NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ …

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGUYỄN HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE,

PROTEASE VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG

TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

TRÀ VINH - 2010

Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh

Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch i

LỜI CẢM TẠ

Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Khoa

Nông nghiệp và Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Bộ môn Công nghệ thực

phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phòng Khoa học công nghệ và đào tạo sau

đại học, Ban lãnh đạo Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, Trung tâm Thí nghiệm, Trung

tâm Công nghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành

nghiên cứu.

Thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó

khăn để thực hiện và hoàn chỉnh nội dung nghiên cứu.

Qúy Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học và các Cán bộ

phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều

kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài.

Quý Thầy, Cô trong Hội đồng báo cáo nghiệm thu đề tài, đặc biệt là Giáo viên phản

biện đã đọc và đóng góp ý kiến quí báo để nghiên cứu được hoàn chỉnh.

Cảm ơn quý Thầy, Cô Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã đóng góp ý kiến, thảo

luận và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm.

Xin chân thành cảm ơn!

Trà vinh, ngày 4 tháng 09 năm 2010

Nguyễn Hoàng Anh


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch ii

TÓM TẮT

Ở Việt Nam, rượu nếp chủ yếu sản xuất theo lối thủ công với chất lượng sản phẩm

không ổn định. Đến nay, phương pháp truyền thống vẫn là phương pháp chủ yếu để

sản xuất rượu mặc dù vẫn còn giới hạn do thời gian sản xuất kéo dài, khó kiểm soát

chất lượng của sản phẩm cuối. Trong nghiên cứu: “Hoàn thiện quy trình sản xuất

rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” được thực hiện để

cải thiện công nghệ sản xuất rượu nếp, nâng cao chất lượng sản phẩm, cũng như dễ

dàng để kiểm soát dây chuyền chế biến đặc biệt là trong giai đoạn dịch hóa, đường

hóa, thủy phân protein và lên men. Vì vậy, những ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng

độ enzyme, tỉ lệ cơ chất và thời gian thủy phân đến hoạt tính các loại enzyme α-

amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột để tạo ra đường khử và papain hoặc

bromelain thủy phân protein để tăng thêm acid amin tự do cho nấm men phát triển

sinh khối và chuyển hóa thành rượu làm tăng hiệu suất lên men trong quy trình sản

xuất đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xác định điều kiện tối ưu

cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu nếp trắng khi sử dụng α-amylase 0,3%, 31

phút tại pH 6,5, nhiệt độ 870C để thủy phân tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu được

khoảng 6,46% và khi sử dụng tiếp glucoamylase 0,6%, 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH

4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến 16,10%. Tiếp theo sử dụng papain với nồng

độ 0,35%, thời gian thủy phân 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng

nitơ amin 0,081%, cùng các thông số động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ±

0,7705 hoặc bromelain nồng độ là 0,5%, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ 550C lượng nitơ

amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ± 0,0013; km=

3,5652 ± 0,4280. Dịch nếp sau khi thủy phân được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men

với nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu

lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc. Kết quả chỉ ra

rằng việc ứng dụng các enzyme thủy phân tinh bột, protein và nấm men thuần chủng

trong quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng có thể giảm thời gian lên men chính còn

6 ngày, tăng độ rượu tạo thành đến 12,6% và sẽ đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh

theo TCVN 7045: 2009, từng bước cải thiện quy trình sản xuất truyền thống theo

phương pháp cổ truyền, có thể sản xuất công nghiệp tạo ra rượu đạt chất lượng cảm

quan cao và đảm bảo an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.

Từ khóa: rượu vang nếp, α–amylase, glucoamylase, dịch hóa, đường hóa, papain, bromelain,

saccharomyces cerevisiae, bánh men thuốc bắc, lên men rượu.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iii

ABSTRACT

In Vietnam, glutinous rice wine has mainly manufactured by manual work and the

quality is not settled. Up to now, traditional method is still the main method to

produce rice wine even though they have a limitation due to taking time for

production, difficult to control the quality of final product. In this study: “The

improvement of white glutinous rice wine production using hydrolysis enzymes

and purebred yeast” was used to improving technological production line of

glutinous rice wine, make the quality of product better as well as make easy to control

processing line especially during liquefaction, saccharification, protein hydrolysis and

alcoholic fermentation stage. Therefore, the effect of pH, temperature, enzyme

concentration, substrate ratio and the time of activation on the activity of four kinds of

commercial enzyme α-amylase, glucoamylase hydrolyze starch to make

transformation of glucose and papain or bromelain hydrolyze protein to increases the

content of amin acid for the yeast to develop biomass and transform into wine, to

increase the fermentation performance of glutinous rice wine were done. The results

showed that optimum conditions four kinds of enzyme were studied directly to white

glutinous rice material established. When using α-amylase 0.3%, 31 minutes at pH 6.5

and 870C to hydrolyze raw material glutinous rice starch, transformation of glucose

was established about 6.46%, and when using glucoamylase 0.6%, 39 minutes at pH

4.0 and 610C directly to glutinous rice material, transformation of glucose was

produced upto 16.10 %. Next, using papain to hydrolyze protein of glutinous rice raw

material with 0.35% concentration, hydrolysis time 45 minutes at pH 5.9, temperature

500C, nitrogen amin produced content 0.081%, kinetic parameters of papain on

glutinous rice starch was Vmax= 0.1065 ± 0.0036; km= 4.7822 ± 0.7705 or using

bromelain with 0.5%, 55 minutes at pH 5.7 and 550C, nitrogen amin produced

0.054%, kinetic parameters of bromelain with substrate as protein of glutinous rice

was calculated as Vmax= 0.0622 ± 0.0013; km= 3.5652 ± 0.4280. Finally, glutinous rice

solution after hydrolysis, filter, adjustment of pH 4.9 are fermented with yeast

Saccharomyces cerevisiae 0.2%, wine product fermented compared to product is wine

fermented in a traditional method using alcoholic starter. Results indicated that the

application of α-amylase, glucoamylase, bromelain and purebred yeast of glutinous

rice wine making can reduce the time for alcohol fermentation shorter 6 days, higher

alcohol level up to 12.6% and will ensure physical-chemical and microorganism

standard criteria TCVN7045: 2009, step by step improving traditional glutinous rice

wine production for industrial production and high-quality sensory produce, hygienic

and safe.

Keyword: glutinous rice wine, α-amylase, glucoamylase, liquefaction, saccharification,

papain, bromelain, alcoholic starter, Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ............................................................................................... i

TÓM TẮT .................................................................................................... ii

ABSTRACT ............................................................................................... iii

MỤC LỤC ................................................................................................... iv

DANH SÁCH BẢNG ................................................................................. xi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ......................................................................... 1

1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1

1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................... 3

2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu ............................................................. 3

2.2 Enzyme amylase ......................................................................................... 4

2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)............................................................ 4

2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3) ...................................................... 7

2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase ............................................................... 8

2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2) .................................................................. 13

2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain ................................................................ 13

2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain .............................................................. 13

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain .......................... 14

2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32) .......................................................... 16

2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain ............................................................ 16

2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain ................................................................ 17

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain ..................... 17

2.5 Nấm men ................................................................................................... 18

2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men.................................................. 18

2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ......................................... 19

2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...................................... 19


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch v

2.6 Bánh men thuốc bắc ................................................................................. 21

2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp ............................. 22

2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột .................................................................... 22

2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp .......................... 23

2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp ............................... 23

2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu .................................................... 24

2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu ......................................... 25

2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu ............................................... 25

2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu ............................. 26

2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men

rượu 27

2.8.1 Sự tạo thành methalnol ...................................................................... 28

2.8.2 Sự tạo thành aldehyde ........................................................................ 28

2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao .......................................................... 28

2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ ............................................................. 29

2.8.5 Sự tạo thành các ester ........................................................................ 29

2.8.6 Sự tạo thành furfurol ........................................................................... 29

2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp ......................................................... 30

2.9.1 Sơ đồ quy trình .................................................................................... 30

2.9.2 Thuyết minh quy trình ......................................................................... 31

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 32

3.1.1 Thời gian và địa điểm ......................................................................... 32

3.1.2 Nguyên vật liệu ................................................................................... 32

3.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 32

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................ 32

3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 34

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 34

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 34


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vi

3.2.3 Phương pháp phân tích ....................................................................... 34

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm ................................................................. 35

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá

trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ........................................ 35

3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme

α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp. ..................................................... 35

3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase

và thời gian thủy phân bột nếp. ............................................................................ 36

3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt

tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ....................................... 37

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong

quá trình đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................... 37


glucoamylase trong thủy phân dịch nếp. .............................................................. 37

3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme

glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng. .......................................... 38

3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt

tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân. .................................. 39

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain

thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase. .................................................................................................. 39


papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ..................................................... 40

3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và

thời gian thủy phân protein nếp. .......................................................................... 40

3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt

tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ................................ 41

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain

thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase. .................................................................................................. 42


bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp................................................. 42


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vii

3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain

và thời gian thủy phân protein nếp. ...................................................................... 42

3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt

tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp. ........................... 43

3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm

rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme

với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. ................ 44

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 46

4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng .............................................. 46

4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình

dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ............................................ 46

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong

quá trình thủy phân bột nếp trắng. ...................................................................... 46

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy

phân bột nếp. ........................................................................................................ 49

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của

enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ..................................................... 51

4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình

đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................................ 52

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase

trong thủy phân dịch nếp trắng. ........................................................................... 53

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian

thủy phân dịch nếp trắng. .................................................................................... 55

4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của

enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân ................................................ 57

4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy

phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase

và glucoamylase. ................................................................................................. 58

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá

trình thủy phân protein nếp. ................................................................................. 59

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy

phân protein nếp. ................................................................................................. 60


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch viii

4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain

trong quá trình thủy phân protein nếp ................................................................. 62

4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy

phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase

và glucoamylase .................................................................................................. 64

4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong

quá trình thủy phân protein nếp ........................................................................... 64

4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy

phân protein dịch nếp. ......................................................................................... 66

4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme

bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp ............................................... 68

4.6 Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu

lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme

với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. ......... 70

4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại

rượu nếp. .............................................................................................................. 71

4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men

chính các loại rượu nếp. ...................................................................................... 72

4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men

chính của các loại rượu nếp................................................................................. 74

4.6.4 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại

rượu nếp. .............................................................................................................. 75

4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men

chính của các loại rượu nếp................................................................................. 77

4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính

của các loại rượu nếp .......................................................................................... 79

4.6.7 Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các

loại rượu nếp ........................................................................................................ 80

4.6.8 Kết quả theo dõi chất lượng sản phẩm rượu nếp trong thời gian

ổn định 3 tháng. ................................................................................................... 80

4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang

nếp ........................................................................................................................ 82


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch ix

4.6.10 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng

bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men

so với TCVN 7045:2009 ....................................................................................... 83

4.6.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng

bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men

so với TCVN 7045:2009 ....................................................................................... 84

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG

ỨNG DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM ... 85

5. 1 Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh

phê duyệt ............................................................................................................. 85

5. 2 Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng ................................................ 86

5.3 Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô

phòng thí nghiệm ................................................................................................ 86

6.1 Kết luận ..................................................................................................... 87

6.2 Đề nghị ...................................................................................................... 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 90

PHỤ LỤC ..................................................................................................... I

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU Ở TRUNG TÂM PHÂN

TÍCH THÍ NGHIỆM, SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, TP.HCM.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch x

DANH SÁCH KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

HTX: Hợp tác xã

DNTN SXTM: Doanh nghiệp tư nhân sản xuất thương mại

TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

Sở KH&CN: Sở Khoa Học và Công Nghệ

w/w (weight/weight): tỉ lệ khối lượng trên khối lượng

w/v (weight/volume): tỉ lệ khối lượng trên thể tích

v/v (volume/volume): tỉ lệ thể tích trên thể tích

KPH: Không phát hiện

TB: Rượu nếp sử dụng bánh men thuốc bắc để lên men

ĐC: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase và bổ sung nấm men thuần

chủng để lên men

PA: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, papain và bổ sung nấm men

thuần chủng để lên men

BR: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, bromelain và bổ sung nấm

men thuần chủng để lên men


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nếp trắng ............................................................. 3

Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau ................... 5

Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau ..... 5

Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men .................................................. 19

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống ..................................................... 22

Bảng 4.1 Thành phần chính của nguyên liệu nếp trắng ............................................ 46

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo

thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng enzyme α-amylase ....................................... 47

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh

bột nếp đến lượng đường khử tạo thành .................................................................... 49

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử tạo

thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase ........................................................... 51

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi

thủy phân dịch nếp bằng enzyme glucoamylase ....................................................... 53

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy

phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra ............................................................. 55

Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra

khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ................................................................ 57

Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành

khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain ...................................... 59

Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng

nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng ............................... 61

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính

enzyme papain ............................................................................................................ 63

Bảng 4.11 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi

thủy phân protein bằng enzyme papain. .................................................................... 64

Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra

khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain ....................................................... 65

Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến

lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng ........................ 67

Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính của


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xii

enzyme bromelain ...................................................................................................... 69

Bảng 4.15 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi

thủy phân protein bằng enzyme bromelain................................................................ 70

Bảng 4.16 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại

rượu ............................................................................................................................. 71

Bảng 4.17 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men

chính của các loại rượu............................................................................................... 73

Bảng 4.18 Kết quả thay đổi độ rượu trong quá trình lên men chính của các loại

rượu ............................................................................................................................. 74

Bảng 4.19 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu ... 76

Bảng 4.20 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của

các loại rượu ............................................................................................................... 78

Bảng 4.21 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của

các loại rượu ............................................................................................................... 79

Bảng 4.22 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 1 tháng ...... 81



Bảng 4.25 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các sản phẩm rượu vang

nếp (TCVN 3217-79) ................................................................................................. 82

Bảng 4.26 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí trong sản phẩm rượu TB và BR

so với TCVN7045: 2009 ............................................................................................ 83

Bảng 4.27 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong sản phẩm rượu TB và BR so

với TCVN7045: 2009 ................................................................................................. 84


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hạt nếp trắng ................................................................................................ 3

Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột ......................... 4

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase ............................................... 6

Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylpectin ..................... 6

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase .......................................... 7

Hình 2.6 Tác dụng của glucoamylase lên phân tử tinh bột ........................................ 7

Hình 2.7 Đồ thị Michaelis-Menten ............................................................................. 10

Hình 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase ....... 10

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase ...................... 11

Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase ............................. 11

Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain ................................................... 13

Hình 2.12 Cấu trúc không gian của enzyme bromelain ............................................. 16

Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................... 19

Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae .......................................................... 20

Hình 2.15 Men thuốc bắc Hải Anh Quang ................................................................. 22

Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxy có

thể hô hấp hiếu khí hoặc lên men yếm khí ................................................................. 24

Hình 2.17 Sơ đồ đường phân trong tế bào nấm men .................................................. 26

Hình 2.18 Sơ đồ tổng quát của quá trình hình thành sản phẩm phụ ........................... 28

Hình 2.19 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến 4 loại rượu vang nếp ............................. 30

Hình 3.1 Máy nghiền nguyên liệu .............................................................................. 33

Hình 3.2 Máy đo pH ................................................................................................... 33

Hình 3.3 Cân phân tích ............................................................................................... 33

Hình 3.4 Chiết quang kế ............................................................................................. 33

Hình 3.5 Chuẩn độ đường ........................................................................................... 33

Hình 3.6 Nấm men ...................................................................................................... 33

Hình 3.7 Nếp trắng ...................................................................................................... 33

Hình 3.8 Water bath ................................................................................................... 33


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xiv

Hình 3.9 Máy chuẩn độ điện thế ................................................................................. 33

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử

tạo thành khi thủy phân bột nếp bằng enzyme α-amylase ................................... 47

Hình 4.2 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến

lượng đường khử tạo thành .................................................................................. 49

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy

phân bột nếp đến lượng đường khử tạo thành ..................................................... 50

Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-

amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành ........................ 51

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo

thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase ...................................................... 52

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng

đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase ................ 54


hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme

glucoamylase ....................................................................................................... 55

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian

thuỷ phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra ............................................... 56

Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme

glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành 57

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh

ra khi thủy phân với enzyme glucoamylase ......................................................... 58

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ

amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain.................. 59


lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain. . 60

Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời

gian đến hàm lượng nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng ............ 61


papain và thời gian thủy phân protein dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành . 62

Hình 4.15 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp sử

dụng đến hoạt tính enzyme papain ...................................................................... 63


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xv

Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin

sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain ..................................... 65


hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp với bromelain. ..... 66

Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời

gian đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp trắng ...... 67


bromelain và thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin sinh ra. ................................. 68

Hình 4.20 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp đến

hoạt tính bromelain ..................................................................................................... 69

Hình 4.21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men chính

của các loại ruợu ......................................................................................................... 72

Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo thời gian

lên men chính của các loại ruợu ................................................................................. 73

Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính

của các loại rượu ......................................................................................................... 75

Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian lên men chính của

các loại rượu................................................................................................................ 77

Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi acid tổng theo thời gian lên men chính

của các loại rượu ......................................................................................................... 78

Hình 4.26 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi ester theo thời gian lên men chính của

các loại rượu................................................................................................................ 80

Hình 4.27 Các sản phẩm rượu vang nếp trắng .......................................................... 84

Hình 5.1 Quy trình sản xuất 4 loại rượu vang nếp trắng ............................................ 86


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Rượu vang là loại thức uống được lên men từ nhiều nguồn liệu: nho, khóm, chuối,

nếp… mang đậm đà bản sắc văn hóa dân tộc của từng địa phương. Từ xưa đến nay,

rượu thường xuất hiện trong các lễ hội, đình đám, các cuộc gặp gỡ của người thân,

bạn bè. Rượu được sử dụng với nhiều mục đích ý nghĩa khác nhau như để chúc mừng,

nâng cao sức khỏe hay để giải bày tâm sự… Rượu trở thành một trong những thức

uống không thể thiếu trong văn hóa ẩm thực cũng như trong đời sống hằng ngày.

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên

men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt quy trình sản xuất, hiện nay ở các

nước trong khu vực đã nghiên cứu, cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền và

được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như

rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc, rượu Shochu ở Hàn Quốc. Ở

Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng từ: rượu nho, rượu Cần ở

các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu nếp của người Kinh, nhiều địa phương đã

sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu Làng Vân ở miền Bắc và rượu Gò Đen, Phú

Lễ, Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng. Trong các loại rượu cổ

truyền kể trên thì rượu nếp là một loại khá đặc biệt, sản phẩm là kết quả của quá trình

lên men từ những hạt nếp mà thành.

Tuy nhiên, phương pháp sản xuất rượu ở một số địa phương vẫn còn theo phương

pháp cổ truyền, tức là quá trình đường hóa và lên men được thực hiện bởi nấm mốc và

nấm men trong bánh men thuốc bắc và thiết bị sản xuất thô sơ, nên năng suất chưa cao

và chất lượng chưa an toàn vì chứa nhiều độc tố, tạp chất ảnh hưởng đến sức khỏe

người tiêu dùng. Do đó, để nâng cao hơn nữa chất lượng sản phẩm truyền thống này

chúng tôi đề ra quy trình sản xuất rượu theo phương pháp mới, thông qua kết hợp hài

hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại. Với việc ứng dụng phương pháp

enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hóa, thủy phân protein và lên

men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như ổn định được chi phí sản xuất, đảm bảo

chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm rượu vang nếp.

Từ những lý do trên việc nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang

nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” có ý nghĩa rất quan trọng.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng qui trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm

TCVN 7045: 2009.



Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể

sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh

thực phẩm.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Từ những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các khảo sát sau:

- Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một

phần hồ tinh bột nếp trắng.

- Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của

dịch nếp trắng.

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein

của dịch nếp trắng.

- Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng

men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên

men chính và ổn định.

- Đánh giá chất lượng sản phẩm (cảm quan, hóa lí và vi sinh vật)

- Phân tích kết quả và tìm ra qui trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp.



CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu

Tên khoa học của nếp là Oryza Sativa thuộc nhóm ngũ cốc, là loại nguyên liệu chứa

tinh bột rất cao phù hợp với công nghệ lên men, trong đó nếp trắng với hàm lượng

tinh bột lên đến hơn 70%, vì vậy nếp trắng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản

xuất rượu.

Hình 2.1 Hạt nếp trắng

Trong tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin, 2cấu tử này khác

hẳn về tính chất hoá học và tính chất vật lý. Phân tử amylose tạo màu xanh với iod

còn amylopectin cho m àu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính

hoà tan, amylose dễ hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không

cao, còn amylopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt

cao. Trong phân tử tinh bột tỉ lệ giữa amylose và amylopectin thay đổi tuỳ thuộc

vào nguồn nguyên liệu, trong hạt gạo chủ yếu là amylose, còn trong hạt nếp là

amylopectin.

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu nếp trắng

Thành phần Hàm lượng (%)

Nước 14,0

Protein 8,2

Lipid 1,5

Glucid 74,9

Acid hữu cơ 0,6

Tro 0,8

(Nguyễn Đức Lượng, 2003)



+ Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷

1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch

xoắn dài không phân nhánh.

+ Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷

6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6

glycoside tạo thành mạch phân nhánh.

2.2 Enzyme amylase

Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy

phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các

polysaccharides. Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin

mạch dài thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn.

Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người

ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm:

- Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh.

- Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm có β-amylase, γ-amylase (glucoamylase).

Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột

2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)

Đặc tính: Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng.

Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn sản



xuất có thành phần amino acid khác nhau. Điều kiện hoạt động và độ bền của các

enzyme α-amylase tùy thuộc vào nguồn chiết suất.

Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau

Nguồn gốc pH tối thích Nhiệt độ tối thích (0C)

Malt 5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75

Vi khuẩn 5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60

Nấm mốc 6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)

Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và

ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase, đồng thời nó còn có vai trò duy trì sự

tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác

động của các enzyme thủy phân protein, nếu α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn

toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion

đơn hóa trị như: Cl- > Br- > I-. Đồng thời chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng

như: Cu2+, Hg2+ (Shahina Naz, 2002).

Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền ở môi trường nhiệt

Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau

Nhiệt độ (0C)

Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu)

Malt Nấm mốc Vi khuẩn

65 100 100 100

70 100 52 100

75 58 3 100

80 25 - 92

85 1 - 58

90 - - 52


* Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin



Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí

nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội

phân (endo).

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase

Giai đoạn dextrin hóa (dịch hóa): Dưới tác dụng của α-amylase, phân tử amylose bị

phân cắt thành các oligosaccharides (6 ÷7 gốc glucose), độ nhớt của hồ tinh bột rất

giảm nhanh.

Giai đoạn đường hóa: Các oligosaccharides lại tiếp tục bị phân cắt tạo thành

maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân α-

amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme α-amylase trên

amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19%

glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase

không cắt được liên kết 1, 6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.

Đề tài nghiên cứu sẽ đề cập đến việc sử dụng Chế phẩm enzyme Termamyl 120L:

ở dạng lỏng, chứa enzyme có khả năng chịu nhiệt ổn định α-amylase, được sản xuất từ

một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Bacillus licheniformis. Enzyme α-amylase

nội bào phân cắt các liên kết α-1, 4-glucoside nằm ở bên trong phân tử cho ra dextrin

và các oligosaccharides.

Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylopectin



Trong dịch tinh bột hòa tan Termamyl 120L có hoạt tính 120 KNU/g (Kilo Novo α-

amylase unit). Hoạt tính có thể bị hủy bằng xử lý nhiệt dung dịch ở pH thấp. Sản

phẩm này không dễ bắt lửa, tan hoàn toàn trong nước và an toàn khi sử dụng theo như

chỉ dẫn, sản phẩm Termamyl 120L có thể gây dị ứng đối với người nhạy cảm (Novo

Nordisk, 2007).

2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3)

Đặc tính: Glucoamylase là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase

amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002).

So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của

ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và

một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5.

Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin

Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside

trong tinh bột, glycogen, polysaccharides, là enzyme ngoại phân (exo enzyme).

Enzyme glucoamylase thủy phân polysaccharides từ đầu không khử tuần tự từng gốc

glucose một nhưng không thủy phân được các dextrin vòng (Lý Nguyễn Bình, 1997).

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase

Khi phân cắt phân tử tinh bột, cùng với việc tạo thành phân tử glucose còn có thể tạo

thành oligosaccharides, ngoài ra γ-amylase có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3

glycoside (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Amylose Amylopectin

Hình 2.6 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột



Đề tài nghiên cứu sử dụng chế phẩm AMG 300L: AMG–Amyloglucosidase Novo

là một exo–D–glucosidase–1,4–alpha được sản xuất từ một chủng vi sinh vật tên là

Aspergillus niger bằng sự lên men chìm. Tên theo hệ thống là 1,4 alpha–D–glucan

glucohydrolase (EC 3.2.1.3). Enzyme này thủy phân các cầu nối α-1,4 và α-1,6 trong

tinh bột.

Trong khi thủy phân, các đơn vị glucose bị tách rời theo thứ tự từ đầu không khử của

phân tử cơ chất nền. Mức độ thủy phân phụ thuộc vào mối nối cũng như chiều dài

chuỗi các mối nối 1,4 alpha dễ dàng bị thủy phân hơn các mối nối 1,6 alpha, trong khi

maltotriose và đặc biệt maltose bị thủy phân ở mức độ thấp hơn các phân tử lớn của

oligosaccharides. Sản phẩm AMG đều không nhiễm hoạt tính transglucosidase bằng

cách chuyển các phân tử của glucose từ vị trí 1,4 alpha qua 1,6 alpha.

Chế phẩm lỏng là những chế phẩm màu nâu, có độ đặc chung 1,2g/ml. Khi AMG tồn

trữ ở nhiệt độ 250C hoạt tính phổ biến được duy trì trong 6 tháng, khi bảo quản ở 50C,

sản phẩm sẽ giữ lại hoạt tính phổ biến ít nhất 1 năm. Hoạt tính có thể bị hủy bằng cách

đun dung dịch chứa enzyme đến 800C trong 5 phút hoặc đến 750C trong khoảng 40

phút (Novo Nordisk, 2007).

2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase

Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng

xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các chế

phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase, để xác

định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:

- Đo sự biến thiên độ nhớt của dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh

bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần.

- Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có amylase

thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod

- Đo lượng maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất.

- Hoạt độ của α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong chế

phẩm tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa

tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính

được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của α-amylase là lượng enzyme chuyển hóa

được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ.

- Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến

glucose. Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên

tinh bột ở 300C và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương

pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm

giải phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucose oxydase).



2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng: khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc

phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, có thể biểu diễn sự liên hệ giữa

vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức: v = k[E].

Trong đó v: vận tốc phản ứng

k: hằng số tốc độ phản ứng

[E]: nồng độ enzyme sử dụng

Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều, tuy nhiên khi

nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng bị chậm lại.

- Ảnh hưởng của cơ chất: cơ chất của enzyme amylase là tinh bột, thuộc nhóm

carbohydrate thực vật có chủ yếu trong các loại ngũ cốc như: gạo tẻ, gạo nếp, ngô,

trong các loại củ: khoai lang, khoai mì (sắn)… Công thức tổng quát của tinh bột là

(C6H11O5)n. Tinh bột được cấu tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin.

Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C.

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị

phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và đường

hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian dextrin, sau

đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và glucose

Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành

phần amylose và amylopectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Phản ứng khi có enzyme xảy ra theo ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES, nếu nồng độ cơ

chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.

Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn

không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.

Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do, hiện tượng này được

xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.

E + S ES P + E (1)

Trong đó:

K1: Hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES

K2: Hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại cơ chất ban đầu và enzyme

K3: Hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P

K1 K3

K2



E: Enzyme

S: Cơ chất

P: Sản phẩm

ES: phức hợp trung gian enzyme-cơ chất.

Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ ES càng lớn vận tốc phản

ứng càng lớn. Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất

theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian thuỷ phân của amylase.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng được biểu diễn theo phương

trình Michaelis-Menten như sau:

V = ][

]max[

Skm

SV

+

Trong đó V: vận tốc phản ứng (hoạt tính enzyme)

km: hằng số Michaelis-Menten (hằng số nhạy cảm enzyme với cơ chất)

Vmax: vận tốc phản ứng cực đại (hoạt tính cực đại của enzyme)

[S]: nồng độ cơ chất

Đồ thị Michaelis-Menten có dạng nhánh hyperbol vuông góc, với V là hàm số của [S]

V

0 km [S]

2

1Vmax

Vmax

Hình 2.7 Đồ thị Michaelis-Menten

Hình 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase

Nồng độ cơ chất (%)

Th

ời

gia

n t

hủ

y p

hâ

n (

ph

út)



-Ảnh hưởng của nhiệt độ: cũng như các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng enzyme

tăng khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng khi đến nhiệt độ nhất định, vượt qua nhiệt

độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm và enzyme có thể bị vô hoạt. Nhiệt độ vô hoạt tùy

thuộc vào loại và nguồn chiết xuất do enzyme amylase có bản chất là protein nên nó

kém bền với nhiệt.

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase

Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, mỗi loại

enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng, nhiệt

độ tối thích của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt các ion kim loại, pH và

chất bảo vệ. Thông thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và

tốc độ phản ứng theo yêu cầu của chế biến.

- Ảnh hưởng của pH: enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường, do

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme–cơ chất và đặc

biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.

Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối

thích, đa số pH của enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ

một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh

Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase

Họ

at

tín

h c

ủa

en

zym

e

Nhiệt độ (oC)

pH

tối

thích

Họ

at

tín

h e

nzy

me



Thay đổi pH tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính enzyme vì thay đổi sự ion hóa các nhóm tại

trung tâm hoạt động, các biến đổi lớn của pH làm biến tính protein của enzyme, do sự

can thiệp vào liên kết phi cộng hóa trị yếu giữ vai trò ổn định cấu trúc không gian. Tốc

độ phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó giảm dần. Đa số các

enzyme bền trong giới hạn pH từ 5,0 ÷ 9,0 và độ bền của enzyme có thể tăng lên khi

có các yếu tố làm bền như Ca2+,… (Lê Ngọc Tú et al…, 2005).

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ

trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động

mạnh, chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt độ enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp.

Chất hoạt hóa thực: ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm

cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của

enzyme. Nhiều enzyme được hoạt hóa bởi các ion Na+, K+, Mg2+, Zn2+, Mn2+…

Chất chống kìm hãm: là chất có khả năng làm mất tác dụng kìm hãm của các chất

khác, như CN- có thể làm mất tác dụng kìm hãm của muối đồng đến enzyme urease.

Chất tác nhân bảo vệ: là các chất có tác dụng bảo vệ các nhóm chức hoạt động của các

trung tâm hoạt động enzyme. Ví dụ như cystein có tác dụng bảo vệ các nhóm thiol của

các tâm hoạt động của nhiều enzyme.

Chất hoạt hóa tiền enzyme: như enterokinase của dịch ruột có khả năng chuyển

trypsinogen không hoạt động thành trypsin hoạt động (Đặng Thị Thu et al…, 2003).

Khả năng làm tăng hoạt tính của các chất này có một giới hạn nhất định, vượt quá giới

hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2002).

- Ảnh hưởng của chất kìm hãm: Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc

làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme, các chất kìm hãm có thể là ion kim

loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein... các chất kìm hãm

có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Trong chất kìm hãm thuận

nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh.

Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường

hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung tâm hoạt

động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme.

Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị

trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử

enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng.

Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng

enzyme tham gia có thể tạo thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ:

nếu có một phản ứng kiểu:



S1 + S2 P1 + P2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có áp lực với P1 và P2 tương

đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với

S1 và S2 (Lê Ngọc Tú et al…, 2005)

Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất

kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng:

E + S ES E + P

Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên

phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này

coi như chất kìm hãm.

ES + S ESS

Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+.

2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2)

2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain

Enzyme papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không

tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan trong H2O hay glycerine.

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của

histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi

liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các

acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain

2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain

Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S. Papain là một protease

thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L. Smith, papain là một chuỗi polypeptide

gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.



Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 ÷ 8,0. Nhiệt độ tối thích để hoạt động

tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C. Một điều cần lưu

ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào

nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain.

So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật, papain có khả năng

thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại

sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của

papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ

chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là endopeptidase vừa là exopeptidase. Các

endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (-NH-CH-COOH)i + (NH2-CH-CO-)k

Trong đó: i + k = n

Các exopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành acid amin

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (H2N-CH-COOH)i’ + (H2N-CH-COOH)k’

Trong đó: i’ + k’ = n

Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết

peptide trừ các liên kết với protein và với glutamic acid có nhóm carboxyl tự do.

Thông tin về enzyme papain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Enzyme papain

được chiết suất từ đu đủ, là một protease cysteine thủy phân được peptide, amides và

ester, đặc biệt là liên kết các acid cơ bản, glycine hay leucine. Chất ức chế bao gồm

Leupeptin và PMSF, có khoảng pH tối ưu 6,0 ÷ 7,0 và pI 8,75.

Enzyme papain thương mại dạng bột màu vàng nâu có khối lượng phân tử 21.000,

hoạt tính >30.000 USP units/mg trên cơ chất casein, ở pH 6,0 và nhiệt độ 400C, ngoài

ra còn thể hiện hoạt tính ở đơn vị khác như: 1 MCU (milk clotting unit)= 9 HDU

(hemoglobin digestion units)= 6 GU (gelatin units)= 30 USP units.

Độ hòa tan dung dịch nước đệm (1mg/ml H2O ở 250C), lưu trữ 20C đến 80C, dạng hòa

tan có thể ổn định cho đến 2 tháng ở nhiệt độ -200C

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain

- Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô

papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 1000C thì

nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung

R R R R

R R R R



dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu

trúc tâm hoạt động của enzym bị phá hủy hoàn toàn.

Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt độ

thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có

tác dụng bảo vệ nó, papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng.

Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều

tháng, enzyme mất hoạt tính của nó mỗi ngày 1÷ 2% do sự tự phân hoặc oxy hóa.

Khi thủy phân protein tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ tối ưu cho papain cũng khác

nhau, đối với cơ chất casein topt là 37oC, papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể

chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2h mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.

- pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 ÷ 8,2 nhưng lại dễ biến

tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH >12,

khi phản ứng với các cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ

khác nhau. Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 ÷ 7,5 với albumin

ở pH tối ưu 4,5 ÷ 7,1 và với gelatin lại có pH tối ưu 5,2 ÷ 6,4, điểm đẳng điện pI = 9.

Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có

thể chịu được các pH=1,5 và pH= 8,5 trong 90 phút. Người ta nhận thấy rằng, sự thay

đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác

động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận

tốc phản ứng do enzyme xúc tác (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

- Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng

không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa

20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu

hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh: TCA 10%, guanidine hydrochloride

6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain.

- Chất hoạt hóa: Papain cần nhóm sulfhyryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Chất

hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay

papain nói riêng. Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25 và

nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain

là các chất có tính khử như: cysteine, glutation, acid hydrocyanic, hydrogensulfite...

trong đó cysteine là chất thường được sử dụng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm

–SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi làm tăng hoạt tính papain.

Để thu được papain hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và

EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò hoạt chất hóa papain còn EDTA đóng vai trò

liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.



- Chất kìm hãm: Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa

như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate,

cystine và các hoạt chất disulfur khác. Đặc biệt papain rất dễ bị mất hoạt tính khi có

mặt hydrogen peroxide, các chất này ức chế papain bằng phản ứng với nhóm –SH ở

trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, khi cysteine ở nồng độ thấp, các ion

kim loại nặng: Cd+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Fe2+ và các tác nhân gây ức chế papain.

Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ hai kể từ đầu mạch

C là chất ức chế cạnh tranh mạnh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động.

Chế phẩm papain bảo quản vài tháng có độ hoạt động khoảng 30%, ngay cả khi hoạt

hóa, lượng sulfuhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1 mol papain và thường không

quá 0,5 mol/mol. Nguyên nhân do nhóm sulfuhydryl đã bị khóa bất thuận nghịch một

phần và bản chất hóa học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu hết.

2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32)

2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain

Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch

chiết từ cây khóm, chủ yếu là các protease cysteine, enzyme bromelain là một

protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine, đây là một

amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là –SH (sulfuhydryl), phân tử có dạng

hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối

disulfite. Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amin thay đổi khác nhau,

bromelain

thân có khoảng 144÷321 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 161÷283 acid

amin, Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở

đầu carbonyl là glycine, bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine.

Hình 2.12 Cấu trúc không gian của enzyme bromelain

Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31kDa,

bromelain quả có điểm đẳng điện pI= 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với



pI=9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985).

2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain

Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Nhóm

sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng

của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác, chúng có khả năng

gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme-cơ chất, chúng tham gia vào nhiều

biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo

thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển

điện tích.

Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia

xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và amino acid

Thông tin về enzyme Bromelain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Bromelain được

sử dụng để thủy phân protein, peptide, amides và ester của các axit amin. Bromelain

được chiết xuất từ thân cây dứa

Enzyme bromelain thương mại dạng bột màu nâu, hoạt tính ≥ 2,0 mAnsonU/mg trên

cơ chất là hemoglobine, ở pH 6,0 và nhiệt độ 35,5°C.

Độ hòa tan dung dịch nước đệm (50g/l H2O ở 20oC), lưu trữ ở nhiệt độ dưới 15°C.

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain

Giống như các chất xúc tác sinh học, bromelain chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như:

loại cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số

nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh chế… Các yếu tố như nhiệt độ,

pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định

mà phụ thuộc lẫn nhau và tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như: bản chất cơ chất,

nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt

hóa.

- Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác

nhau, nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn

papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain.

- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau

lên hoạt tính của enzyme, enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác

dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C (Lê Ngọc Tú,

2004).

Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 ÷ 600C, nhiệt

độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử

enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí



không gian của nhóm -SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất,

Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt

tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).

Nhiệt độ phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian

phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng

đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.

Ở dịch chiết quả pH= 3,5 khi tăng nhiệt độ đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính.

Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn, ở 50C, pH 4 ÷ 10 bromelain giữ hoạt

tính tối đa trên casein trong 24 giờ; ở 550C, pH= 6,1 bromelain bị mất 50% hoạt tính

trong vòng 20 phút, quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính.

- Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt động xúc

tác của enzyme, hoạt tính enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường,

mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH

tối thích. pH tối thích của bromelain không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời

gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất dung

dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt. Enzyme bromelain đã tinh sạch chỉ còn lại

60÷70% hoạt tính, bromelain có biên độ pH rộng (3÷10) nhưng pH tối thích của

enzyme là 5 ÷ 8 tùy thuộc vào cơ chất.

pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của

enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ

làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm

giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme do đó hoạt tính enzyme sẽ bị

giảm hoặc thậm chí mất hẳn (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

- Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thủy

ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm

hãm thay đổi theo nồng độ của muối. Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế

bromelain do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme.

2.5 Nấm men

2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men

Nấm men có cấu tạo đơn bào, tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như hình

cầu, elip, trứng… kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8 ÷ 15µm.



Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

STT Thành phần Hàm lượng (%) STT Thành phần Hàm lượng (%)

1 Carbon 49,80 6 K2O 0,04

2 CaO 12,40 7 SO3 0,42

3 Nitro 6,70 8 MgO 0,38

4 Hydro 3,54 9 Fe2O3 0,04

5 P2O5 2,34 10 SiO 0,09


2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nẩy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một

chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ qua các giai đoạn:

Giai đoạn tiền phát: tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối tăng nhiều.

Giai đoạn phát triển logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh của tế bào nấm

men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân. Trong giai đoạn này

có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men.

Giai đoạn phát triển chậm dần: tốc độ sinh trưởng của tế bào nấm men chậm dần,

thành phần dinh dưỡng trong môi trường dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên

men được tích tụ nhiều.

Giai đoạn ổn định: tế bào nấm men không tăng, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết.

Giai đoạn chết: tế bào nấm men giảm dần do tốc độ chết tăng, tốc độ sinh sản chậm.

Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men

2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang



Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis, chủng nấm men này có tốc độ

lên men nhanh, tạo ra sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol, đặc trưng của nấm men vang

là có hình elip hoặc elip kéo dài. Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng

cách nẩy chồi, trong điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử.

Saccharomyces vini: trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là

Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là Saccharomyces cerevisiae Hansen. Trong

quá trình lên men nước quả, nấm men này sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là

đường, acid hữu cơ và các tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit,

tiamin, piridoxin... Ngoài ra chúng còn có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu

sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc

trưng riêng biệt. Nhiều loài nấm men này trong quá trình lên men rượu tạo được một

lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích, ở giai đoạn cuối của quá trình lên men

Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong rượu, sau đó chúng thường bị già,

không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh.

Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả

năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng rượu tới

18 độ. Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccharose, maltose và 1/3

rafinose và không lên men được lactose, pentose (Nguyễn Đức Lượng, 2002).

Loại nấm men thường được sử dụng sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces

cerevisiae, loại này có khả năng lên men nhiều loại đường như glucose, fructose,

saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu như gạo, nếp, ngô, sắn... Nấm

men này có thể lên men tốt với lượng đường từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ

rượu trong dịch lên men từ 10 ÷ 12%, nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 320C.

Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae

Yêu cầu đối với nấm men rượu vang: Khả năng lên men cao, chịu được nhiệt độ, bền

với ethanol và nồng độ đường cao.



Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một

lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết thúc,

theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi. Đối

với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 280C.

Đặc điểm của lên men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường, chúng không

tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men

xít, bám chắc ở đáy thùng, nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 100C.

Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α-galactosidase

lên men hoàn toàn đường rafinose, còn nấm men nổi thì chỉ có một số ít chủng có khả

năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO2.

Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2

thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù. Ví dụ: nấm men dùng

trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng

thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng.

Các loài nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ

thích hợp 18 ÷ 250C, ở 350C sinh sản của chúng bị ức chế, ở 400C sinh sản bị ngừng

hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 160C sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện lý

hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn

đến quá trình sống của nấm men.

2.6 Bánh men thuốc bắc

Loại bánh men Hải Anh Quang có tính năng hòa men với nước ngâm trực tiếp vào

cơm, là loại men rượu được sản xuất trên dây chuyền tiên tiến của DNTN SXTM Hải

Anh Quang phân phối và cung cấp các đại lý trên toàn quốc.

Cách sử dụng: Một gói men nhỏ 100g dùng cho 10 kg (gạo, tấm, ngô) đã nấu chín để

nguội hẳn. Dùng một gói men nhỏ hòa tan với 20 lít nước đựng trực tiếp trong lu,

khạp. Bỏ cơm đã nguội hẳn vào lu, khạp đảo nhẹ rồi đậy kín. Ủ lên men ở nhiệt độ

280C đến 350C, sau khi ngâm được 24 giờ, đảo nhẹ đều lại lần nữa rồi đậy nắp kín ủ

thêm 8 đến 10 ngày thì chưng cất. Rượu sẽ đạt từ 16 lít đến 18 lít rượu 450 (trước khi

chưng cất rượu chan thêm 15 lít nước).

Thành phần men thuốc bắc: Gạo, lúa mạch, ngô, khoai mì, thuốc bắc, giống men (vi

khuẩn, nấm men và nấm mốc), chất tạo xốp. Loại men này khi lên men chìm cơm, khi

nấu không bao giờ bị khê, khét

Thời gian sử dụng: 6 tháng, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, tránh tiếp xúc với ánh

sáng mặt trời.



Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống

Hình 2.15 Men thuốc bắc Hải Anh Quang

2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp

2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột

Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra

dễ dàng hơn, đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể

tích, khi gia nhiệt tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu

tiếp tục tăng nhiệt thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng

nhất gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của

hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần. Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh

bột tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột. Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị

phá vỡ, điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp giữa

các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành những

mạng, giữa các mạng là amylose và amylopectin.

Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết

hydro, ngoài ra trong tinh bột còn có các liên kết khác chắc chắn hơn (do sự xoắn

mạch của amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho

quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết.

Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu, người ta thường bổ sung một lượng

nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu.

Khi làm nguội, dung dịch amylopectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng

biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng, đối với dung dịch

amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt

nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Do đó

làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội

nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá, một biện pháp kỹ thuật thường dùng là

Thành phần Hàm lượng (%)

Độ ẩm ≤ 8

Glucid ≥ 80

Protein ≥ 8,5

Tổng tế bào nấm men ≥ 107

Nấm mốc độc hại Không có



sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu (Bùi Thị Quỳnh

Hoa, 2004).

2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp

Nguồn tinh bột trong nguyên liệu nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải

qua giai đoạn đường hoá, tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase, enzyme

này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên

men. Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố:

- Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn

bởi nhiệt độ. Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme, nếu vượt quá

nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ đối với cơ chất, nhiệt độ không

chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ

các thành phần của sản phẩm đường hóa, khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra

nhiều hơn so với đường khử. Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase

và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu

suất quá trình phân cắt tinh bột.

- pH: Bản chất của enzyme là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein,

những nhóm hoá học cơ bản của enzyme có khả năng ion hoá. Sự hiện diện của ion

H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này, nếu nhóm này là trung tâm hoạt

động của enzyme thì sẽ kìm hãm hay kích thích enzyme tùy theo nồng độ.

- Thời gian đường hóa: Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ

thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá. Thời gian đường

hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi.

Thời gian đường hoá ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Khi đường

hoá khối nấu ở 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men

không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá.

- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ

cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ

đường hóa tăng. Trong sản xuất tốc độ của quá trình thủy phân là một hàm số, là sự

tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme- cơ chất, nếu có sự khác nhau về loại, lượng,

hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau.

2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp

Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là

chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm

men) tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men

khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí.



Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid

accetic, citric…

Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình

lên men lactic, lên men rượu, butylic… lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với

sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường thành rượu C2H5OH và CO2,

người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa:

Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxygen có thể hô

hấp hiếu khí hoặc lên men yếm khí (Walker, 1998)

2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng nấm men nhất định, tùy

theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau, thông thường số

lượng tế bào nấm men phải lớn hơn 107 ÷ 108 cfu/ml. Do diện tích bề mặt của tế bào

nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường khử và

các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề

mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào

Rượu ethylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm

men, rượu tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường,

CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg

nhiệt độ 25 ÷ 300C là 0,856 ÷ 0,873 lít CO2 trong 1 lít nước, vì thế CO2 sinh ra trong

quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng

Glucose 6-phosphate

NADH

Pyruvate

CO2

Citric acid cycle and

Oxidative phosphorylation

ATP

Nấm men phát triển sinh khối

Sugar

O2

CO2

Glucose 6-phosphate

Triose phosphate

Pyruvate

Ethanol

+

CO2

Oxaloacetat

e

CO2

Succinat

e

Succinate

Sugar

Glycerol

Ethanol

CO2

Nấm men lên men rượu

Hô hấp hiếu khí Lên men yếm khí



thái bão hòa, khi bão hòa phân tử CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình

thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày

càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa

khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề

mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ ra làm cho khí

CO2 bị phóng thích ra bên ngoài, lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở

lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên nấm men luôn ở

trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường

điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ

tăng nhanh quá trình lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)

2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu

- Giai đoạn 1: Khoảng 60 giờ kể khi cho nấm men tiếp xúc với dịch men, sự lên men

xảy ra rất chậm.

- Giai đoạn 2: Đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 ÷ 120 giờ sau thời kỳ

đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến cực đại.

- Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn

định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời

gian lên men phụ kéo dài khác nhau.

Giai đoạn lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men

và ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men rượu, giai đoạn này trong điều kiện

lên men bình thường, nồng độ đường trong dung dịch lên men sẽ giảm đi, mức độ

giảm tùy theo sản phẩm và công nghệ sản xuất, chính những loại đường không lên

men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kì lên men cuối phụ thuộc

vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng,

càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình, tuỳ theo

sản phẩm, nồng độ đường của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất sẽ

tạo ra quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng, thành phần mong muốn của họ.

2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu



2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của tế bào

nấm men, do đó ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men và chất lượng rượu thành

phẩm. Nấm men phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 ÷ 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối

thiểu là 50C, nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 ÷ 220C

có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới

hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 ÷ 450C, nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết.

- Ảnh hưởng của pH: pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, mỗi loại nấm men

phát triển tốt ở một pH nhất định gọi là pH tối thích, nấm men trong sản xuất rượu

NADH + H+

(Acid 1,3 di P - glyceride)

(Acid pyruvic)

(Aldehyd acetic)

(Rượu ethanol)

(Acid P - enolpiruvic)

(Acid 3 P - glyceride)

(Glucose)

CH3CHO

CH3CH2OH

(I)

(Aldehyde - 3 P - glyceride)

ATP

(DioxyKeton P )

ADP

Glucose-6- P

Fructose-6- P

ATP

ADP Fructose-1,6-di P

CHO

CH – OH

CH – O P

CH2 – OH

C = O

CH – O P

NAD H3PO4

CH2 – O P

CH – OH

COO P

ADP

ATP

CH2 – O P

CH – OH

COOH

CH2 – OH

CHO P

COOH

– H2O

CH2

CO P

COOH

CH3

C = O

COOH Piruvatkinase

ADP ATP

CO2

NAD

NADH + H+

Hình 2.17 Sơ đồ đường phân trong tế bào nấm men

(Acid 2 P - glyceride)



vang có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là

4 ÷ 5,0. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH= 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm

men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn

người ta thực hiện trong giới hạn pH khoảng 3,8 ÷ 4,0. Khi pH= 8 thì nấm men phát

triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH= 3,8 nấm men phát triển

mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường lên

men người ta thường bổ sung acid vào môi trường.

- Nồng độ đường: Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng

nồng độ thích hợp từ 10 ÷ 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả

năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 ÷ 35%, nồng độ đường thấp quá cũng

làm giảm năng lực lên men.

- Ảnh hưởng của nồng độ rượu: Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và

khả năng phát triển của nấm men, nồng độ rượu phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế

bào nấm men, nguyên liệu và chuẩn bị cho môi trường lên men.

- Ảnh hưởng của nồng độ Oxy: Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men

đường tạo thành C2H5OH và CO2, còn trong điều kiện có đầy đủ oxy nấm men có khả

năng oxy hóa đường thành CO2 và H2O và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pasteur” kìm

hãm sự lên men bằng Oxy là thành phần không thể thiếu trong quá trình tăng

sinh khối. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế

biến còn lại, với sự có mặt của oxy, nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ

phát triển sinh khối, trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều

aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây

tối màu, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ, gây thối cho sản phẩm

theo thời gian bảo quản. Còn thiếu oxy trong giai đoạn đầu quá trình lên men diễn

ra chậm do không đủ oxy cho quá trình tăng sinh khối làm cho không đủ tế bào lên

men ảnh hưởng chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất.

2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

Cũng tương tự như trên, quá trình phosphoryl hóa fructose, manose có thể tạo thành

các ester hexose-6-phosphate tương ứng, song song với quá trình chuyển hóa đường

thành rượu, các sản phẩm phụ khác: aldehyde, rượu bậc cao, ester, acid hữu cơ,

methanol (Trần Thị Luyến, 2004).



2.8.1 Sự tạo thành methalnol

Trong thành phần nguyên liệu có chứa các pectin, ester của acid polygalacturovic và

rượu methylic, nên sau khi nấu nguyên liệu thì ester này bị phân hủy thành methylic

Ester của acid polygalacturovic Acid pectic + Methy lic

Tạo thành methylic có thể do hoạt động của nấm mốc: vì trong chế phẩm enzyme

amylase thu nhận từ nấm mốc luôn chiếm một lượng pectinase và hemixenlulose.

Do đó khi đường hóa có một lượng pectin bị thủy phân thành acid pectic và

methalnol.

2.8.2 Sự tạo thành aldehyde

Aldehyde là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể tạo

thành qua con đường oxy hóa các loại rượu.

Acid pyruvic Acetaldehyde

Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde, có thể giảm rất nhiều trong quá trình lên men

phụ: do các aldehyde này ngưng tụ lại với nhau để tạo thành các aldol hoặc tác dụng

với ethanol tạo thành dietylacetate, 2-cetaldehyde tác dụng với nhau tạo thành

acetone tiếp tục chuyển thành diacetyl sau cùng chuyển thành 2, 3 butanol.

2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men

rượu, là các loại rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn 2, các alcohol này tuy ít

nhưng nếu lẫn vào ethylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, đó là các

loại alcohol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic… Hàm lượng của chúng chỉ

khoảng 0,4 ÷ 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các

alcohol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin.

Nấm men

Glucose Acid pyruvic Alanin

Acid amin Rượu cao Acid hữu cơ

Decacboxyl hóa

Hình 2.18 Sơ đồ tổng quát của quá trình hình thành sản phẩm phụ



Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo

phản ứng:

R-CH(NH2)-COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2.

Như vậy việc tạo thành alcohol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy

ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu.

2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ

Là sản phẩm bậc hai thường trực của quá tr ình lên men rượu chủ yếu là acid lactic và

acid acetic được tạo thành từ acid pyruvic:

Acid lactic được tạo thành từ phosphordioxyaceton

Phosphordioxyaceton

Ngoài ra acid succinic cũng được tạo thành từ hai con đường: Dehydrogen và trùng

hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehydeacetic và Deamin glutamic.

2.8.5 Sự tạo thành các ester

Song song với việc tạo ra acid và alcohol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men,

các acid và alcohol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng.

Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ

thuộc vào nhiều yếu tố, chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như

chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. Phương trình tổng quát tạo thành

ester:

R-CH2 OH + R2-COOH → RCH2OO-CH2R2 + H2O

Dựa vào những kết quả thu được trong các phòng thí nghiệm cũng như trên thực tế

sản xuất, người ta nhận thấy rằng, lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo

thành trong quá trình lên men phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo pH,

nhiệt độ, nấm men, nguyên liệu... (Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, 2007).

2.8.6 Sự tạo thành furfurol

Các loại đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccharose, glucose, fructose và

một ít maltose được tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt độ cao các đường sẽ bị

phân hủy và mất nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và

melanoidin. Đường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol.

Acid lactic Acid pyruvic

Acetaldehyde Oxy hóa

Acid acetic

Acid lactic + H3PO4 H2O



2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp

2.9.1 Sơ đồ quy trình

Thanh trùng

Gạo nếp

Nghiền

Pha loãng 1: 4

Hồ hóa

Dịch hóa

Đường hóa

Làm nguội

Enzyme α-amylase

Enzyme γ-amylase

Enzyme papain

Thủy phân protein

Làm nguội

Lên men

Lọc

Enzyme bromelain

Hình 2.19 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến 4 loại rượu vang nếp

Lên men phụ

Lọc

Ổn định

Sản phẩm

Hấp

Làm nguội Men Thuốc Bắc

Nước

TB ĐC

BR PA

Làm nguội

Lọc Lọc

Ngâm

Thanh trùng Thanh trùng



2.9.2 Thuyết minh quy trình

- Nghiền: Việc nghiền nhỏ nguyên liệu là khâu rất quan trọng quyết định đến hiệu quả

của quá trình hồ hóa tinh bột và quá trình đường hóa bằng sự thủy phân của enzyme.

Nghiền nhằm tạo điều kiện để tăng tốc độ quá trình lý học và hóa sinh học trong khi

hòa thấm nước vào hạt tinh bột. Đồng thời nghiền nhỏ còn có tác dụng làm tăng

cường tiếp xúc giữa nước và bột nếp giúp các chất hòa tan dễ dàng vào nước khi nấu,

việc nghiền nhỏ nguyên liệu được thực hiện bằng máy nghiền búa.

- Hồ hóa: Mục đích của quá trình hồ hóa là phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt

tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hòa tan trong nước nhằm tạo điều kiện

cho enzyme amylase dễ dàng thủy phân hồ tinh bột.

- Dịch hóa: Quá trình dịch hóa với tác dụng của enzyme α-amylase sẽ phân cắt tinh

bột đã được hồ hóa từ dạng rắn sang dạng lỏng để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình

đường hóa triệt để hơn với sự xúc tác của enzyme glucoamylase.

- Đường hóa Quá trình đường hóa với tác dụng đầu tiên của enzyme α-amylase tinh

bột sẽ được thủy phân tạo thành dextrin mạch ngắn và một ít đường khử (glucose), với

hàm lượng đường khử thấp nên hiệu suất lên men thấp. Dưới tác dụng tiếp theo của

enzyme glucoamylase sẽ thủy phân tinh bột sót lại và các loại đường sau khi dịch nếp

đã được phân cắt bằng α-amylase thành đường khử triệt để hơn cho nấm men sử dụng

để chuyển hóa thành rượu.

- Thủy phân protein: Sau khi đường hóa, dịch nếp được bổ sung enzyme papain hoặc

bromelain để thực hiện quá trình thủy phân protein thành peptide mạch ngắn và acid

amin tự do nhằm cải thiện độ trong, màu sắc và mùi vị của sản phẩm rượu vang.

- Làm nguội: Sản phẩm sau khi thủy phân xong dịch nếp có nhiệt độ khá cao nên cần

làm nguội đến nhiệt độ phòng để tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men phát triển và

lên men rượu.

- Lên men: Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ phòng, trong thời gian lên

men có hai quá trình xảy ra song song ở mức độ khác nhau đó là quá trình phát triển

sinh khối của nấm men và quá trình rượu hóa. Với 4 sản phẩm rượu được lên men với

2 nguồn: bánh men thuốc bắc và enzyme, nấm men thuần chủng để tiến hành lên men.

Lên men phụ: Rượu vang nếp được lên men và không qua chưng cất nên sau khi lên

men xong sẽ còn nhiều sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm và gây

độc cho người tiêu dùng. Vì vậy, cần có thời gian lên men phụ để chuyển hóa và ổn

định rượu làm cho chất lượng rượu tốt hơn, thời gian lên men phụ và ổn định chất

lượng rượu vang thường là 6 tháng.



CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Từ ngày 01/06/2009 đến 01/08/2010

Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực

Phẩm - Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại học Cần Thơ và

Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Trung tâm Thí Nghiệm – Khoa Nông Nghiệp

Thủy Sản – Trường Đại học Trà Vinh.

3.1.2 Nguyên vật liệu

- Nếp thơm trắng được mua tại siêu thị Coop Mart-Cần Thơ.

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae.

- Enzyme α-amylase, glucoamylase, papain, bromelain

3.1.3 Hóa chất

- NaOH 30%, 10%, NaOH 0,1N.

- Pb(CH3COO)2 30%.

- Na2SO4 bão hoà.

- Metyl xanh 1% trong nước.

- Fehling A (69,28g CuSO4 trong 1 lít nước cất).

- Fehling B (346g Kalinatritartrate và 100g NaOH trong 1 lít nước cất).

- Phenolphtalein 1% trong cồn.

- Acid citric, sorbic

- Na2CO3 khan.

- NaHSO3 khan 98%.

- H2SO4 đậm đặc 98%, H2SO4 0,1N.

- Anilin C6H5NH2, formol.

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

- Máy nghiền nguyên liệu (JIYU MILL, Nhật).

- Máy đo pH (pH meter HANNA-12P, Nhật).

- Chiết quang kế cầm tay (ATAGO, Nhật).

- Rượu kế (thang đo 0 ÷ 30 độ, Trung Quốc).



- Cân phân tích (OHAUS, độ chính xác d = 0,0001, Nhật)

- Bếp điện, nhiệt kế

- Bình thủy tinh lên men.

- Hệ thống chưng cất rượu.

- Pipet 20ml, 10 ml, 5ml, micropipet 10 – 100µl, 100 – 1000µl.

Cùng một số thiết bị dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm thực phẩm…

Hình 3.1 Máy nghiền nguyên liệu Hình 3.2 Máy đo pH Hình 3.3 Cân phân tích

Hình 3.4 Chiết quang kế Hình 3.5 Chuẩn độ đường Hình 3.6 Nấm men

Hình 3.7 Nếp trắng Hình 3.8 Water bath Hình 3.9 Máy chuẩn độ điện thế



3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Nếp thơm trắng được mua ở siêu thị Coop Mart-Cần Thơ, đóng gói nhỏ với trọng

lượng 1 kg, chất lượng đồng nhất và nghiền mịn bằng máy nghiền.

Các loại enzyme amylase (Termamyl 120L, AMG 300L), protease (Papain,

Bromelain) được mua ở dạng thương mại.

Nấm men: Sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae.

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và theo thể thức thừa số với cùng một nguồn dữ

liệu, 2- 3 lần lặp lại. Kết quả được tính toán thống kê và phân tích phương sai, kiểm

định LSD, vẽ đồ thị bằng chương trình Stagraphics plus 4.0, Excel, SAS 9.1.

3.2.3 Phương pháp phân tích

- Xác định pH bằng máy đo pH.

- Phân tích hàm lượng chất khô (độ Brix) bằng chiết quang kế.

- Xác định hàm lượng đường tạo thành theo phương pháp Lane-Eynon (Bộ môn Công

nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng-Trường Đại học

Cần Thơ).

- Xác định nồng độ rượu tạo thành bằng phương pháp chưng cất (Nguyễn Đình

Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).

- Xác định hàm lượng acid toàn phần theo bằng phương pháp định phân (Nguyễn

Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).

- Xác định hàm lượng ester theo bằng phương pháp định phân (Nguyễn Đình Thưởng

và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).

- Định tính furfurol dựa vào phản ứng màu giữa furfurol với anilin trong môi trường

acid có màu hồng-da cam (Lê Thanh Mai et al, 2005).

- Xác định hàm lượng nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ formol theo phương

pháp Sorensen (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

- Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm (Ngô Thị Hồng Thư, 1998).

- Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu nếp theo Ref AOAC 992.23,2002

(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).

- Xác định hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu và dịch nếp theo TCVN 4594-1988




- Xác định hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp bằng phương pháp GC-EZ faast


- Xác định hàm lượng aldehyde bằng phương pháp GC-AOAC

968:09,972:10,983:13,984:14 1990 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở

KH&CN TP.HCM).

- Xác đinh hàm lượng methanol (CH3OH) bằng phương pháp GC-AOAC

968:09,972:10, 983:13, 984:14 1990 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở

KH&CN TP.HCM).

- Kiểm nghiệm vi sinh vật: Clostridium perfringens (ISO 7937:2004), Coliform

(Ref.ISO 4831: 2006), Ecoli (Ref.NF V08-017: 1980), Staphylococcus aureus (Ref

.ISO 6888-3: 2003), Tổng số nấm men nấm mốc (ISO 7954: 1987), Tổng số vi khuẩn

hiếu khí (ISO 4833: 2003) (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN

TP.HCM).

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và

đường hóa một phần bột nếp trắng.

3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong

quá trình thủy phân bột nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme α-amylase.

b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.

Nhân tố A: pH dịch nếp A1: 5,5 A2: 6,0 A3: 6,5 A4: 7,0

Nhân tố B: nhiệt độ thủy phân B1: 750C B2: 800C B3: 850C B4: 900C

c. Các nghiệm thức:

Nhân tố A

Nhân tố B (oC)

B1 B2 B3 B4

A1 A1B1 A1B2 A1B3 A1B4




- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị



d. Chuẩn bị mẫu: Cho mg nguyên liệu nếp xay nhuyễn vào bình tam giác định mức

bằng nước cất. Chỉnh pH và nhiệt độ theo các mức cần khảo sát rồi bổ sung enzyme α-

amylase vào tỉ lệ enzyme sử dụng là 0,3% (v/v), giữ nhiệt 30 phút để enzyme hoạt

động, sau thời gian thủy phân làm nguội nhanh bằng nước lạnh.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử trong dịch nếp sau khi thủy phân.

Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân của

enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp.

3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy

phân bột nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme và thời gian thủy phân thích hợp cho

quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp.

b. Bố trí thí nghiệm: kế thừa các thông số như tỉ lệ 1 nếp: 4 nước, pH, nhiệt độ của α-

amylase trong quá trình dịch hóa để khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ enzyme

và thời gian thủy phân.

Thí nghiệm được bố trí 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.

Nhân tố C: nồng

độ α- amylase C1: 0,1 % C2: 0,2 % C4:0,3 % C4: 0,4 %

Nhân tố D: thời

gian thủy phân D1: 10phút D2: 20phút D3: 30phút D4: 40phút


Nhân tố C (%)

Nhân tố D (phút)

D1 D2 D3 D4

C1 C1D1 C1D2 C1D3 C1D4





d. Chuẩn bị mẫu: Cân mg nếp xay nhuyễn cho vào bình tam giác và định mức bằng

nước. Điều chỉnh pH và nhiệt độ theo thông số tối ưu ở thí nghiệm 3.3.1.1. Nồng độ



α-amylase và thời gian thủy phân lần lượt thay đổi theo mức bố trí, sau khi thủy phân

tiến hành làm nguội nhanh bằng nước lạnh.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử sinh ra trong dịch nếp sau khi thủy phân.

Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân của α-

amylase tối ưu để ứng dụng cho thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.

3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-

amylase trong quá trình thủy phân.

a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp lên hoạt tính của

enzyme α-amylase.

b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố tỉ lệ bột nếp và lặp lại 3 lần.

- Nhân tố E: E1:5%; E2:10%; C3:15%; C4:20%; C5:25%; C6:30%; C7:35%, C8:40%.

- Tổng nghiệm thức: 8 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24 đơn vị.

c. Chuẩn bị mẫu: Cho vào bình tam giác gồm nước và bột nếp với tỉ lệ lần lượt thay

đổi theo 8 mức độ khảo sát. Sử dụng các thông số tối ưu pH, nhiệt độ, nồng độ α-

amylase và thời gian thủy phân từ thí nghiệm 3.3.1.1 và 3.3.1.2, sau thời gian thủy

phân mẫu được làm nguội nhanh bằng nước lạnh.

d. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử tạo thành.

Kết quả thí nghiệm: Xác định mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và hoạt tính

enzyme α-amylase.

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường

hóa dịch nếp trắng.

3.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase

trong thủy phân dịch nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp cho enzyme glucoamylase.

b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.

Nhân tố F: pH của dịch nếp F1: 3,5 F2: 4,0 F3: 4,5 F4: 5,0

Nhân tố G: nhiệt độ thủy phân G1: 550C G2: 600C G3: 650C G4: 700C




Nhân tố F

Nhân tố G (oC)

G1 G2 G3 G4

F1 F1G1 F1G2 F1G3 F1G4





d. Chuẩn bị mẫu: Tương tự như thí nghiệm 3.3.1, sau khi thủy phân bằng α- amylase,

dịch nếp được thay đổi pH và nhiệt độ theo các mức khảo sát rồi bổ sung tiếp enzyme

glucoamylase, kết thúc quá trình thủy phân dịch nếp được tiến hành làm nguội nhanh

bằng nước lạnh.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử sinh ra.

Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình đường hóa bằng

glucoamylase.

3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian

thủy phân dịch nếp trắng.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân

thích hợp cho quá trình đường hóa.

b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.

Nhân tố H: nồng độ

glucoamylase H1: 0,4 % H2: 0,5 % H3:0,6 % H4: 0,7 %

Nhân tốI: thời gian

thủy phân I1:10phút I2: 20phút I3: 30phút I4: 40phút




Nhân tố H (%)

Nhân tố I (phút)

I1 I2 I3 I4

H1 H1I1 H1I2 H1I3 H1I4




- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị

d. Chuẩn bị mẫu: Tiến hành dịch hóa theo các thông số tối ưu của các thí nghiệm

3.3.1, chỉnh pH và nhiệt độ theo thông số tối ưu của thí nghiệm 3.3.2.1, bổ sung

enzyme glucoamylase với nồng độ thay đổi theo 4 mức độ và thời gian thủy phân điều

chỉnh theo các mức khảo sát, kết thúc quá trình thủy phân tiến hành làm nguội nhanh

dịch nếp bằng nước lạnh.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử tạo thành.

Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân thích

hợp cho quá trình đường hóa, áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme

glucoamylase trong quá trình thủy phân.

a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất đến lên hoạt tính của

enzyme glucoamylase.

b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố, lặp lại 3 lần.

Nhân tố J: tỉ lệ bột nếp (%): J1: 5, J2: 10, J3: 15, J4: 20, J5: 25, J6: 30, J7: 35, J8:40


c. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần

khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2.1 và 3.3.2.2.

d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử sinh ra.

Kết quả thí nghiệm: xác định ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme

glucosamylase.

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein

dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.



3.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá

trình thủy phân protein nếp.

a. Mục đích: Xác định được pH, nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của enzyme

papain.

b. Bố trí thí nghiệm: gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.

Nhân tố K: pH của dịch nếp K1: 5,0 K2: 5,5 K3: 6,0 K4: 6,5

Nhân tố L: nhiệt độ thủy phân L1: 400C L2: 450C L3: 500C L4: 550C


Nhân tố K

Nhân tố L (oC)

L1 L2 L3 L4

K1 K1L1 K1L2 K1L3 K1L4




- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16, số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.

d. Chuẩn bị mẫu: Dịch nếp sau khi được thủy phân bằng enzyme α-amylase,

glucoamylase được điều chỉnh pH theo các mức vừa khảo sát và sau đó nâng nhiệt lên

các mức bố trí rồi bổ sung enzyme papain vào, sau khi thủy phân dịch nếp được tiến

hành làm nguội nhanh bằng nước lạnh.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sinh ra sau khi thủy phân bằng papain

Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối thích cho enzyme papain để áp

dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.

3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy

phân protein nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme và thời gian thủy phân của enzyme

papain thích hợp cho sản phẩm rượu có mùi vị, màu sắc, độ trong tốt nhất.




Nhân tố M: nồng

độ papain M1: 0,1 % M2: 0,2 % M3: 0,3 % M4: 0,4 %

Nhân tố N: thời

gian thủy phân N1: 20phút N2: 30phút N3: 40phút N4: 50phút


Nhân tố M (%)

Nhân tố N (phút)

N1 N2 N3 N4

M1 M1N1 M1N2 M1N3 M1N4




Tổng số nghiệm thức: 4 x 4= 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.

d. Chuẩn bị mẫu: Sau khi xác định được pH và nhiệt độ tối thích của enzyme papain

ở thí nghiệm 3.3.3.1, tiến hành quá trình thủy phân protein ở các nồng độ enzyme

papain và thời gian thủy phân khác nhau.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân bằng papain

Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ và thời gian thủy phân của enzyme papain

tối ưu để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.

3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain

trong quá trình thủy phân protein nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của

enzyme papain thông qua hằng số Vmax và km


Nhân tố O: tỉ lệ bột nếp (%) O1:5, O2: 10, O3: 15, O4: 20, O5: 25, O6: 30, O7: 35,

O8:40


c. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần

khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2; 3.3.3.1 và 3.3.3.2



d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân.

Kết quả thí nghiệm: xác định km, Vmax của enzyme papain.

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân

protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.

3.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong

quá trình thủy phân protein nếp.

a. Mục đích: Xác định được điều kiện tối thích về pH và nhiệt độ cho hoạt động xúc

tác của enzyme bromelain.


Nhân tố P: pH của dịch nếp P1: 5,0 P2: 5,5 P3: 6,0 P4: 6,5

Nhân tố Q: nhiệt độ thủy phân Q1: 450C Q2: 500C Q3: 550C Q4: 600C


Nhân tố P

Nhân tố Q (oC)

Q1 Q2 Q3 Q4

P1 P1Q1 P1Q2 P1Q3 P1Q4




Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị

d. Chuẩn bị mẫu: Dịch nếp sau khi được thủy phân bằng enzyme α-amylase,

glucoamylase được điều chỉnh thông số pH và nhiệt độ theo các mức bố trí rồi bổ

sung tiếp enzyme bromelain để phân cắt protein dịch nếp.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sau khi thủy phân bằng enzyme bromelain

Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH của enzyme bromelain thích hợp

nhất để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.

3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy

phân protein nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân

thích hợp cho sản phẩm rượu có màu sắc, mùi vị và độ trong tốt nhất.




Nhân tố R: nồng độ bromelain R1: 0,3 % R2: 0,4 % R3:0,5 % R4: 0,6 %

Nhân tố S: thời gian thủy phân S1:30phút S2:40phút S3:50phút S4:60phút


Nồng độ enzyme (%)

Thời gian thủy phân (phút)

S1 S2 S3 S4

R1 R1S1 R1S2 R1S3 R1S4




Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.

d. Chuẩn bị mẫu: Sau khi xác định pH và nhiệt độ tối thích của enzyme bromelain ở

thí nghiệm 3.3.4.1, tiến hành quá trình thủy phân protein ở các nồng độ enzyme và

thời gian khác nhau để thu được nitơ amin thích hợp cho quá trình lên men.

e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sau khi thủy phân bằng enzyme bromelain.

Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ và thời gian thủy phân của bromelain thích

hợp nhất để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.

3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme

bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp.

a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến lên hoạt tính

của enzyme bromelain thông qua hằng số Vmax, km.


Nhân tố T : tỉ lệ bột nếp (%): T1: 5, T2: 10, T3: 15, T4: 20, T5: 25, T6: 30, T7: 35, T8:

40


d. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần

khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2; 3.3.4.1 và 3.3.4.2.

e. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân bằng bromelain.



Kết quả thí nghiệm: xác định Vmax, km của enzyme bromelain.

3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men

truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần

chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.

a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra quy trình sản xuất sản phẩm rượu theo tiêu chuẩn an

toàn chất lượng vệ sinh thực phẩm và đạt giá trị cảm quan tốt nhất.

b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 1 nhân tố các loại rượu, lặp lại 3 lần:

U1: Rượu lên men bằng bánh men thuốc bắc, ký hiệu: (TB)

U2: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase và sử dụng nấm men thuần

chủng lên men, ký hiệu: (ĐC)

U3: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase, papain và sử dụng nấm men

thuần chủng lên men, ký hiệu: (PA)

U3: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase, bromelain và sử dụng nấm men

thuần chủng lên men, ký hiệu: (BR)

- Tổng nghiệm thức: 1x 4 = 4 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 4 x 3 = 12 đơn vị

c. Chuẩn bị mẫu:

Loại rượu lên men theo phương pháp cổ truyền sử dụng bánh men thuốc: Nguyên liệu

nếp được hấp chín, để nguội và bổ sung bánh men thuốc bắc được hòa tan trực tiếp

với nước để lên men.

Các loại rượu sử dụng enzyme và nấm men thuần chủng: Dung dịch nếp được dịch

hóa, đường hóa và thủy phân protein theo kết quả tối ưu thu được ở các thí nghiệm

trước, tiến hành lọc, điều chỉnh pH và bổ sung nấm men thuần chủng để lên men.

d. Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu chất lượng rượu được phân tích trong suốt thời gian

lên men chính 7÷8 ngày và lên men phụ, ổn định, bảo quản trong 3 tháng.

Chỉ tiêu hóa lý:

- Hàm lượng chất khô hòa tan (Brix) bằng chiết quang kế.

- Chỉ số pH.

- Hàm lượng đường khử còn sót lại.

- Nồng độ Ethanol bằng cồn kế.

- Hàm lượng acid tổng (Acid acetic).

- Hàm lượng Ester (Etyl acetate).

- Hàm lượng Aldehyde (Aldehyde acetic).



- Hàm lượng cồn bậc cao (Isobutanol, Isopentanol 1:3).

- Hàm lượng Furfurol.

- Hàm lượng Methanol.

Chỉ tiêu cảm quan:

- Độ trong và màu sắc.

- Mùi.

- Vị.

Chỉ tiêu vi sinh vật:

- Clostridium perfringens (cfu/ml).

- Coliform (cfu/ml).

- Ecoli (MPN/ml).

- Staphylococcus aureus (cfu/ml).

- Tổng số nấm men nấm mốc (cfu/ml).

- Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/ml).

Kết quả thí nghiệm: Xác định quy trình sản xuất rượu theo tiêu chuẩn chất lượng

an toàn vệ sinh thực phẩm và đạt giá trị cảm quan tốt nhất để sản xuất thực nghiệm.



CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng

Nguyên liệu nếp trắng thơm chọn để thực hiện thí nghiệm được mua từ Liên hiệp

HTX thương mại TP.HCM (SAIGON CO.OP), thành phần chính của hạt nếp thể hiện

ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Thành phần chính của nguyên liệu nếp trắng thơm

Chỉ tiêu Giá trị (%)

Độ ẩm 10,92

Tinh bột 77,16

Protein 7,93

(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)

Theo kết quả phân tích thành phần chính của nguyên liệu ở bảng 4.1, cho thấy nếp

trắng có hàm lượng tinh bột 77,16 % là rất cao. Vì thế khi thực hiện tiến trình hồ hóa

tinh bột sẽ làm độ nhớt của dịch nếp tăng cao gây cản trở cho quá trình đường hóa sau

này, chính vì vậy với việc sử dụng enzyme α-amylase để phân cắt hồ tinh bột nhằm

làm giảm độ nhớt trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần là rất cần thiết.

4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và


4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy

phân bột nếp trắng.

Dựa trên những tài liệu tham khảo cho thấy, hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme

phụ thuộc rất nhiều vào pH và nhiệt độ, mỗi loại enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao

nhất ở mỗi giá trị pH và nhiệt độ tối thích, cho nên thí nghiệm được thực hiện với mục

tiêu là xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase để tiến hành quá trình

dịch hóa, đường hóa một phần hồ tinh bột nguyên liệu nếp.

Thí nghiệm tiến hành với enzyme α-amylase được sử dụng ở nồng độ 0,3% (v/v) và

thời gian thủy phân là 30 phút, dung dịch sau khi thủy phân được phân tích hàm lượng

đường khử sinh ra, kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.1.



Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân

tinh bột nếp bằng enzyme α-amylase, (g/100ml)

pH dịch nếp

Nhiệt độ thuỷ phân (oC) Trung bình

(pH) 75 80 85 90

5,5 4,64 5,48 5,65 5,54 5,33c

6,0 4,89 5,60 5,90 5,72 5,53b

6,5 5,48 5,84 6,18 6,04 5,88a

7,0 5,12 5,22 6,04 5,97 5,59b

Trung bình

(Nhiệt độ) 5,03D 5,53C 5,94A 5,82B

Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự

khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.2 cho thấy pH và nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn

đến hoạt tính xúc tác của enzyme α-amylase khi thủy phân tinh bột trong nguyên liệu

nếp trắng

7580

8590

5.5

6

6.5

7

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Nhiệt độ (oC)

pH

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi

thủy phân tinh bột nếp trắng bằng enzyme α-amylase



Theo kết quả những nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà

khoa học nhận thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định

nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại, giá trị pH mà ở

đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu, vượt quá giới hạn pH này hoạt động

xúc tác của enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Thí nghiệm tiến hành bằng

cách điều chỉnh pH của dịch tinh bột nếp từ 5,5 đến 7,0 ở nhiệt độ từ 75oC đến 90oC

để khảo sát hoạt tính của enzyme, kết quả cho thấy hoạt động của enzyme α-amylase

có những ảnh hưởng.

Qua kết quả thí nghiệm ở bảng 4.2 và hình 4.1 nhận thấy pH tối thích cho α- amylase

hoạt động trên nguyên liệu nếp trắng với pH 6,5 thì lượng đường khử sinh ra cao nhất.

Với pH 5,5 lượng đường khử thu được thấp nhất. Ở giá trị pH 6,0 và 7,0 lượng đường

khử tạo thành không có khác biệt ý nghĩa. Hàm lượng đường khử thu được khi thủy

phân ở các mức giá trị pH còn lại có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với mức 5%.

Số liệu thí nghiệm còn cho thấy, pH cao hoặc thấp hơn pH tối ưu, hàm lượng đường

khử sinh ra đều giảm, do đó có thể nói rằng pH có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến hoạt

tính enzyme. Có thể vì khi thay đổi pH môi trường sẽ làm thay đổi khả năng ion hóa

của enzyme và cơ chất, do đó sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng tạo phức hợp ES làm

giảm vận tốc phản ứng, vì thế phải chọn pH tối thích cho enzyme hoạt động để đạt

được hiệu quả cao nhất.

Bên cạnh ảnh hưởng của pH thì nhân tố nhiệt độ cũng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

tính enzyme α-amylase, trong các phản ứng sinh học khi nhiệt độ tăng thì khả năng

xúc tác của enzyme sẽ tăng nhưng tốc độ phản ứng không phải lúc nào cũng tăng tỷ lệ

thuận với nhiệt độ, khả năng tăng nhiệt độ có một giới hạn nhất định nếu quá giới hạn

nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh (Nguyễn Đức Lượng, 2002).

Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.1 cho thấy hàm lượng đường khử

sinh ra sẽ tăng khi tăng nhiệt độ từ 75oC, 80oC đến 85oC và sẽ giảm nếu tiếp tục tăng

nhiệt độ đến 900C, giữa các mức nhiệt độ ảnh hưởng đến lượng khử tạo thành đều

khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Số liệu thí nghiệm đạt được hoàn toàn phù hợp với lý thuyết vì bản chất của enzyme

là protein thường không bền ở nhiệt độ cao, vì thế khi tăng nhiệt độ trong giai đoạn

đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian ES của

enzyme cho phù hợp với cơ chất, khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không

gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không

gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt tiêu

(Nguyễn Đức Lượng, 2002). Điều này cũng phù hợp với đặc tính của enzyme α-

amylase sử dụng trong nghiên cứu của đề tài có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis là loài có thể chịu được nhiệt độ cao.



Z = -60,7044 +1,07437*X +6,18554*Y-0,498333*Y2-0,0063*X2+0,00327467*X*Y; R2= 99,81%

Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng đường khử (%)

Hình 4.2 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử

Theo đồ thị không gian 3D hình 4.2.a thể hiện sự phụ thuộc của lượng đường khử theo

pH và nhiệt độ khi thủy phân tinh bột nếp để tiến hành dịch hóa, đường hóa một phần.

Đồng thời đồ thị Contour hình 4.2.b cho phép chọn điểm pH và nhiệt độ tối ưu cho

quá trình thủy phân để thu được hàm lượng đường khử tạo thành cao nhất.

Từ các số liệu ở bảng 4.2 và hình 4.1; 4.2.a, 4.2.b nhận thấy đường khử thu được khi

thủy phân tinh bột trong nếp trắng có giá trị cao nhất ở pH 6,5 và nhiệt độ 870C là 2

thông số tối ưu để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần tinh bột cho

các thí nghiệm tiếp theo.

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp.

Tiến hành thí nghiệm với α-amylase để dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp với

nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau, số liệu được thể hiện ở bảng 4.3

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh bột nếp đến lượng

đường khử tạo thành, (g/100ml)

Nồng độ

enzyme (%)

Thời gian (phút) Trung bình

(Nồng độ) 10 20 30 40

0,1 4,65 5,16 5,12 5,31 5,06c

0,2 5,06 5,42 5,65 5,84 5,49b

0,3 5,22 5,60 6,11 6,18 5,78a

0,4 5,06 5,48 6,32 6,32 5,80a

Trung bình

(Thời gian) 5,00C 5,42B 5,80A 5,91A



(a) (b)



Để quá trình dịch hóa, đường hóa xảy ra nhanh và hiệu quả, các thông số pH tối ưu

pH 6,5 và nhiệt độ tối thích 870C được kế thừa từ thí nghiệm 4.2.1. Theo kết quả

thống kê thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân có

ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme khi phân cắt tinh bột nếp

0.10.2

0.30.4

10

20

30

40

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Nồng độ alphamylase (v/v)

Thời gian

(phút)

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp

đến lượng đường khử tạo thành

Tiến hành dịch hóa, đường hóa tinh bột là công đoạn không thể thiếu đối với công

nghệ sản xuất rượu, trong giai đoạn này enzyme sẽ phân cắt tinh bột thành những

phân tử dextrin mạch ngắn và đường khử, vì vậy chỉ tiêu được quan tâm nhiều nhất

trong thí nghiệm là lượng đường khử sinh ra, loại đường chủ yếu được nấm men sử

dụng để phát triển sinh khối và lên men rượu.

Qua kết quả thống kê bảng 4.3 và hình 4.3 nhận thấy với cùng nồng độ tinh bột nếp,

nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân, chỉ có thay đổi nồng độ enzyme α-amylase thì

lượng đường khử tạo thành cũng khác nhau, hàm lượng đường khử sẽ tăng nếu tăng

nồng độ enzyme sử dụng nhưng không đều. Hàm lượng đường khử tăng nhiều khi

nồng độ enzyme α-amylase tăng từ 0,1%, 0,2%, 0,3% có sự khác biệt ý nghĩa thống

kê và tăng chậm khi nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,4% không có sự khác biệt

thống kê ở mức ý nghĩa 5%.

Bên cạnh ảnh hưởng nhân tố nồng độ enzyme, theo số liệu thể hiện ở bảng 4.3 và hình

4.3 còn cho thấy lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo thời gian thủy phân, lượng

đường khử tăng nhanh trong khoảng thời gian 10 phút đến 30 phút và tăng chậm trong

khoảng thời gian 30 phút đến 40 phút. Kết quả thống kê cho thấy, ở các mức thời gian

thủy phân 10, 20, 30 phút thì lượng đường khử sinh ra có sự khác biệt ý nghĩa nhưng



ở khoảng 30 và 40 phút thì lượng đường khử sinh ra không có sự khác biệt thống kê ở

mức ý nghĩa 5%.

Z= 0,209885*Y + 21,6977*X – 0,0864364*X*Y – 32,3212*X2- 0,00296129*Y2; R 2 = 99,41%

Ghi chú X: Nồng độ enzyme α-amylase (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%)

Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian

thủy phân đến lượng đường khử tạo thành.

Theo đồ thị 3D hình 4.4.a thể hiện sự phụ thuộc của hàm lượng đường khử theo nồng

độ enzyme và thời gian dịch hóa, đường hóa một phần. Đường khử sinh ra tăng theo

nồng độ enzyme và thời gian thủy phân. Đồng thời đồ thị Contour hình 4.4.b còn cho

phép chọn điểm tối ưu về nồng độ enzyme và thời gian cho quá trình thủy phân tinh

bột nếp trắng.

Từ các số liệu ở bảng 4.3 và hình 4.3 cùng hình 4.4.a, 4.4.b đồng thời xét về mặt hiệu

quả kinh tế mang lại, có thể nhận thấy rằng nồng độ enzyme α-amylase 0,3 % và thời

gian thủy phân 31 phút với lượng đường khử thu được 6,46% là 2 thông số tối ưu để

tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase

trong quá trình thủy phân.

Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng với mục tiêu

là xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong

quá trình thủy phân, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân với

enzyme α-amylase

Cơ chất bột nếp (%) 5 10 15 20 25 30 35 40

Đường khử (%) 1,80f 3,05e 4,61c 6,11d 7,06c 8,13b 9,42a 9,59a

Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa

thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

(a) (b)



Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ enzyme sử dụng là 0,3%, thời gian thủy phân

là 31 phút, ở pH 6,5 và nhiệt độ 87oC với tỉ lệ bột nếp thay đổi từ 5 đến 40%

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0 10 20 30 40 50

Nồng độ bột nếp (w/v)

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân

bằng enzyme α-amylase

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.4 và hình 4.5 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột nếp thì

hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc

phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến 30%. Khi tiếp tục tăng nồng

độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng

chậm hơn so với trước. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn đầu khi nồng

độ cơ chất tinh bột thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng

độ cơ chất và đạt đến điểm cực đại nghĩa là toàn bộ enzyme kết hợp được với cơ chất.

Khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lớn hơn nữa thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ không

tăng đáng kể do nồng độ tinh bột quá cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gây

khó khăn cho hoạt động xúc tác của enzyme nên hàm lượng đường khử sinh ra không

tăng nhiều.

4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa


Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các loại đường và dextrin để tạo

thành C2H5OH và CO2, để thực hiện được điều đó thì phải trải qua từng công đoạn: hồ

hóa, dịch hóa và đường hóa để tạo thành đường khử. Tuy nhiên nếu chỉ đơn thuần sử

dụng α-amylase thì lượng đường khử tạo thành không cao thể hiện ở kết quả thí

nghiệm 4.2.2 (Đường khử: 6,11% ở pH: 6,5, nhiệt độ: 85oC, nồng độ enzyme: 0,3%,

Thời gian: 30 phút, tỉ lệ 1 nếp: 4 nước). Bên cạnh đó lượng tinh bột còn sót lại 1,95%

trong dịch nếp sau khi thủy phân (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở

KH&CN TP.HCM, 2010). Nguyên nhân là do khi chỉ sử dụng enzyme α-amylase phân

cắt các phân tử amylose và amylopectin trong tinh bột sẽ tạo thành nhiều sản phẩm:



oligosaccharides, disaccharides và monosaccharide (Đường khử). Trong đó đường

khử do α-amylase đã cắt gần hết các liên kết 1,4 glycoside, phần còn lại là các phân tử

dextrin mạch nhánh có liên kết 1,6 glycoside mà enzyme α-amylase thì không cắt

được liên kết 1,6 glycoside.

Với hàm lượng đường khử như thế, quá trình lên men diễn ra không tốt do không đủ

lượng đường khử cho nấm men sử dụng, thể hiện ở độ rượu thu được khi lên men chỉ

khoảng 3% (Trần Thị Hồng Chúc, 2008), chính vì thế để tăng thêm hàm lượng đường

khử cho nấm men hoạt động tốt hơn, năng suất rượu cao hơn, vấn đề đặt ra là làm sao

nâng cao hiệu suất lên men? Khi đó một trong những giải pháp hiệu quả được đặt ra là

sử dụng kết hợp tiếp theo sau glucoamylase để thủy phân các polysaccharides,

oligosaccharides, disaccharides còn lại vì enzyme này có khả năng phân cắt được liên

kết 1,4 glycoside và cả liên kết 1,6 glycoside.

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân


Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 những thông số: pH, nhiệt độ, thời

gian, nồng độ enzyme α-amylase được cố định sử dụng tiếp theo để tiến hành khảo sát

ảnh hưởng các mức pH và nhiệt độ của dịch nếp để thủy phân tiếp bằng enzyme

glucoamylase đến lượng đường khử sinh ra, số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5.

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch

nếp bằng enzyme glucoamylase, (g/100ml)

pH dịch nếp


(pH) 55 60 65 70

3,5 14,36 14,56 14,36 13,28 14,14b

4,0 14,56 15,88 14,97 14,56 14,93a

4,5 14,16 14,75 14,36 14,16 14,36b

5,0 13,43 13,79 13,60 13,62 13,61c

Trung bình

(Nhiệt độ) 14,13BC 14,68A 14,32B 13,91C



Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.5 cho thấy hai nhân tố pH và nhiệt độ đều có ảnh

hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân tinh

bột nếp đã được dịch hóa và đường hóa một phần trước bằng enzyme α-amylase



5560

6570

3,5

4

4.5

5.0

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Nhiệt độ (oC)

pH

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi

thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase

Theo kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5 và hình 4.6 cho thấy khi tăng nhiệt độ từ

55oC đến 60oC lượng đường khử sinh ra tăng nhưng từ 65oC đến 70oC thì lượng

đường khử tạo thành không tăng nữa mà lại còn giảm. Trong 4 mức nhiệt độ trên thì

lượng đường khử sinh ra khi thủy phân tinh bột nếp với nhiệt độ 60oC là cao nhất và

thấp nhất ở 70oC và 55oC, về mặt thống kê cho thấy lượng đường khử sinh ra 4 mức

nhiệt độ có khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.

Theo số liệu thí nghiệm cho thấy bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của

enzyme thì giá trị pH cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme

glucoamylase, khi thủy phân dịch nếp với giá trị pH 4,0 thì hàm lượng đường khử sinh

ra cao nhất và ở pH 5,0 lượng đường khử tạo thành là nhỏ nhất. Xét về mặt thống kê

cho thấy hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở pH 3,5 và 4,5 là không

có khác biệt ý nghĩa. Hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở các mức

giá trị pH có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Số liệu thí nghiệm đạt được hoàn toàn phù hợp với thông tin cung cấp từ nhà sản xuất

enzyme (Novo Nordisk, 2007) vì glucoamylase được sản xuất từ Aspergillus niger có

khoảng pH hoạt động tối thích từ 3,5 ÷ 4,5 và với giá trị pH càng cao thì hoạt tính

enzyme glucoamylase càng giảm. Điều này còn phù hợp với lý thuyết vì hầu hết các

enzyme glucoamylase có tính acid và hoạt động thích hợp ở pH thấp (Nguyễn Đức

Lượng, 2006).



Z = 0,135225*X + 5,73466*Y + 0,0725998*Y*X -1,26061*Y2 - 0.00372956*X2; R2 = 99,92 %

Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (oC), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng đường khử (%)

Hình 4.7 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường

khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase

Với kết quả thí nghiệm ở bảng 4.5 và hình 4.6 cùng đồ thị 3D hình 4.7.a và đồ thị

Contour hình 4.7.b nhận thấy có ảnh hưởng lớn của pH và nhiệt độ đến lượng đường

khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp tiếp bằng enzyme glucoamylase có giá trị cao

nhất ở pH 4 và nhiệt độ 61oC là 2 thông số tối ưu để tiến hành đường hóa cho các thí

nghiệm tiếp theo sau.

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch

nếp trắng.

Khi bổ sung enzyme glucoamylase vào dịch nếp trong quá trình đường hóa thì hàm

lượng đường khử tăng lên đáng kể. Số liệu thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.6

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến

lượng đường khử sinh ra, (g/100ml)

Nồng độ

enzyme (%)


(Nồng độ) 10 20 30 40

0,4 13,11 13,79 14,16 14,36 13,85c

0,5 13,60 14,36 14,97 15,18 14,52b

0,6 14,36 14,75 15,88 16,13 15,28a

0,7 14,16 14,56 15,88 16,13 15,18a

Trung bình

(Thời gian) 13,81C 14,36B 15,22A 15,45A



(a) (b)



Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.6 cho thấy: nồng độ enzyme và thời gian thủy

phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của glucoamylase trong quá trình đường hóa.

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thuỷ phân dịch nếp

đến lượng đường khử sinh ra

Từ kết quả thống kê ở bảng 4.6 và hình 4.8 thể hiện hàm lượng đường khử thu nhận

được khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ở nồng độ 0,4% và 0,5% có khác biệt

thống kê, nhưng giữa nồng độ 0,6% và 0,7% thì lượng đường khử sinh ra tăng không

đáng kể, không có khác biệt thống kê ở ý nghĩa 5%. Điều này có thể giải thích ứng với

nồng độ glucoamylase thấp thì chưa đủ lượng enzyme để phân cắt hết các cơ chất

như: polysaccharides, oligosaccharides, disaccharides sau khi được thủy phân bởi

enzyme α-amylase. Nhưng khi tăng nồng độ enzyme glucoamylase sử dụng thì tốc độ

phản ứng thủy phân sẽ tăng vì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn,

nhưng tăng đến một giới hạn nhất định thì sự tăng này không có khác biệt ý nghĩa

thống kê. Ở nồng độ enzyme glucoamylase 0,6% cho thấy lượng tinh bột còn sót lại là

1,86% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM,2010) vì tinh

bột vẫn tiếp tục được phân cắt nếu sử dụng tiếp glucoamylase nhằm tăng thêm lượng

đường khử.

Đối với yếu tố thời gian thủy phân, khi đường hóa dịch nếp thì hàm lượng đường khử

sinh ra cũng tăng theo thời gian hoạt động của enzyme glucoamylase. Điều này có thể

lý giải, khi thời gian thủy phân đủ dài thì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

nhiều hơn và hiệu quả phân cắt các liên kết trong chuỗi polysaccharides,

oligosaccharides và disaccharides triệt để hơn, nên lượng đường khử thu được sẽ cao

hơn. Tuy nhiên, về mặt thống kê thì hàm lượng đường khử thu nhận được không có sự

khác biệt ý nghĩa khi thủy phân ở 30 phút và 40 phút vì khi kéo dài thời gian nhưng

0.40.5

0.60.7

10

20

30

40

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Nồng độ glucoamylase (v/v)

Thời gian

(phút)



lượng cơ chất còn lại không nhiều nên lượng đường khử sinh ra tăng lên không đáng

kể. Đường khử thu được khi thủy phân ở 10 phút, 20 phút so với 30 phút và 40 phút

thì có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Z = 44,0201*X+ 0,0865722*Y + 0,052097*Y*X-0,00112331*Y2-36,6521*X2; R2 = 99,94 %

Ghi chú X: Nồng độ enzyme glucoamylase (v/v), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%)

Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời

gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành

Số liệu thể hiện ở bảng 4.6 và hình 4.8 cùng đồ thị 3D hình 4.9.a với đồ thị Countour

hình 4.9.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, cho thấy nồng độ enzyme

glucoamylase 0,6% và thời gian 39 phút lượng đường khử thu được 16,10% là 2 thông

số tối ưu để tiến hành quá trình đường hóa cho các thí nghiệm sau.

4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase

trong quá trình thủy phân

Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng đã được thuỷ

phân trước bằng enzyme α-amylase với mục tiêu là xác định ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp

đến hoạt tính enzyme glucoamylase, thực hiện thí nghiệm với các nồng độ bột nếp

thay đổi từ 5% đến 40% (w/v) cùng với các thông số tối ưu đạt được từ thí nghiệm

4.3.1, 4.3.2 như nồng độ enzyme được sử dụng là 0,6% và thời gian thủy phân là 39

phút, pH 4, nhiệt độ 61oC. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.7

Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân bằng

enzyme glucoamylase

Tỉ lệ bột nếp (%) 5 10 15 20 25 30 35 40

Đường khử (%) 4,03g 7,94f 11,67e 15,88d 18,52c 22,45b 26,18a 26,59a



Số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.7 và hình 4.10 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột

thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng.

Nhưng vận tốc phản ứng chỉ tăng nhanh khi tăng nồng độ tinh bột từ 5% đến 30%,

(a) (b)



cho đến khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng

tiếp tục tăng, song tốc độ tăng chậm hơn so với trước có thể do lượng enzyme đã liên

kết với cơ chất gần hết nếu tiếp tục tăng tỉ lệ bột nếp thì tốc độ phản ứng vẫn không

tăng nữa.

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50

Nồng độ nếp (w/v)

Đư

ờn

g k

hử

(w

/v)

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân

với enzyme glucoamylase

Sau khi khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột

trong nguyên liệu nếp, tiến hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm

men với nồng độ 0,2% (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm rượu (ĐC) sẽ được

so sánh với rượu lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng men thuốc bắc

(TB) và rượu lên men từ dịch nếp có bổ sung thêm papain (PA) hoặc bromelain (BR),

kết quả được thể hiện ở thí nghiệm 4.6.

4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein

dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase.

Nấm men Saccharomyces cerevesiae chỉ có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng

trong môi trường như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin tự do,

peptide), vitamin và các nguyên tố vi lượng… qua màng tế bào trong quá trình phát

triển sinh khối và lên men rượu. Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng

là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho

quá trình phát triển sinh khối và chuyển hoá thành rượu của nấm men được tiến hành.

Nhưng nấm men cần phải được cung cấp thêm từ môi trường nguồn nitơ ở dạng hòa

tan có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn nitơ dạng hữu cơ thường dùng là acid

amin tự do, pepton, amid, urê, đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat (Nguyễn

Đức Lượng, 2002). Chính vì thế thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu thủy phân

protein trong nguyên liệu nếp 7,93% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở

KH&CN TP.HCM) để tăng thêm lượng acid amin tự do và peptide mạch ngắn cho



nấm men phát triển tốt hơn và tạo ra sản phẩm rượu chất lượng cao hơn với màu vàng

nhạt (phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin), độ trong và mùi, vị đặc trưng

cho rượu vang nếp.

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân

protein nếp.

Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 và 4.3 các thông số được cố định sử

dụng tiếp để tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ thủy phân của enzyme papain

đến lượng nitơ amin tạo thành. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8 như sau:

Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân

protein trong dịch nếp bằng enzyme papain, (g/100g).

pH dịch nếp


(pH) 40 45 50 55

5,0 0,0636 0,0702 0,0724 0,0714 0,0694c

5,5 0,0687 0,0747 0,0796 0,0743 0,0743b

6,0 0,0719 0,0780 0,0826 0,0781 0,0777a

6,5 0,0680 0,0736 0,0758 0,0747 0,0730b

Trung bình

(Nhiệt độ) 0,0681C 0,0741B 0,0776A 0,0746B



4045

5055

5

5.5

6

6.5

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

0.0600

0.0700

0.0800

0.0900

Nit

ơ a

min

(w

/w)

Nhiệt độ (oC)

pH

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin tạo

thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain



Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và đồ thị hình 4.11 cho thấy nhiệt độ thủy phân

và pH dịch nếp có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain.

Đối với nhân tố nhiệt độ: Khi tiến hành thủy phân protein trong dịch nếp ở nhiệt độ

50oC thì lượng nitơ amin sinh ra là cao nhất và thấp nhất ở nhiệt độ 40oC, giữa các

mức nhiệt độ 40oC, 45oC, 50oC và 55oC lượng nitơ amin sinh ra đều có khác biệt ý

nghĩa thống kê ở mức 5%.

Bên cạnh thông số nhiệt độ thì yếu tố pH dịch nếp cũng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

tính enzyme papain, ở pH 6,0 lượng nitơ amin tạo thành là cao nhất và pH 5,0 là thấp

nhất, giữa các mức pH 5,0, 5,5, 6,0 và 6,5 cho thấy lượng nitơ amin tạo thành đều

khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Z = -0,487917 + 0,00928307*X + 0,113975*Y -0,0000366*Y*X – 0,0095125*Y2 –

0,000090625*X2; R2 = 99,75 %

Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng nitơ amin (%)

Hình 4.12 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin

tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain.

Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và hình 4.11 cùng đồ thị 3D hình 4.12.a,

với đồ thị Contour hình 4.12.b cho thấy hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi phân

cắt protein trong dịch nếp có giá trị cao nhất ở pH 5,9 và nhiệt độ 500C điều này hoàn

toàn phù hợp với lý thuyết về điều kiện tối thích cho enzyme papain có nguồn gốc từ

đu đủ. Do đó, chế độ nhiệt độ 500C và pH 5,9 là 2 thông số tối ưu để enzyme papain

thủy phân protein trong dịch nếp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp.

Kế thừa số liệu pH và nhiệt độ tối ưu đạt từ thí nghiệm 4.4.1 tiến hành thí nghiệm

khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân đến

khả năng phân cắt protein trong dịch nếp trắng thông qua hàm lượng nitơ amin sinh

ra. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9:

(a) (b)



Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo

thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng, (g/100g).

Nồng độ

enzyme (%)

Thời gian thủy phân (phút) Trung bình

(Nồng độ) 20 30 40 50

0,1 0,0568 0,0651 0,0690 0,0695 0,0651c

0,2 0,0641 0,0675 0,0718 0,0747 0,0695b

0,3 0,0668 0,0684 0,0812 0,0816 0,0745a

0,4 0,0671 0,0704 0,0819 0,0820 0,0754a

Trung bình

(Thời gian) 0,0637C 0,0678B 0,0760A 0,0769A



Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.9 cho thấy nồng độ enzyme và thời gian thủy phân

có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain

Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến hàm lượng

nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng

Theo số liệu thống kê được thể hiện ở bảng 4.9 và hình 4.13 cho thấy khi cùng nồng

độ cơ chất bột nếp, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân với các mức nồng độ papain

khác nhau thì lượng nitơ amin tạo thành cũng sẽ khác nhau. Ở nồng độ enzyme papain

0.10.2

0.30.4

20

30

40

50

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

0.0600

0.0700

0.0800

0.0900

Nit

ơ a

min

(w

/w)

Nồng độ papain (v/v)

Thời gian (phút)



0,3% lượng nitơ amin sinh ra cao hơn nhiều so với nồng độ 0,1% và 0,2 %, tuy nhiên

ở 2 mức 0,3% và 0,4% thì lượng nitơ amin sinh ra không có khác biệt thống kê ở mức

ý nghĩa 5%.

Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy thời gian thủy phân có ảnh hưởng rõ rệt đến quá

trình phân cắt protein trong dịch nếp, hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng theo thời gian

thủy phân từ 10 phút đến 30 phút, nhưng khi tăng thời gian cao hơn 30 phút thì lượng

nitơ amin tạo thành tăng lên không đáng kể. Kết quả thống kê cho thấy ở các mức thời

gian thủy phân 10 phút, 20 phút và 30 phút thì lượng nitơ amin sinh ra có khác biệt ý

nghĩa, nhưng ở 30 phút và 40 phút không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

Z= 0,141952*X+0,00255603*Y-0,000370731*Y*X-0,0000276501*Y2 – 0,179262*X2; R2= 99,69 %

Ghi chú X: Nồng độ enzyme papain (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng nitơ amin (%)

Hình 4.14 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian

thủy phân protein dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành

Từ các số liệu thể hiện ở bảng 4.9, hình 4.13 và đồ thị 3D cùng đồ thị Contour hình

4.14.a; 4.14.b cho thấy nồng độ enzyme papain 0,35% (v/v) và thời gian thủy phân 45

phút hàm lượng nitơ amin thu được 0,0809% là 2 thông số tối ưu để thủy phân protein

trong dịch nếp cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá

trình thủy phân protein nếp

Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất là protein trong nguyên liệu nếp trắng đã được

dịch hóa và đường hóa trước bằng α-amylase, glucoamylase với mục tiêu là xác định

độ nhạy km và vận tốc cực đại Vmax của enzyme papain trong quá trình thủy phân.

Trong thí nghiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,35% và thời gian thủy phân

là 45 phút, pH 5,9, nhiệt độ 500C. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.10

(a) (b)



Bảng 4.10 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính enzyme papain

Tỉ lệ bột

nếp (%) 5 10 15 20 25 30 35 40

Nitơ amin 0,0602g 0,0680f 0,0776e 0,0834cd 0,0885cd 0,0904cb 0,0968a 0,0989a

V SmaxV=K Sm +

0,0544 0,0720 0,0808 0,0859 0,0894 0,0919 0,0937 0,0951



Hình 4.15 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp sử dụng đến hoạt tính

enzyme papain

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.10 và hình 4.15 cho thấy khi tăng nồng độ bột nếp đồng

nghĩa việc tăng hàm lượng protein thì hàm lượng nitơ amin sinh ra cũng tăng theo

nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột

nếp từ 5% đến 30%. Khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc

phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước có thể do lượng

enzyme đã liên kết với cơ chất gần hết nếu tiếp tục tăng cơ chất thì phản ứng vẫn

không tăng nữa.

Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1 để xác định giá trị Vmax và km

của enzyme papain khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng như sau:

Vmax= 0,1065 ± 0,00362 (g/100g/45phút); km= 4,7822 ± 0,7705 (g/100g)

Với các thông số tối ưu: nồng độ enzyme, tỉ lệ bột nếp, thời gian, pH và nhiệt độ thủy

phân kế thừa từ thí nghiệm 4.4.1, 4.4.2 và 4.4.3 được ứng dụng để thủy phân protein

trong dịch nếp với mục tiêu là thu được những acid amin tự do thể hiện ở bảng 4.11

nhằm để cải thiện màu sắc, mùi vị đặc trưng cho sản phẩm rượu vang nếp.



Bảng 4.11 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein

bằng enzyme papain, (mg/kg)

STT Acid amin mg/kg STT Acid

amin mg/kg STT Acid amin mg/kg

1 Histidine 2,4 8 Glycine 0,8 15 Phenylalanine 0,0

2 Tyrosine 1,9 9 Valine 1,1 16 Hydroxylysine 0,0

3 Cystine 0,0 10 Leucine 0,7 17 Tryptophan 4,3

4 Lysine 1,3 11 Isolecine 0,5 18 Asparticacid 7,5

5 Threonine 0,0 12 Serine 0,0 19 Methionine 4,7

6 Arginine KPH 13 Proline 16,1

7 Alanine 0,7 14 Glutamic 0,0


Sau khi khảo sát động học và ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy

phân tinh bột và papain trong quá trình phân cắt protein trong nguyên liệu. Bột nếp

được pha với tỉ lệ 1 nếp: 4 nước để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một

phần bằng 0,3% α–amylase trong 31 phút ở pH 6,5, nhiệt độ 870C và kết hợp với

0,6% glucoamylase trong 39 phút ở pH 4, nhiệt độ 610C cho quá trình đường hóa, tiếp

theo là thủy phân protein trong dịch nếp bằng papain với nồng độ enzyme 0,35 %, thời

gian 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C. Quá trình thủy phân bằng enzyme kết thúc tiến

hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2 % w/v

để lên men rượu (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm lên men này được so sánh

với sản phẩm lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc

(TB), sản phẩm lên men từ dịch nếp không sử dụng protease (ĐC) và sản phẩm lên

men từ dịch nếp có bổ sung bromelain (BR), kết quả được thể hiện thí nghiệm 4.6.

4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein

dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase

4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy

phân protein nếp

Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 và 4.3 các thông số được cố định sử

dụng tiếp để tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ thủy phân của enzyme

bromelain đến lượng nitơ amin tạo thành. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng

4.12 như sau:



Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng mức pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân

dịch nếp bằng enzyme bromelain, (g/100g)

pH


(pH) 45 50 55 60

5,0 0,0460 0,0462 0,0508 0,0465 0,0474b

5,5 0,0466 0,0509 0,0551 0,0532 0,0515a

6,0 0,0465 0,0504 0,0514 0,0503 0,0496a

6,5 0,0463 0,0478 0,0493 0,0468 0,0475b

Trung bình

(Nhiệt độ) 0,0464C 0,0488B 0,0517A 0,0492B



Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.12 cho thấy pH và nhiệt độ thủy phân có ảnh

hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme bromelain

Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy

phân dịch nếp bằng enzyme bromelain

4550

5560

5

5.5

6

6.5

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

Nit

ơ a

min

(w

/w)

Nhiệt độ (oC)

pH



Dựa trên những số liệu thể hiện ở bảng 4.12 và hình 4.16 cho thấy pH và nhiệt độ có

ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein trong dịch nếp của enzyme bromelain

Đối với nhân tố nhiệt độ ở 550C lượng nitơ amin sinh ra cao nhất, ở 450C là thấp nhất,

giữa các mức nhiệt độ 450C, 500C, 550C và 600C lượng nitơ amin sinh ra đều có khác

biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.

Bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ thì pH cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của

enzyme bromelain, ở pH 5,5 và 6 lượng nitơ amin tạo thành cao nhất và thấp nhất ở

pH 5,0 và 6,5. Hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi thủy phân ở pH 5,5 và 6

không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Hàm lượng nitơ amin thu được khi thủy phân

ở mức pH 5,0 và 6,5 có sự khác biệt thống kê ý nghĩa ở mức 5%.

Z= -0,325421 + 0,00592317*X + 0,07557*Y - 0,0000866667*X*Y - 0,0000495*X2 - 0,0062*Y2;

R2= 99,68 %

Ghi chú: X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng nitơ amin (%)

Hình 4.17 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ

amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme bromelain.

Theo số liệu thí nghiệm cho thấy hàm lượng nitơ amin tạo thành sẽ giảm khi thay đổi

pH và nhiệt độ thủy phân đều này có nghĩa là enzyme bromelain chỉ thủy phân protein

tốt nhất ở mỗi giá trị pH và nhiệt độ tối thích, điều này hoàn toàn phù hợp với lý

thuyết về điều kiện tối thích cho enzyme bromelain có nguồn gốc từ khóm. Thông qua

kết quả ở bảng 4.12 và hình 4.16, đồ thị không gian 3D hình 4.17.a và đồ thị Countour

hình 4.17.b cho thấy hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi thủy phân protein trong

dịch nếp có giá trị cao nhất ở pH 5,7 và nhiệt độ 550C. Do đó, chế độ nhiệt độ 550C và

pH 5,7 là 2 thông số tối ưu để bromelain thủy phân protein trong dịch nếp khi tiến

hành các thí nghiệm sau.

4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein

dịch nếp.

(a) (b)



Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian

thủy phân đến khả năng thủy phân protein trong dịch nếp trắng thể hiện ở bảng 4.13

Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến lượng nitơ amin

sinh ra khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng, (g/100g).

Nồng độ

enzyme (%)


(Nồng độ) 30 40 50 60

0,3 0,0443 0,0476 0,0461 0,0492 0,0468c

0,4 0,0445 0,0483 0,0519 0,0521 0,0492b

0,5 0,0474 0,0513 0,0535 0,0537 0,0515a

0,6 0,0478 0,0522 0,0536 0,0538 0,0519a

Trung bình

(Thời gian) 0,0460C 0,0499B 0,0513AB 0,0522A



Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến hàm

lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp trắng

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.13 và hình 4.18 cho thấy khi nồng độ bromelain tăng thì

cơ hội tiếp xúc giữa enzyme cơ chất sẽ tăng lên, từ đó tốc độ phản ứng thủy phân sẽ

tăng. Ở nồng độ enyzme 0,5% và 0,6% lượng nitơ amin sinh ra cao nhất và không có

0.30.4

0.50.6

30

40

50

60

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

0.0600

Nit

ơ a

min

(w

/w)

Nồng độ bromelin (v/v)

Thời gian (phút)



khác biệt ý nghĩa thống kê nhưng lượng nitơ amin tạo thành khi sử dụng nồng độ

enzyme 0,3% và 0,4% so với 0,5% và 0,6% thì có sự khác biệt thống kê ở mức độ ý

nghĩa 5%.

Số liệu thí nghiệm ở bảng 4.13 và đồ thị hình 4.18 cũng cho thấy thời gian thủy phân

có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt động của bromelain khi phân cắt protein trong dịch nếp

trắng, điều này có thể giải thích khi thời gian thủy phân đủ dài thì khả năng tiếp xúc

giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn và hiệu quả phân cắt các liên kết trong chuỗi

peptide triệt để hơn nên lượng nitơ amin tạo thành tăng cao hơn. Hàm lượng nitơ amin

sinh ra tăng theo thời gian thủy phân từ 30 đến 50 phút, nhưng khi tăng thời gian thủy

phân cao hơn 50 phút thì lượng nitơ amin sinh ra tăng lên không nhiều. Kết quả thống

kê cho thấy ở các mức thời gian thủy phân 30, 40, 50 phút thì lượng nitơ amin sinh ra

có khác biệt ở mức ý nghĩa 5%, nhưng 50 và 60 phút thì lượng nitơ amin tạo thành

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Z = 0,0804055*X+ 0,00112547*Y-0,0000102213*Y*X – 0,0000102604*Y2-0,0688545*X2;

R2 = 99,79%

Ghi chú X: Nồng độ enzyme bromelain (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng nitơ amin (%)

Hình 4.19 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời

gian thủy phân đến lượng nitơ amin sinh ra

Theo số liệu ở bảng 4.13, hình 4.18 và hình 4.19.a, 4.19.b đồng thời xét về mặt hiệu

quả kinh tế mang lại, cho thấy nồng độ enzyme bromelain 0,5 % và thời gian 55 phút

với hàm lượng nitơ amin sinh ra 0,054 % là thông số tối ưu để tiến hành quá trình

thủy phân protein trong dịch nếp cho các thí nghiệm tiếp theo.

4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá


Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất là protein trong nguyên liệu nếp trắng đã được

dịch hóa và đường hóa trước bằng enzyme α-amylase, glucoamylase với mục tiêu là

xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân.

(b)

(a)



Trong thí nghiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,5% và thời gian thủy phân

là 55 phút ở pH 5,7 và nhiệt độ 55oC kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.14.

Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính của enzyme bromelain,

(g/100g).

Tỉ lệ bột nếp

(%)

5 10 15 20 25 30 35 40

Nitơ amin 0,0376e 0,0458d 0,0467d 0,0535c 0,0548bc 0,0563ab 0,0564ab 0,0578a

V SmaxVK Sm

=+

0,0362 0,0458 0,0503 0,0529 0,0546 0,0558 0,0567 0,0574



Hình 4.20 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp đến hoạt tính enzyme

bromelain

Số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.14 và hình 4.20 cho thấy khi tăng nồng độ

protein trong bột nếp thì hàm lượng nitơ amin sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc

phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến

25%. Khi tiếp tục tăng nồng độ lên 30%, 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp

tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước.

Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1 xác định được các giá trị Vmax

và km của enzyme bromelain khi phân cắt protein trong dịch nếp trắng ứng với nồng

độ enzyme 0,5% và thời gian thủy phân 55 phút, pH 5,7 và nhiệt độ 550C như sau:

Vmax = 0,0622 ± 0,00132 (g/100g/55phút); km = 3,5652 ± 0,4280 (g/100g)



Với các thông số tối ưu như nồng độ bromelain, tỉ lệ bột nếp, thời gian, pH và nhiệt độ

thủy phân được kế thừa từ thí nghiệm 4.5.1, 4.5.2 và 4.5.3 được ứng dụng để thủy

phân protein trong dịch nếp với mục tiêu là thu được những acid amin tự do thể hiện ở

bảng 4.15 nhằm để cải thiện màu sắc, mùi vị đặc trưng cho sản phẩm rượu vang nếp.

Bảng 4.15 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein

bằng enzyme bromelain, (mg/kg)

STT Acid amin mg/kg STT Acid

amin mg/kg STT Acid amin mg/kg

1 Histidine 1,8 8 Glycine 1,7 15 Phenylalanine 0,8

2 Tyrosine 2,2 9 Valine 1,5 16 Hydroxylysine 0,0

3 Cystine 0,0 10 Leucine 1,3 17 Tryptophan 3,3

4 Lysine 1,3 11 Isolecine 0,5 18 Asparticacid 6,5

5 Threonine 0,0 12 Serine 0,0 19 Methionine 6,9

6 Arginine KPH 13 Proline 19,5

7 Alanine 1,2 14 Glutamic 1,4


Sau khi khảo sát động học và ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy

phân tinh bột và bromelain trong quá trình phân cắt protein nguyên liệu. Nếp được

pha với nước tỉ lệ 1: 4 để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bằng

0,3% α–amylase trong 31 phút ở pH 6,5, nhiệt độ 870C và kết hợp với 0,6%

glucoamylase trong 39 phút ở pH 4, nhiệt độ 610C cho quá trình đường hóa, tiếp theo

là thủy phân protein trong dịch nếp bằng bromelain với nồng độ enzyme 0,5%, thời

gian 55 phút ở pH 5,7, nhiệt độ 550C. Quá trình thủy phân bằng enzyme kết thúc tiến

hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2 % w/v

(Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm lên men này được so sánh với sản phẩm

lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc (TB), sản phẩm

lên men từ dịch nếp không sử dụng protease (ĐC) và sản phẩm lên men từ dịch nếp có

bổ sung enzyme papain (PA), kết quả được thể hiện thí nghiệm 4.6.

4.6 Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men

truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men

thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.

Sản phẩm rượu lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng nguyên liệu nếp

trắng với men thuốc bắc Hải Anh Quang, loại men được sử dụng rất phổ biến trên thị

trường vì đây là loại men này có tính năng hòa men với nước ngâm trực tiếp cơm.

Quy trình sản xuất tiến hành theo hướng dẫn sử dụng được in trên bao bì của nhà sản

xuất. Với phương châm là tạo ra rượu nếp có hương thơm cổ truyền dân tộc, rượu êm



dịu, không nhức đầu không khát nước, năng suất cao, dễ sử dụng, không hư hỏng, phù

hợp với mọi nguồn nước và mọi khí hậu.

Sản phẩm thứ nhất là rượu lên men truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc (TB),

thứ 2 là rượu sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase thủy phân tinh bột thành

đường khử rồi bổ sung nấm men thuần chủng để lên men rượu (ĐC), thứ 3 là rượu

dùng enzyme α-amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột và papain thủy phân protein

thành acid amin rồi chủng nấm men để lên men rượu (PA), loại rượu thứ 4 dùng

enzyme α-amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột và bromelain phân cắt protein

thành acid amin rồi chủng nấm men để lên men rượu (BR).

Các sản phẩm rượu nếp được tiến hành khảo sát sự biến đổi các chỉ tiêu chất lượng về

hóa lí: độ Brix, đường khử, độ rượu, pH, acid, ester, furfurol, methanol, aldehyde…

về cảm quan và vi sinh vật theo TCVN 7045: 2009 trong suốt quá trình lên men chính

7÷8 ngày, lên men phụ và ổn định trong 3 tháng.

4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp.

Sự thay đổi độ Brix dịch lên men được xem một trong những chỉ tiêu quan trọng để

đánh giá quá trình lên men rượu nhanh hay chậm

Bảng 4.16 Kết quả khảo sát thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu

Thời gian lên men

(ngày)

Độ Brix Trung bình

(Thời gian) Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain

1 16,3 14,0 12,3 9,7 13,1a

2 14,4 10,8 8,8 6,6 10,2b

3 11,0 8,8 7,5 6,3 8,4c

4 10,4 6,9 5,9 5,6 7,2cd

5 7,2 6,1 5,4 5,3 6,0de

6 7,0 5,8 5,2 5,1 5,8f

7 6,4 4,8 5,2 4,9 5,3f

Trung bình

(Loại rượu) 10,4A 8,2B 7,2BC 6,2C



Kết quả thống kê ở bảng 4.16 và hình 4.21 cho thấy độ Brix dịch lên men đều giảm

theo thời gian. Trong 4 ngày đầu lên men độ Brix giảm rất nhanh có sự khác biệt



thống kê ở mức ý nghĩa 5% vì ở giai đoạn nấm men sử dụng rất nhiều chất dinh

dưỡng hòa tan để phát triển sinh khối và lên men nhưng từ ngày 6 đến 7 thì độ Brix

thay đổi nhỏ, không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê do lúc này trong dịch lên men

lượng đường còn lại không nhiều, quá trình lên men gần đến thời điểm kết thúc.

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.16 cho thấy độ Brix của 4 loại rượu có sự khác biệt thống

kê ở mức ý nghĩa 5%, rượu loại 1 sử dụng bánh men thuốc bắc độ Brix sau quá trình

lên men cao hơn 3 loại rượu sử dụng trực tiếp enzyme amylase, protease thương mại

để phân cắt tinh bột và protein vì những sản phẩm được tạo thành sau quá trình thủy

phân dễ dàng được nấm men sử dụng để phát triển sinh khối và chuyển hóa thành

rượu.

4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại

rượu nếp.

Trong quá trình lên men rượu để kiểm soát chính xác hơn tốc độ tiến trình nhanh hay

chậm có thể thông qua hàm lượng đường khử còn lại. Kết quả thống kê thể hiện ở

bảng 4.17 cho thấy đường khử của 4 loại rượu giảm dần theo thời gian lên men rượu.

Dựa vào bảng 4.17 và hình 4.22 cho thấy hàm lượng đường khử giảm mạnh nhất

trong 5 ÷ 6 ngày đầu của quá trình ủ. Trong thời gian này nấm men sử dụng rất nhiều

đường khử để phát triển sinh khối và chuyển hóa thành rượu. Những ngày tiếp theo

lượng đường khử còn lại rất ít và giảm dần rất chậm.

Theo kết quả thống kê nhận thấy vào các ngày 5, 6 hàm lượng đường khử còn lại

không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% nên có thể dựa vào thông số hàm

lượng đường khử còn lại làm yếu tố để xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men

chính chuyển qua tiến trình lên men phụ và ổn định sản phẩm.

Hình 4.21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men chính của các loại ruợu

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

Độ

Bri

x

TB

ĐC

PA

BR



Bảng 4.17 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính của các loại

rượu


(ngày)

Hàm lượng đường khử, (g/100ml) Trung bình


1 13,75 11,99 11,04 6,25 10,76a

2 12,73 7,69 4,88 3,31 7,15b

3 9,95 4,91 3,30 1,57 4,93c

4 6,66 2,02 0,72 0,54 2,49d

5 3,17 1,29 0,44 0,41 1,33de

6 2,02 0,58 0,41 0,29 0,83de

7 0,46 0,42 0,37 0,23 0,37f

Trung bình

(Loại rượu) 6,96A 4,13B 3,02BC 1,80C



Lượng đường khử còn lại sau khi lên men ở 4 loại rượu cũng khác biệt có ý nghĩa ở

mức 5%, loại rượu 3, 4 có sử dụng enzyme papain và bromelain hàm lượng đường

khử còn sót lại thấp hơn rượu loại 2 không sử dụng protease và loại rượu dùng bánh

men thuốc bắc nên nồng độ rượu trong 2 sản phẩm này sẽ cao hơn vì nấm men sử

dụng đường chuyển thành rượu.

Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo thời gian lên men

chính của các loại rượu

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

Đư

ờn

g k

hử

(%

)

TB

ĐC

PA

BR



4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men chính của các loại

rượu nếp.

Chất lượng rượu vang cao hay thấp thể hiện qua rất nhiều chỉ tiêu trong đó độ rượu là

một trong những tiêu chí để đánh giá và quyết định, chính vì thế thông số nồng độ

rượu được phân tích trong suốt thời gian lên men chính, lên men phụ và ổn định.

Thông thường phân loại rượu dựa theo độ rượu là chủ yếu, có ba loại chính: rượu

vang: 8 ÷ 18% độ cồn, thường vào khoảng 12 %; rượu mùi: khoảng 15 ÷ 75% độ cồn,

thông thường dưới 30%; rượu mạnh: thường vào khoảng 30 ÷ 55% độ rượu.

Bảng 4.18 Kết quả thay đổi độ rượu trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp


(ngày)

Độ rượu, (v/v) Trung bình


1 1,5 2,5 4,3 5,5 3,5f

2 2,5 5,8 7,8 8,8 6,3e

3 3,7 7,8 8,8 9,5 7,5d

4 4,5 9,8 10,3 10,7 8,8c

5 5,0 10,8 11,5 11,5 9,7b

6 6,5 11,5 11,7 11,8 10,4ab

7 8,3 11,5 11,8 12,0 10,9a

Trung bình

(Loại rượu) 4,6C 8,5B 9,5A 10,0A



Từ kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.16 và hình 4.23 cho thấy độ rượu tăng khá

nhanh trong 5 ngày đầu của tiến trình và sau đó ổn định, điều này được giải thích là

trong giai đoạn đầu nấm men phát triển nhanh vì trong dịch lên men hàm lượng đường

khử còn cao, quá trình lên men diễn ra khá mạnh nên lượng rượu sinh ra nhiều. Độ

rượu tăng chậm trong những ngày còn lại do quá trình lên men yếu dần vì lượng

đường khử ở bảng 4.15 còn lại rất ít và độ cồn tăng dần sẽ ức chế hoạt động nấm men

vì ở nồng độ rượu 2÷ 5 % có tác dụng kìm hãm nấm men phát triển và ở nồng độ rượu

5÷ 6% làm nấm men đình chỉ sinh sản mặc dù lên men vẫn tiếp tục (Lương Đức

Phẩm, 2002). Độ rượu đạt tối đa 11÷12 % vào khoảng 6, 7 ngày, không có sự khác

biệt ý nghĩa thông kê ở mức 5 % nên có thể kết thúc quá trình lên men chính vào ngày

thứ 6 để chuyển sang công đoạn lên men phụ và ổn định sản phẩm.



Theo số liệu thể hiện ở bảng 4.18 và hình 4.23 cho thấy ở rượu loại 1 sử dụng bánh

men thuốc bắc hòa với nước chan trực tiếp vào cơm nếp có độ rượu sinh ra thấp nhất

do trong bánh men thuốc bắc nấm mốc sinh ra enzyme có hoạt tính không cao như

enzyme thương mại và nấm men lên men hoạt động không tốt bằng nấm men thuần

chủng. Tiếp theo là rượu loại 2 dùng enzyme α-amylase và glucoamylase thương mại

để dịch hóa và đường hóa nhằm chuyển tinh bột thành đường và bổ sung nấm men

thuần chủng lên men thu được độ rượu cao hơn loại 1. Cuối cùng là 2 loại rượu với

việc sau khi sử dụng hệ enzyme amylase tiếp tục thủy phân protein bằng enzyme

papain hoặc bromelain để tăng cường thêm lượng acid amin tự do và peptide mạch

ngắn cung cấp cho hoạt động phát triển sinh khối và lên men của nấm men được tốt

hơn, kết quả là rượu loại 3 và 4 có độ rượu tạo thành cao hơn loại 1, 2.

Theo kết quả thí nghiệm cho thấy rượu loại 3 sử dụng thêm enzyme papain và loại 4

bổ sung thêm enzyme bromelain thu được độ rượu sinh ra cao nhất và không có sự

khác biệt giữa 2 mẫu. Rượu loại 1 sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu loại 2 chỉ sử

dụng hệ enzyme amylase có hàm độ rượu sinh ra thấp hơn và có sự khác biệt ý nghĩa

thống kê với 2 mẫu rượu loại 3, 4. Do đó để sản xuất rượu vang nếp có độ rượu cao có

thể chọn mẫu có bổ sung enzyme protease vì độ rượu là một trong những yếu tố chính

quyết định chất lượng và thời gian bảo quản lâu dài sản phẩm rượu vang.

4.6.4 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp.

Theo những kết quả nghiên cứu cho thấy pH 4,5 ÷ 5 là khoảng tối thích cho nấm men

Saccharomyces cerevesiae phát triển. Cùng với nghiên cứu (Hà Thị Thụy Vy, 2009)

giá trị pH 4,9 là thông số tối thích cho nấm men hoạt động trong sản xuất rượu vang

nếp. Cho nên dịch nếp trước khi bổ sung nấm men được điều chỉnh về pH 4,9. Trong

quá trình lên men rượu, sự biến đổi của pH theo thời gian ở các mẫu phản ánh quá

trình tạo thành các acid hữu cơ, sản phẩm phụ của quá trình lên men ethanol.

Một trong những nguyên nhân làm pH giảm trong quá trình lên men rượu tương ứng

với việc tăng acid tổng số. Giá trị pH giảm trong quá trình lên men rượu là do:

Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính của các loại rượu

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

Độ

rư

ợu

, (%

)

TB

ĐC

PA

BR



+ Trong quá trình phát triển của nấm men sẽ sinh ra acid oxalic di chuyển ra khỏi tế

bào nấm men vào canh trường.

+ Trong quá trình phát triển nấm men làm phá vỡ hệ đệm phosphate (do nấm men

sử dụng phosphate trong quá trình thủy phân) làm cho pH giảm.

+ Trong quá trình lên men sẽ sinh ra CO2 sẽ hòa tan vào canh trường làm pH giảm

(Bùi Thị Huỳnh Hoa, 2004).

Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.19 và hình 4.24 cho thấy có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê ở mức 5% về pH của 4 loại rượu và sự thay đổi của pH của từng mẫu

theo thời gian lên men.

Bảng 4.19 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp


(ngày)

Giá trị pH Trung bình


1 4,13 3,75 3,82 3,79 3,87a

2 3,52 3,59 3,74 3,86 3,68c

3 3,50 3,66 3,85 3,88 3,72bc

4 3,46 3,72 3,86 3,92 3,74bc

5 3,49 3,70 3,91 3,97 3,77abc

6 3,58 3,72 3,94 3,98 3,80ab

7 3,66 3,75 3,96 3,99 3,84ab

Trung bình

(Loại rượu) 3,62B 3,70B 3,87A 3,91A



Trong những ngày đầu, pH của 4 mẫu có giảm là do quá trình lên men rượu xảy ra tạo

ra khí CO2 và C2H5OH, lượng CO2 hòa tan vào nước tạo ra H2CO3 là acid yếu làm

giảm pH. Từ ngày thứ 3 trở đi pH tăng trở lại, do H2CO3 là acid không bền nó phân ly

tạo ra khí CO2 và nước làm cho pH tăng trở lại sau đó ổn định trong giai đoạn cuối

của quá trình lên men rượu.



Kết quả thí nghiệm còn cho thấy, ở giai đoạn nấm men hô hấp hiếu khí để phát triển

sinh khối trong giai đoạn đầu, quá trình lên men diễn ra nhanh hơn, acid hữu cơ tạo

thành nhiều hơn nên giá trị pH giảm nhanh hơn. Vào giai đoạn cuối của quá trình lên

men, pH có xu hướng tăng nhẹ trong cả 4 trường hợp. Có lẽ do những acid tạo thành

đã phản ứng với các cấu tử khác trong dịch lên men như các loại rượu để tạo thành các

ester. Thật ra, ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, phản ứng ester hóa cũng có thể

xảy ra nhưng do lượng acid tạo thành nhanh và hàm lượng rượu còn ít nên pH giảm.

Ngoài ra pH giảm trong thời gian đầu có thể vì nấm men chuyển hóa đường sinh ra

rượu có tính acid yếu, bên cạnh đó còn có sự hiện diện của vi khuẩn khác có thể tạo

thành một số acid khác: lactic, acetic, citric… dựa vào giá trị pH có thể dự đoán quá

trình lên men rượu đạt hay không.

4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men chính của các

loại rượu nếp.

Hàm lượng acid trong quá trình lên men rượu chủ yếu là acetic, loại acid dễ bay hơi

và quyết định đến độ chua của rượu. Chỉ cần một lượng nhỏ acid acetic cũng có thể

làm tăng hương vị đặc trưng của rượu vang.

Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian lên men chính của các loại rượu

3.00

3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

pH

TB

ĐC

PA

BR



Bảng 4.20 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại rượu


(ngày)

Hàm lượng acid tổng, (g/l) Trung bình


1 0,411 1,355 1,836 1,957 1,390c

2 0,800 1,767 2,023 2,268 1,715b

3 1,206 1,915 2,246 2,246 1,903b

4 1,641 2,138 2,334 2,368 2,123a

5 1,869 2,062 2,354 2,256 2,134a

6 2,049 2.088 2,372 2,326 2,210a

7 2,145 2,141 2,403 2,404 2,270a

Trung bình

(Loại rượu) 1,446C 1,924B 2,224A 2,261A



Trong quá trình lên men rượu lượng acid sinh ra có khuynh hướng tăng theo thời gian,

điều này có thể do trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm:

acetic, lactic, citric, pyruvic và succinic nhưng nhiều hơn cả là acetic và lactic.

Theo số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.20 và hình 4.25 cho thấy hàm lượng acid

tổng tăng dần theo thời gian trong giai đoạn lên men chính. Điều này được lý giải là

do trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các sản phẩm phụ song hành là các acid

Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi acid tổng theo thời gian lên men chính của

các loại rượu nếp

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

Aci

d t

ổn

g s

ố (

g/l

)

TB

ĐC

PA

BR



hữu cơ như: acetic, lactic, pyruvic… Trong những ngày đầu lên men hàm lượng acid

tăng nhanh và dần dần ổn định vào cuối tiến trình, mặc dù vậy không phải hàm lượng

acid cao thì rượu có chất lượng tốt, với hàm lượng này quá cao thì ảnh hưởng tới vị và

khả năng tồn trữ sản phẩm. Dựa vào lượng acid tổng ứng với thời gian lên men có thể

biết được chất lượng men và sản phẩm lên men có bị nhiễm vi sinh vật hay không.

Quá trình lên men tạo ra rượu thì bên cạnh đó cũng tạo ra acid hữu cơ và CO2 làm pH

giảm thấp tương ứng với việc tăng acid tổng số, khi độ rượu cao nấm men lên men

chậm nhưng một số vi khuẩn sinh acid chịu được độ cồn cao vẫn phát triển làm tăng

lượng acid vào giai đoạn cuối của quá trình lên men.

Trong bốn mẫu rượu sau khi lên men chính thì rượu loại 3, 4 có hàm lượng acid cao

nhất và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với loại 1, 2 vì cơ chất nền trong dịch nếp

trước khi lên men của các mẫu không giống nhau

4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại

rượu nếp

Song song với việc tạo thành acid và ethanol dưới tác dụng của enzyme esterase của

nấm men sẽ sản sinh ra các hợp chất ester tương ứng góp phần tạo nên hương vị đặc

trưng cho từng loại rượu vang nếp

Bảng 4.21 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu


(ngày)

Hàm lượng ester, (g/l) Trung bình


1 0,754 0,686 0,817 0,809 0,767d

2 0,770 0,732 0,783 0,747 0,758d

3 0,842 0,736 0,687 0,648 0,728cd

4 0,780 0,751 0,663 0,641 0,709c

5 0,744 0,685 0,628 0,587 0,661b

6 0,717 0,654 0,582 0,563 0,629b

7 0,660 0,546 0,544 0,544 0,573a

Trung bình

(Loại rượu) 0,752A 0,684B 0,672B 0,648B





Trong quá trình lên men khoảng 2 ngày đầu thì lượng ester gia tăng là do nấm men bắt

đầu hoạt động mạnh và ester sinh ra theo 2 con đường: Thứ nhất là do acid béo no tác

dụng với rượu bậc cao thành ester (phản ứng này xãy ra trong tế bào nấm men), thứ

hai acid hữu cơ tác dụng với rượu sinh ra ester (phản ứng này xãy ra bên ngoài tế bào

nấm men) (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004).

4.6.7 Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp

Tất cả sản phẩm rượu vang nếp được định tính furfurol trong suốt thời gian lên men,

kết quả thí nghiệm cho thấy cả 4 mẫu rượu đều không phát hiện furfurol, do furfurol

(C5H4O2) có nhiệt độ sôi rất cao (161,7oC). Nguyên nhân hình thành furfurol trong

quá trình sản xuất rượu là do quá trình nấu nguyên liệu và chưng cất làm cháy dịch lên

men tạo ra.

Sự tạo thành furfurol và oxymetyl furfurol do đường mất nước. Kết quả thí nghiệm

cho thấy chỉ tiêu furfurol đã không hình thành trong giai đoạn lên men chính, cho nên

trong giai ổn định rượu với điều kiện bảo quản ở 100C sẽ khó làm biến đổi hàm lượng

furfurol. Thêm vào đó sản phẩm rượu vang nếp không qua chưng cất nên chỉ tiêu này

không phát hiện là hoàn toàn hợp lý.

4.6.8 Kết quả theo dõi chất lượng sản phẩm rượu nếp trong thời gian ổn định 3 tháng.

Sau giai đoạn lên men chính các sản phẩm rượu nếp tiếp tục được lên men phụ sau đó

được lọc và ổn định ở điều kiện nhiệt độ 100C. Trong thời gian ổn định và bảo quản

các chỉ tiêu chất lượng rượu về hóa lí, vi sinh và cảm quan được theo dõi suốt trong 3

tháng. Kết quả chỉ tiêu hóa lí rượu được thể hiện ở bảng 4.22, bảng 4.23 và bảng 4.24

Bảng 4.22 Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau thời gian 1 tháng

Loại rượu Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí

Hình 4.26 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi ester theo thời gian lên men chính của các loại rượu

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1 2 3 4 5 6 7 8

Thời gian (ngày)

Est

er (

g/l

) TB

ĐC

PA

BR



Brix

Đường

khử

(g/100ml)

Độ

rượu

(v/v)

pH Acid

(g/l)

Ester

(g/l)

Furfurol

(g/l)

TB 4,8c 0,10c 10,5b 3,61b 2,121a 0,440b KPH

ĐC 5,6a 0,89a 11,3ab 3,76ab 2,334a 0,625a KPH

PA 5,1bc 0,56b 11,5ab 3,87a 2,187a 0,620a KPH

BR 5,5ab 0,58b 12,0a 3,85a 2,370a 0,634a KPH



KPK: Không phát hiện


Loại rượu

Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí

Brix

Đường

khử

(g/100ml)

Độ

rượu

(v/v)

pH Acid

(g/l)

Ester

(g/l)

Furfurol

(g/l)

TB 4,6d 0,09c 10,3b 3,71a 2,103c 0,464d KPH

ĐC 5,2b 0,89a 11,5a 3,76a 2,327a 0,623c KPH

PA 5,0c 0,56b 11,8a 3,84a 2,229b 0,636b KPH

BR 5,5a 0,58b 12,0a 3,85a 2,352a 0,660a KPH






Loại rượu

Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí

Brix

Đường

khử

(g/100ml)

Độ

rượu

(v/v)

pH Acid

(g/l)

Ester

(g/l)

Furfurol

(g/l)

TB 4,6d 0,09c 10,5a 3,66a 2,040b 0,471c KPH

ĐC 5,2b 0,89a 11,8a 3,78a 2,304a 0,629b KPH

PA 5,0c 0,56b 11,8a 3,86a 2,214a 0,638b KPH

BR 5,4a 0,58b 12,0a 3,85a 2,328a 0,662a KPH



Sau thời gian 3 tháng ổn định và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 100C, các chỉ tiêu chất

lượng sản phẩm rượu dần dần ổn định, theo kết quả thể hiện ở bảng 4.22, 4.23, 4.24

cho thấy: độ Brix, đường khử sót lại, độ rượu, pH không có biến đổi nhiều có thể do

quá trình lên men rượu gần đến giai đoạn kết thúc tiến trình. Ngoài ra, trong giai đoạn

lên men phụ và ổn định, chỉ tiêu không kém phần quan trọng quyết định chất lượng đó

là chỉ số ester, tăng dần theo thời gian tạo nên hương vị đặc trưng cho từng sản phẩm

rượu vang, chính vì thế giá trị của rượu còn tùy thuộc vào “độ tuổi” của rượu.

4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp

Các sản phẩm rượu sau thời gian ổn định và bảo quản 3 tháng được mã hóa và thông

qua hội đồng gồm 10 thành viên để tiến hành đánh giá chỉ tiêu chất lượng cảm quan.

Bảng 4.25 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các sản phẩm rượu vang nếp (TCVN

3217-79)

Loại

rượu

Các chỉ tiêu chất lượng cảm quan

Độ trong & màu sắc (0,8) Mùi (1,2) Vị (2,0) Điểm đã được hiệu chỉnh

TB 4,3b 4,0a 3,8a 15,8

ĐC 4,6a 3,0b 3,1c 13,4

PA 4,6a 3,3b 3,3b 14,3

BR 4,7a 3,8a 3,8a 15,9



Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm (a, b, c…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa


Dựa theo những kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, các sản phẩm rượu sử dụng

enzyme α-amylase, glucoamylase và papain hoặc bromelain và nấm men thuần chủng

đạt kết quả tốt hơn rượu sử dụng bánh men thuốc bắc về mặt thời gian lên men, độ

rượu, chỉ số ester… kết hợp với kết quả đánh giá cảm quan ở bảng 4.25 có thể nhận

thấy sản phẩm rượu ĐC, PA và BR đạt chất lượng về màu sắc và độ trong cao hơn so

với rượu TB. Tuy nhiên sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc cho kết quả về

mặt mùi, vị tốt hơn rượu sử dụng enzyme amylase, papain nên chọn 2 loại rượu TB và

BR gửi phân tích các chỉ tiêu về hóa lí và vi sinh theo TCVN 7045: 2009 để đánh giá.

Đồng thời xét về điểm trung bình đã hiệu chỉnh nhân với các hệ số thì rượu BR, TB

đạt loại khá (15,2 ÷ 18,5) còn rượu ĐC và PA chỉ đạt loại trung bình (11,2÷15,1).

4.6.10 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc

bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009

Dựa trên những kết quả tối ưu đã đạt được, tiến hành phân tích các chỉ tiêu hóa lí và vi

sinh của sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc (TB) và rượu sử dụng enzyme:

α-amylase, glucoamylase, bromelain và nấm men thuần chủng (BR) so với các mức

giới hạn quy định trong TCVN 7045: 2009 để kiểm tra mức độ an toàn vệ sinh thực

phẩm của các sản phẩm rượu nghiên cứu.

Bảng 4.26 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí rượu TB và BR so với TCVN 7045: 2009

Các chỉ tiêu hóa lí

Loại rượu

TB BR TCVN

Aldehyde (mg/l) 275,7 346 -

Ester (mg/l) 146 119,1 -

Ethanol (%, v/v) 11,1 12,6 8 18

Furfurol (mg/l) Không phát hiện Không phát hiện -

Methanol (%, v/v) 0,004 0,003 0,05

Rượu bậc cao (mg/l) Không phát hiện Không phát hiện -


Theo kết quả thể hiện bảng 4.26 cho thấy hầu hết các chỉ tiêu chất lượng hóa lí của 2

loại rượu TB và BR đều trong phạm vi giới hạn cho phép, đặc biệt chỉ tiêu methanol

trong 2 sản phẩm rượu TB và BR đều thấp hơn rất nhiều so với mức cho phép trong



ruợu vang. Tuy nhiên, chỉ tiêu aldehyde còn cao nhưng hàm lượng này sẽ giảm khi ổn

định và bảo quản sản phẩm thời gian dài hơn (Nguyễn Thị Giang Thanh, 2008).

4.6.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc

bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009

Bảng 4.27 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN 7045: 2009

Các chỉ tiêu vi sinh vật

Loại rượu

TB BR TCVN

Clostridium perfringens (cfu/ml) 0 0 0

Coliform (cfu/ml) 0 0 10

Ecoli (MPN/ml) 0 0 0

Staphylococcus aureus (cfu/ml) 0 0 0

Tổng số nấm men, mốc (cfu/ml) 1,0.104 1,6.101 10

Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/ml) 9,4.104 2,5.101 102


Dựa trên số liệu phân tích thể hiện ở bảng 4.27 cho thấy các loài: Clostridium

perfringens, Coliform, Ecoli, Staphylococcus aureus gây bệnh cho người tiêu dùng

đều không có hiện diện trong 2 sản phẩm TB và BR. Bên cạnh đó chỉ tiêu tổng số nấm

men, mốc và tổng số vi khuẩn hiếu khí của sản phẩm rượu (BR) gần đạt mức giới hạn

tiêu chuẩn cho phép. Đối với sản phẩm rượu (TB) lên men theo phương pháp cổ

truyền do sử dụng bánh men thuốc bắc chất lượng không ổn định, có thể đã bị nhiễm

trong quá trình sản xuất men nên chỉ tiêu tổng số nấm men, mốc và tổng số vi khuẩn

hiếu khí cao hơn gấp nhiều lần so với giới hạn cho phép trong TCVN 7045: 2009 cho

sản phẩm rượu vang.

Hình 4.27 Các sản phẩm rượu vang nếp trắng



CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG ỨNG

DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM

5. 1 Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh phê duyệt

BỐ TRÍ TN ĐỀ CƯƠNG PHÊ DUYỆT THỰC TẾ THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU

- Khảo sát nồng độ enzyme α-amylase,

glucoamylase và thời gian thủy phân đến

hiệu suất đường hóa

- TN 1,2: Khảo sát pH, nhiệt độ, nồng độ

nếp, nồng độ của enzyme α-amylase,

glucoamylase và thời gian thủy phân dịch

hóa, đường hóa bột nếp.

- Khảo sát nồng độ enzyme protease và

thời gian thủy phân đến mùi vị sản phẩm.

- TN 3,4: Khảo sát pH, nhiệt độ, nồng độ

nếp, xác định Vmax, Km, nồng độ 2

enzyme papain, bromelain và thời gian

thủy phân đến màu sắc, độ trong, mùi, vị.

- Khảo sát nồng độ nấm men và thời gian

lên men đến nồng độ sản phẩm và tạp chất

sinh ra.

- TN 5: Theo dõi, so sánh và đánh giá chất

lượng 4 sản phẩm rượu: TB, ĐC, PA, BR

trong suốt thời gian lên men chính 7÷8 ngày

và ổn định trong 3 tháng ở 100C. Ghi chú:

Kế thừa và thử nghiệm: pH, nồng độ nấm

men (Hà Thị Thụy Vy, 2009)

- Khảo sát nhiệt độ và pH của quá trình

lên men

- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ lọc

để đạt chất lượng cảm quan tốt nhất.

- Tiến hành lọc rượu: Bằng cột ép cotton

kích thước lỗ lọc 1µm, 0,1µm cho chất

lượng sản phẩm tốt nhưng giá thành cao vì

lỗi lọc chỉ sử dụng một lần; cột than hoạt

tính 5µm làm mất màu, mùi và vị sản

phẩm; bột trợ lọc thời gian lọc dài; giấy

lọc, bông gòn thu được sản phẩm trong tốt.

- Đánh giá chất lượng sản phẩm rượu

(cảm quan, hóa lí và vi sinh)

- Đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79

- Phân tích hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045:

2009 (Trung tâm phân tích thí nghiệm, Sở

KH&CN Tp.HCM, 2010)

- Tìm ra quy trình sản xuất. - Đề ra quy trình theo TCVN 7045:2009

- Hạch toán kinh tế sản xuất rượu nếp. - Hạch toán kinh tế, giá thành sản phẩm



5. 2 Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng

Ứng dụng nghiên cứu sản xuất: nước giải khát từ dịch đường gluocse thu được sau khi

thủy phân tinh bột bằng enzyme amylase; nước uống có độ cồn thấp gồm (đường,

rượu, CO2); rượu vang từ nguồn tinh bột: Khoai lang, khoai mì, bắp, nếp than, gạo,

tấm…; trái cây: chuối, mít, quách...; sản xuất cồn sinh học từ cellulose (rơm, cỏ) để

pha với xăng E95.

Hộ gia đình sản xuất rượu đế truyền thống ở Trà Vinh đạt độ rượu 8 90 (PTN 160) Bổ

sung enzyme glucoamylase ở công đoạn đường hóa sau 1 ngày ủ mốc. Kết quả cho

thấy đã tăng lượng đường khử tạo thành và độ rượu thu được cũng cao hơn 7,30 và

10,70 đồng thời hiệu suất thu hồi sản phẩm: 2,8 lít và 3,7 lít (Đàm Thị Hải Yến, 2008).

Công ty TNHH SXTM HUY VIỆT TÂY ĐÔ, Địa chỉ: Quận Thốt Nốt, TP. Cần Thơ.

Ứng dụng α-amylase và β-amylase vào quá trình đường hóa nên lượng đường khử

chưa cao so với tỷ lệ 1 cơ chất (gạo, tấm, sắn): 3 nước. Quá trình lên men đạt độ rượu

chỉ khoảng 8 90, sau đó tiến hành chưng cất và chưng luyện để thu được sản phẩm

chính cồn tuyệt đối và sản phẩm phụ từ quá trình lên men là CO2 để bổ sung vào nước

giải khát có gas, nước đá khô, công nghệ lạnh, hàn…

- Đáp ứng nhu cầu sử dụng rượu vang từ đặc sản quê hương Việt Nam (gạo, nếp,

khoai) cho đối tượng khách hàng: Việt Kiều, người già, phụ nữ…

5.3 Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

STT Nguyên, vật liệu Tỷ lệ Số lượng Đơn giá Thành tiền

1 Nếp trắng 1 kg 145000 14500

2 Alpha-amylase 0,3 % 3 ml 400000 4800

3 Gluco-amylase 0,6 % 6 ml 500000 12000

4 Bromelain 0,5 % 5 ml 900000 1440

5 Nấm men 0,2% 2g 80000 1120

6 Citric 500

7 Na2CO3 500

8 Keo thủy tinh 1 1000

9 Chai, nắp 6 2500 15000

10 Nhãn, màng co 6 2000

12 2000

13 Nhiên liệu 2000

14 Nhân công 30000

15 Chi phí khác 3000

89860

Khấu hao (Waterbath, Tủ lạnh, pH, Brix, Nhiệt kế)

Tổng cộng: Giá thành 29.953 đ/lít rượu



CHƯƠNG 6 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

6.1 Kết luận

Qua quá trình thực hiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực

Phẩm- Trường Đại học Cần Thơ và Trung Tâm Thí Nghiệm; Trung Tâm Công Nghệ

Sau Thu Hoạch- Trường Đại học Trà Vinh cho thấy khi sử dụng enzyme α–amylase,

glucoamylase, papain hoặc bromelain và nấm men thuần chủng trong quá trình sản

xuất rượu nếp có thể rút ngắn thời gian đường hóa và thủy phân protein chỉ khoảng

2÷3 giờ, so với quy trình sản xuất rượu theo phương pháp cổ truyền thống sử dụng

bánh men thuốc bắc mất 2÷3 ngày. Bên cạnh độ cồn của sản phẩm ứng dụng enzyme

và nấm men thuần chủng đạt 12,60 sau 6 ngày lên men, trong khi đó rượu sử dụng

bánh men thuốc bắc để lên men chỉ khoảng 110 trong thời gian 8 ngày lên men. Kết

quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tối ưu cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu

nếp trắng và phương pháp lên men rượu như sau:

- Enzyme α-amylase với nồng độ 0,3%, thời gian thủy phân 31 phút tại pH 6,5, nhiệt

độ 870C để dịch hóa và đường hóa một phần tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu

được khoảng 6,46%, hàm lượng tinh bột còn sót lại 1,95%.

- Enzyme glucoamylase với nồng độ sử dụng 0,6% để đường hóa tinh bột, thời gian

thủy phân 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH 4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến

16,10%, hàm lượng tinh bột còn soát lại 1,86%.

- Enzyme papain với nồng độ 0,35% để phân cắt protein, thời gian thủy phân 45 phút

ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng nitơ amin 0,081%, cùng các thông số

động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ± 0,7705.

- Enzyme bromelain nồng độ là 0,5% để phân cắt protein, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ

550C lượng nitơ amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ±

0,0013; km= 3,5652 ± 0,4280.

- Dịch nếp sau khi thủy phân bằng enzyme được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men với

nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu lên

men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc. Kết quả chỉ ra rằng

việc ứng dụng các enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột, bromelain

phân cắt protein và nấm men thuần chủng lên men cho ra sản phẩm rượu đạt chất

lượng cảm quan cao và đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045: 2009.



Do đó để sản xuất rượu vang nếp theo tiêu chuẩn chất lượng, an toàn vệ sinh thực

phẩm và đạt giá trị cảm quan cao có thể tiến hành theo quy trình công nghệ như sau:

Thanh trùng

Ổn định ở 100C

Chiết, Lọc

Hình 5.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng

Gạo nếp

Nghiền

Pha loãng 1: 4

Hồ hóa

Dịch hóa

Đường hóa

Làm nguội

Nồng độ α-amylase 0,3%; 31 phút

ở pH 6,5; nhiệt độ 870C

Nồng độ γ-amylase 0,6%; 39 phút


Thủy phân protein

Làm nguội

Lên men chính

pH: 4,9, Nấm men: 0,2 %

Thời gian: 6 ngày

Thanh trùng

Nồng độ bromelain 0,5%; 55 phút


Lên men phụ

Sản phẩm rượu BR

Hấp

Làm nguội Tỉ lệ 1kg Nếp : 10g

Men: 3,5 lít Nước

TB ĐC

BR PA

Làm nguội

Lọc

Nồng độ papain 0,35%; 45 phút


Ngâm

Lọc Lọc

Thanh trùng



6.2 Đề nghị

Để qui trình sản xuất rượu được hoàn chỉnh hơn chúng tôi có các đề nghị sau:

- Tuyển chọn, phân lập giống nấm men đặc trưng cho lên men rượu vang nếp.

- Trang bị thiết bị lên men kiểm soát nhiệt độ và áp suất và thiết bị lọc vi sinh

- Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm mới từ dịch glucose thu được sau khi thủy phân

- Tiến hành bảo quản rượu ở các nhiệt độ và kết hợp các chất bảo quản khác nhau.

- Khảo sát thay đổi màu sắc theo thời gian ổn định và bảo quản rượu.

- Khảo sát sử dụng enzyme protease có nguồn gốc từ vi sinh vật có hoạt tính exo-

protase như neutrase.

- Khảo sát sự ảnh hưởng hàm lượng acid amin tự do trong dịch lên men đến khả năng

tạo màu vàng, mùi, vị đặc trưng riêng cho từng sản phẩm.

- Nghiên cứu sản xuất hỗn hợp enzyme có hoạt tính amylase và protease từ vi sinh vật.

- Nghiên cứu sản xuất rượu nếp chưng cất theo TCVN 7043: 2009.

- Nghiên cứu thực nghiệm ở quy mô xưởng sản xuất.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Bùi Ái, (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Nhà xuất

bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

Bùi Thị Quỳnh Hoa, (2004), Bài giảng Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải

khát, Đại học Cần Thơ.

Lê Ngọc Tú, (2004), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà

Nội.

Lê Ngọc Tú, (2003), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.

Lê Ngọc Tú, Lưu Dzuẩn, Đặng Thị Thu, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thủy, (2000),

Biến hình sinh học các sản phẩm từ hạt, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn

Diên, (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan

Chi, (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Lý Nguyễn Bình, (1997), Giáo trình Kỹ thuật lên men, Trường Đại học Cần Thơ.

Lương Đức Phẩm, (2002), Vi sinh Vật Học & An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, Nhà xuất

bản Nông Nghiệp.

Ngô Thị Hồng Thư, (1989), Kiểm nghiệm thực phẩm bằng phương pháp cảm quan,

Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia

Thành Phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đình Thưởng &Nguyễn Thanh Hằng, (2007), Công nghệ sản xuất và kiểm tra

cồn etylic, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Nguyễn Đức Lượng, (2002), Công nghệ vi sinh vật (tập 2), NXB Đại học Quốc Gia

Thành Phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đức Lượng, (2006), Công nghệ vi sinh - tập 3-Thực phẩm lên men truyền

thống, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

Phạm Thu Cúc, (1999), Giáo trình sinh hóa I, Tủ sách Đại Học Cần Thơ.

Trần Thị Luyến, (2004), Bài giảng các quá trình cơ bản và biến đổi của thực phẩm,

Đại học Thủy sản Nha Trang.



Tiếng Anh

Dung, N.T.P, (2004), Defined fungal starer granules for purple glutious rice wine

Wageningen, The Netherland

Ota S., H. Umi, E. Muta and Y. Okamoto, (1975), Chemical odification of Stem

Bromelain I-1 and Fruit Bromelain A with 2-Hydroxy-5-nitrobenzyl Bromide,

Tetranitromethane, and Hydrogen Peroxide, Journal of Biochem, Vol. 78, No. 3 627-

635_© 1975 Japanese Biochemical Society.

Novo Nordish Ferment Ltd. B296, B194, B552e – GB (2007).

Shahina Naz, (2002), Enzyme and food,

Walker, G.M., (1998), Yeasts physiology and biotechnology, Jonhn Wiley & sons,

Chichester 350p.

http://www.merck-chemicals.com/papain/MDA_CHEM-

107144/p_9dWb.s1L7V4AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=papain&

BackButtonText=search+results

http://www.merck-chemicals.com/bromelain/MDA_CHEM-101651/p_uuid

http://www.merck-chemicals.com/papain/MDA_CHEM-107144/p_9dWb.s1L7V4AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=papain&BackButtonText=search+results



http://www.merck-chemicals.com/bromelain/MDA_CHEM-101651/p_uuid


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch I

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Các phương pháp phân tích

A.1 Xác định độ ẩm

Theo nguyên tắc áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm không đổi.

- Tiến hành: Sấy cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C đến trọng lượng không đổi,

dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân m0 (g). Cho nếp vào cốc khoảng

2 – 3g, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là

m1(g). Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra

để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để

cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu

giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2 (g). Kết quả tính độ ẩm: (W)

W = (m1 – m2)*100/ (m1 – m0) (%)

Trong đó:

m0: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy .

m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

A.2 Đo pH của mẫu

Chọn chức năng đo pH trên máy.

Chuẩn bị cốc chứa mẫu. Nhúng điện cực sạch và khô vào cốc. Ấn START và đọc giá

trị pH trên màn hình. Trong quá trình đo pH, nên khuấy thật nhẹ mẫu bằng cá từ để

đảm bảo đồng nhất mẫu. Lấy điện cực ra, rửa sạch bằng nước cất và ngâm nó trong

dung dịch bảo quản.

A.3 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix) bằng chiết quang kế

Phương pháp xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng khúc xạ kế dựa trên độ khúc

xạ ánh sáng của đường và một số hợp chất hữu cơ khác quy ra đường. Dễ dàng hoạt

động cho giá trị đo chính xác và ổn định. Chỉ cần dùng 2 đến 3 giọt mẫu đo, thang đo:

từ 0 đến 30% ,thang đo nhỏ nhất 0,1%, độ phân giải: 6,5 giây, nhiệt độ làm việc: 5 –

400C tự động bù nhiệt.

A.4 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Lane - Eynon

Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose,

mantose, …) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ Cu+), kết

tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch II

* Hoá chất:

- NaOH 10%, 1N; Pb(CH3COO)2 30%; Na2SO4 bão hòa (30%).

- Dung dịch fehling A: CuSO4 tinh thể 69,28g, thêm nước cất đến 1000ml.

- Dung dịch fehling B: Kali, Natri tartrate 346g, NaOH 100g, thêm nước cất đến

1000ml.

- Metyl xanh 1% trong cồn.

Dụng cụ;

- Bình tam giác 200ml; Buret; Giấy lọc; Phễu lọc.

- Bếp điện.

Tiến hành:

- Cân mg mẫu cho vào bình tam giác 100ml.

- Cho thêm vào bình 50ml nước cất, dùng dung dịch Na2CO3 10% để trung hòa dung

dịch về pH= 7 (dùng giấy quì tím làm chỉ thị màu).

- Tiến hành đun sôi cách thủy trong 15 phút, sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy.

- Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml. Kết tủa protein với 3ml dung dịch

acetate chì 30%. Loại bỏ acetate chì bằng 10- 15ml dung dịch Na2SO4 bão hoà. Thêm

nước cất với vạch định mức, lắc đều và lọc.

- Định lượng đường khử trong dịch lọc theo phương pháp sau:

Cho vào bình tam giác 100ml hỗn hợp 5ml fehling A + 5ml fehling B, lắc đều, sau đó

cho vào 15ml dịch lọc. Đem đun sôi trên bếp và quan sát màu của dung dịch:

+ Nếu màu xanh của dung dịch Fehling biến mất, nghĩa là đường dư, cần pha

loãng dịch lọc và định phân lại.

+ Nếu màu xanh của dung dịch Fehling chưa mất, thêm từ từ từng ml dung

dịch lọc (dịch đường) vào bình tam giác, đun sôi và quan sát cho đến khi có kết tủa

màu đỏ gạch, dung dịch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt xanh

metylen vào dung dịch đang sôi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc thể tích

và tra bảng tính ra hàm lượng đường.

Công thức tính toán:

Số tra bảng * HSPL * 100

Hàm lượng đường khử = (%)

Khối lượng mẫu * 1000


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch III

ml

dung

dịch

chuẩn

đường

mg

đường

khử

ml

dung

dịch

chuẩn

đường

mg

đường

khử

ml

dung

dịch

chuẩn

đường

mg

đường

khử

ml

dung

dịch

chuẩn

đường

mg

đường

khử

15

336,0

24

213,3

33

156,0

42

124,2

16

316,0

25

204,8

34

152,2

43

121,4

17

298,0

26

197,4

35

147,1

44

118,7

18

282,0

27

190,4

36

143,9

45

116,1 19

267,0

28

183,7

37

140,2

46

113,7

20

254,5

29

177,6

38

136,6

47

111,4 21

242,9

30

171,7

39

133,3

48

109,2

22

231,8

31

166,3

40

130,1

49

107,1 23

222,2

32

161,2

41

127,1

50

105,1

A.5 Định lượng nitơ amino bằng phương pháp định lượng nitơ formon

* Nguyên lý: Các acid amin trong dung dịch nước thì trung tính, không những do 2

nhóm hoá chức acid (-COOH) và amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau, mà còn do cả 2

nhóm hoá chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formon, nhóm -NH2 kết

hợp với formon thành nhóm metylenic N=CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính chất

acid của nhóm -COOH nổi bật lên và có thể định lượng bằng một chất kiềm với

phenolphtalein làm chỉ thị màu.

* Chú ý: Các muối amoni, ví dụ NH4Cl ở dung dịch trung tính, khi gặp formon cũng

làm cho dung dịch trở thành acid, do hình thành hexmetylen tetramin và HCl theo

phản ứng: 4NH4Cl + 6CH2O (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl

- Do đó cũng định lượng được bằng một chất kiềm.

Tóm lại:

- Nếu trong chất thử chỉ có acid amin thì nitơ formon là nitơ amin.

- Nếu trong chất thử có cả acid amin lẫn muối amoni thì nitơ formon là tổng của nitơ

acid amin và nitơ amoni. Muốn có nitơ acid amin, phải lấy nitơ formon trừ đi nitơ

amoni.

R - CH - COOH R - CH - COOH

NH2 N = CH2 + H2O

+ OCH2


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch IV

Pnm

100*

25

100**00014,0=

Vnm

1000*

25

100**00014,0=

- Đây là trường hợp một acid yếu được định lượng bằng một chất kiềm mạnh, nên

điểm tương đương phải ở pH kiềm (pH 9 ÷ 9,5) do đó phản ứng kết thúc khi

phenolphtalein chuyển màu đỏ tươi (chứ không phải màu hồng như thông thường).

* Tiến hành:

- Đo pH ban đầu (pH0) của dung dịch cần chuẩn nitơ amin.

- Điều chỉnh pH đến khoảng pH cần cho hoạt động thuỷ phân (pHt), Đo pHt.

- Cân chính xác P (g) hoặc V (ml) chất cần đo, cho vào bình định mức 100 ml, cho

tiếp 50 ml nước cất, lắc mạnh trong 10 phút để hoà tan, cho tiếp nước cất vừa đủ 100

ml, lắc đều và lọc.

- Điều chỉnh pH hiện tại (pHt) về mức pH = 7,0.

- Lấy 25 ml dịch lọc, cho vào bình nón với 20 ml formon trung tính, cho thêm vài giọt

phenolptalein, sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,01N cho đến màu đỏ tươi (pH 9 ÷ 9,5).

* Tính lượng nitơ amin theo công thức: (g/100 g)

(g/l)

Trong đó:

0,00014 = số g nitơ tương ứng với 1 ml NaOH 0,01N.

n = số ml NaOH 0,01N sử dụng.

V hoặc P = số ml hoặc số g chất thử.

A.6 Đo độ rượu bằng phương pháp chưng cất

Lấy 100 ml mẫu cho vào bình định mức 100 ml sau đó rót vào bình cất 1 rồi tráng

bình bằng 100ml nước cất rồi cũng đỗ vào bình 1 có dung tích khoảng 500 ml.

Nối với hệ thống chưng cất, lấy bình định mức 100 ml để thu nước ngưng sau chưng

cất, tiến hành chưng cất cho tới khi nước ngưng đầy tới ngấn 100 ml. Cất xong đậy

kín và đem làm lạnh tới nhiệt độ 200C, sau đó dùng cồn kế để đo độ rượu.

A.7 Xác định acid toàn phần của rượu

* Nguyên tắc:

Trong rượu vang chứa rất nhiều loại acid khác nhau và được tạo thành trong quá trình

lên men hoặc được sử dụng trong quá trình điều chỉnh pH của dịch lên men nhưng chủ

yếu là acid acetic. Vì thế, người ta thường biểu diễn độ acid trong rượu vang theo acid

acetic.

* Dụng cụ:


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch V

Ống sinh hàn; Ống đong; Bình tam giác; Pipet; Buret.

* Hóa chất:

NaOH 0,1N; Phenolphtalein 0,5%; H2SO4 0,1N.

* Tiến hành thử:

Lấy 100 ml rượu cho vào bình tam giác 250 ml. Nối với hệ thống ống sinh hàn, đun

sôi 15 phút để đuổi hết CO2 rồi sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng, cho vào 3 ÷ 4

giọt phenolphthalein rồi dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn đến màu hồng nhạt.

* Kết quả

v

VAx

1000*6*= (mg/l)

Trong đó:

V: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân.

v: số ml rượu lấy để chuẩn độ.

6: số mg acid acetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N.

1000: hệ số chuyển đổi thành lít.

A. 8 Xác định hàm lượng ester của rượu

*Nguyên tắc:

Sau khi xác định xong acid tiếp tục xác định hàm lượng ester trên cơ sở:

CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH

Xác định NaOH tác dụng với ester ta suy ra được lượng ester trong rượu.

* Dụng cụ:

Ống sinh hàn; Ống đong; Bình tam giác; Pipet; Buret.

* Hóa chất:

NaOH 0,1N; Phenolphtalein 0,5%; H2SO4 0,1N.

* Tiến hành thử:

Lấy 100 ml rượu cho vào bình tam giác 250ml.

Trung hòa rượu bằng NaOH 0,1N (tiến hành giống như chuẩn acid).

Sau khi chuẩn xong ta thêm vào hốn hợp 5ml NaOH 0,1N rồi nối bình tam giác với hệ

thống ống sinh hàn và đun sôi trong 1 giờ để tạo điều kiện cho phản ứng:

CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VI

Đun xong đem làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó cho đúng 5ml H2SO4 0,1N vào

bình và lắc đều, tiếp đó chuẩn lại lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N tới

xuất hiện màu hồng nhạt.

* Kết quả:

Hàm lượng ester (tính theo ester của acid acetic) trong rượu được tính:

v

VE

1000*8,8*= (mg/l)

Trong đó:

V: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân.

v: số ml rượu lấy để chuẩn độ.

8,8: số mg ester etylic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N.

1000: hệ số chuyển đổi thành lít.

A.9 Định tính fufurol

* Nguyên tắc:

Nếu trong rượu chứa fufurol thì khi phản ứng với aniline (C6H5NH2) trong môi trường

acid có màu hồng-da cam. Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng fufurol.

* Dụng cụ:

Ống đong, pipet.

* Hóa chất:

Dung dịch HCl (d = 1,19).

Anilin tinh khiết.

* Tiến hành:

Lấy ống nghiệm hoặc ống đong 25ml có nút nhám, dùng ống hút nhỏ 10 giọt aniline

tinh khiết vào ống đong và 3 giọt HCl (d = 1,19). Tiếp đó cho 10ml rượu lắc đều và để

yên. Nếu sau 10 phút hỗn hợp phản ứng vẫn không màu thì xem như đạt yêu cầu, nếu

có xuất hiện màu hồng thì xem như rượu có chứa fufurol.

A.10 Phương pháp đánh giá cảm quan

Dựa vào khả năng cảm giác của từng thành viên đối với từng chỉ tiêu. Số diểm chưa

có trọng lượng là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu

chất lượng và được quy định trong bảng 1:

Bảng 1 Bảng điểm mô tả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 3217-79


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VII

Tên Chỉ

tiêu

Điểm chưa có

trọng lượng

Yêu cầu

Độ trong

và màu

sắc

5

4

3

2

1

0

Chất lỏng trong suốt, không có vẩn đục và vật thể lạ nhỏ,

màu hoàn toàn đặc trưng cho cho rượu vang nếp.

Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ,

màu đặc trưng cho cho rượu vang nếp.

Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi

khác với màu đặc trưng cho rượu vang nếp.

Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ, thô trầm

trọng, màu khác nhiều với màu đặc trưng của rượu vang nếp.

Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm

trọng, thô, màu không đặc trưng cho rượu vang nếp.

Vẩn đục, sản phẩm bị hỏng

Mùi

5

4

3

2

1

Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho rượu vang nếp

Chưa hòa hợp, thơm đặc trưng cho cho rượu vang nếp, hơi

khó nhận thấy

Hơi nồng, thoáng mùi phụ, ít đặc trưng cho rượu vang nếp

Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho rượu vang nếp

Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho rượu vang nếp

Vị

5

4

3

2

1

Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho rượu vang

nếp

Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho rượu

vang nếp

Chưa hòa hợp, hơi gắt và hậu yếu, ít đặc trưng cho rượu

vang nếp

Đắng, sốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho rượu vang nếp

Có vị lạ, khó chịu của sản phẩm hỏng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VIII

Bảng 2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu

STT Chỉ tiêu Hệ số quan trọng

1

2

3

Độ trong và màu sắc

Mùi

Vị

0,8

1,2

2,0

Tổng cộng: 4,0

Bảng 3 Đánh giá mức chất lượng

STT Mức chất

lượng

Số điểm

chung

Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình

chưa có trọng điểm hội đồng cảm quan

1 Loại tốt 18,6-20,0 Mùi: 4,8

Vị: 4,8

2 Loại khá 15,2-18,5 Mùi: 3,8

Vị: 3,8

3 Loại trung

bình

11,2-15,1 Mỗi chỉ tiêu: 2,8

4 Loại kém 7,2-11,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,8

5 Loại rất kém 4,0-7,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,0

6 Loại hỏng 0-3,9 Mỗi chỉ tiêu: 1,0


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch IX

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7045 : 2009

Rượu vang – Quy định kỹ thuật

Wine – Specification

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các sản phẩm rượu vang.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các

tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu

viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa

đổi.

TCVN 7087: 2008 (CODEX STAN 1-2005), Ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn.

TCVN 8007: 2009 Rượu- Chuẩn bị mẫu và kiểm tra cảm quan.

TCVN 8010: 2009 Rượu chưng cất xác định ethanol.

TCVN 8012: 2009 Rượu xác định độ axit.

AOAC 940.20, Sulfurous aicd in wine (Axit sulfurơ trong rượu vang).

AOAC 973.20, Cyanide in wine (Xyanua trong rượu vang).

AOAC 983.13, Alcohol in wine – Gas chromatographic method (Cồn trong rượu

vang- Phương pháp sắc ký khí).

AOAC 988.07, Carbon dioxide in wine – Titrimetric method (Cacbon dioxit trong

rượu vang- Phương pháp chuẩn độ).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau đây:

3.1 Rượu vang (Wine): Đồ uống có cồn được chế biến bằng phương pháp lên men từ

trái cây và không qua chưng cất.

4 Yêu cầu kỹ thuật

4.1 Yêu cầu cảm quan

Các chỉ tiêu cảm quan đối với rượu vang được quy định trong Bảng 1.

Phụ Lục B: Tiêu Chuẩn Việt Nam (TCVN 7045 : 2009)


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch X

Bảng 1 Yêu cầu cảm quan

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Màu sắc Đặc trưng cho từng loại sản phẩm

Mùi Thơm đặc trưng của nguyên liệu và sản phẩm lên men, không có

mùi lạ

Vị Đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có vị lạ

Trạng thái Trong, không vẩn đục

4.2 Chỉ tiêu hoá học

Các chỉ tiêu hóa học của rượu vang được quy định trong Bảng 2

Bảng 2 Các chỉ tiêu hoá học của rượu vang

Tên chỉ tiêu Mức

1. Hàm lượng etanol (cồn) ở 200C, % (thể tích) Từ 8 đến 18

2. Hàm lượng metanol trong 1 l etanol 1000, % thể tích,

không lớn hơn 0,05

3. Độ acid Nhà sản xuất tự

công bố

4. Hàm lượng SO2, mg/l etanol 1000, không lớn hơn 350

6. Hàm lượng CO2 Nhà sản xuất tự

công bố

5. Hàm lượng xyanua, mg/l etanol 1000, không lớn hơn 0,1

5 Phụ gia thực phẩm

Phụ gia thực phẩm sử dụng cho rượu vang: theo quy định hiện hành

6 Yêu cầu vệ sinh

6.1 Kim loại nặng

Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng đối với rượu vang được: theo quy định hiện

hành


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XI

6.2 Vi sinh vật

Các chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang: theo quy định hiện hành

7 Phương pháp thử

Xác định các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 8007:2009.

Xác định hàm lượng etanol, theo AOAC 983.13.

Xác định hàm lượng metanol, theo TCVN 8010:2009.

Xác định hàm lượng axit, theo TCVN 8012:2009.

Xác định hàm lượng CO2, theo AOAC 988.07.

Xác định hàm lượng SO2, theo AOAC 940.20.

Xác định hàm lượng cyanua, theo AOAC 973.20.

8 Bao gói, ghi nhãn, bảo quản và vận chuyển

8.1 Bao gói

Rượu vang phải được đựng trong các bao bì kín, chuyên dùng cho thực phẩm và

không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.

8.2 Ghi nhãn

Ghi nhãn sản phẩm theo theo quy định hiện hành và TCVN 7087: 2008 (CODEX

STAN 1-2005).

8.3 Bảo quản

Bảo quản rượu vang nơi khô, mát, tránh ánh nắng mặt trời và không ảnh hưởng đến

chất lượng của sản phẩm.

8.4 Vận chuyển

Phương tiện vận chuyển rượu vang phải khô, sạch, không có mùi lạ và không ảnh

hưởng đến chất lượng sản phẩm.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XII

Phụ lục C: Kết quả xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic 4.0

4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và


4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ cuả enzyme α-amylase trong quá trình thủy

phân bột nếp trắng

Bảng 1 Phân tích phương sai ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi

thủy phân tinh bột nếp bằng α-amylase

Analysis of Variance for Duong khu - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nhiet do 5.90487 3 1.96829 356.14 0.0000

B:pH 1.91461 3 0.638203 115.47 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.770713 9 0.0856347 15.49 0.0000

RESIDUAL 0.176857 32 0.00552677

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 8.76704 47

--------------------------------------------------------------------------------

All F-ratios are based on the residual mean square error.

Bảng 2 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân

tinh bột nếp bằng α-amylase

Multiple Range Tests for Duong khu by pH

--------------------------------------------------------------------------------

Method: 95.0 percent LSD

pH Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

5.5 12 5.32717 X

6 12 5.52633 X

7 12 5.58533 X

6.5 12 5.8845 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 3 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy

phân tinh bột nếp bằng α-amylase

Multiple Range Tests for Duong khu by Nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------


Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

75 12 5.03083 X

80 12 5.5325 X

90 12 5.81583 X

85 12 5.94417 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp.

Bảng 4 Phân tích phương sai ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân đến lượng

đường khử tạo thành


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIII


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nong do 4.26426 3 1.42142 146.82 0.0000

B:Thoi gian 6.23916 3 2.07972 214.82 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.991085 9 0.110121 11.37 0.0000

RESIDUAL 0.3098 32 0.00968125

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 5 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nồng độ α-amylase đến lượng đường khử tạo thành

khi thủy phân tinh bột nếp

Multiple Range Tests for Duong khu by Nong do

--------------------------------------------------------------------------------


Nong do Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

0.1 12 5.0575 X

0.2 12 5.4925 X

0.3 12 5.775 X

0.4 12 5.79583 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 6 Kiểm định LSD về ảnh hưởng thời gian thủy phân của α-amylase đến lượng đường khử

tạo thành

Multiple Range Tests for Duong khu by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------


Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

10 12 4.99417 X

20 12 5.41417 X

30 12 5.79917 X

40 12 5.91333 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase

trong quá trình thủy phân

Bảng 7 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ bột nếp lượng đường khử tạo thành

ANOVA Table for Duong khu by Nong do nep

Analysis of Variance

-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 174.432 7 24.9188 1077.22 0.0000

Within groups 0.370121 16 0.0231325

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 174.802 23

Bảng 8 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIV

Multiple Range Tests for Duong khu by Nong do nep

--------------------------------------------------------------------------------


Nong do nep Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

5 3 1.79833 X

10 3 3.051 X

15 3 4.60667 X

20 3 6.10733 X

25 3 7.05933 X

30 3 8.133 X

35 3 9.418 X

40 3 9.588 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa


4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân

dịch nếp.

Bảng 9 Phân tích phương sai ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi

thủy phân dịch nếp bằng glucoamylase


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nhiet do 3.89405 3 1.29802 13.40 0.0000

B:pH 10.667 3 3.55567 36.72 0.0000

INTERACTIONS

AB 2.31802 9 0.257557 2.66 0.0200

RESIDUAL 3.099 32 0.0968437

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 10 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân

dịch nếp bằng glucoamylase

Multiple Range Tests for Duong khu by pH

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

5 12 13.6117 X

3.5 12 14.1383 X

4.5 12 14.3567 X

4 12 14.9267 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 11 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy

phân dịch nếp bằng glucoamylase


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XV

Multiple Range Tests for Duong khu by Nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

70 12 13.9058 X

55 12 14.1267 XX

65 12 14.3192 X

60 12 14.6817 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch

nếp trắng.

Bảng 12 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy

phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nong do 15.7894 3 5.26312 69.78 0.0000

B:Thoi gian 20.9417 3 6.98056 92.55 0.0000

INTERACTIONS

AB 1.42445 9 0.158272 2.10 0.0597

RESIDUAL 2.4136 32 0.075425

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 13 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ enzyme glucoamylase đến lượng đường khử tạo

thành

Multiple Range Tests for Duong khu by Nong do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

0.4 12 13.8533 X

0.5 12 14.5242 X

0.7 12 15.1817 X

0.6 12 15.28 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 14 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử

tạo thành

Multiple Range Tests for Duong khu by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

10 12 13.8067 X

20 12 14.3617 X

30 12 15.2225 X

40 12 15.4483 X

--------------------------------------------------------------------------------


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVI

4.3.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme glucoamylase.

Bảng 15 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ nếp đến lượng đường khử tạo thành khi

thủy phân bằng glucoamylase

ANOVA Table for Duong Khu by Ti Le Bot Nep


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 1461.81 7 208.83 1179.97 0.0000

Within groups 2.83167 16 0.176979

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 1464.64 23

Bảng 16 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến lượng đường khử tạo thành khi

thủy phân bằng glucoamylase

Multiple Range Tests for Duong Khu by Ti Le Bot Nep

--------------------------------------------------------------------------------


Ti Le Bot Nep Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

5 3 4.03133 X

10 3 7.94133 X

15 3 11.6667 X

20 3 15.8833 X

25 3 18.5193 X

30 3 22.4497 X

35 3 26.178 X

40 3 26.593 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.4 Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau

khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân

protein nếp.

Bảng 17 Phân tích phương sai ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi

thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain.

Analysis of Variance for Nito amin - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:pH 0.000278093 3 0.0000926978 8.64 0.0012

B:Nhiet do 0.000385218 3 0.000128406 11.96 0.0002

INTERACTIONS

AB 0.0000162228 9 0.00000180253 0.17 0.9949

RESIDUAL 0.000171735 16 0.0000107334

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------



Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVII

Bảng 18 Kiểm định LSD ảnh hưởng của pH dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy

phân protein bằng enzyme papain

Multiple Range Tests for Nito amin by pH

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

5 8 0.0694125 X

6.5 8 0.0730375 X

5.5 8 0.0743125 X

6 8 0.07765 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 19 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân

protein trong dịch nếp bằng enzyme papain

Multiple Range Tests for Nito amin by Nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

40 8 0.0680625 X

45 8 0.0741125 X

55 8 0.0746125 X

50 8 0.077625 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp

Bảng 20 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng

nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp trắng

Analysis of Variance for Nito Amin - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nong do 0.000545343 3 0.000181781 20.90 0.0000

B:Thoi gian 0.000982495 3 0.000327498 37.66 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.0000941075 9 0.0000104564 1.20 0.3577

RESIDUAL 0.00013913 16 0.00000869562

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 21 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain đến lượng nitơ amin tạo thành

khi thủy phân protein dịch nếp trắng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVIII

Multiple Range Tests for Nito Amin by Nong do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

0.1 8 0.0650875 X

0.2 8 0.069525 X

0.3 8 0.0744875 X

0.4 8 0.07535 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 22 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân

protein trong dịch nếp trắng

Multiple Range Tests for Nito Amin by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

20 8 0.063725 X

30 8 0.067825 X

40 8 0.075975 X

50 8 0.076925 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá


Bảng 23 Phân tích phương sai ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain

ANOVA Table for Nito amin by nongdonep


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.00391306 7 0.000559008 48.23 0.0000

Within groups 0.000185467 16 0.0000115917

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.00409852 23

Bảng 24 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain

Multiple Range Tests for Nito amin by nongdonep

--------------------------------------------------------------------------------


nongdonep Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

5 3 0.0602 X

10 3 0.0679667 X

15 3 0.0776 X

20 3 0.0834 XX

25 3 0.0885333 XX

30 3 0.0903667 X

35 3 0.0968 X

40 3 0.0989333 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein

dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIX

4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy

phân protein nếp

Bảng 25 Phân tích phương sai ảnh hưởng của các mức pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo

thành khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain

Analysis of Variance for Nito amin - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nhiet do 0.000170981 3 0.0000569936 12.20 0.0000

B:pH 0.000135424 3 0.0000451414 9.67 0.0001

INTERACTIONS

AB 0.0000559808 9 0.00000622009 1.33 0.2599

RESIDUAL 0.000149453 32 0.00000467042

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 26 Kiểm định LSD ảnh hưởng của pH đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân dịch

nếp bằng enzyme bromelain

Multiple Range Tests for Nito amin by pH

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

5 12 0.0473833 X

6.5 12 0.047525 X

6 12 0.0496417 X

5.5 12 0.0514667 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 27 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân

dịch nếp bằng enzyme bromelain

Multiple Range Tests for Nito amin by Nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

45 12 0.04635 X

50 12 0.0488083 X

60 12 0.0491833 X

55 12 0.051675 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein

nếp.

Bảng 28 Phân tích phương sai ảnh hưởng của mức nồng độ enzyme và thời gian đến lượng nitơ

amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XX

Analysis of Variance for Nito Amin - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Thoi gian 0.000266677 3 0.0000888924 13.88 0.0000

B:Nong do 0.000197181 3 0.0000657269 10.26 0.0001

INTERACTIONS

AB 0.0000336969 9 0.0000037441 0.58 0.7996

RESIDUAL 0.00020492 32 0.00000640375

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 29 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain đến lượng nitơ amin tạo

thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng

Multiple Range Tests for Nito Amin by Nong do

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

0.3 12 0.0467917 X

0.4 12 0.0491917 X

0.5 12 0.0514667 X

0.6 12 0.0518583 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 30 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin tạo thành khi

thủy phân protein trong dịch nếp

Multiple Range Tests for Nito Amin by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

30 12 0.0460083 X

40 12 0.04985 X

50 12 0.0512583 XX

60 12 0.0521917 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá


Bảng 31 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain

ANOVA Table for Nito Amin by Nong do nep


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.00104661 7 0.000149516 93.06 0.0000

Within groups 0.0000257067 160.00000160667

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.00107232 23


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXI

Bảng 32 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme

bromelain

Multiple Range Tests for Nito Amin by Nong do nep

--------------------------------------------------------------------------------


Nong do nep Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

5 3 0.0376 X

10 3 0.0458333 X

15 3 0.0467 X

20 3 0.0535333 X

25 3 0.0548333 XX

30 3 0.0563 XX

35 3 0.0563667 XX

40 3 0.0578 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6 Kết quả theo dõi và đánh giá chất lượng rượu lên men truyền thống sử dụng

bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong

giai đoạn lên men chính và ổn định.

4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu

Bảng 33 Phân tích phương sai thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu

Analysis of Variance for Do Brix - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Ngay 563.985 6 93.9974 41.56 0.0000

B:Loai Ruou 199.995 3 66.6649 29.47 0.0000

INTERACTIONS

AB 66.7212 18 3.70673 1.64 0.0814

RESIDUAL 126.66 56 2.26179

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 34 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix của các loại rượu trong quá trình lên men chính

Multiple Range Tests for Do Brix by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------


Loai Ruou Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

4 21 6.22381 X

3 21 7.18095 XX

2 21 8.17143 X

1 21 10.381 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 35 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix trong thời gian lên men chính của các loại rượu


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXII

Multiple Range Tests for Do Brix by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------


Ngay Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

7 12 5.31667 X

6 12 5.78333 X

5 12 6.01667 XX

4 12 7.19167 XX

3 12 8.41667 X

2 12 10.15 X

1 12 13.05 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại

rượu

Bảng 36 Phân tích phương sai thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men của các

loại rượu Analysis of Variance for Duongkhu - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Ngay 1070.14 6 178.356 55.75 0.0000

B:Loai Ruou 306.402 3 102.134 31.92 0.0000

INTERACTIONS

AB 152.169 18 8.45382 2.64 0.0029

RESIDUAL 179.171 56 3.19948

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------


Bảng 37 Kiểm định LSD thay đổi đường khử của các loại rượu trong quá trình lên men chính Multiple Range Tests for Duongkhu by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

4 21 1.80095 X

3 21 3.02286 XX

2 21 4.1319 X

1 21 6.96381 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 38 Kiểm định LSD thay đổi đường khử theo thời gian lên men chính của các loại rượu Multiple Range Tests for Duongkhu by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

7 12 0.370833 X

6 12 0.828333 XX

5 12 1.32667 XX

4 12 2.48667 X

3 12 4.93167 X

2 12 7.15583 X

1 12 10.7592 X

--------------------------------------------------------------------------------


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIII

4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men của các loại rượu.

Bảng 39 Phân tích phương sai thay đổi độ rượu trong quá trình lên men của các loại rượu Analysis of Variance for Do ruou - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Ngay 499.202 6 83.2004 169.43 0.0000

B:Loai Ruou 379.214 3 126.405 257.41 0.0000

INTERACTIONS

AB 34.869 18 1.93717 3.94 0.0000

RESIDUAL 27.5 56 0.491071

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

All F-ratios are based on the residual mean square error. Bảng 40 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu của các loại rượu trong quá trình lên men chính Multiple Range Tests for Do ruou by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 21 4.57143 X

2 21 8.54762 X

3 21 9.47619 X

4 21 9.97619 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 41 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính của các loại rượu

Multiple Range Tests for Do ruou by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 12 3.45833 X

2 12 6.25 X

3 12 7.45833 X

4 12 8.83333 X

5 12 9.70833 X

6 12 10.375 XX

7 12 10.9167 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6.4 Kết quả thay đổi pH dịch nếp trong quá trình lên men của các loại rượu

Bảng 42 Phân tích phương sai thay đổi pH trong quá trình lên men của các loại rượu


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIV

Analysis of Variance for pH - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Ngay 0.340829 6 0.0568048 3.86 0.0027

B:Loai Ruou 1.22191 3 0.407303 27.68 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.907324 18 0.0504069 3.43 0.0002

RESIDUAL 0.824067 56 0.0147155

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

All F-ratios are based on the residual mean square error. Bảng 43 Kiểm định LSD thay đổi pH của các loại rượu trong quá trình lên men chính Multiple Range Tests for pH by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 21 3.61762 X

2 21 3.69714 X

3 21 3.86714 X

4 21 3.91238 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 44 Kiểm định LSD thay đổi pH theo thời gian lên men chính của các loại rượu

Multiple Range Tests for pH by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 12 3.675 X

3 12 3.72167 XX

4 12 3.73833 XX

5 12 3.76667 XXX

6 12 3.80333 XXX

7 12 3.83833 XX

1 12 3.87167 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại

rượu

Bảng 45 Phân tích phương sai thay đổi acid trong quá trình lên men của các loại rượu Analysis of Variance for Acid - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Ngay 7.23752 6 1.20625 67.30 0.0000

B:Loai Ruou 8.94721 3 2.9824 166.40 0.0000

INTERACTIONS

AB 3.22295 18 0.179053 9.99 0.0000

RESIDUAL 1.00367 56 0.0179228

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------



Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXV

Bảng 46 Kiểm định LSD thay đổi acid của các loại rượu trong quá trình lên men chính Multiple Range Tests for Acid by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 21 1.44557 X

2 21 1.92371 X

3 21 2.224 X

4 21 2.26076 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 47 Kiểm định LSD thay đổi acid theo thời gian lên men chính của các loại rượu Multiple Range Tests for Acid by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 12 1.39008 X

2 12 1.71508 X

3 12 1.90275 X

4 12 2.12342 X

5 12 2.134 X

6 12 2.20975 X

7 12 2.2695 X

-------------------------------------------------------------------------------- 4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại

rượu

Bảng 48 Phân tích phương sai thay đổi ester trong quá trình lên men của các loại rượu Analysis of Variance for ester1 - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Loai Ruou 0.12557 3 0.0418567 19.51 0.0000

B:Ngay 0.365078 6 0.0608463 28.35 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.133491 18 0.00741619 3.46 0.0002

RESIDUAL 0.12017 56 0.0021459

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

All F-ratios are based on the residual mean square error. Bảng 49 Kiểm định LSD thay đổi ester của các loại rượu trong quá trình lên men chính Multiple Range Tests for ester1 by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

4 21 0.648381 X

3 21 0.672014 XX

2 21 0.684324 X

1 21 0.7524 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 50 Kiểm định LSD thay đổi ester theo thời gian lên men chính của các loại rượu


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVI

Multiple Range Tests for ester1 by Ngay

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

7 12 0.573467 X

6 12 0.6292 X

5 12 0.660733 X

4 12 0.708875 X

3 12 0.728175 XX

2 12 0.757858 XX

1 12 0.76665 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6.8 Kết quả thay đổi chất lượng sản phẩm rượu vang nếp trong thời gian ổn định

Bảng 51 Phân tích phương sai sự thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 1 tháng

ANOVA Table for Do Brix by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.82 3 0.273333 9.11 0.0292

Within groups 0.12 4 0.03

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.94 7 Bảng 52 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 1 tháng Multiple Range Tests for Do Brix by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------


Loai ruou Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 2 4.8 X

3 2 5.1 XX

4 2 5.5 XX

2 2 5.6 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 53 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 1 tháng ANOVA Table for Duong khu by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.638261 3 0.212754 1564.37 0.0000

Within groups 0.000544 4 0.000136

----------------------------------------------------------------------------- Bảng 54 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 1 tháng Multiple Range Tests for Duong khu by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.098 X

3 2 0.564 X

4 2 0.58 X

2 2 0.889 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 55 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 1 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVII

ANOVA Table for Do ruou by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 2.34375 3 0.78125 2.78 0.1744


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3.46875 7 Bảng 56 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 1 tháng Multiple Range Tests for Do ruou by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 10.5 X

2 2 11.25 XX

3 2 11.5 XX

4 2 12.0 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 57 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 1 tháng ANOVA Table for pH by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0829 3 0.0276333 6.54 0.0506

Within groups 0.0169 4 0.004225

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0998 7 Bảng 58 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 1 tháng Multiple Range Tests for pH by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 3.61 X

2 2 3.755 XX

4 2 3.845 X

3 2 3.87 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 59 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 1 tháng ANOVA Table for Acid by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.08406 3 0.02802 3.04 0.1552

Within groups 0.036828 4 0.009207

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.120888 7 Bảng 60 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 1 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVIII

Multiple Range Tests for Acid by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 2.121 X

3 2 2.187 X

2 2 2.334 X

4 2 2.37 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 61 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 1 tháng ANOVA Table for Ester by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0522236 3 0.0174079 21.16 0.0065

Within groups 0.0032912 4 0.0008228

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0555148 7 Bảng 62 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 1 tháng

Multiple Range Tests for Ester by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.44 X

3 2 0.6204 X

2 2 0.6248 X

4 2 0.6336 X

--------------------------------------------------------------------------------


ANOVA Table for Do Brix by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.855 3 0.285 57.00 0.0010


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.875 7 Bảng 64 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 2 tháng Multiple Range Tests for Do Brix by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------


Loai Ruou Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 2 4.6 X

3 2 5.0 X

2 2 5.2 X

4 2 5.5 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 65 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 2 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIX

ANOVA Table for Duong Khu by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.646994 3 0.215665 1684.88 0.0000

Within groups 0.000512 4 0.000128

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.647506 7 Bảng 66 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 2 tháng Multiple Range Tests for Duong Khu by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.093 X

3 2 0.564 X

4 2 0.58 X

2 2 0.889 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 67 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 2 tháng ANOVA Table for Do ruou by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 3.625 3 1.20833 19.33 0.0076


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3.875 7

Bảng 68 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 2 tháng Multiple Range Tests for Do ruou by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 10.25 X

3 2 11.5 X

2 2 11.75 X

4 2 12.0 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 69 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 2 tháng ANOVA Table for pH by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.02465 3 0.00821667 0.61 0.6421

Within groups 0.0537 4 0.013425

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.07835 7 Bảng 70 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 2 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXX

Multiple Range Tests for pH by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 3.71 X

2 2 3.76 X

3 2 3.835 X

4 2 3.845 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 71 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 2 tháng ANOVA Table for Acid by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0765574 3 0.0255191 65.75 0.0007

Within groups 0.0015525 4 0.000388125

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0781099 7 Bảng 72 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 2 tháng Multiple Range Tests for Acid by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 2.103 X

3 2 2.229 X

2 2 2.3265 X

4 2 2.352 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 73 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 2 tháng ANOVA Table for Ester by Loai Ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0475167 3 0.0158389 935.00 0.0000

Within groups 0.00006776 4 0.00001694

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0475845 7 Bảng 74 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 2 tháng Multiple Range Tests for Ester by Loai Ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.4642 X

2 2 0.6226 X

3 2 0.6358 X

4 2 0.66 X

--------------------------------------------------------------------------------



Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXI

ANOVA Table for Brix by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.7 3 0.233333


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.7 7 Bảng 76 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 3 tháng Multiple Range Tests for Brix by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 4.6 X

3 2 5.0 X

2 2 5.2 X

4 2 5.4 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 77 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 3 tháng ANOVA Table for DuongKhu by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.646994 3 0.215665 1684.88 0.0000

Within groups 0.000512 4 0.000128

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.647506 7 Bảng 78 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 3 tháng Multiple Range Tests for DuongKhu by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.093 X

3 2 0.564 X

4 2 0.58 X

2 2 0.889 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 79 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 3 tháng ANOVA Table for Do ruou by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 2.75 3 0.916667 14.67 0.0127


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3.0 7 Bảng 80 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 3 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXII

Multiple Range Tests for Do ruou by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 10.5 X

3 2 11.75 X

2 2 11.75 X

4 2 12.0 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 81 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 3 tháng ANOVA Table for pH by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0524375 3 0.0174792 3.10 0.1515

Within groups 0.02255 4 0.0056375

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0749875 7

Bảng 82 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 3 tháng Multiple Range Tests for pH by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 3.655 X

2 2 3.775 X

4 2 3.845 X

3 2 3.86 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 83 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 3 tháng ANOVA Table for Acid by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.102294 3 0.034098 15.03 0.0121

Within groups 0.009072 4 0.002268

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.111366 7 Bảng 84 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 3 tháng Multiple Range Tests for Acid by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 2.04 X

3 2 2.214 X

2 2 2.304 X

4 2 2.328 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 85 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 3 tháng


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXIII

ANOVA Table for Ester by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0457162 3 0.0152387 370.41 0.0000

Within groups 0.00016456 4 0.00004114

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.0458808 7 Bảng 86 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 3 tháng Multiple Range Tests for Ester by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 2 0.4708 X

2 2 0.6292 X

3 2 0.638 X

4 2 0.6622 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp

Bảng 87 Phân tích phương sai độ trong và màu sắc của các loại rượu nếp ANOVA Table for Dotrongvamausac by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.2825 3 0.0941667 9.42 0.0053


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.3625 11 Bảng 88 Kiểm định LSD độ trong độ trong và màu sắc của các loại rượu nếp Multiple Range Tests for Dotrongvamausac by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 4.26667 X

2 3 4.56667 X

3 3 4.6 X

4 3 4.66667 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 89 Phân tích phương sai về mùi của các loại rượu nếp ANOVA Table for Mui by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 1.89583 3 0.631944 15.17 0.0012

Within groups 0.333333 8 0.0416667

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 2.22917 11 Bảng 90 Kiểm định LSD về mùi của các loại rượu nếp


Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXIV

Multiple Range Tests for Mui by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 2.96667 X

3 3 3.3 X

4 3 3.8 X

1 3 3.96667 X

-------------------------------------------------------------------------------- Bảng 91 Phân tích phương sai về vị của các loại rượu nếp ANOVA Table for Vi by Loai ruou


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 1.16333 3 0.387778 33.24 0.0001

Within groups 0.0933333 8 0.0116667

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 1.25667 11 Bảng 92 Kiểm định LSD về vị của các loại rượu nếp Multiple Range Tests for Vi by Loai ruou

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 3.1 X

3 3 3.33333 X

1 3 3.8 X

4 3 3.83333 X

--------------------------------------------------------------------------------

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ …

Documents

Transcript of NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ …