 7,11-7,15 (6H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’,
H-6’’, H-3’’’, H-5’’’); 6,89 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4’’’); 6,72 (2H, d, J = 8,0 Hz,
H-2’, H-6’); 5,40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,70
(1H, d, J = 4,5Hz, H-4); 3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,42 (C=O); 156,82 (C-1’’’);
134,53 (C-1’); 131,51(C-3’); 130,30 (C-5’); 129,30 (C-3’’’); 128,94 (C-6’’’);
128,68 (C-2’’); 128,11 (C-6’’); 122,84 (C-4’); 122,21 (C-4’’’); 115,53 (C-2’’’,
C-6’’’); 82,10 (C-3); 60,91 (C-4); 44,4 (C-5)
b). Hợp chất 9b: là chất lỏng
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’);
7,31-7,33 (3H, m, H-3’’, H-5’’, H-4’’’); 7,12-7,15 (4H, m, H-2’, H-6’, H-2’’, H-
6’’); 7,05 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-5’’’); 6,88 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-4’’’); 6,71
(1H, t, J = 1,5 Hz, H-2’’’); 6, 65 (1H, dd, J = 1,0; 7,5 Hz, H-6’’’); 5,36 (1H, d, J
= 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-4);
3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 164,79 (C=O); 157,32 (C-1’’’);
134,66 (C-1’); 134,34 (C-1’’); 131,58 (C-3’’’); 131,61 (2C, C-3’, C-5’); 130,19
(2C, C-3’’, C-5’’); 130,13 (C-5’’’); 128,97 (2C, C-2’, C-6’); 128,67 (2C, C-2’’;
C-6’’); 128,17 (C-4’’); 123,03 (C-4’); 122,45 (C-4’’’); 115,97 (C-2’’’); 113,86
(C-6’’’); 81,92 (C-3); 60,61 (C-4); 44,44 (C-5).
29
c). Hợp chất 9c: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 110-111oC
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,31 (3H, m, H-3’’, H-5’’, H-4’’);
7,14-7,19 (4H, m, H-2’, H-6’, H-2’’, H-6’’); 7,03 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-5’’’);
6,80-6,85 (3H, m, H-4’’’, H-3’, H-5’); 6,71 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-2’’’); 6,64 (1H,
dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-6’’’); 5,34 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); ); 4,87 (1H, d, J =
14,5 Hz, H-5a); 4,72 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-4); 3,84 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5b);
3,78 (3H, s, OCH3).
d). Hợp chất 9d: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 81-81,5oC
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,29-7,32 (3H, m, H-2’’’, H-6’’’, H-
4’’); 7,20 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,17 (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-2’, H-
6’); 7,11 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 6,86 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4’’’); 6,81
(2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’, H-6’’); 6, 72 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’’, H-5’’); 5,37
(1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,71 (1H, d, J = 4,5
Hz, H-4); 3,84 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-5b); 3,77 (3H, s, OCH3).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,64 (C=O); 159,91 (C-4’’);
157,02 (C-1’’’); 134,86 (C-1’); 129,98 (2C, C-3’’’, C-5’’’); 129,18 (2C, C-2’’,
C-6’’); 128,85 (2C, C-3’, C-5’); 128,67 (2C, C-2’, C-6’); 124,51(C-4’); 121,93
(C-4’’’); 115,58 (2C, C-2’’’, C-6’’’); 113,79 (2C, C-3’’, C-5’’); 82,17 (C-3);
61,05 (C-4); 55,22 (OCH3); 44,04 (C-5).
e). Hợp chất 9e: là chất lỏng
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,23-7,27 (3H, m, H-4’’’, H-3’’’, H-
5’’’); 7,15 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-6’, H-2’); 6,89 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-3’, H-5’);
6,87 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-2’’, H-5’’); 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’’, H-6’’’);
6,77 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 6,73 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-4’’, H-6’’); 5,40
(1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,87 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-5a); 4,77 (1H, d, J = 4,0
Hz, H-4); 3,85 (1H, d, J = 15 Hz, H-5b); 3,79 (6H, s, OCH3).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,57 (C=O); 159,91 (C-3’’);
159,85 (C-4’); 156,94 (C-1’’’); 136,26 (C-1’’’); 129,91 (C-1’); 129,83 (C-5’’);
30
129, 12 (2C, C-3’’’, C-5’’’); 124,45 (C-6’); 121,86 (C-2’); 121,05 (C-4’’’);
120,81 (C-6’’); 115,50 (C-6’’’); 114,42 (C-2’’’); 114,04 (C-5’); 113,91 (C-3’);
113,71(C-4’’; 113,47 (C-2’’); 82,08 (C-3); 61,03 (C-4); 55,18 (1C, OCH3);
55,13 (1C, OCH3); 43,94 (C-5).
f). Hợp chất 9f: là chất lỏng
1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,20-7,26 (1H, m, H-5’’ ); 7,18 (2H,
d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’ ); 7,02 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-5’’’) 6,82 (4H, t, J = 8,5
Hz, H-3’, H-5’, H-4’’, H-6’’); 6,73 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- 4’’’); 6,70 (1H, dd, J
= 1,5 Hz, H- 2’’’ ); 6,68 (1H, s, H-2’’); 6,64 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’’’);
5,34 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-3); 4,82 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-5a); 4,74 (1H, d, J =
4,0 Hz, H-4); 3,81 (1H, d, J = 14,5 Hz , H-5b); 3,76 (6H, s, OCH3).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 164,94 (C=O); 159,93 (C-3’’);
159,89 (C-4’); 157,41 (C-1’’’); 136,05 (C-1’’); 134,39 (C-3’’’); 129,91 (C-5’’’);
129,83 (C-1’); 129,80 (C-2’, C-6’); 124,02 (C-5’’); 122,05 (C-4’’’); 120,76 (C-
6’’); 115,98 (C-2’’’); 114,03 (C-4’’); 113,76 (C-3’, C-5’); 113,73 (C-6’’);
113,46 (C-2’’); 81,87 (C-3); 60,74 (C-4); 55,12 (C-OCH3); 43,98 (C-5).
31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM
Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic
Phản ứng ete hóa các dẫn chất của phenol với este 2-brom metyl axetat
trong môi trường Na2CO3 và DMF ở 140oC. Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ
này trong thời gian 4h. Tiếp theo, thực hiện phản ứng thủy phân trong môi
trường NaOH 1N và dung môi là MeOH/H2O, ở nhiệt độ sôi trong thời gian 12
h nhận được các axit 3a, 3b với hiệu suất 70%, 50%. Hợp chất 3a, b được clo
hóa bởi tác nhân (COCl)2 trong dung môi CH2Cl2 và xúc tác DMF, thu được hợp
chất 4a, b (sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic
Tổng hợp dẫn xuất imine
Bước tiếp theo là tổng hợp dẫn xuất imine. Dẫn xuất imine 8a,b thu được
nhờ phản ứng cộng nucleophin giữa dẫn xuất của benzylamin 6 và dẫn xuất
benzanđehit 7a-b trong môi trường CH2Cl2 và một đương lượng của Na2SO4.
Phản ứng được đun hồi lưu trong thời gian 4h nhận được sản phẩm imine 8a-b
(sơ đồ 2.2)
Tổng hợp các dẫn xuất cis-β- lactam
Phản ứng tổng hợp hợp β-lactam được tiến hành khi cho imine 8a-c phản
ứng với các hợpchất ketene 5a-b, nhận được insitu khi các clorua axit phản ứng
với 1,5đương lương Et3N, thu được dẫn xuất β-lactam (cơ chế phản ứng tạo
thành ketene từ clorua axit được nêu trong sơ đồ 3.2) [15].
32
Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM
Cấu trúc của các hợp chất cis-β-lactam đã được nghiên cứu bằng các
phương pháp phổ
3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9a
Phổ proton của chất 9a có các tín hiệu cộng hưởng dạng AB tại 7,41ppm
(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’) và 6,72 ppm (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’) đặc
trưng cho nhân thơm thế brom ở vị trí para. Hai nhân thơm còn lại có các tín
hiệu cộng hưởng tại 7,31-7,34 ppm (3H, m, H-4’’, H-2’’’, H-6’’’); 7,11-7,15
ppm (6H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’, H-3’’’, H-5’’’) và 6,89 ppm (1H, t, J =
7,0 Hz, H-4’’’. Ngoài ra trong phổ 1H NMR của dẫn chất 9a có tín hiệu cộng
hưởng các proton của vòng lactam: H-3 (5,40 ppm) là doublet có hằng số tương
33
tác J = 4,5 Hz, tín hiệu cộng hưởng doublet của proton H-4 (4,70 ppm) với hằng
số J = 4,5 Hz khẳng định sản phẩm 9a là cis-β-lactam [9].
3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9b
Trong phổ1H NMR của dẫn chất 9b có hằng số tương tác spin spin của
các H-3 và H-4 là 4,5 Hz, từ đó có thể khẳng định sản phẩm 9b là cis-β-lactam.
3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9c
34
Tương tự như vậy trong phổ1H NMR của dẫn chất 9c có hằng số tương
tác spin spin của các H-3 và H-4 là 4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm
9c là cis-β-lactam.
3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9d
Trên phổ proton của chất 9d có các tín hiệu cộng hưởng tại 3,77 ppm đặc
trưng cho proton của nhóm OCH3 và tín hiệu cộng hưởng dạng AB tại 7,20 ppm
(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,17 ppm (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-2’, H-6’)
đặc trưng cho nhân thơm thế nhóm OCH3 ở vị trí para. Hai nhân thơm còn lại có
các tín hiệu tại 7,29-7,32 ppm (3H, m, H-2’’’, H-6’’’, H-4’’); 7,11 ppm (2H, t, J
= 8,0 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 6,86 ppm (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4’’’); 6,81 ppm (2H, d,
J = 8,5 Hz, H-2’’, H-6’’); 6,72 ppm (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3’’, H-5’’). Ngoài ra,
Ngoài ra trong phổ 1H NMR của dẫn chất 9d có tín hiệu cộng hưởng các proton
của vòng lactam: H-3 (5,37 ppm) là doublet có hằng số tương tác J = 4,5 Hz, tín
hiệu cộng hưởng doublet của proton H-4 (4,71 ppm) với hằng số J = 4,5 Hz
khẳng định sản phẩm 9d là cis-β-lactam
35
3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9e
Trên phổ 1H NMR của dẫn chất 9e cũng có hằng số tương tác spin spin là
4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm 9e là cis-β-lactam.
3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9f
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất 9f
36
Từ phổ 1H NMR của dẫn chất 9f cũng có hằng số tương tác spin spin là
4,5 Hz, cho cho phép khẳng định sản phẩm 9f là cis-β-lactam.
Sản phẩm nhận được có độ chọn lọc lập thể cao, chỉ có mặt của cis-β-
lactam. Điều này có thể được giải thích nhờ hiệu ứng điện tử của các tác nhân
tham gia phản ứng. Các dẫn xuất β-lactam 9a-c đều là các β-lactam có chứa
nhóm thế là các hệ thơm được tổng hợp từ phản ứng giữa hợp chất imine
R2N=CHR3 (R1 và R3 đều là các nhóm thế lớn với nhân thơm benzen) và dẫn
xuất ketene có gắn nhóm thế phenoxy ( R1). Chúng ta thấy rằng, tất cả các dẫn
xuất thu được đều tồn tại ở dạng cis-β-lactam với các nhóm thế lớn gắn với C-3
và C-4 ở phía sau, do hằng số tương tác spin-spin của hai proton H-3 và H-4 có
hằng số bé (J = 4,5 Hz). Điều này được giải thích bởi sự điều khiển phản ứng
Staudinger qua hai giai đoạn với các phức chuyển tiếp (phức π và phức
σ)[15],[19].
Phức π phức σ
Khi các nhóm R1, R2, R3 đều là các nhóm giàu điện tử thì phức π hình
thành giữa ketene và imine ở dạng exo. Nhóm thế R1 và R2 của imine là các
nhóm giàu điện tử giúp cho điện tích dương trên nguyên tử nitơ được giải tỏa
làm cho phức σ bền hơn. Hơn nữa, nhóm R1 của ketene là nhóm phenoxy, đây
cũng là một nhóm giàu điện tử, làm cho dạng enolat ở phức σ tăng tính
nucleophin dẫn đến phức σ dễ dàng chuyển thành sản phẩm theo con đường tạo
cis-β-lactam.
37
Mật độ điện tử của nhóm thế R1 của ketene đóng vai trò chính trong việc
hình thành cáccis-β-lactam hay trans-β-lactam [15], [19]. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành tổng hợp các β-lactam từ các dẫn xuất ketene có gắn các
nhóm thế khác nhau (R1- là nhóm phenoxy- hoặc m-clophenoxy), thấy rằng khi
nhân thơm benzen của nhóm thế R1 giảm điện tử hơn do có nhóm thế clo thì sản
phẩm tạo thành vẫn là cis-β-lactam, có lẽ là nhóm này có hiệu ứng chưa đủ
mạnh để ảnh hưởng đến mât độ điện tử của phức phức σ trung gian, nên enolat
tạo thành có tính nucleophin mạnh xúc tiến phản ứng vòng hóa tạo thành vòng
lactam theo định hướng cis.
3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS
Đối với các loại máy HPLC-MS mà chúng tôi nghiên cứu, trong hệ thống
có hai detector: detector DAD và detector MS.
3.3.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành đo phổ UV-Vis đối với các loại mẫu nghiên cứu trong
dung môi metanol và thu được kết quả như hình sau:
Hình 3.7. Phổ UV-Vis của hợp chất 9a
38
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của hợp chất 9b
Hình 3.9. Phổ UV-Vis của hợp chất 9c
Hình 3.10. Phổ UV-Vis của hợp chất 9d
Từ các hình trên có thể nhận thấy các hợp chất 9a, 9b, 9c, và 9d đều có
hai cực đại hấp thụ vào khoảng 210 nm và 260 nm.
39
Cấu trúc các hợp chất 9a, 9b, 9c và 9d như hình vẽ sau:
Kí hiệu chất Công thức
9a
9d
9b
9c
Ta nhận thấy rằng, phân tử các hợp chất trên đều có vòng benzen. Mà
vòng benzen có các dải hấp thụ: λ=180nm; λ=203nm; λ=256nm. Và khi vòng
40
benzen có các nhóm thế có hiệu ứng +C thì các dải hấp thụ được chuyển về các
bước sóng dài.
Mặt khác metanol lại có hai dải hấp thụ vào khoảng 150nm và 183nm. Vì
vậy chúng tôi đã chọn bước sóng 260nm làm bước sóng nghiên cứu.
3.3.2. Khảo sát phổ MS
Để chọn điều kiện cho bắn phá MS các hợp chất β-lactam theo phương
pháp ESI, chúng tôi khảo sát cả hai chế độ positive và negative để thu được các
pic ion giả phân tử tương ứng. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát đối với
hợp chất 9c và thu được kết quả như sau:
Hình 3.11. Phổ MS positive của hợp chất 9c
41
Hình 3.12. Phổ MS negative của hợp chất 9c
Qua phổ MS ở trên ta thấy rằng với điều kiện chế độ Negative không có
mảnh ion giả phân tử phù hợp với hợp chất nghiên cứu; chế độ Positive thì cho
ta pic ion giả phân tử [2M+Na]+ = 810,10 phù hợp với công thức phân tử của
hợp chất 9c. Vậy chọn chế độ positive cho detector MS để nghiên cứu các hợp
chất 9a, 9b, 9d và đều thu được mảnh ion giả phân tử [2M+Na]+ tương ứng với
từng hợp chất nghiên cứu (phụ lục 25, 26, 31, 32, 34, 35).
3.3.3. Khảo sát chương trình dung môi cho quá trình sắc ký
Từ việc nghiên cứu tài liệu [8], chúng tôi nhận thấy rằng việc phân tích
các đồng phân quang học có một tâm bất đối bằng các điều kiện dung môi, cột
tách thông thường là rất khó. Nhưng những phân tử nghiên cứu có hai trung tâm
bất đối thì việc phân tích trở nên dễ dàng. Do đó chúng tôi tiến hành phân tích
các đồng phân bằng gradient pha động và tiến hành khảo sát các gradient bằng
cách tăng % kênh B (giảm độ phân cực của pha động) theo bảng sau:
Bảng 3.2.1. Bảng thay đổi thành phân pha động trong các gradient
MinGradient
Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3%B %B %B
0561015161730
520205070
100100100
15303050100100100100
20306080
100100100100
Chúng tôi sử dụng 3 loại gradient: Gradient 1, gradient 2, và gradient 3
trên mẫu 9c và thu được các kết quả sau:
42
Hình 3.13.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1
Hình 3.14.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2
Hình 3.15.Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3
43
Từ các sắc ký đồ ta thấy rằng, khi giảm độ phân cực của pha động, sẽ làm
giảm thời gian lưu, và làm giảm khả năng tách chất. Điều đó có thể giải thích là
do, các chất nghiên cứu đều là các chất kém phân cực, nếu ta làm giảm độ phân
cực sẽ làm giảm thời gian lưu. Từ kết quả trên chúng tôi chọn gradien 1để
nghiên cứu và phân tích các chất.
3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký.
a. Kết quả phân tích hợp chất 9a
Chúng tôi áp dụng các điều kiện đã khảo sát được ở trên và tiến hành
phân tích hợp chất 9a và thu được kết quả sắc đồ như sau:
Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a
Kết quả về diện tích pic:
Trên sắc kí đồ píc 1 có tR = 22,319 phút có phổ khối lượng với píc ion giả
phân tử là 839,0 tương ứng với [M+M+Na]+ (hình 3.17).
44
Hình 3.17: Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a)
Pic 2 có thời gian lưu 24,124 phút cũng có píc ion giả phân tử là 839,6
tương ứng với [M+M+Na]+ (hình 3.18) Khẳng định pic 1 và pic 2 là hai đồng
phân lập thể dạng cis và trans với dạng cis là chiếm ưu thế (cấu dạng cis đã được
chứng minh bằng phổ NMR).
Hình 3.18: Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a)
Từ đó có thể thấy rằng phương pháp HPLC cho phép tách và phân tích hai
đồng phân cis và trans của hợp chất beta-lactam 9a. Từ đó ta tính được độ chọn
lọc lập thể của hợp chất 9a là:
% as % as
% as % as
di teroisomerA di teroisomerBde
di teroisomerA di teroisomerB
-=
+
45
de= .100% = 97,6128%
b. Kết quả phân tích hợp chất 9b
Đối với hợp chất 9b khi phân tích bằng máy HPLC chúng tôi thu được sắc
đồ:
Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b
Kết quả về diện tích pic:
Tương tự hợp chất 9b cũng được tách và phân tích bằng phương pháp
HPLC, kết quả phân tích thu được độ chọn lọc lập thể là: de = 96,6672 %
c. Kết quả phân tích hợp chất 9c
Sắc đồ của hợp chất 9c khi phân tích bằng máy HPLC:
46
Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c
Diện tích pic tương ứng:
Tương tự hợp chất 9c cũng được tách và phân tích bằng phương pháp
HPLC, kết quả phân tích thu được độ chọn lọc lập thể là de = 96,7716 %
47
d. Kết quả phân tích hợp chất 9d
Sắc ký đồ của hợp chất 9d
Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d
Diện tích pic tương ứng:
Tương tự hợp chất 9d cũng được tách và phân tích bằng phương pháp
HPLC, kết quả phân tích thu được độ chọn lọc lập thể là de = 96,3116 %
Tóm lại, phương pháp HPLC đã được sử dụng hiệu quả để tách các đồng
phân lập thể cis –trans của các hợp chất beta-lactam 9a-d. Các chất này có độ
chọn lọc lập thể rất cao (de = 96,3116 – 97,6128 %). Như vậy, tổng hợp beta-
lactam theo phương pháp Staudinger sử dụng các nhóm giàu điện tử, cho phép
nhận được sản phẩm với độ chọn lọc lập thể cao (de ~ 97%).
48
KẾT LUẬN
1. Tổng hợp chọn lọc lập thể thành công 6 dẫn xuất cis-β-lactam: 9a, 9b, 9c, 9d,
9e, 9f bằng phương pháp Staudinger với việc sử dụng các nhóm thế giàu điện
tử.
2. Cấu trúc các dẫn xuất của cis β-lactam được chứng minh bằng phương pháp
1H-NMR và 13C-NMR qua việc so sánh hằng số J của hai H liền kề.
3. Bằng phương pháp HPLC đã tách được các đồng phân cis và trans β-lactam.
4. Bằng phương pháp HPLC đã xác định độ chọn lọc lập thể (de) của của các
hợp chất β-lactam 9a-d tương ứng là: 97,6128; 96,6672 ; 96,7716 và 96,3116
%.
49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Trang web
[1]. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/
[2]. http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10073251&locale=en_US
[3]. http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/nmr/nmr1.htm
II. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
[4]. Nguyễn Hữu Đĩnh – Trần Thị Đà, Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu
cấu trúc phân tử (1999), Nhà xuất bản giáo dục.
[5]. Nguyễn Kim Phi Phụng, Khối Phổ lý thuyết – bài tập – bài giải (2004), Nhà xuất
bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
[6]. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ lý thuyết – bài
tập phổ - bài giải (2005), Nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
[7]. Phạm Thị Thắm, Phạm Thế Chính, Hoàng Thị Phương, Phạm Anh Tuân, Đặng
Thị Tuyết Anh, Ngô Thị Thuận, Nguyễn Văn Tuyến, Tạp chí hóa học (số 4B tập
50, 2012)
[8]. Nguyễn Văn Tuyến, Hóa học hữu cơ nâng cao – Các phương pháp tổng hợp hữu
cơ hiện đại (2012), Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
III. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
[9]. Ahmed Abouabdellah, Jean-Pierre Bégué, Danièle Bonnet-Delpon, Truong Thi Thanh Nga. J.Org.Chem.,62, 8826-8833, 1997
[10]. Brady, W. T.; Gu, Y. Q. J. Org. Chem. 1989, 54, 2838.
[11]. (a) Cossio, F. P.; Ugalde, J. M.; Lopez, X.; Lecea, B.; Palomo, C. J. Am. Chem.
Soc. 1993, 115, 995. (b) Arrieta, A.; Lecea, B.; Cossìo, F. P. J. Org. Chem. 1998,
63, 5869.
[12]. For a selection of recent reviews on the biological activity of β-lactams, see: (a)
von Nussbaum, F.; Brands, M.; Hinzen, B.; Weigand, S.; Ha ¨bich, D. Angew.
Chem., Int. Ed. 2006, 45, 5072. (b) Singh, G. S. Mini-Re . Med. Chem. 2004, 4, 69.
(c) Singh, G. S. Mini-Re . Med. Chem. 2004, 4, 93. (d) Buynak, J. D. Curr. Med.
Chem. 2004, 11, 1951. (e) Veinberg, G.; Vorona, M.; Shestakova, I.; Kanepe, I.;
Lukevics, E. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 1741. (f) Kidwai, M.; Sapra, P.;
Bhushan, K. R. Curr. Med. Chem. 1999, 6, 195
[13]. For selected reviews on the “β-lactam synthon method”, see: (a) Alcaide, B.;
Almendros, P.; Aragoncillo, C. Chem. Re . 2007, 107, 4437. (b) Deshmukh,
A.R.A.S.; Bhawal, B. M.; Krishnaswamy, D.; Govande, V. V.; Shinkre, B. A.;
50
Jayanthi, A. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1889. (c) Alcaide, B.; Almendros, P.
Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1921. (d) Ojima, I. F.; Delaloge, F Chem. Soc. Re
1997, 26, 377.
[14]. For some previous general reviews on the topic, see: (a) Coates, C.; Kabir, J.;
Turos, E. Sci. Synth. 2005, 21, 609. (b) Walton, J. C. Top. Curr. Chem. 2006, 264,
163. (c) Singh, G. S. Tetrahedron 2003, 59, 7631. (d) Magriotis, P. A. Angew.
Chem., Int. Ed. 2001, 40, 4377. (e) Go `mez-Gallego, M.; Manchen ˜o, M. J.;
Sierra, A. M. Tetrahedron 2000, 56, 5743. (f) Barrett, A. G. M.; Sturgess, M. A.
Tetrahedron 1988, 44, 5615.
[15]. Hashim Mahamed; Bimal K. Banik. Heteroletters special issue,1, 23-26, 2011[16]. Hegedus, L. S.; Montgomery, J.; Narukawa, Y.; Snustad, D. C. J. Am. Chem.
Soc. 1991, 113, 5784.
[17]. Hu, L.; Wang, Y.; Li, B.; Du, D.-M.; Xu, J. Tetrahedron 2007, 63, 9387.
[18]. Kirmse, W.; Rondan, N. G.; Houk, K. N. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 7989.
[19]. Lei Jiao, Yong Liang; Jiaxi Xu. J.AM.Chem.Soc., 128, 6060-6069, 2006[20]. Li, B.; Wang, Y.; Du, D.-M.; Xu, J. J. Org. Chem. 2007, 72, 990.
[21]. Liang, Y.; Jiao, L.; Zhang, S.; Xu, J. J. Org. Chem. 2005, 70, 334.
[22]. Pacansky, J.; Chang, J. S.; Brown, D. W.; Schwarz, W J. Org. Chem. 1982, 47,
2233.
[23]. Shaikh, A. L.; Puranik, V. G.; Deshmukh, A. R. A. S. Tetrahedron Lett. 2006,
5993.
[24]. Sharma, A. K.; Kumar, R. S.; Mahajan, M. P. Heterocycles 2000, 52, 603.
[25]. Sordo, J. A.; Gonzalez, J.; Sordo, T. L. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6249.
[26]. Staudinger, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 356, 51.
[27]. Wang, Y.; Liang, Y.; Jiao, L.; Du, D. M.; Xu, J. J. Org. Chem. 2006, 71, 6983.
[28]. Weatherwax, A.; Abraham, C. J.; Lectka, T. Org. Lett. 2005, 7, 3461.
51
PHỤ LỤC
