ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lê Thị Ngọc Quỳnh

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA

PROTEIN GIÀU METHIONINE

TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng

PGS. TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Tiến Dũng và PGS.TS.

Nguyễn Quang Huy, những người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt

quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường.

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên tại

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền

Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.

Cuối cùng, nhưng không kém phần quan trọng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và

bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong thời gian

qua.

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu

protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide

reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên

Lê Thị Ngọc Quỳnh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học .................................................................. 9

Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi. ....................................... 12

Bảng 1.3. Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật ............................. 17

Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu. ................................ 23

Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu. ............................................ 24

Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen

đáp ứng với điều kiện bất lợi ................................................................................... 27

Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN .. 31

Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp ................... 35

Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao ...................... 38

Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng

phiên mã với điều kiện bất lợi.................................................................................. 41

Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP..................... 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine ........................................................... 4

Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met ................................... 13

Hình 1.3. Phản ứng khử MetO về Met của các Msr ................................................. 16

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu .................................... 25

Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của

Arabidopsis .............................................................................................................. 31

Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học. ............ 32

Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào .............. 33

Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử ..................... 33

Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO .................................................................. 34

Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm Blast2GO ............................................................................................... 36

Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm

gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán ........................................... 37

Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau ...................... 44

Hình 3.9. Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A. môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh

hygromycin 15mg/l, B. môi trường ½ MS đặc ......................................................... 45

Hình 3.10. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch ........ 46

Hình 3.11. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất ................... 48

Hình 3.12. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trường ½ MS ......... 50

Hình 3.13. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. . .......... 51

Hình 3.14. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. ............ 52

Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1........ 54

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt,

kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ABA Abscisic acid Axit abscisic

ABRE ABA responsive element Yếu tố đáp ứng ABA

AtMRP Arabidopsis thaliana

Methionine-rich protein

Protein giàu Methionin trên

Arabidopsis thaliana

ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat

bHLH basic Helix loop helix Cấu trúc xoắn vòng xoắn

bZIP Basic region-leucine zipper Khóa kéo cơ bản vùng leucine

CELLO subCELlular LOcalization

predictor

Dự đoán vị trí cư trú trong tế

bào

CgS Cystathionine gamma-

synthase Cystathionin gamma-synthaza

cs Cộng sự

FOX Full-length cDNA Over-

eXpressing

Biểu hiện quá mức cDNA

hoàn chỉnh

ICEr2 Induction of CBF

Expression region 2

Vùng 2 biểu hiện cảm ứng bởi

CBF

Met Methionine Methionin

MetO Methionine sulfoxide Methionin sufoxit

MetO2 Methionine sulfone Methionin sulfone

MRP Methionine-rich protein Protein giàu methionin

MS Murashige & Skoog Môi trường MS

Msr Methionine sulfoxide

reductase Methionin sulfoxit reductaza

OPH O-phosphohomoserine O-phosphohomoserine

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PEL Pseudo-Etiolation in Light Sự giả vàng úa dưới ánh sáng

PSORT Protein Subcellular

lOcalization pRedicTion

Dự đoán vị trí cư trú của

protein trong tế bào

RBC1 RIKEN Bioresource Center Dòng cây chuyển gen từ TT

Tài nguyên Sinh học RIKEN

ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy phản ứng

RSRE Rapid Stress Response

Element

Yếu tố đáp ứng nhanh với điều

kiện lạnh

SAM S - Adenosyl Methionine S - Adenosyl Methionine

TS Threonine synthase Threonine synthaza

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

Chương 1- TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

1.1. Methionine và protein giàu Methionine .............................................................. 2

1.1.1. Tổng quan chung về Methionine................................................................... 2

1.1.2. Các protein giàu Methionine ......................................................................... 5

1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine ............................................ 7

1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng ................ 7

1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng ......................... 12

1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine ..................................................... 15

1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy

phản ứng.................................................................................................................. 19

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 19

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam............................................................... 21

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................ 23

2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 23

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 23

2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................... 23

2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................... 24

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 24

2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học ...................................................... 24

2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm .................................................... 28

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 30

3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP ............................................... 30

3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis .............. 30

3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện

thường và điều kiện bất lợi ................................................................................... 37

3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng

điều kiện bất lợi.................................................................................................... 41

3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen At3G55240

(dòng RBC1) ........................................................................................................... 44

3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen ................... 44

3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen .............................................. 45

3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi ....... 49

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 59

Tài liệu tiếng Việt .................................................................................................... 59

Tài liệu tiếng Anh .................................................................................................... 59

PHỤ LỤC................................................................................................................... i

1

MỞ ĐẦU

Ở thực vật, sự hình thành và loại bỏ các dạng oxy phản ứng (ROS) được kiểm

soát chặt chẽ thông qua con đường dẫn truyền tín hiệu. Tuy nhiên, trong tình trạng

môi trường bất lợi, nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột do mất kiểm soát, gây

ra tổn thương cho các chất phân tử lớn trong tế bào như lipit, protein, axit nucleic dẫn

đến giảm tuổi thọ hoặc sức sống của sinh vật.

Các dạng oxy phản ứng ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng của tế bào thông qua

nhiều quá trình khác nhau, trong đó bao gồm cả oxy hóa Methionine (Met), một axit

amin chứa lưu huỳnh có mặt trong phân tử protein, tạo thành Met sulfoxide (MetO).

Đây là một trong những nguyên nhân gây mất hoạt tính, mất đi khả năng điều hòa

trao đổi chất của protein, dẫn đến làm giảm sức đề kháng, giảm sức sống của cây

trồng. Trong cơ thể sinh vật, MetO được sửa chữa bằng enzyme Methionine sulfoxide

reductase (Msr). Quá trình sửa chữa này tạo ra những tác động tích cực, đặc biệt là

tăng khả năng đề kháng cao, chống lại sự oxy hóa gây ra bởi các điều kiện bất lợi từ

môi trường trên thực vật.

Nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và sửa chữa MetO thông qua những hiểu

biết về các protein giàu Met là đích tác động của Msr sẽ cho phép tiếp cận vấn đề

này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu

với các điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, các protein giàu Met hiện chưa được công bố

một cách hệ thống ở cả những nghiên cứu trong và ngoài nước. Xuất phát từ những

lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine

trên cây Arabidopsis thaliana”.

Luận văn nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein

mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide

reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

tài trợ.

2

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. Methionine và protein giàu Methionine

1.1.1. Tổng quan chung về Methionine

Methionine (Met) là một α – axit amin chứa lưu huỳnh, được sử dụng trong

nhiều con đường chuyển hóa tế bào như thành phần cấu tạo nên protein, bộ ba mở

đầu (AUG) mã hóa cho tín hiệu bắt đầu quá trình sinh tổng hợp chuỗi polypeptide.

Ngoài ra Met đóng vai trò như một phân tử tham gia vào quá trình điều hòa thông

qua dạng dẫn xuất là S - Adenosyl Methionine (SAM) [40]. SAM đóng vai trò chìa

khóa cho nhiều con đường chuyển hóa khác nhau thông qua việc cung cấp nhóm

methyl (-CH3) trong tế bào. Bên cạnh đó, SAM cũng là tiền chất cho các hợp chất

chuyển hóa như: ethylene (CH2=CH2) - hormone quan trọng liên quan đến sự kiểm

soát của nhiều quá trình ở thực vật như làm chín và già hóa, vitamin B1, 3-

dimethylsulphoniopropionate (chất bảo vệ thẩm thấu, giúp thực vật chống lại những

điều kiện bất lợi về thẩm thấu), và đóng vai trò như là nguồn sulfur của khí quyển:

dimethylsulphide [8]. SAM là hợp chất cung cấp nhóm propyl amin cho quá trình

sinh tổng hợp các polyamine, spermidine, spermine, những chất đóng vai trò quyết

định cho quá trình phát triển của thực vật bao gồm sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào,

tế bào chết theo chương trình (apoptosis), cân bằng nội môi và điều hòa biểu hiện gen

[7]. Dẫn xuất của Met, S-methylmethionine, được sử dụng như phân tử vận chuyển

chính để giảm lượng sulfur trong một số loài động vật, đây cũng là hợp chất liên quan

đến việc hình thành dạng lưu động và dạng dự trữ của Met [14].

Met là một axit amin thiết yếu, được cung cấp thông qua thức ăn của động vật

không nhai lại. Động vật có vú nói chung và con người nói riêng chỉ có thể tổng hợp

ra khoảng một nửa số axit amin trong tổng số 20 axit amin cơ bản cấu tạo nên protein.

Do đó, những axit amin không thể tổng hợp được cần phải được bổ sung qua chế độ

ăn uống. Cây trồng phổ biến như ngũ cốc (lúa, gạo...) và các loại đậu thường có hàm

lượng Met thấp [40]. Ở các nước đang phát triển, cải thiện chất lượng dinh dưỡng là

cách để giải quyết nhiều vấn đề khi mà thức ăn có nguồn gốc từ thực vật là nguồn

3

cung cấp protein chủ yếu cho con người cũng như cho gia súc và gia cầm. Để giải

quyết nhu cầu cung cấp các axit amin thiết yếu trong thức ăn chăn nuôi, các phụ gia

có thể được thêm vào hoặc là sử dụng đa dạng nguồn thực vật. Do đó, nâng cao hàm

lượng các axit amin thiết yếu trong cây trồng nông nghiệp là mong muốn của nhiều

nhà nghiên cứu, người chăn nuôi và người tiêu dùng [29].

Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như

lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate. Aspartate kinase

là enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine,

threonine, Met và isoleucine. Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate

bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate [77]. Thông thường, có ít

nhất hai dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật. β-aspartyl phosphate sẽ

được chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc

tác tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase. Trong

vi khuẩn và nấm, homoserine là điểm trung gian tạo thành threonine và Met [77]. Tuy

nhiên, trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O-

phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS)

và cystathionine gamma-synthase (CgS). OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành

threonine bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành

Met: phản ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành

homocysteine và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-

lyase và homocysteine methyltransferase [40] (Hình 1.1). Cuối cùng, chỉ có khoảng

20% Met được sử dụng làm thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ

được biến đổi để tạo thành SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh

tổng hợp Met [32].

4

Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine [40]

Việc tạo cây trồng biến đổi gen tác động vào hoạt động của các enzyme đã

giúp tăng cường hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp các amino axit chứa sulfur [73].

Các nghiên cứu hiện nay đều khẳng định rằng có thể kiểm soát quá trình sinh tổng

hợp Met trong thực vật thông qua mức độ cạnh tranh giữa CgS và TS với cơ chất

chung của chúng là OPH [10, 40, 93]. Khi hoạt động của TS giảm: thể đột biến

Arabidopsis (mto2) thể hiện hoạt tính của enzyme TS thấp, Met tự do được tạo thành

5

trong lá non tăng gấp 20 lần, kèm theo giảm 6% lượng threonine so với đối chứng,

nhưng không có sự khác biệt ở cây trưởng thành [10]. Kết quả này khẳng định rằng,

cây Arabidopsis non điều hòa sinh tổng hợp Met thông qua tương tác qua lại giữa

CgS và TS [10]. Trên khoai tây (Solanum tuberosum), Zeh và cs đã sử dụng RNA đối

mã (RNA antisense) của TS dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S. Kết quả cho

thấy các dòng chuyển gen có hoạt tính của TS giảm xuống 6%, đồng thời giảm 45%

mức độ threonine, trong khi mức độ của Met tăng lên gấp 239 lần so với cây không

chuyển gen. Kết quả này đã tái khẳng định tỉ lệ enzyme TS đóng vai trò là điểm kiểm

soát chính trong quá trình sinh tổng hợp Met trong khoai tây. Điều này góp phần xây

dựng chiến lược tăng cường hàm lượng Met và cải thiện chất lượng protein trong

thực vật [93].

1.1.2. Các protein giàu Methionine

Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín

hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA.

Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N

(N-terminal) trong chuỗi peptide. Tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá

trình cải biến protein sau dịch mã. Trung bình một protein chứa khoảng 1,5% gốc

Met trong toàn bộ chuỗi polypeptide [26]. Trong Escherichia coli, hàm lượng Met

trung bình khoảng từ 1-3% (các protein giàu Met nhất: nhân tố kéo dài chuỗi

polypeptide TU: 2,8%; các protein liên quan đến các điều kiện bất lợi oxy hóa KatE:

1,3%; HypT: 2%; MsrA: 3,3%) [26]. Giá trị Met tương tự cũng đã được công bố với

các protein nấm men và protein ở động vật [26].

Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm

trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của Brazil [5], hạt hướng

dương [50], ngô [49, 66], và lúa [60]. Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm

lượng Met trong khoảng 11-22% [6]. Prolamin từ ngô (Zea mays) được gọi là zein,

trong đó chiếm số lượng lớn là α-zein, các nhóm nhỏ hơn là β, γ, δ-zein [22]. β-zein

và δ-zein là MRP với các gốc Met tập trung chủ yếu gần đầu C của phân tử . Trong

6

đó, β-zein trong ngô có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kDa với 160 axit amin, với

18 gốc Met và 7 gốc cysteine [76]. δ-zein được hình thành từ hai tiểu phần có trọng

lượng phân tử khoảng 14,4 kDa và 21,1 kDa. Cả hai tiểu phần này đều giàu Met: tiểu

phần 21,2 kDa có chứa 26,9% Met, tiểu phần 14,4 kDa có chứa 22,8% Met [76]. Phân

tử β-zein do một gen quy định trong khi đó δ-zein do 2 gen khác nhau mã hóa [76].

Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá

kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt

là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các

axit amin chứa sulfur như Met. 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18%

methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7]. Protein 2S

albumin cũng được biểu hiện trong một số loài thực vật như thuốc lá, hạt cải dầu và

đậu tương [7]. Hạt của một số loài đậu đã được tăng gấp đôi hàm lượng Met trong

các protein do chuyển gen 2S albumin từ hoa hướng dương. Tuy nhiên, việc cải thiện

hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met

cần thiết trong thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, protein 2S albumin từ quả hạnh nhân

Brazil và hoa hướng dương đã được biết là nguyên nhân gây dị ứng trong một số

trường hợp [47]. Chính vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu protein giàu Met còn là

cơ sở để ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện hàm lượng Met ở cây trồng.

Năm 2000, Chakraborty và cs đã tinh sạch được protein mã hóa bởi gen AmA1

tách chiết từ hạt rau dền đỏ (Amaranthus hypochondriacus) [20]. Protein AmA1 có

hàm lượng cân bằng các axit amin thiết yếu gồm lysine, tryptophan, tyrosine, và axit

amin chứa lưu huỳnh. Đặc biệt là AmA1 không gây dị ứng do không tạo ra phản ứng

với IgE. Biểu hiện quá mức gen này trên khoai tây làm tăng hàm lượng Met 3-7 lần

so với kiểu dại [20].

Năm 2005, Izquierdo và Godwin đã tách dòng trình tự cDNA hoàn chỉnh mã

hóa cho δ-Kafirin, protein dự trữ giàu Met có mặt trong hạt cây cao lương (Sorghum

bicolor L.) và biểu hiện thành công. Protein δ-Kafirin có trọng lượng phân tử khoảng

16 kDa với 147 axit amin trong đó 17% là Met [44]. Sử dụng PCR phiên mã ngược

và Realtime PCR cho thấy δ-kafirin chỉ biểu hiện ở những hạt đang trong giai đoạn

7

phát triển [44]. So sánh trình tự DNA cho thấy gen mã hóa cho δ-Kafirin có độ tương

đồng cao với gen mã hóa cho tiểu phần 14,4 kDa của δ-zein ngoại trừ thiếu đi một

phần quy định vùng giàu Met. Do vậy, hàm lượng Met có mặt trong δ-Kafirin thấp

hơn trong δ-zein [76].

Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự

cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein. Met được tìm thấy

nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các

protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép. Tuy nhiên, đối với các protein có

chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide

(MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng [15]. Do đó, MRP được xem như

protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài

sinh vật khác nhau.

1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine

1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng

Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất tối ưu của thực vật chịu ảnh

hưởng nghiêm trọng bởi điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong bối cảnh khí hậu trái đất

có nhiều thay đổi bất thường như hiện nay. Gần đây, tổ chức Nông Lương Liên Hợp

Quốc (FAO) đã chỉ ra rằng, điều kiện bất lợi từ môi trường sống ảnh hưởng đến 37%

năng suất cây trồng trên toàn thế giới [46]. Hạn hán và mặn hóa là nhân tố bất lợi

chính mà cây trồng gặp phải. Quá trình sống của thực vật và tạo sản phẩm thứ cấp

phụ thuộc chủ yếu vào nước. Gần 20% diện tích đất trên toàn thế giới đang bị thiếu

nước cho sản xuất cây trồng và con số này sẽ ngày càng tăng lên khi diện tích đất

trồng ngày càng bị sa mạc hóa [17]. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng

các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật,

dẫn đến quá trình sinh trưởng chậm lại. Do khí khổng đóng nên lượng CO2 trong lá

bị giảm xuống, ức chế quá trình cố định carbon nhưng lại làm tăng lượng các dạng

oxy phản ứng (ROS) có mặt trong thực vật, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa [38].

Đất nhiễm mặn cũng gây ảnh hưởng lớn đến cây trồng, làm giảm đến 23% năng suất

8

cây trồng trên toàn thế giới [86]. Tăng cường nồng độ muối trong đất làm giảm khả

năng hấp thụ nước của thực vật. Khi một lượng lớn Na+ và Cl- được đưa vào cây

thông qua rễ, cả hai ion Na+ và Cl- đều gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển do

giảm quá trình trao đổi chất và giảm hiệu suất quang hợp [25].

Do quá trình công nghiệp hóa tăng nên tình trạng đất bị nhiễm ion kim loại

nặng cũng là một vấn đề đáng được đề cập đến. Các kim loại nặng cadmium (Cd),

bạc, thủy ngân xâm nhập vào các hệ sinh thái từ nhiều nguồn khác nhau: khói bụi,

nước thải của các xí nghiệp sản xuất chì, thiếc, sắt, thép, nước thải trong ngành đúc

điện, trong phân lân bón cho cây trồng, trong các nhiên liệu diesel [34]. Cd dễ dàng

được cây hấp thụ và chuyển lên mạch xylem của lá, gây ức chế tăng trưởng, ảnh

hưởng đến khả năng quang hợp, sự hấp thu các hợp chất vi lượng và đa lượng dẫn

đến giảm năng suất cây trồng [11]. Điều quan trọng là Cd sẽ đi vào chuỗi thức ăn và

gây ra mối đe dọa cho sức khỏe con người cũng như các nhóm động vật khác [21].

Kim loại này có thể gây độc tế bào theo cách trực tiếp hay gián tiếp và có thể được

giải thích thông qua cấu trúc hóa học của nó. Cd có thể liên kết với nhóm -SH của

các protein và enzyme, làm cho protein, enzyme bị mất đi cấu hình, không hoạt động

được chức năng, đặc biệt là với nhóm enzyme làm nhiệm vụ thu dọn ROS [24]. Bên

cạnh đó, cơ chế gây độc quan trọng của cadmium với tế bào thực vật do sự tương

đồng về mặt hóa học của Cd2+ và các ion kim loại liên kết với vị trí hoạt động của

enzyme hay các yếu tố truyền tin. Cd2+ ảnh hưởng đến cơ chế nội cân bằng của các

ion kim loại thiết yếu và các ion kim loại hóa trị 2 như Fe và Zn, giải phóng ion Fe/Cu

tự do gây kích thích hiệu ứng Fenton gây ra ROS, tăng các quá trình tổn thương do

oxy hóa [24]. Chính vì vậy, Cd cũng như các ion kim loại nặng khác, dẫn đến điều

kiện bất lợi do oxy hóa và tăng cường hàm lượng ROS trong thực vật bằng cách gây

rối loạn quá trình loại bỏ ROS của các chất chống oxy hóa [24].

Paraquat (1,1 dimethyl-4,4’-bipyridynium dichloride) là thuốc diệt cỏ dạng

bipyridinium, lần đầu tiên được công nhận hoạt tính diệt thực vật vào năm 1955 [39].

Cho đến nay, paraquat vẫn giữ được tầm quan trọng của nó bên cạnh các loại thuốc

diệt cỏ khác có nguồn gốc từ glyphosate và glufosinate. Paraquat là thuốc diệt cỏ có

9

hoạt lực nhanh, làm đảo chiều chiều dòng điện tử của quang hệ I (PSI) xảy ra trong lục

lạp. Kết quả là gây nên sự tích lũy superoxide trong lục lạp [39]. Superoxide được tạo

ra một cách liên tục và nhanh chóng sẽ lấn át các cơ chế bảo vệ nội sinh của thực vật

và gây ra hàng loạt ảnh hưởng tiêu cực đến thực vật. Paraquat có thể dễ dàng thâm

nhập xuyên qua lớp biểu bì lá, làm giảm khả năng quang hợp một cách nhanh chóng,

gây mất sức trương và làm vỡ màng tế bào. Các dấu hiệu này được nhận thấy chỉ sau

vài giờ xử lý với paraquat trong điều kiện ánh sáng liên tục và cuối cùng là các mẫu

mô bị mất nước và mất màu hoàn toàn [39]. Lá cây Arabidopsis thaliana 3 tuần tuổi

kiểu dại được ngâm trong dung dịch paraquat 4 µM. Sau 2 ngày thí nghiệm dưới điều

kiện ánh sáng liên tục, lá cây bị mất màu hoàn toàn do paraquat là hợp chất sản sinh

ROS làm phân hủy diệp lục và phá vỡ các tế bào [91].

Các dạng oxy phản ứng (ROS) là khái niệm để chỉ các dẫn xuất của oxy có khả

năng oxy hóa mạnh. ROS được chia thành hai nhóm: nhóm các gốc tự do (có chứa

electron liên kết chưa cặp đôi) và nhóm các dẫn xuất không phải gốc tự do. Các ROS

không phải gốc tự do dễ dàng chuyển hóa thành các gốc tự do trong quá trình phản ứng

oxy hóa. Một số ROS là gốc tự do điển hình bao gồm hydroxyl, superoxide và nitric

oxide; trong khi oxy mức đơn và peroxynitrile là các ROS không phải gốc tự do thường

gặp trong các quá trình sinh hóa (Bảng 1.1). [19].

Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học [19]

ROS Ký hiệu

Gốc hydroxyl ∙OH

Gốc superoxide ∙O2-

Oxy mức đơn 1O2

Nitric Oxide ∙NO

Peroxynitrite ONOO-

ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trò quan trọng

trong liên lạc tế bào và cân bằng nội môi. ROS được tạo ra ở nhiều bào quan khác nhau

10

trong tế bào, những nơi xảy ra chuỗi dẫn truyền điện tử như lục lạp, ti thể, peroxisome

[31], có khoảng 1-2% oxy trong các mô tế bào thực vật sẽ tạo thành ROS [31]. Dưới

điều kiện ánh sáng, lục lạp và peroxisome là nơi hình thành đa số ROS có mặt trong

các mô, tế bào thực vật, nhưng trong điều kiện không có ánh sáng thì ty thể lại là bào

quan chính tạo nên ROS [31]. Khi được duy trì ở nồng độ thấp, ROS đóng vai trò như

tín hiệu phân tử để kiểm soát quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật, kích thích

các con đường giúp cây chống chịu lại với các điều kiện bất lợi, tín hiệu cho quá trình

già hóa và đưa tế bào vào con đường chết theo chu trình [13].

Tuy nhiên, khi gặp điều kiện sống bất lợi từ môi trường (như hạn hán, lạnh,

nóng, nấm bệnh...), nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột, có thể làm tổn

thương các cấu trúc tế bào do tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn

điện, phân giải thành phần phospholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết

các tế bào, tổn thương các cơ quan [31]. Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng

đem lại nhiều hậu quả nghiêm trọng. Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các

vai trò phá hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng

giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian [31].

Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao

gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt trong bào tương,

kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị

kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học. ROS được sinh ra ở các bào

quan khác nhau và dẫn đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy

thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào. Các tín hiệu thông

qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay

phosphatase. Cuối cùng, sự thay đổi trong biểu hiện gen xảy ra nhờ hoạt động của

các nhân tố phiên mã và các yếu tố có mặt trên promoter. Vùng promoter của một

số gen cảm ứng bởi điều kiện bất lợi chứa yếu tố cis [90]. Các nhân tố phiên mã

khác nhau tương tác với yếu tố cis và hình thành phức hệ khởi đầu quá trình phiên

mã. Phức hệ khởi đầu phiên mã hoạt hóa RNA polymerase để bắt đầu quá trình

phiên mã của gen đáp ứng khi bị tổn thương [90]. Axit abscisic (ABA) đóng vai

11

trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi như hạn hán và

chịu mặn, cũng như đóng vai trò trong quá trình nảy mầm và trạng thái ngủ của

hạt [25]. Vùng promoter của một số gen cảm ứng bởi ABA khi so sánh với các

promoter của gen khác thì được nhận thấy là thường chứa vùng trình tự bảo toàn

ACGTGGC, được gọi là yếu tố đáp ứng với ABA (ABRE) [2]. ABRE đầu tiên

được tìm thấy trên gen Em của lúa mì, có chức năng chính trong quá trình phát

sinh phôi của hạt, và gen RAB16 của lúa gạo, đóng vai trò trong quá trình trưởng

thành của hạt và các mẫu mô thực vật bị mất nước [90]. ABRE là yếu tố cis chính

có mặt trong các gen cảm ứng với ABA [2]. Bên cạnh đó, các yếu tố điều hòa trên

promoter của những gen phụ thuộc vào phản ứng với ABA còn chứa trình tự nhận

biết cho các protein MYB và MYC. Trình tự DNA đặc hiệu MYC và MYB là

CACATG (MYCR) và (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C (MYBR), được phát hiện trên

vùng promoter của gen RD22. Các nhân tố phiên mã AtMYC và AtMYB bám vào

trình tự DNA đặc hiệu MYCR và MYBR và hoạt hoá biểu hiện gen chức năng

trong điều kiện mất nước [2]. Trong khi ABRE, MYBR, MYCR là trình tự cis cảm

ứng điều kiện khô hạn thì ICEr2 – cảm ứng biểu hiện CBF vùng 2 (Induction of

CBF Expression region 2) lại là yếu tố cis cảm ứng trong điều kiện lạnh [90]. Cuối

cùng, khi gây tổn thương cho mô lá A. thaliana bằng cách tạo ra các điều kiện cực

đoan, một số gen đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi đã được tìm thấy. Trên vùng

promoter của các gen phản ứng nhanh với điều kiện bất lợi, người ta đã tìm thấy

một yếu tố cis mới và được gọi là yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi

(RSRE - Rapid Stress Response Element) [12]. Các yếu tố cis tham gia điều hòa

biểu hiện gen trong điều kiện bất lợi được thể hiện qua Bảng 1.2.

12

Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi

Tên yếu tố

cis Trình tự

Nhân tố phiên

mã bám vào

yếu tố cis

Đáp ứng trong

điều kiện bất lợi

Tài liệu

tham

khảo

ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) bZIP Hạn hán, đáp ứng

phụ thuộc ABA [90]

MYBR (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYB Hạn hán, đáp ứng

phụ thuộc ABA [90]

MYCR CACATG bHLH Hạn hán, đáp ứng

phụ thuộc ABA [90]

ICEr2 ACTCCG Chưa biết Chịu lạnh [90]

RSRE CGCGTT CBF1, CBF2,

CBF3, TGA3,

CAMTA

Chịu lạnh, hạn

hán, bị côn trùng

và vi khuẩn tấn

công

[12]

Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu

huỳnh là Cys và Met. Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều

nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi

khác nhau đối với protein [23, 88]. Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan

tâm hơn. Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met

đã từng được công bố [45].

1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng

Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử

protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone

(MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy (Hình 1.2) [26]. MetO tồn tại với hai dạng

đồng phân quang học là methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R-

sulfoxide (Met-R-O). Ngược lại với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy

trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận

nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch .

13

Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met [26]

Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do

so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa

trong tế bào [70]. Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ

protein cũng như các đại phân tử khác. Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong

protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời. Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met

trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc

vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong

cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein. Shechter đã phát hiện

chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn

toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có

thể bị oxy hóa [74].

Glutamine synthetase có nguồn gốc từ Escherichia coli đã được sử dụng để

nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến các gốc Met. Kết quả cho thấy là những gốc Met

nằm trên bề mặt đều bị oxy hóa trong khi những gốc nằm trong phần lõi hầu như

không bị ảnh hưởng bởi H2O2. Trong tổng số 16 gốc Met có mặt trong glutamine

synthetase thì có đến 8 gốc bị oxy hóa nhưng hoạt tính của enzyme lại không hề bị

thay đổi [26]. Điều này được giải thích là do glutamine synthetase có các gốc Met ở

tập trung xung quanh trung tâm hoạt động của enzyme để bảo vệ chúng khỏi các dạng

14

oxy phản ứng. Do đó, Met không những có nhiệm vụ bảo vệ các axit amin khác mà

còn bảo vệ các protein tránh bị mất chức năng dưới tác động của ROS [26].

α-2 Macroglobulin là chất ức chế protease, hoạt động chủ yếu ở những vị trí

bị viêm nhiễm, là nơi rất dễ bị ROS tấn công [48]. Mỗi một tiểu phần α-2

macroglobulin có thể loại bỏ được ít nhất 10 mol dạng oxy hoạt động, tương ứng với

một lượng gốc Met chuyển hóa thành MetO [69]. Nếu dạng oxy phản ứng hoạt động

mạnh, sẽ dẫn đến quá trình oxy hóa gốc tryptophan và làm bất hoạt protease. Chính

vì vậy, Met đóng vai trò như “vệ sĩ phân tử” bảo vệ các gốc tryptophan đơn mang

tính chất quan trọng trong protein [48].

Các gốc Met trong protein thường được bố trí sao cho chúng tạo thành liên kết

kỵ nước với các axit amin mạch vòng như tryptophan, phenylalanine và tyrosine [87].

Liên kết này khá phổ biến và giúp ổn định cấu trúc phân tử protein với mỗi liên kết

chứa 1,0–1,5 kcal/mol, xấp xỉ bằng năng lượng của liên kết ion trong muối ăn NaCl

[87]. Các axit amin mạch vòng rất dễ bị tấn công bởi ROS, bởi vậy thiết lập tương

tác với các gốc Met là cách để chúng tránh khỏi sự tấn công bởi ROS. Tuy nhiên, quá

trình oxy hóa Met cũng sẽ phá vỡ các liên kết kỵ nước, do đó phá vỡ cấu trúc không

gian ba chiều của protein [48]. Ảnh hưởng của quá trình oxy hóa lên đặc tính của các

protein là rất khác nhau. Đối với một số enzyme, oxy hóa Met thành MetO hay thậm

chí là thay thế Met bằng các axit amin khác có thể chỉ có ảnh hưởng nhỏ đến hoạt

tính của enzyme nhưng cũng có thể dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, mất đi khả năng

điều hòa các quá trình trao đổi chất [79].

Khi nghiên cứu trên Arabidopsis thaliana, Gustavsson và cs đã nghiên cứu

ảnh hưởng của ROS trên Hsp21, protein sốc nhiệt có hoạt tính giống như chaperone.

Hsp21 có mặt ở lục lạp, với đầu C bảo thủ và đầu N biến đổi. Điều thú vị là đầu N lại

chứa những trình tự giàu Met có tính bảo thủ cao. Cấu trúc bậc 2 của chuỗi protein

này được dự đoán là do sự có mặt của trình tự giàu Met tạo nên chuỗi xoắn α lưỡng

cực do tất cả Met đều nằm về một bên của phân tử. Khi các gốc Met này bị oxy hóa

dẫn đến Hsp21 bị mất đi chức năng do cấu trúc không gian của phân tử protein bị phá

vỡ [35]. Sau đó, để nghiên cứu tầm quan trọng của các gốc Met có mặt trên phân tử,

15

thể đột biến Hsp21 trên Arabidopsis thaliana đã được tạo ra bằng cách thay thế tất cả

các gốc Met thành leucine. Nguyên nhân là do Met và leucine đều là các axit amin

kỵ nước, tương tự nhau về mặt cấu trúc nhưng khác nhau là leucine không có sulfur

do đó không bị ảnh hưởng bởi quá trình oxy hóa bởi ROS. Kết quả cho thấy là thể

đột biến Hsp21 không bị mất đi hoạt tính enzyme, nhưng mất đi khả năng kiểm soát

quá trình oxy hóa khử [36].

Calmodulin chứa trình tự giàu Met, là protein có bốn vị trí gắn với canxi riêng

biệt. Khi được gắn với canxi, calmodulin sẽ hoạt hóa nhiều protein tham gia vào các

chuỗi dẫn truyền tín hiệu tế bào như các nhân tố phiên mã, protein kinase,

phosphatase và các kênh vận chuyển ion [81]. Chuỗi Met có mặt trên phân tử đặc biệt

phù hợp với chức năng này do là chuỗi không phân nhánh, góc xoắn linh hoạt, có

phân tử lưu huỳnh phân cực nên ái lực van der Waal mạnh. Ái lực này sẽ bị giảm

đáng kể khi Met bị chuyển hóa thành MetO. Do đó các MRP có Met bị chuyển hóa

thành MetO dưới ảnh hưởng của ROS sẽ có cấu trúc bậc 2 chuyển từ dạng xoắn α

sang dạng gấp nếp β [35]. Đặc biệt là việc oxy hóa Met nằm gần đầu C dẫn đến việc

calmodium bị mất đi khả năng hoạt hóa Ca-ATPase trên màng tế bào chất [30]. Như

vậy, ROS làm thay đổi cấu trúc của protein do làm thay đổi cơ chế liên kết,

calmodulin bị giảm liên kết tạo chuỗi với Ca-ATPase trên màng tế bào chất, mất đi

khả năng hoạt hóa các enzyme tham gia vào chuỗi dẫn truyền tín hiệu [30]. Trong

sinh vật sống, MetO được sửa chữa thành Met bởi sự xúc tác của enzyme Methionine

sulfoxide reductase (Msr).

1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine

Trong suốt quá trình tiến hóa, thực vật đã sản sinh ra hệ thống kiểm soát và

điều hòa ROS một cách chặt chẽ. Đáng chú ý là 2 cơ chế liên quan đến vai trò của:

(i) Các chất chống oxy hóa nội bào không có hoạt tính enzyme (non‒enzymatic

antioxidant) gồm ascorbate, glutathione, tocopherol, flavonoids, alkaloids và

carotenoid. (ii) Hệ thống các enzyme loại bỏ ROS (enzymatic antioxidant) ở thực

vật gồm superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, methionine sulfoxide

16

reductase (Msr), peroxiredoxin và glutathione peroxidase [46]. Ở Arabidopsis

thaliana, có ít nhất 152 gen đã được biết đến, mã hóa cho các enzyme tham gia vào

quá trình sản sinh và loại bỏ ROS trong tế bào [46].

Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi,

chính vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng

như các enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met. Ngược lại với MetO2, MetO có

thể được chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr.

Msr đầu tiên đã được mô tả trong E.coli vào năm 1981 [16] và sau đó được biết đến

là MsrA. Hai mươi năm sau đó, MsrB cũng đã được phát hiện. Người ta thấy rằng,

MsrA tham gia quá trình khử Met-S-O trong khi MsrB khử Met-R-O về dạng Met

(Hình 1.3). MsrA có thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein

trong khi MsrB khử Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết

trong protein do ái lực thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do [55]. Cả MsrA và MsrB

đều là những enzyme có tính bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực

bao gồm cả tế bào người và hầu hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và

MsrB. MsrA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật

từ vi khuẩn [63] đến cây trồng [72] đến động vật có vú [63], trong đó có cả người

[51]. Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở E.coli, chỉ có tính đặc hiệu

trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả năng khử MetO liên kết

trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O). Đặc biệt, fRMsr chỉ được tìm thấy

trong một vài sinh vật đơn bào [26].

Hình 1.3. Phản ứng khử MetO về Met của các Msr

Protein

Protein

Protein

Protein

Methionine-S-Sulfoxide

Methionine-R-Sulfoxide

MetMet ROS

17

Arabidopsis thaliana chứa 5 gen mã hóa cho 5 protein MsrA khác nhau bao

gồm MsrA1, MsrA2, MsrA3 nằm trong bào tương, MsrA4 nằm trong lục lạp và MsrA5

với đích đến là các con đường tiết trong cơ thể [45]. Chín MsrB có mặt trong

Arabidopsis cũng có đích đến là các bào quan khác nhau; MsrB1 và B2 có mặt trong

lục lạp, MsrB3 đích đến là con đường tiết, trong khi 6 MsrB còn lại có mặt trong bào

tương của tế bào [45]. Phân tích biểu hiện của những gen này dựa vào kỹ thuật

microarray (vi dãy) cho thấy msrB1, msrB2 và msrB6 được biểu hiện chủ yếu ở lá trong

khi các msrB5, msrB7, msrB8 và msrB9 lại được tìm thấy chủ yếu trong rễ cây

Arabidopsis [56]. Các loài thực vật khác như các cây thuộc họ bạch dương có chứa 5

gen mã hóa cho MsrA và 4 gen mã hóa cho MsrB, ở lúa gồm 4 protein MsrA và 3

protein MsrB, trong khi ở động vật có vú số lượng Msr tổng số trung bình chỉ khoảng

4 gen mã hóa cho Msr (Bảng 1.3) [45].

Bảng 1.3. Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật [45]

Giới Tên sinh vật MsrA MsrB

Sinh vật nhân sơ quang

hợp

Anabaena sp. PCC 7120 2 1

Synechocystis sp. PCC 6803 2 1

Synechococcus sp. CC9311 2 2

Sinh vật nhân chuẩn

quang hợp

Arabidopsis thaliana 5 9

Populus trichocarpa (bạch dương) 5 4

Vitis vinifera (nho) 3 3

Oryza sativa (lúa gạo) 4 3

Physcomitrella patens (rêu) 5 3

Chlamydomonas reinhardtii (tảo) 5 3

Ostreococcus lucimarinus 3 3

Ostreococcus tauri 4 3

Synechocystis sp. PCC 6803 2 1

Synechococcus sp. CC9311 2 2

Sinh vật nhân sơ không

quang hợp Escherichia coli 1 1

Sinh vật nhân chuẩn

không quang hợp

Homo sapiens (loài người) 1 3

Drosophila melanogaster (Ruồi giấm) 1 1

Saccharomyces cerevisiae (Nấm men) 1 1

18

Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền để bất hoạt hay biểu hiện quá mức các

gen Msr đã chỉ ra 2 chức năng chính của chúng trong tế bào: bảo vệ tế bào chống

lại các điều kiện cực đoan do oxy hóa và điều hòa chu trình sống. Bất hoạt các gen

mã hóa cho MsrA làm tăng độ nhạy cảm của vi khuẩn, nấm men, giun tròn

(Caenorhabditis elegans), chuột và thực vật với các điều kiện bất lợi oxy hóa.

Ngược lại, tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa cho MsrA làm tăng khả năng

chống lại điều kiện bất lợi oxy hóa ở ruồi giấm (Drosophila), các tế bào động vật

có vú và thực vật [83]. MsrA2 có vai trò điều hòa quá trình phát triển của A. thaliana

dưới điều kiện bình thường. Khi gen mã hóa cho MsrA2 bị bất hoạt thì quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây bị chậm lại dưới điều kiện ngày ngắn, tuy nhiên

lại không bị ảnh hưởng dưới điều kiện ngày dài [26]. Enzyme MsrB7và MsrB8

trong bào tương của A. thaliana giúp cây chống lại những ảnh hưởng tiêu cực khi

bị xử lý với H2O2 và methyl viologen, là gốc hoạt động của paraquat một trong

những thuốc trừ cỏ được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [26, 56]. MsrB2 trong

một loài ớt (Capsicum annuum) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng lại mầm

bệnh [26]. Tuy nhiên, các protein đích của cả MsrA và MsrB trên thực vật vẫn chưa

được biết đến nhiều. Do vậy tác động của Msr này lên các quá trình đặc biệt của tế

bào vẫn chưa được làm rõ [56, 83].

Có thể thấy rằng, khử MetO thành Met với sự tham gia của enzyme Msr là

một quá trình được ghi nhận ở hầu hết các tế bào sinh vật trong sinh giới. Quá trình

này liên quan trực tiếp đến các vấn đề lão hóa, khả năng đề kháng của sinh vật đến

sự thay đổi của môi trường. Tuy nhiên trong điều kiện môi trường sống có nhiều bất

lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi

nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt độ thấp hoặc cao và những

tổn thương cơ học [9]. Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và

phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng.

19

1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy

phản ứng

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về sự oxy hóa Met bởi ROS trên các

phân tử MRP và quá trình sửa chữa bởi enzyme Msr đã được thực hiện khá công phu.

Từ năm 1989, Reddy và cs đã chỉ ra α-2-macroglobulin đóng vai trò như chất ức chế

protease và hoạt động tại những vị trí sưng tấy, nơi có khả năng bị tấn công cao bởi

ROS. Tại đó, mỗi tiểu phần của α-2-macroglobulin có khả năng thu dọn ít nhất 10

mole chất oxy hóa với lượng tương ứng chuyển hóa Met thành MetO. Nhưng nếu cứ

tiếp tục phải đối mặt với các tác nhân oxy hóa, tryptophan sẽ bị chịu tác dụng của

ROS, dẫn đến bất hoạt α-2-macroglobulin [68]. Năm 2002, Gustavsson và cs đã gây

sốc nhiệt nhẹ protein Hsp21 nằm trong lục lạp. Kết quả là protein này bị bất hoạt do

các Met trên bề mặt phân tử chuyển hóa thành MetO. Cuối cùng, protein lại được

hoạt hóa do tác dụng của Msr làm giảm lượng MetO [37].

Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng

được ghi nhận [18, 28, 46]. Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên

protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức

năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật [81]. Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa

Met với sự mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin [26] và sự mất chức năng của

protein này [26, 46, 78] cũng được ghi nhận.

Việc phát hiện một cách có hệ thống các protein có Met mẫn cảm với tác nhân

oxy hóa, sự oxy hóa Met cũng như sửa chữa bởi Msr đã được rất nhiều nhà khoa học

tập trung nghiên cứu. Các phương pháp xác định bao gồm khối phổ, sửa đổi các gốc

Met và MetO kết hợp với phân tích axit amin, dựa vào phân tích phóng xạ, sắc ký

lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp miễn dịch sử dụng các kháng thể đặc

hiệu với các dạng MetO [26].

Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải

protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung

20

tính (neutrophil). Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với

đầu dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ. Peptide được phát hiện tăng 16 Da

[71]. Đây là kết quả của quá trình oxy hóa Met thành MetO. Nhóm tác giả đã phát

hiện có khoảng 10-50% các gốc Met trong protein E.coli bị oxy hóa khi tiếp xúc với

HOCl hoặc bạch cầu phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm. Protein nằm ở vỏ tế bào có

mức độ mẫn cảm cao đối với sự oxy hóa Met, trong khi Met gắn trên các protein

thuộc tế bào chất và nội màng hầu như không bị oxy hóa [71]. Điều này cho thấy các

protein nội bào được bảo vệ trước tác dụng của HOCl. Tuy nhiên, đáng tiếc rằng

nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các protein và vị trí các

gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa.

Shechter và cs đã sử dụng phương pháp sửa đổi bằng hóa học để xác định các

gốc MetO khi vẫn có mặt gốc Met trong phân tử protein. Protein đã bị oxy hóa được

xử lý với cyanogen bromide trong điều kiện 80% axit formic. Phản ứng của protein

có chứa Met với cyanogen bromide làm đứt liên kết peptide tại vị trí carboxyl của

phân tử Met. Phản ứng này làm đứt các liên kết peptide trong chuỗi peptide một cách

có định hướng. Sau khi xử lý, các gốc Met sẽ bị chuyển hóa thành homoserine còn

gốc MetO được giữ nguyên. Mẫu protein lại tiếp tục được đông khô và thủy phân

trong môi trường HCl 6N có chứa dithioerythritol để toàn bộ MetO sẽ bị khử để trở

về dạng Met (trên 95% tổng số lượng MetO sẽ bị chuyển hóa). Cuối cùng, homoserine

và Met sẽ được đo bằng phương pháp phân tích axit amin, tương ứng với hàm lượng

Met và MetO để chỉ ra tổng số gốc Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa của protein

[75]. Tuy nhiên, phương pháp này không sử dụng được để phân tích axit amin tự do.

Năm 2008, Le và cs đã rất nỗ lực khi nghiên cứu sự oxy hóa Met và sự khử

MetO thông qua việc sử dụng protein có Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa.

Nhóm tác giả đã thành công khi phân lập và biểu hiện ba MRP và phát triển các

phương pháp kiểm tra quá trình oxy hóa Met và khử MetO thông qua điện di protein

SDS-PAGE và tạo kháng thể nhận biết MetO nhờ kỹ thuật lai miễn dịch [53]. Le và

cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại

tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật [52]. Bên cạnh

21

đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP

mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa

Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr [57]. Thông qua đó, natri

hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP.

Gần đây, Tarrago và cs đã sử dụng sắc ký ái lực như là một cách tiếp cận để

dò tìm các protein là cơ chất (đích tác động) của Msr mà cụ thể là AtMsrB1. Kết quả

đã chỉ ra 24 protein có vai trò trong quá trình quang hợp, dịch mã và tham gia vào

quá trình bảo vệ cây chống lại những bất lợi về oxy hóa cũng như có vai trò trong quá

trình sinh tổng hợp đường và các axit amin. Bên cạnh đó, đa số đích tác động của

MsrB1 là các protein chứa hàm lượng cao Met [84]. Năm 2015, Jacques và cs đã sử

dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị

trí MetO trên hệ protein của cây mô hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa [45]. Sử

dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả đã tìm

thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng

protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại. Catalase 2 là

enzyme catalase chính có mặt ở trong lá, với nhiệm vụ là bảo vệ các tế bào khỏi các

tổn thương oxy hóa bằng cách xúc tác quá trình chuyển hóa hydrogen peroxide thành

nước và oxy phân tử. Hoạt tính của hai glutathione S-transferase (GSTF) là GSTF9

và GSTF23 có dấu hiệu giảm rõ rệt trong điều kiện cực đoan [45].

Mặc dù việc oxy hóa và khử gốc oxy hóa ở các gốc Met trong calmodulin và

các protein truyền tín hiệu canxi khác đã được chứng minh là tham gia vào việc điều

hòa chức năng protein [26, 28, 78], tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng

viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ [26, 45, 84].

Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu

protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng

oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu

22

về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum

sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn

trùng chích hút nhựa cây có mức độ phá hoại được đánh giá là nguy hiểm đối với

nhiều cây trồng họ Fabaceae [1]. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố

ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý

được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam [3].

Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng

của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay,

vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các

tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của

Msr trên thực vật.

Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc

can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với

oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy,

chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây

Arabidopsis thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới

về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam.

23

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất

lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở

dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt

Arabidopsis thaliana kiểu dại chủng Columbia (Col-0) được sử dụng cho các thí

nghiệm. Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong

thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung

tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dòng FOX,

cDNA hoàn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn

vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào

cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa. Dòng cây chuyển gen biểu hiện quá

mức gen At3G55240 đã được nghiên cứu bởi Ichikawa và cs (2006) [43].

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu.

STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

1 Murashige & Skoog medium

chứa các vitamin Duchefa (Hà Lan)

Môi trường nảy

mầm hạt và thử

mức độ nhạy

cảm với điều

kiện bất lợi

2 Hygromycin B Sigma (Mỹ)

3 Natri clorua Merck (Mỹ)

4 Paraquat diclorua Syngenta (Indonesia)

5 Cadmium clorua Himedia (Ấn Độ)

24

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công

nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp sử dụng trong nghiên cứu đươc

thông kê trong Bang 2.2.

Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Cân phân tích Sartorius (Đức)

2 Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

3 Máy cất nước Hamilton (Anh)

4 Nồi hấp tiệt trùng tự động Tomy (Nhật Bản)

5 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ)

6 Tủ lạnh –20C và 4C Panasonic (Nhật Bản)

7 Tủ sấy Memmert (Đức)

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1.

2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học

2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP

Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc

Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền

Nông nghiệp. Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu

Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin

và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java.

Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào

phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) [85] và phần mềm Blast2go Basic

phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen

25

thành 3 nhóm: tham gia vào các quá trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành

phần của tế bào.

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu

Dự đoán vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm

hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào. Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ

chức cao nên chức năng của protein trong các quá trình sinh học có mối liên hệ chặt

chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào. Trong những năm gần đây, nhiều công

Danh sách các gen mã hóa MRP

Chú giải chức năng các gen mã hóa MRP

Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter

gen mã hóa MRP

Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter

gen mã hóa MRP

Cây Arabidopsis biểu hiện quá mức hoặc bị đột biến gen ứng viên

Đánh giá hình tháiThử nghiệm điều

kiện bất lợi

Thử kháng mặnThử kim loại

nặng CadmiumThử paraquat

TIN SINH HỌC

THỰC NGHIỆM

26

cụ dự đoán được phát triển. Phần lớn các công cụ này dựa vào thuật toán nội suy,

xác định vị trí cư trú của protein thông qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự

đặc hiệu của các protein đã biết [58]. Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp

này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác. Cụ thể, TargetP chỉ tập trung

xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory

pathway signal peptide). Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein

nằm trong lục lạp. pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58].

Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa

toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để

tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP

(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) [27], pSORT (http://www.psort.org/)

[41], và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [92]. Trong đó, vị trí cư trú nằm trên

lục lạp được dự đoán bằng ChloroP và pSORT. Vị trí cư trú nằm trên ty thể được

dự đoán bằng pSORT và CELLO.

2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều

kiện bình thường và điều kiện bất lợi

Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức

độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65]. Các thử

nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:

Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại

(chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3%

sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều

kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol

m-2 s-1 photon ). Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới

nước đầy đủ trong tuần đầu tiên. Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ

được ngừng tưới nước trong vòng 10 ngày. Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo

dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm

lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích

microarray. Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là

27

GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04

năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM

1037236-GSM 1037247 [65].

Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu

dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3%

sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong

điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60

µmol m-2 s-1 photon). Cây 10 ngày tuổi trên môi trường GM đã được chuyển sang

môi trường ½ MS đặc không có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200

mM NaCl và được giữ trong vòng 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần).

Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho

đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen. Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập

theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 -

GSM795514 [64]. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành

khai thác dữ liệu.

Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP.

Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với

điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết như Bảng 2.3. Trình tự 1-

kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm

yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4 [82].

Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen

đáp ứng với điều kiện bất lợi [90]

Yếu tố cis Trình tự nhận biết

ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)

MYBR (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C

MYCR CACATG

ICEr2 ACTCCG

RSRE CGCGTT

28

2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm

2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240

Hạt giống Arabidopsis chuyển gen và hạt đối chứng được xử lý sơ bộ bằng

ethanol 70% trong 5 phút, sau đó được khử trùng tiếp bằng dung dịch NaClO nồng

độ 1% trong thời gian 1 phút. Tiếp theo rửa hạt 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại

bỏ các phần dư thừa của hóa chất vô trùng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt

và sinh trưởng của cây con sau này.

Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên

đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong

điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ

phòng nuôi 24±2oC. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn

khác nhau. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi

trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể

đất ở tuần tuổi khác nhau.

2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi

Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên

môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi

sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên môi

trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.

Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen

và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin.

Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng

độ 750 µM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ

3 đến ngày thứ 8.

Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành

dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91] có cải biến. Gieo hạt cây

chuyển gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh

Hygromycin. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi

trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong

29

dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM,

được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều

kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu của lá sau 24 giờ.

30

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP

3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis

Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit

amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP

được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc

gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp (Phụ lục). Trong

số toàn bộ AtMRP, hàm lượng Met lớn 7 % được tìm thấy ở 47 gen (chiếm 38,8

% tổng số gen mã hóa cho MRP), đặc biệt có 2 gen AT4G16980 và AT1G33820

mã hóa cho phân tử protein có kích thước tương ứng là 164 và 182 axit amin, chứa

15,95 % và 16,02 % Met.

MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Theo Thimm và

cs (2004), MAPMAN xác định chức năng của gen có thể tham gia vào một phần của

quá trình trao đổi chất, hoặc có chức năng cụ thể (như tổng hợp protein), đáp ứng

sinh học (như gen tham gia vào trao đổi chất và/ hoặc đáp ứng với hormone), hoặc

mã hóa cho các họ enzyme mà chức năng của chúng chưa rõ [85]. Kết quả phân tích

cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong

tế bào. Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trong

đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein

(12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP,

chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP. Bên cạnh

đó, một số MRP cũng phân bố rải rác trong các chu trình quan trọng khác như liên

kết và vận chuyển kim loại, tương tác với yếu tố bất lợi, xử lý RNA sau phiên mã,

chu kỳ tế bào, liên quan đến sự phát triển của tế bào. Những phân tích trên MRP đã

biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham

gia vào trong tế bào thực vật.

31

Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN

Nhóm chức năng gen AtMRP

Kiểm soát ion kim loại 2

Phản ứng điều kiện bất lợi 1

Xử lý RNA 4

Điều hòa phiên mã RNA 20

Biến đổi protein 12

Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) 6

Chu trình tế bào 3

Sự phát triển 1

Vận chuyển (kim loại) 6

Chưa biết chức năng 56

(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của

Arabidopsis

32

Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm

BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học

(Hình 3.2), thành phần của tế bào (Hình 3.3) và chức năng phân tử (Hình 3.4).

Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm

quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học

của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan

trọng của tế bào.

Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

33

Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

34

Lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ra ROS ở mức độ cao. Như vậy,

việc xác định vị trí hoạt động của MRP trong bào quan có thể góp phần làm sáng tỏ

về chức năng của chúng. Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tôi đã

sử dụng 3 công cụ bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đoán dựa trên trình

tự polypeptide của 121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đoán

có đích đến ở lục lạp bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự

đoán là cư trú trong ty thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Bảng

3.2 và Hình 3.5). Trong đó, chỉ có 2 protein cùng được dự đoán là nằm trên lục lạp

bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1 protein cũng được dự đoán ở ty thể bởi pSORT

và CELLO (Hình 3.5).

Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO

Việc có ít trùng lặp trong kết quả dự đoán giữa các phương pháp tin sinh học

về vị trí lưu trú của các protein đặc hiệu đã được nhóm tác giả Liu và cs nêu rõ, cụ

thể là do sự khác nhau trong thuật toán và cơ sở dữ liệu mẫu của mỗi phương

pháp nên thường các công cụ dự đoán khác nhau cho ra những kết quả cũng khá là

khác nhau [58]. Do đó, chúng tôi quan tâm nhiều hơn đến tổng số lượng dự đoán

của MRP có kết quả là đích đến là lục lạp và ty thể từ cả 2 phần mềm, bởi kết quả

này có thể bổ trợ cho nhau.

10 92

ChloroP pSORT

A. Lục lạp

21

2 61

CELLO pSORT

B. Ty thể

9

35

Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp

TT Tên protein Chloro P WoLF PSORT CELLO

Lục lạp Lục lạp Ty thể Ty thể

1 At1G06960.3 Y

2 At1G10590.3 Y

3 At1G22590.1 Y Y

4 At1G32560.1 Y

5 At1G33860.1 Y

6 At1G49800.1 Y

7 At1G68160.1 Y

8 At2G07708.1 Y Y

9 At2G26975.1 Y

10 At2G46600.1 Y

11 At3G07560.1 Y

12 At3G11160.1 Y

13 At3G28190.1 Y

14 At3G28990.1 Y

15 At3G29070.1 Y

16 At3G43410.1 Y

17 At3G46900.1 Y

18 At3G59900.1 Y

19 At4G08395.1 Y

20 At4G32470.2 Y Y

21 At4G34590.1 Y

22 At5G26673.1 Y

23 At5G41170.1 Y

24 At5G59030.1 Y

25 At5G59040.1 Y Y

26 At5G61710.1 Y Y

27 ATMG00500.1 Y

28 ATMG00650.1 Y

Tổng số 12 11 3 7

Y: được dự đoán là có mặt trong bào quan tương ứng

36

Để tăng mức độ tin cậy của kết quả, chúng tôi đã kiểm chứng lại vị trí bào

quan mà 121 AtMRP cư trú bằng phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0. Sử dụng

công cụ Graphs, lựa chọn mục Cellular Component trong GO Category, đã đếm được

9 trình tự AtMRP trên ty thể (Hình 3.6). Điều này làm tăng mức độ tin cậy từ kết quả

dự đoán về đích đến của MRP trong tế bào. Như đã biết, lục lạp và ty thể là hai bào

quan sản sinh ROS [31], chính điều này làm các MRP cư trú trong đó dễ dàng bị oxy

hóa khi dư lượng ROS tăng cao do yếu tố bất lợi tác động. Như vậy, kết quả dự đoán

vị trí cư trú của MRP trong tế bào bước đầu có thể nhận định được vai trò của chúng

tham gia trong các bào quan.

Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm Blast2GO

Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động quá trình oxy hóa và khử Met trong thực

vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan

trọng trong tế bào như kiểm soát quá trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+. Sản phẩm

của các gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp

phần làm sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào.

37

3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều

kiện thường và điều kiện bất lợi

Ban đầu, dữ liệu microarray của gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis kiểu

dại ở điều kiện bình thường so với điều kiện chịu mặn và hạn hán [54, 64] được thu

thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Trong tổng số 121 gen AtMRP, dữ

liệu biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26 %) được ghi nhận số liệu (Phụ lục).

Tất cả các gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ 2 lần được coi là có biểu hiện đáp ứng

với điều kiện bất lợi. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ

phiên mã thay đổi trong điều kiện chịu mặn và/hoặc điều kiện hạn. Trong điều kiện

chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và giảm ít nhất 2 lần.

Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương ứng là cao hơn và

thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng tăng gấp hơn 2

lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực đoan trong

thí nghiệm (Hình 3.7). Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện

chịu hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen

mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được

chỉ ra ở Bảng 3.3.

Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm

gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán

38

Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao

TT Tên gen Met

(%)

Chiều dài

(axit amin)

Số lần thay đổi ở mức độ biểu hiện Mô tả gen

Xử lý hạn Xử lý mặn

1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA nhóm I

2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết

3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9 Biểu hiện quá mức dẫn đến sự “giả vàng

úa dưới ánh sáng”

4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết

5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến

yếu tố MYC

6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0 Gen giả mã hóa cho protein trong họ chuỗi

truyền điện tử P450

7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết

8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11

9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài

10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết

39

Gen At4G33467, mã hóa cho protein chưa biết đến chức năng và là gen có

biểu hiện tăng mạnh nhất trong điều kiện hạn hán, mức độ thay đổi gấp hơn 330

lần so với nhóm đối chứng. Một gen khác như At1G32560, mã hóa cho protein

chứa vùng domain LEA nhóm 1 liên quan đến sự cảm ứng với điều kiện mất nước,

gen này tăng mức biểu hiện gấp khoảng 135 lần trong điều kiện hạn. Gen mã hóa

cho protein LEA như At1G32560 có vai trò trong quá trình phát triển muộn của

phôi. LEA thường xuất hiện nhiều trong hạt và các mẫu mô thực vật trong điều

kiện bất lợi như khô hạn, chịu mặn, nhiệt độ căng thẳng. Họ protein LEA được

chứng minh rằng khi tăng cường biểu hiện sẽ giúp thực vật có khả năng chống

chịu tốt hơn trong điều kiện chịu mặn [64]. Bên cạnh đó, gen At3G62090 mã hóa

cho yếu tố phiên mã bHLH (helix loop helix-HLH) được đặc trưng bởi cấu trúc

xoắn-vòng-xoắn cơ bản, có mức độ biểu hiện được tăng cường gấp 64 và 2 lần

trong khi xử lý hạn và mặn. Ngược lại, trong số các gen có biểu hiện giảm,

At3G55240 bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất, mức độ biểu hiện của gen này bị

giảm tương ứng khoảng 60 và 26 lần trong điều kiện hạn và mặn. Ichikawa và cs

(2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng “giả

vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều

dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp). Các trình tự

tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ lúa nhưng

không được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen mã hóa

cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật [43]. Tuy nhiên, chưa có

bất kỳ một công bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với

sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn At3G55240 là

gen ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với

cây trồng trong các điều kiện cực đoan.

Trong Arabidopsis, có đến 50% gen mã hóa MRP có biểu hiện thay đổi

trong điều kiện bất lợi đều thuộc nhóm protein chưa biết được chức năng (Bảng

3.4). Số còn lại được dự đoán là giữ các chức năng khác nhau trong tế bào, quan

trọng nhất là MRP có vai trò truyền dẫn tín hiệu liên quan đến Ca2+ và là nhân tố

40

phiên mã RNA protein giúp thực vật phản ứng với điều kiện bất lợi. Trong 6

AtMRP mã hóa cho protein tham gia vào quá trình tín hiệu Ca2+, 3 gen có biểu

hiện đáp ứng trong điều kiện mặn hoặc hạn hán: 1 gen có đáp ứng tăng cường biểu

hiện và 2 gen có biểu hiện đáp ứng giảm biểu hiện (Bảng 3.4). Điều đó cho thấy

rằng tín hiệu Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát tín hiệu khi thực

vật chịu điều kiện bất lợi phi sinh học. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu

trước đó về vai trò của calmodulin trong quá trình cân bằng ROS ở thực vật [4,

78, 81]. Hoạt tính xúc tác của catalase điều hòa nồng độ H2O2 trong Arabidopsis,

bị kích thích bởi phức hệ Ca2+/calmodulin để duy trì mức độ cân bằng nội môi

H2O2 [4]. Bên cạnh đó, có đến 13/20 AtMRP đóng vai trò là các nhân tố điều hòa

phiên mã RNA, gồm 7 gen mã hóa MRP được tăng cường biểu hiện và 6 gen mã

hóa MRP bị giảm biểu hiện với điều kiện hạn hán và/hoặc điều kiện chịu mặn.

At3G62090, At5G42325 và At4G34590 đều là những nhân tố phiên mã được tăng

cường biểu hiện trong cả điều kiện hạn hán và chịu mặn. At3G62090 thuộc họ

protein có cấu trúc cơ bản xoắn vòng xoắn (bHLH) hay còn gọi là nhân tố tương

tác với phytochrome (PIF). Penfield và cs đã chỉ ra rằng PIF đóng vai trò quan

trọng trong việc kiểm soát các tín hiệu từ môi trường tác động đến thực vật, đặc

biệt là phản ứng với ánh sáng trong quá trình này mầm của hạt. Gen At3G62090

mã hóa cho PIF6. Trong điều kiện ánh sáng đỏ mạnh, PIF6 làm cho trụ dưới lá

mầm ngắn hơn, trong khi dưới điều kiện ánh sáng xanh thì trụ dưới lá mầm lại có

hình thái bình thường hay khác biệt không đáng kể [67]. At4G34590 hay còn gọi

là gen mã hóa cho nhân tố điều hòa phiên mã bZIP11 (basic region-leucine zipper).

bZIP11 biểu hiện trong toàn bộ đời sống của thực vật và đặc biệt là ở các mô mạch

như các gân xung quanh lá. Đặc biệt là biểu hiện ngoại bào mạnh của bZIP11 gây

nên sự ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [59].

41

Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng

phiên mã với điều kiện bất lợi

Nhóm chức năng gen AtMRP1 srMRP2

Biểu hiện tăng Biểu hiện giảm Tổng số

Kiểm soát ion kim loại 2 1 - 1

Phản ứng điều kiện bất lợi 1 1 - 1

Xử lý RNA 4 - - -

Điều hòa phiên mã RNA 20 7 6 13

Biến đổi protein 12 1 1 2

Tín hiệu (Ca2+) 6 1 2 3

Chu trình tế bào 3 - 1 1

Sự phát triển 1 1 - 1

Vận chuyển (kim loại) 6 1 3 4

Chưa biết chức năng 56 13 13 26 1 Số lượng các gen, một gen có thể tham gia nhiều hơn một nhóm chức năng

2 srAtMRP: MRP có biểu hiện đáp ứng với điều kiện cực đoan

3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP

đáp ứng điều kiện bất lợi

Yếu tố cis nằm trong vùng promoter của gen đóng vai trò như vị trí nhận biết

và bám của các nhân tố phiên mã, cần thiết cho việc biểu hiện của gen đặc hiệu cho

các mô hay các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi. Khi phân tích promoter của các

gen, một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra, và cũng là yếu

tố điều khiển quan trọng liên quan đến hoạt động của các gen tham gia kiểm soát

quá trình phản ứng với điều kiện bất lợi [2]. Do đó, để xác định các gen ứng viên

AtMRP có thể liên quan đến quá trình phản ứng với điều kiện cực đoan trên

A.thaliana, 5 yếu tố cis liên quan đến phản ứng với điều kiện bất lợi đã được tìm

kiếm trong vùng 1-kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của các gen mã

hóa MRP. Kết quả về dự đoán một số yếu tố cis trên promoter của các gen mã hóa

MRP được trình bày trong Bảng 3.5.

42

Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP

TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE

1 At1G10586.2 1

2 At1G20790.1 1 1

3 At1G32560.1 3

4 At1G40104.1 1

5 At1G43320.1 1

6 At1G56085.1 1

7 At1G63057.1 1 1

8 At1G64405.1 1

9 At1G67350.1 1

10 At1G68160.1 1

11 At1G68240.1 1

12 At1G72510.1 3 1

13 At1G76640.1

14 At1G77682.1 1

15 At2G07708.1 1

16 At2G17200.1 1 1

17 At2G27030.2 1

18 At2G41780.1 2

19 At3G10640.2 2 1

20 At3G11530.1 3

21 At3G11825.1 1 1

22 At3G16960.1 1 1

23 At3G23050.1 1 1

24 At3G28990.1 1

25 At3G29070.1 1

26 At3G44935.1 1

27 At3G49270.3 1

28 At3G50360.1 1

29 At3G52270.1 1

30 At3G55240.1 1

31 At3G56610.1 1 1

32 At3G59900.1 1

33 At3G62090.1 1

34 At3G62420.1 1

35 At4G00850.1 1

36 At4G02450.1 1

37 At4G12334.1 1

38 At4G12860.1 1

39 At4G16980.1 1

40 At4G20440.1 1

41 At4G32470.2 2 1

43

TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE

42 At5G21990.1 1

43 At5G26673.1 1

44 At5G37860.1 1

45 At5G39570.1 1

46 At5G41170.1 1

47 At5G42325.1 1

48 At5G49500.1 1

49 At5G59030.1 1 1

50 At5G59040.1 1

51 At5G67060.1 1 1

52 ATMG00500.1 1

53 ATMG00650.1 1 1

Tổng 23 26 16 5 4

Cả 5 yếu tố cis đều được tìm thấy trong các gen AtMRP. Trong đó, MYBR

được tìm thấy trong 21 gen AtMRP, ABRE có mặt trong 19 gen AtMRP, 16 gen

AtMRP có chứa MYC, 5 gen AtMRP có chứa ICEr2 và RSRE có mặt trong 4 gen

AtMRP (Hình 3.8). Khi phân tích sự có mặt của một số yếu tố cis nằm vùng promoter

của AtMRP, ABRE được tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA

nhóm I. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra

rằng 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng

promoter [42].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis

đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP. Ở Arabidopsis, 6

gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán và độ mặn cao có trung bình

0,83 yếu tố cis này trên promoter của mỗi gen. Điều này cho thấy sự tăng về tần số

xuất hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP

có mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn.

44

Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau

3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen

At3G55240 (dòng RBC1)

3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen

Dựa trên các kết quả phân tích tin sinh học, gen ứng viên At3G55240 có mức

độ biểu hiện giảm rất mạnh trong cả điều kiện hạn hán và độ mặn cao đã được chọn

để tiến hành thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Câu hỏi được đặt ra là At3G55240

có vai trò sinh học gì trong cơ thể sinh vật? Một phương pháp tiếp cận để nghiên cứu

chức năng gen là tăng cường biểu hiện gen dựa vào dòng chuyển gen biểu hiện cDNA

hoàn chỉnh của Arabidopsis. Kiểu hình của cá thể mang gen chuyển có thể không

thay đổi nếu vẫn giữ được ít nhất một bản sao bình thường của gen cần chuyển (dị

hợp tử). Do đó, dòng chuyển gen bắt buộc phải chứa cả hai allen mang gen cần chuyển

(đồng hợp tử) để có thể tiến hành được các nghiên cứu về biểu hiện chức năng gen

trong cơ thể.

Chính vì vậy, hạt giống dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen

At3G55240 (gọi tắt là dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác

0

5

10

15

20

25

ABRE MYB MYC ICEr2 RSRE

Số g

en

Các yếu tố cis

45

định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử. Hạt chuyển gen được khử trùng và gieo đồng thời trên

môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin. Kết quả nảy mầm hạt

cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng sinh hygromycin được thể hiện

qua Hình 3.9. Như vậy kết quả này cho thấy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên cả 2 môi

trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là đồng hợp

tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức nảy mầm và

sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ mẩy và lép

của hạt thí nghiệm.

Hình 3.9. Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A. môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh

hygromycin 15mg/l, B. môi trường ½ MS đặc

3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen

a. Hình thái cây trên đĩa thạch

Hạt dòng cây chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng được gieo trên môi trường

½ MS. Đĩa cây được đặt trong phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với

16 giờ chiếu sáng. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14

ngày tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên

đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.10. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch

46

ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu

xanh lá cây nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng.

Hình 3.10. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch

b. Hình thái cây trên giá thể đất

Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường

½MS chuyển sang giá thể đất, đặt trong phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 24°C, quang

chu kỳ với 16 giờ chiếu sáng. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi

nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và

cây đối chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.11.

Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn

phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây

nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng. Sự khác biệt này bắt đầu được nhận thấy

từ cây 7 ngày tuổi và càng thể hiện rõ nét khi cây phát triển dần. Ichikawa và cs

cũng đã ghi nhận kiểu hình khác biệt này ở dòng cây RBC1 [43]. Kiểu hình này

tương tự như cây vàng úa trong điều kiện ánh sáng yếu hay còn gọi là “sự giả vàng

úa dưới ánh sáng” gọi tắt là PEL (Pseudo-Etiolation in Light).

Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại không ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của

dòng RBC1 [43]. Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường ngoại trừ khả năng tổng

47

hợp tinh bột thấp hơn so với dòng đối chứng [43]. Các dòng tăng cường biểu hiện

gen At3G55240 trong ngân hàng các dòng FOX của RIKEN đều có mức độ phiên

mã của gen được tăng lên 1x103 cho đến hơn 1x108 lần so với cây kiểu dại [43]. Khi

mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng thì số lượng lục lạp càng giảm. Như

vậy, mức độ biểu hiện của At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp của cây

[43].

48

Hình 3.11. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất

A. Cây 3 tuần tuổi, B. Cây 4 tuần tuổi, C. Cây 5 tuần tuổi

49

Bên cạnh đó, gen At3G55240 được dự đoán là có ảnh hưởng đến quá trình phát

triển sớm của cây. Ichikawa và cs đã nghiên cứu để làm giảm biểu hiện gen này bằng

RNA can thiệp nhưng chỉ thu được các dòng cây bị chết rất sớm trong giai đoạn đầu

của sự phát triển. Các dòng cây phát triển được như bình thường thì lại không hề ghi

nhận được sự giảm biểu hiện của gen này ở mức độ phiên mã [43]. Do đó, bất hoạt gen

At3G55240 chỉ thu được kiểu hình gây chết ở giai đoạn phát triển sớm. Chính vì vậy,

biểu hiện quá mức gen At3G55240 là phương pháp tiếp cận duy nhất để bước đầu xác

định vai trò của gen đối với Arabidopsis trong một số điều kiện bất lợi.

3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi

Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phòng

vệ, gen At3G55240 được biểu hiện quá mức trong cây mô hình A. thaliana và thử nghiệm

phản ứng của cây trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Gieo dòng hạt chuyển gen

RBC1 và hạt đối chứng kiểu dại trên môi trường ½ MS tương ứng có và không có kháng

sinh hygromycin 15mg/l . Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 12

ngày tuổi chuyển sang 3 loại môi trường: (i) Môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng

độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Môi trường ½ MS, có bổ sung CdCl2

ở nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại 3 lần. (iii) Môi trường ½ MS: đĩa đối

chứng. Đếm các cây sống sót trên môi trường NaCl và CdCl2 bắt đầu từ ngày thứ 3 đến

ngày thứ 8. Kết quả thử nghiệm chống chịu với điều kiện mặn ở nồng độ NaCl 175 mM

được biểu hiện trên Hình 3.12 và Hình 3.13.

50

Hình 3.12. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trường ½ MS

51

Hình 3.13. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày tuổi được chuyển sang môi

trường ½ MS có chứa 175 mM NaCl .

52

Hình 3.14. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày tuổi được chuyển sang môi

trường ½ MS có chứa 750 µM CdCl2

53

Kết quả này cho thấy cả dòng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen

RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự

xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8,

số lượng cây chết trắng hoàn toàn ở dòng cây chuyển gen tăng lên nhanh hơn so với

dòng cây đối chứng (sau 8 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ còn 6/15 cây sống sót trong

khi dòng cây đối chứng còn 9/15 cây). Điều này được ghi nhận ở cả 3 lần lặp lại thí

nghiệm. Như vậy, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana

nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao.

Triệu chứng dễ nhận thấy nhất đối với Arabidopsis chịu điều kiện bất lợi gây

ra bởi kim loại nặng Cd là lá vàng úa và cuộn lại do mất cân bằng nước và rối loạn

quá trình đóng mở khí khổng. Lá cây vàng úa là do Cd làm thay đổi tỷ lệ Fe : Zn và

gây nên những ảnh hưởng tiêu cực trong quá trình trao đổi chất ở lục lạp [24]. Sau

5 ngày kể từ ngày chuyển sang môi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, lá của

dòng cây RBC-1 bắt đầu có hiện tượng vàng úa dần dần. Như vậy, RBC-1 xuất hiện

triệu chứng bị gây độc bởi Cd sớm hơn so với giống cây kiểu dại. Sau đó, từ ngày

thứ 5 đến ngày thứ 8 của thí nghiệm, dòng cây RBC-1 đều cho thấy cây chết vàng

với tốc độ nhanh hơn (sau 7 ngày, dòng cây chuyển gen chỉ còn 6/15 cây sống sót

trong khi dòng cây đối chứng còn 10/15 cây sống sót) (Hình 3.12 và Hình 3.14).

Kết quả này được ghi nhận ở 3 lần lặp lại thí nghiệm. Do vậy, dễ dàng nhận thấy

rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cũng làm gia

tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở nồng độ cao.

Cuối cùng, dòng cây RBC1 được so sánh với dòng cây đối chứng trong thí

nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat. Lá cây Arabidopsis 3 tuần tuổi từ dòng

chuyển gen RBC1 và dòng cây đối chứng kiểu dại được cắt rời và ngâm vào dung

dịch paraquat ở nồng độ 0 µM (nồng độ đối chứng chỉ chứa dung dịch H2O khử

trùng) và các nồng độ thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Đĩa thí nghiệm được ghi nhận kết

quả sau 24 giờ chiếu sáng liên tục. Paraquat là hợp chất có hoạt tính khử, nguyên

nhân sinh ra anion superoxide trong tế bào được ghi nhận ở Arabidopsis và

Nicotiana benthamian. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào [91].

54

Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1

Kết quả của thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã của gen

At3G55240 trong dòng RBC1 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat

(Hình 3.15). Lá của dòng RBC1 xử lý với paraquat bị mất diệp lục và trở nên trắng

hoàn toàn chỉ sau 24 giờ xử lý. Điều này được nhận thấy ở tất cả các nồng độ sử dụng

trong thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Ngược lại, dòng cây đối chứng bị mất diệp lục ở

mức độ chậm hơn so với RBC1. Bên cạnh đó, giữa các nồng độ thì biểu hiện của

55

dòng cây đối chứng cũng có sự khác nhau rõ rệt: ở nồng độ 1 µM và 2 µM, tốc độ

mất màu diệp lục là tương tự nhau và nhanh hơn so với nồng độ paraquat 0,5 µM.

Chính vì vậy, trong thí nghiệm này, nồng độ paraquat 0,5 µM được xem như là nồng

độ tối ưu nhất để so sánh vì sự khác biệt là rõ ràng nhất giữa dòng RBC1 và dòng đối

chứng.

Tóm lại, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cho

thấy sự gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào trong điều kiện chịu mặn, bị gây độc

bởi CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat, được thể hiện qua mức độ gây chết tế bào ở mức

nhanh hơn so với kiểu dại. Điều này gợi ý rằng gen At3G55240 có thể đóng vai trò

trong quá trình loại bỏ ROS. Ở thực vật, ROS đóng vai trò tín hiệu quan trọng như

chất truyền tin thứ hai trong việc kích hoạt cơ chế phòng thủ chống lại điều kiện bất

lợi [13]. Khi nhận được tín hiệu từ ROS dưới điều kiện căng thẳng oxy hóa, thực vật

thường phản ứng lại bằng cách kích hoạt một loạt cơ chế phản ứng phức tạp để khử

ROS, nhờ hoạt động của các chất loại bỏ ROS có và không có bản chất enzyme. Do

đó, biểu hiện mạnh mẽ của protein có vai trò dọn dẹp ROS ở giai đoạn đầu của điều

kiện bất lợi sẽ làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phòng thủ, giảm khả năng kháng

lại của thực vật [89].

Hiện nay, chưa có một công bố chính thức nào về việc tăng cường mức độ biểu

hiện của protein khử ROS lại làm tăng tính nhạy cảm của cây đối với điều kiện bất

lợi phi sinh học và ngược lại. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã đề cập đến vấn đề này

khi cây gặp phải điều kiện bất lợi sinh học [61, 62, 89]. Tương tự như khi gặp phải

điều kiện bất lợi về mặt phi sinh học, thực vật cũng có những phản ứng phòng vệ để

chống lại sự tấn công của mầm bệnh và các yếu tố sinh học khác, nguyên nhân sản

sinh ra ROS như H2O2 và superoxide. Trên đối tượng cây thuốc lá (Nicotiana

tabacum), biểu hiện của ascorbate peroxidase bị ức chế ở mức độ sau phiên mã trong

suốt quá trình đưa tế bào vào chết theo chu trình khi cây bị mầm bệnh tấn công [61].

Cây thuốc lá chuyển gen làm giảm biểu hiện của ascorbate peroxidase hay catalase

bị giảm biểu hiện lại cho thấy chống chịu tốt hơn khi bị mầm bệnh tấn công [62].

Metallothionein là protein giàu cysteine, có khối lượng phân tử nhỏ (6-7 kDa). Bên

56

cạnh đó, metallothionein được xác định là có vai trò trong việc dọn dẹp ROS và cân

bằng kim loại bên trong tế bào [89]. Cây lúa (Oryza sativa) biểu hiện quá mức gen

OsMT2b mã hóa cho metallothionein lại làm tăng mức độ mẫn cảm của cây đối với

vi khuẩn gây bệnh bạc lá và nấm gây bệnh đạo ôn [89].

Bên cạnh đó, ảnh hưởng của MRP đến phản ứng của cây trước một số điều

kiện bất lợi cũng được nghiên cứu. Calmodulin là protein được tập trung nghiên cứu

về ảnh hưởng của oxy hóa Met đến việc rối loạn và làm mất chức năng của protein

[18, 30, 78]. Đây là protein đóng vai trò quan trọng liên quan đến khả năng chống

chịu với những điều kiện cực đoan ở cây trồng. Đột biến cây Arabidopsis bằng cách

chèn thêm đoạn T-DNA vào 7 gen mã hóa cho calmodulin đã góp phần khẳng định

vai trò đặc biệt của các gen này đến quá trình chống chịu của thực vật với điều kiện

bất lợi gây ra bởi paraquat và H2O2; cụ thể, các đột biến gen mã hóa calmodulin 5

và calmodulin 6 cho thấy sự tăng tính nhạy cảm đối với paraquat và H2O2 trong quá

trình nảy mầm và sinh trưởng của hạt [4].

Protein sốc nhiệt Hsp21 cũng là protein đích được nghiên cứu nhiều quá trình

oxy hóa Met và ảnh hưởng của nó đối với cây trồng [35-37, 80]. Gen mã hóa cho

Hsp21 được tăng cường biểu hiện trong cây A. thaliana dưới sự kiểm soát của

promoter CaMV 35S và dòng cây chuyển gen không hề cho thấy sự sai khác gì đáng

kể về mặt kiểu hình. Tuy nhiên, khi thực hiện thí nghiệm chịu nhiệt dưới điều kiện

ánh sáng có cường độ mạnh 4 giờ mỗi ngày, đồng nghĩa với việc tạo điều kiện bất lợi

về mặt oxy hóa, thì dòng cây chuyển gen và cây đối chứng cho thấy sự khác biệt rõ

rệt. Dòng cây biểu hiện mạnh Hsp21 ít bị ảnh hưởng và trọng lượng tươi vẫn lớn hơn

dòng cây đối chứng [80]. Do vậy, protein này giúp tăng cường sự sống sót cho tế bào

thực vật trong những điều kiện bất lợi oxy hóa [80].

Chính vì vậy, thông qua nghiên cứu này, gen At3G55240 được dự đoán là mã

hóa cho protein đóng vai trò trong việc triệt tiêu ROS. Tuy nhiên, trong giai đoạn

đầu kích hoạt quá trình phòng thủ, việc biểu hiện quá mức của một protein đóng vai

trò dọn dẹp ROS lại là một bất lợi đối với cây trồng khi tín hiệu kích thích phản vệ

không còn mạnh mẽ. Kết quả này bước đầu sẽ cung cấp những dẫn liệu cho nghiên

57

cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trò của gen mã hóa MRP liên quan đến tính

chống chịu ở thực vật, về đích tác động của Msr bên cạnh một số MRP được công

bố trước đây như calmodulin và hsp21.

58

KẾT LUẬN

Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1. Hệ gen của cây Arabidopsis thaliana có chứa 121 gen mã hóa MRP,

trong đó khoảng 50% đã biết chức năng là đóng các vai trò quan trọng trong

quá trình của tế bào như tham gia vào tín hiệu Ca2+, kiểm soát quá trình phiên

mã RNA. Trong số này có 21 MRP có đích đến ở lục lạp và 9 MRP cư trú ở ty

thể.

2. Trong tổng số gen mã hóa MRP ở Arabidopsis có 39 gen đáp ứng phiên

mã trong điều kiện hạn hán, 28 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện mặn.

Trong đó, gen At3G55240 có biểu hiện giảm rất mạnh ở cả 2 điều kiện là hạn

hán và mặn.

3. Dòng cây Arabidopsis chuyển gen RBC1 biểu hiện quá mức gen

At3G55240 sinh trưởng và phát triển tốt, tuy nhiên lại có đặc điểm hình thái

đặc trưng của sự giả vàng úa dưới ánh sáng. Dòng cây chuyển gen RBC1 mẫn

cảm hơn (nhạy cảm hơn) với điều kiện mặn, CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat.

KIẾN NGHỊ

Để tiếp tục phát triển kết quả nghiên cứu trong phạm vi của đề tài, chúng tôi

có một số kiến nghị như sau:

1. Sử dụng các phương pháp thực nghiệm, ví dụ phương pháp phân tích

hình thái và phương pháp thử nghiệm trên một số điều kiện bất lợi, để làm rõ

hơn vai trò của một số gen mã hóa MRP chưa biết chức năng mà có đáp ứng

phiên mã mạnh với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra trong nghiên cứu này, ví

dụ gen At4G34590 được tăng cường biểu hiện lên đến 337,5 lần trong điều

kiện hạn hán.

2. Mở rộng nghiên cứu, trước mắt trong phạm vi lĩnh vực tin sinh học, đối

với MRP trên các cây nông nghiệp quan trọng khác như lúa gạo, ngô và sắn.

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Mai Văn Chung (2014), “Các gốc oxy tự do trong phản ứng bảo vệ của cây đậu

đối với rệp hại”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nghệ An, 3: 16-19.

2. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và

ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1): 1-

18.

3. Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014), “Ảnh hưởng của điều kiện tách

chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây diệp hạ

châu (Phyllanthus amarus) trồng tại Phú Yên”, Tạp chí Khoa học và Phát triển,

12(3): 412-421.

Tài liệu tiếng Anh

4. Al-Quraan, N.A., Locy, R.D., Singh, N.K. (2011), "Implications of paraquat

and hydrogen peroxide-induced oxidative stress treatments on the GABA shunt

pathway in Arabidopsis thaliana calmodulin mutants", Plant Biotechnology

Reports, 5(3): 225-234.

5. Altenbach, S.B., Pearson, K.W., Leung, F.W., Sun, S.S. (1987), "Cloning and

sequence analysis of a cDNA encoding a Brazil nut protein exceptionally rich

in methionine", Plant Molecular Biology, 8(3): 239-250.

6. Altenbach, S.B.,Simpson, R.B. (1990), "Manipulation of methionine-rich

protein genes in plant seeds", Trends in Biotechnology, 8: 156-160.

7. Amir, R. (2008), "Towards improving methionine content in plants for

enhanced nutritional quality", Function Plant Science Biotechnology, 2: 36-46.

8. Amir, R., Hacham, Y., Galili, G. (2002), "Cystathionine γ-synthase and

threonine synthase operate in concert to regulate carbon flow towards

methionine in plants", Trends in Plant Science, 7(4): 153-156.

60

9. Apel, K.,Hirt, H. (2004), "Reactive oxygen species: metabolism, oxidative

stress, and signal transduction", Annual Review Plant Biology, 55: 373-399.

10. Bartlem, D., Lambein, I., Okamoto, T., Itaya, A., Uda, Y., Kijima, F., Tamaki,

Y., Nambara, E., Naito, S. (2000), "Mutation in the threonine synthase gene

results in an over-accumulation of soluble methionine in Arabidopsis", Plant

Physiology, 123(1): 101-110.

11. Benavides, M.P., Gallego, S.M., Tomaro, M.L. (2005), "Cadmium toxicity in

plants", Brazilian Journal of Plant Physiology, 17(1): 21-34.

12. Benn, G., Wang, C.Q., Hicks, D.R., Stein, J., Guthrie, C., Dehesh, K. (2014),

"A key general stress response motif is regulated non-uniformly by CAMTA

transcription factors", Plant Journal, 80(1): 82-92.

13. Bhattacharjee, S. (2005), "Reactive oxygen species and oxidative burst: roles in

stress, senescence and signal", Current Science, 89: 1113-1121.

14. Bourgis, F., Roje, S., Nuccio, M.L., Fisher, D.B., Tarczynski, M.C., Li, C.,

Herschbach, C., Rennenberg, H., Pimenta, M.J., Shen, T.-L. (1999), "S-

methylmethionine plays a major role in phloem sulfur transport and is

synthesized by a novel type of methyltransferase", The Plant Cell, 11(8): 1485-

1497.

15. Brosnan, J.T.,Brosnan, M.E. (2006), "The sulfur-containing amino acids: an

overview", The Journal of Nutrition, 136(6): 1636-1640.

16. Brot, N., Weissbach, L., Werth, J., Weissbach, H. (1981), "Enzymatic reduction

of protein-bound methionine sulfoxide", Proceedings of the National Academy

of Sciences, 78(4): 2155-2158.

17. Burke, E.J., Brown, S.J., Christidis, N. (2006), "Modeling the recent evolution

of global drought and projections for the twenty-first century with the Hadley

Centre climate model", Journal of Hydrometeorology, 7(5): 1113-1125.

18. Carruthers, N.J.,Stemmer, P.M. (2008), "Methionine Oxidation in the

Calmodulin-Binding Domain of Calcineurin Disrupts Calmodulin Binding and

Calcineurin Activation", Biochemistry, 47(10): 3085-3095.

61

19. Chai, J. (2013), "Roles of SRF in Endothelial Cells During Hypoxia", in

Research Directions in Tumor Angiogenesis, InTech, 2: 29-46.

20. Chakraborty, S., Chakraborty, N., Datta, A. (2000), "Increased nutritive value

of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from

Amaranthus hypochondriacus", Proceedings of the National Academy of

Sciences, 97(7): 3724-3729.

21. Clemens, S. (2006), "Toxic metal accumulation, responses to exposure and

mechanisms of tolerance in plants", Biochimie, 88(11): 1707-1719.

22. Coleman, C.E., Larkins, B.A. (1999), "The prolamins of maize", in seed

Proteins, Springer, 6: 109-139.

23. Couturier, J., Chibani, K., Jacquot, J.P., Rouhier, N. (2013), "Cysteine–based

redox regulation and signaling in plants", Frontiers in Plant Science, 4: 105.

24. DalCorso, G., Farinati, S., Maistri, S., Furini, A. (2008), "How plants cope with

cadmium: staking all on metabolism and gene expression", Journal of

Integrative Plant Biology, 50(10): 1268-1280.

25. Deinlein, U., Stephan, A.B., Horie, T., Luo, W., Xu, G., Schroeder, J.I. (2014),

"Plant salt-tolerance mechanisms", Trends in Plant Science, 19(6): 371-379.

26. Drazic, A.,Winter, J. (2014), "The physiological role of reversible methionine

oxidation", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics,

1844(8): 1367-1382.

27. Emanuelsson, O., Nielsen, H., Brunak, S., von Heijne, G. (2000), "Predicting

subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid

sequence", Journal of Molecular Biology, 300(4): 1005-1016.

28. Erickson, J.R., Mei-ling, A.J., Guan, X., Kutschke, W., Yang, J., Oddis, C.V.,

Bartlett, R.K., Lowe, J.S., O'Donnell, S.E., Aykin-Burns, N. (2008), "A

dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKII by methionine

oxidation", Cell, 133(3): 462-474.

29. Galili, G.,Höfgen, R. (2002), "Metabolic engineering of amino acids and storage

proteins in plants", Metabolic Engineering, 4(1): 3-11.

62

30. Gao, J., Yao, Y., Squier, T.C. (2001), "Oxidatively Modified Calmodulin Binds

to the Plasma Membrane Ca-ATPase in a Nonproductive and Conformationally

Disordered Complex", Biophysical Journal, 80(4): 1791-1801.

31. Gill, S.S.,Tuteja, N. (2010), "Reactive oxygen species and antioxidant

machinery in abiotic stress tolerance in crop plants", Plant Physiology and

Biochemistry, 48(12): 909-930.

32. Giovanelli, J., Mudd, S.H., Datko, A.H. (1985), "Quantitative analysis of

pathways of methionine metabolism and their regulation in Lemna", Plant

Physiology, 78(3): 555-560.

33. Götz, S., García-Gómez, J.M., Terol, J., Williams, T.D., Nagaraj, S.H., Nueda,

M.J., Robles, M., Talón, M., Dopazo, J., Conesa, A. (2008), "High-throughput

functional annotation and data mining with the Blast2GO suite", Nucleic Acids

Research, 36(10): 3420-3435.

34. Gupta, V.K., Nayak, A., Agarwal, S. (2015), "Bioadsorbents for remediation of

heavy metals: Current status and their future prospects", Environmental

Engineering Research, 20(1): 1-18.

35. Gustavsson, N., Härndahl, U., Sundby, C., Emanuelsson, A., Roepstorff, P.

(1999), "Methionine sulfoxidation of the chloroplast small heat shock protein

and conformational changes in the oligomer", Protein Science, 8(11): 2506-

2512.

36. Gustavsson, N., Kokke, B., Anzelius, B., Boelens, W.C., Sundby, C. (2001),

"Substitution of conserved methionines by leucines in chloroplast small heat

shock protein results in loss of redox‐response but retained chaperone‐like

activity", Protein Science, 10(9): 1785-1793.

37. Gustavsson, N., Kokke, B., Härndahl, U., Silow, M., Bechtold, U., Poghosyan,

Z., Murphy, D., Boelens, W.C., Sundby, C. (2002), "A peptide methionine

sulfoxide reductase highly expressed in photosynthetic tissue in Arabidopsis

thaliana can protect the chaperone‐like activity of a chloroplast‐localized

small heat shock protein", The Plant Journal, 29(5): 545-553.

63

38. Hasanuzzaman, M.,Fujita, M. (2011), "Selenium pretreatment upregulates the

antioxidant defense and methylglyoxal detoxification system and confers

enhanced tolerance to drought stress in rapeseed seedlings", Biological Trace

Element Research, 143(3): 1758-1776.

39. Hawkes, T.R. (2014), "Mechanisms of resistance to paraquat in plants", Pest

Management Science, 70(9): 1316-1323.

40. Hesse, H., Kreft, O., Maimann, S., Zeh, M., Hoefgen, R. (2004), "Current

understanding of the regulation of methionine biosynthesis in plants", Journal

of Experimental Botany, 55(404): 1799-1808.

41. Horton, P., Park, K.-J., Obayashi, T., Fujita, N., Harada, H., Adams-Collier, C.,

Nakai, K. (2007), "WoLF PSORT: protein localization predictor", Nucleic

Acids Research, 35(2): 585-587.

42. Hundertmark, M.,Hincha, D.K. (2008), "LEA (late embryogenesis abundant)

proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana", BMC Genomics,

9(1): 118.

43. Ichikawa, T., Nakazawa, M., Kawashima, M., Iizumi, H., Kuroda, H., Kondou,

Y., Tsuhara, Y., Suzuki, K., Ishikawa, A., Seki, M., Fujita, M., Motohashi, R.,

Nagata, N., Takagi, T., Shinozaki, K., Matsui, M. (2006), "The FOX hunting

system: an alternative gain-of-function gene hunting technique", Plant Journal,

48(6): 974-85.

44. Izquierdo, L.,Godwin, I.D. (2005), "Molecular characterization of a novel

methionine-rich δ-kafirin seed storage protein gene in sorghum (Sorghum

bicolor L.)", Cereal Chemistry, 82(6): 706-710.

45. Jacques, S., Ghesquière, B., De Bock, P.-J., Demol, H., Wahni, K., Willems, P.,

Messens, J., Van Breusegem, F., Gevaert, K. (2015), "Protein methionine

sulfoxide dynamics in Arabidopsis thaliana under oxidative stress", Molecular

& Cellular Proteomics, 14(5): 1217-1229.

46. Jacques, S., Ghesquière, B., Van Breusegem, F., Gevaert, K. (2013), "Plant

proteins under oxidative attack", Proteomics, 13(6): 932-940.

64

47. Kelly, J.,Hefle, S. (2000), "2S methionine‐rich protein (SSA) from sunflower

seed isan IgE‐binding protein", Allergy, 55(6): 556-559.

48. Kim, G., Weiss, S.J., Levine, R.L. (2014), "Methionine oxidation and reduction

in proteins", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1840(2):

901-905.

49. Kirihara, J.A., Petri, J.B., Messing, J. (1988), "Isolation and sequence of a gene

encoding a methionine-rich 10-kDa zein protein from maize", Gene, 71(2):

359-370.

50. Kortt, A.A., Caldwell, J.B., Lilley, G.G., Higgins, T.J. (1991), "Amino acid and

cDNA sequences of a methionine‐rich 2S protein from sunflower seed

(Helianthus annuus L.)", European Journal of Biochemistry, 195(2): 329-334.

51. Kuschel, L., Hansel, A., Schönherr, R., Weissbach, H., Brot, N., Hoshi, T.,

Heinemann, S.H. (1999), "Molecular cloning and functional expression of a

human peptide methionine sulfoxide reductase (hMsrA)", FEBS letters, 456(1):

17-21.

52. Le, D.T., Lee, B.C., Marino, S.M., Zhang, Y., Fomenko, D.E., Kaya, A.,

Hacioglu, E., Kwak, G.-H., Koc, A., Kim, H.-Y. (2009), "Functional analysis

of free methionine-R-sulfoxide reductase from Saccharomyces cerevisiae",

Journal of Biological Chemistry, 284(7): 4354-4364.

53. Le, D.T., Liang, X., Fomenko, D.E., Raza, A.S., Chong, C.-K., Carlson, B.A.,

Hatfield, D.L., Gladyshev, V.N. (2008), "Analysis of

Methionine/Selenomethionine Oxidation and Methionine Sulfoxide Reductase

Function Using Methionine-Rich Proteins and Antibodies against Their

Oxidized Forms", Biochemistry, 47(25): 6685-6694.

54. Le, D.T., Nishiyama, R., Watanabe, Y., Tanaka, M., Seki, M., Yamaguchi-

Shinozaki, K., Shinozaki, K., Tran, L.-S.P. (2012), "Differential gene

expression in soybean leaf tissues at late developmental stages under drought

stress revealed by genome-wide transcriptome analysis", Plos One, 7(11):

e49522.

65

55. Lee, B.C., Dikiy, A., Kim, H.-Y., Gladyshev, V.N. (2009), "Functions and

evolution of selenoprotein methionine sulfoxide reductases", Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1790(11): 1471-1477.

56. Li, C.-W., Lee, S.-H., Chieh, P.-S., Lin, C.-S., Wang, Y.-C., Chan, M.-T.

(2012), "Arabidopsis root-abundant cytosolic methionine sulfoxide reductase B

genes MsrB7 and MsrB8 are involved in tolerance to oxidative stress", Plant

and Cell Physiology, 53(10): 1707-1719.

57. Liang, X., Kaya, A., Zhang, Y., Le, D.T., Hua, D., Gladyshev, V.N. (2012),

"Characterization of methionine oxidation and methionine sulfoxide reduction

using methionine-rich cysteine-free proteins", BMC Biochemistry, 13(1): 21.

58. Liu, L., Zhang, Z., Mei, Q., Chen, M. (2013), "PSI: a comprehensive and

integrative approach for accurate plant subcellular localization prediction", Plos

One, 8(10): e75826.

59. Ma, J., Hanssen, M., Lundgren, K., Hernández, L., Delatte, T., Ehlert, A., Liu,

C.M., Schluepmann, H., Dröge‐Laser, W., Moritz, T. (2011), "The sucrose‐

regulated Arabidopsis transcription factor bZIP11 reprograms metabolism and

regulates trehalose metabolism", New Phytologist, 191(3): 733-745.

60. Masumura, T., Shibata, D., Hibino, T., Kato, T., Kawabe, K., Takeba, G.,

Tanaka, K., Fujii, S. (1989), "cDNA cloning of an mRNA encoding a sulfur-

rich 10 kDa prolamin polypeptide in rice seeds", Plant Molecular Biology,

12(2): 123-130.

61. Mittler, R., Feng, X., Cohen, M. (1998), "Post-transcriptional suppression of

cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced

programmed cell death in tobacco", The Plant Cell, 10(3): 461-473.

62. Mittler, R., Herr, E.H., Orvar, B.L., Van Camp, W., Willekens, H., Inzé, D.,

Ellis, B.E. (1999), "Transgenic tobacco plants with reduced capability to

detoxify reactive oxygen intermediates are hyperresponsive to pathogen

infection", Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(24): 14165-

14170.

66

63. Moskovitz, J., Weissbach, H., Brot, N. (1996), "Cloning the expression of a

mammalian gene involved in the reduction of methionine sulfoxide residues in

proteins", Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(5): 2095-2099.

64. Nishiyama, R., Le, D.T., Watanabe, Y., Matsui, A., Tanaka, M., Seki, M.,

Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., Tran, L. (2012), "Transcriptome

analyses of a salt-tolerant cytokinin-deficient mutant reveal differential

regulation of salt stress response by cytokinin deficiency", Plos One, 7(2):

e32124.

65. Nishiyama, R., Watanabe, Y., Leyva-Gonzalez, M.A., Van Ha, C., Fujita, Y.,

Tanaka, M., Seki, M., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., Herrera-

Estrella, L. (2013), "Arabidopsis AHP2, AHP3, and AHP5 histidine

phosphotransfer proteins function as redundant negative regulators of drought

stress response", Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(12):

4840-4845.

66. Pedersen, K., Argos, P., Naravana, S., Larkins, B.A. (1986), "Sequence analysis

and characterization of a maize gene encoding a high-sulfur zein protein of Mr

15,000", Journal of Biological Chemistry, 261(14): 6279-6284.

67. Penfield, S., Josse, E.-M., Halliday, K.J. (2010), "A role for an alternative splice

variant of PIF6 in the control of Arabidopsis primary seed dormancy", Plant

molecular biology, 73(1-2): 89-95.

68. Reddy, V., Pizzo, S.V., Weiss, S. (1989), "Functional inactivation and structural

disruption of human alpha 2-macroglobulin by neutrophils and eosinophils",

Journal of Biological Chemistry, 264(23): 13801-13809.

69. Reddy, V.Y., Desorchers, P., Pizzo, S.V., Gonias, S.L., Sahakian, J.A., Levine,

R.L., Weiss, S.J. (1994), "Oxidative dissociation of human alpha 2-

macroglobulin tetramers into dysfunctional dimers", Journal of Biological

Chemistry, 269(6): 4683-4691.

67

70. Rinalducci, S., Murgiano, L., Zolla, L. (2008), "Redox proteomics: basic

principles and future perspectives for the detection of protein oxidation in

plants", Journal of Experimental Botany, 59(14): 3781-3801.

71. Rosen, H., Klebanoff, S.J., Wang, Y., Brot, N., Heinecke, J.W., Fu, X. (2009),

"Methionine oxidation contributes to bacterial killing by the myeloperoxidase

system of neutrophils", Proceedings of the National Academy of Sciences,

106(44): 18686-18691.

72. Sadanandom, A., Poghosyan, Z., Fairbairn, D.J., Murphy, D.J. (2000),

"Differential regulation of plastidial and cytosolic isoforms of peptide

methionine sulfoxide reductase in Arabidopsis", Plant Physiology, 123(1): 255-

264.

73. Saito, K. (2000), "Regulation of sulfate transport and synthesis of sulfur-

containing amino acids", Current Opinion Plant Biology, 3(3): 188-95.

74. Shechter, Y. (1986), "Selective oxidation and reduction of methionine residues

in peptides and proteins by oxygen exchange between sulfoxide and sulfide",

Journal of Biological Chemistry, 261(1): 66-70.

75. Shechter, Y., Burstein, Y., Patchornik, A. (1975), "Selective oxidation of

methionine residues in proteins", Biochemistry, 14(20): 4497-4503.

76. Shewry, P. (2002), "The Major Seed Storage Proteins of Spelt Wheat, Sorghum,

Millets and Pseudocereals", in Pseudocereals and Less Common Cereals,

Springer Berlin Heidelberg, 1: 1-24.

77. Singh, B.K. (2000), "Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology",

Biologia Plantarum, 43(3): 358-359.

78. Snijder, J., Rose, R.J., Raijmakers, R., Heck, A.J. (2011), "Site-specific

methionine oxidation in calmodulin affects structural integrity and interaction

with Ca 2+/calmodulin-dependent protein kinase II", Journal of Structural

Biology, 174(1): 187-195.

68

79. Stadtman, E.R., Moskovitz, J., Berlett, B.S., Levine, R.L. (2002), "Cyclic

oxidation and reduction of protein methionine residues is an important

antioxidant mechanism", Molecular and Cellular Biochemistry, 234(1): 3-9.

80. Sundby, C., Härndahl, U., Gustavsson, N., Åhrman, E., Murphy, D.J. (2005),

"Conserved methionines in chloroplasts", Biochimica et Biophysica Acta

(BBA)-Proteins and Proteomics, 1703(2): 191-202.

81. Takahashi, F., Mizoguchi, T., Yoshida, R., Ichimura, K., Shinozaki, K. (2011),

"Calmodulin-dependent activation of MAP kinase for ROS homeostasis in

Arabidopsis", Molecular Cell, 41(6): 649-660.

82. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S. (2007), "MEGA4: molecular

evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0", Molecular

Biology and Evolution, 24(8): 1596-1599.

83. Tarrago, L.,Gladyshev, V. (2012), "Recharging oxidative protein repair:

catalysis by methionine sulfoxide reductases towards their amino acid, protein,

and model substrates", Biochemistry (Moscow), 77(10): 1097-1107.

84. Tarrago, L., Kieffer-Jaquinod, S., Lamant, T., Marcellin, M., Garin, J., Rouhier,

N., Rey, P. (2012), "Affinity chromatography: a valuable strategy to isolate

substrates of methionine sulfoxide reductases?", Antioxidants & Redox

Signaling, 16(1): 79-84.

85. Thimm, O., Bläsing, O., Gibon, Y., Nagel, A., Meyer, S., Krüger, P., Selbig, J.,

Müller, L.A., Rhee, S.Y., Stitt, M. (2004), "Mapman: a user‐driven tool to

display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other

biological processes", The Plant Journal, 37(6): 914-939.

86. Tuteja, N. (2007), "Mechanisms of High Salinity Tolerance in Plants", Methods

in Enzymology, 428: 419-438.

87. Valley, C.C., Cembran, A., Perlmutter, J.D., Lewis, A.K., Labello, N.P., Gao,

J., Sachs, J.N. (2012), "The methionine-aromatic motif plays a unique role in

stabilizing protein structure", Journal of Biological Chemistry, 287(42): 34979-

34991.

69

88. Waszczak, C., Akter, S., Eeckhout, D., Persiau, G., Wahni, K., Bodra, N., Van

Molle, I., De Smet, B., Vertommen, D., Gevaert, K. (2014), "Sulfenome mining

in Arabidopsis thaliana", Proceedings of the National Academy of Sciences,

111(31): 11545-11550.

89. Wong, H.L., Sakamoto, T., Kawasaki, T., Umemura, K., Shimamoto, K. (2004),

"Down-regulation of metallothionein, a reactive oxygen scavenger, by the small

GTPase OsRac1 in rice", Plant Physiology, 135(3): 1447-1456.

90. Yamaguchi-Shinozaki, K.,Shinozaki, K. (2005), "Organization of cis-acting

regulatory elements in osmotic-and cold-stress-responsive promoters", Trends

in Plant Science, 10(2): 88-94.

91. Yang, H., Yang, S., Li, Y., Hua, J. (2007), "The Arabidopsis BAP1 and BAP2

genes are general inhibitors of programmed cell death", Plant Physiology,

145(1): 135-146.

92. Yu, C.S., Chen, Y.C., Lu, C.H., Hwang, J.K. (2006), "Prediction of protein

subcellular localization", Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics,

64(3): 643-651.

93. Zeh, M., Casazza, A.P., Kreft, O., Roessner, U., Bieberich, K., Willmitzer, L.,

Hoefgen, R., Hesse, H. (2001), "Antisense inhibition of threonine synthase leads

to high methionine content in transgenic potato plants", Plant Physiology,

127(3): 792-802.

i

PHỤ LỤC

Danh sách gen mã hóa MRP trong hệ gen Arabidopsis thaliana và kết quả phân tích microarray thể hiện sự thay đổi ở mức độ

phiên mã của gen AtMRP trong cây kiểu dại ở điều kiện hạn hán và chịu mặn.

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

1 At1G01160.1 7.22 14 195 1,799 -1,091 Nhân tố tương tác với GRF2

2 At1G06960.3 6.03 12 200 - - Ribonucleoprotein nhân con / protein tham

gia ghép nối

3 At1G10586.2 6.06 8 133 - - Điều hòa quá trình phiên mã

4 At1G10590.3 6.58 10 153 - - Protein liên kết DNA

5 At1G15310.1 6.28 30 479 17,547 -1,251 Tương tác với peptide tín hiệu; Liên kết với

RNA7S/GTP/mRNA

6 At1G16225.1 6.57 13 199 -1,630 -2,339 Tương tự họ protein liên quan với syntaxin

7 At1G16240.1 6.93 16 232 1,703 -1,095 Protein syntaxin

8 At1G20790.1 7.14 31 435 1,426 -1,109 Protein F-box

9 At1G21940.1 6.04 11 183 -1,494 1,507 Protein chưa biết

10 At1G22590.1 6.45 8 125 -3,955 -1,594 Nhân tố phiên mã AGL87

ii

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

11 At1G30473.1 7.98 19 239 2,221 1,237 Liên kết với ion kim loại

12 At1G32560.1 6.02 8 134 135,330 3,312 Protein chứa vùng LEA nhóm 1, có nhiều

trong giai đoạn phát sinh phôi muộn

13 At1G33820.1 16.02 29 182 4,431 -1,021 Protein chưa biết

14 At1G33860.1 8.55 13 153 2,370 2,157 Protein chưa biết

15 At1G40104.1 6.81 42 618 - - Protein chưa biết

16 At1G43320.1 7.69 9 118 1,588 -1,085 Protein chưa biết

17 At1G47389.1 6.28 15 240 - - Protein chưa biết

18 At1G48900.1 6.68 33 495 1,521 -1,108 Protein có tiểu phần 54 kDa nhận biết tín

hiệu

19 At1G49800.1 6.54 7 108 2,291 -1,055 Protein chưa biết

20 At1G52415.1 6.09 7 116 1,746 -1,204 protein vận chuyển lipit/ 2S albumin protein

dự trữ trong hạt

21 At1G56085.1 6.58 10 153 2,031 1,269 Protein chưa biết

22 At1G63055.1 6.48 7 109 1,411 2,766 Protein chưa biết

23 At1G63057.1 7.83 9 116 - - Protein chưa biết

iii

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

24 At1G63800.1 6.52 12 185 -1,054 -3,558 Ubiquitin ligase 5 (UBC5)

25 At1G64405.1 6.84 8 118 -9,615 -1,177 Protein chưa biết

26 At1G64690.1 6.25 17 273 1,287 -1,190 Protein chưa biết

27 At1G67350.1 6.15 8 131 -1,030 -1,207 Protein chưa biết

28 At1G67870.1 7.91 22 279 1,228 -4,102 Protein giàu glycine

29 At1G68160.1 6.62 18 273 1,646 -1,187 Protein chưa biết

30 At1G68240.1 6.52 12 185 -1,824 -2,767 Nhân tố phiên mã

31 At1G72510.1 6.1 10 165 -1,565 1,009 Protein chưa biết

32 At1G76640.1 7.59 12 159 -28,693 1,084 Protein liên quan calmodulin

33 At1G77682.1 6.73 7 105 1,498 -1,061 Protein kháng khuẩn thionin

34 At2G06530.1 6.25 14 225 2,185 1,180 Protein chưa biết

35 At2G07708.1 6.43 9 141 -1,403 -2,045 Protein chưa biết

36 At2G17190.1 6.7 36 538 1,554 -1,034 Thuộc họ protein ubiquitin

37 At2G17200.1 6.18 34 551 1,172 1,180 Thuộc họ protein ubiquitin

38 At2G21100.1 6.99 13 187 2,135 -1,555 Protein tham gia kháng bệnh, liên quan đến

sinh tổng hợp lignan

iv

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

39 At2G21655.1 7.1 11 156 1,576 -1,090 Protein chưa biết

40 At2G21727.1 6.67 10 151 1,913 1,303 Protein liên quan đến sự hình thành giao tử

ECA1

41 At2G26975.1 6.94 10 145 -1,830 -1,342 Protein vận chuyển ion Cu

42 At2G27030.2 6.25 7 113 1,335 -1,557 Protein liên kết với ion Ca (calmodulin5)

43 At2G27050.1 6.17 36 584 -1,442 1,098 Một nhân tố phiên mã không nhạy cảm với

ethylene 1 (EIL1)

44 At2G28610.1 6.17 15 244 -1,247 2,205 Protein điều tiết quá trình phát triển cân

xứng trục của hoa Arabidopsis

45 At2G36355.2 6.25 7 113 -1,292 -1,251 Protein chưa biết

46 At2G36930.1 6.09 12 198 -1,820 1,065 Protein ngón tay kẽm (loại C2H2)

47 At2G37410.1 8.26 20 243 1,224 1,417 Là một translocase xúc tác cho quá trình

vận chuyển trong ty thể

48 At2G41780.1 6.35 8 127 1,101 -1,468 Protein chưa biết

49 At2G46600.1 8.21 11 135 -1,019 -2,458 Protein liên kết với ion Ca

50 At3G05220.1 8.33 48 577 -4,137 1,072 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng

51 At3G06130.1 6.14 29 473 -300,37 -1,331 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng

v

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

52 At3G07560.1 7.26 22 304 1,444 1,235 mã hóa cho peroxin 13 (PEX13) bao gồm cả

vận chuyển protein đến peroxisome

53 At3G10640.2 6.51 11 170 - - Protein nằm ở không bào với số 60.1

54 At3G11160.1 6.94 10 145 3,511 -1,599 Protein chưa biết

55 At3G11530.1 6.25 7 113 1,714 -1,496 Protein nằm ở không bào với số 55 (VPS

55), là một protein vận chuyển

56 At3G11825.1 6.06 6 100 1,711 -1,085 Ức chế protease/protein dự trữ trong

hạt/protein vận chuyển lipid

57 At3G13227.1 6.36 7 111 1,165 2,764 Protein giàu serine

58 At3G16960.1 6.19 7 114 2,542 -1,191 Tương tự với protein liên quan đến tính bất

tự hợp của Arabidopsis

59 At3G18540.1 6.74 18 268 -1,621 -1,095 Protein chưa biết

60 At3G20557.1 6.2 8 130 1,507 -8,907 Protein chưa biết

61 At3G23050.1 6.2 15 243 -3,558 -1,744 Nhân tố phiên mã đóng vai trò như chất kìm

hãm biểu hiện của gen cảm ứng auxin

62 At3G28190.1 8.11 9 112 1,291 -1,046 Protein chưa biết

63 At3G28990.1 8.77 10 88 -1,103 -1,063 Protein chưa biết

vi

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

64 At3G29070.1 7.59 17 225 1,523 -1,324 Protein vận chuyển xuyên màng

65 At3G30845.1 8.65 9 105 1,900 -1,028 Protein chưa biết

66 At3G43410.1 7.44 9 122 1,472 -1,087 Protein chưa biết

67 At3G44935.1 7.34 8 110 1,525 -1,197 Protein chưa biết

68 At3G46900.1 7.01 11 158 -4,507 -1,494 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng

COPT2

69 At3G49270.3 7.28 11 152 - - Protein chưa biết

70 At3G50330.1 7.39 17 231 1,328 -1,003 Là nhân tố phiên mã liên kết với những

vùng DNA đặc hiệu HEC2 (HECATE 2)

71 At3G50360.1 6.55 11 169 3,116 1,194 Protein liên kết với ion Ca ATCEN2

(Centrin2)

72 At3G50890.1 6.45 16 249 -2,.608 -1,669 Là nhân tố phiên mã liên kết với những

vùng DNA đặc hiệu

73 At3G51920.1 7.33 11 151 -1,387 1,414 Protein liên kết với ion Ca (calmodulin 9)

74 At3G52270.1 6.64 19 287 -1,127 -1,466 Nhân tố phiên mã RNA polymerase II

75 At3G55240.1 6.12 6 95 -60,288 -26,876 Biểu hiện quá mức dẫn đến kiểu hình “giả

vàng úa trong điều kiện ánh sáng”

vii

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

76 At3G56610.1 7.09 9 128 1,129 -1,230 Protein chưa biết

77 At3G59900.1 6.2 8 130 10,699 -2,570 Protein chưa biết

78 At3G62090.1 6.38 22 346 64,561 2,277 nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến yếu

tố MYC

79 At3G62420.1 6.21 9 146 5,896 1,665 Nhân tố phiên mã bZIP liên kết với yếu tố

cis có trình tự ACTCAT

80 At4G00050.1 7.54 30 399 1,070 2,151 Nhân tố phiên mã liên kết với DNA đặc

hiệu

81 At4G00120.1 6.6 13 198 1,552 -2,254 Nhân tố phiên mã liên kết với DNA đặc

hiệu

82 At4G00850.1 6.31 14 223 2,062 1,280 Nhân tố phiên mã 3 tương tác với GRF1

83 At4G02450.1 9.58 23 241 1,569 -1,084 Protein giàu glycine, protein tham gia sửa

chữa DNA bắt cặp sai

84 At4G03120.1 6.31 13 207 -1,071 -1,057 Protein giàu proline, protein mang hợp chất

trong ty thể

85 At4G06490.1 6.21 9 146 1,701 -1,059 Protein chưa biết

86 At4G08395.1 6.93 16 232 1,256 -1,638 Protein chưa biết

viii

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

87 At4G12334.1 6.25 7 113 -9,787 -3,038 Gen giả mã hóa họ chuỗi truyền điện tử

P450

88 At4G12860.1 7.95 12 152 1,466 -1,023 Liên kết với ion Ca

89 At4G16030.1 7.08 8 114 -1,472 -1,086 Protein thuộc họ L19e ở ribosome, tham gia

cấu tạo nên ribosome

90 At4G16980.1 15.95 26 164 -40,311 1,015 Thuộc họ protein arabinogalactan

91 At4G20440.1 6.64 17 257 1,015 1,184 Protein giống với thụ thể của protein kinase

92 At4G22670.1 6.59 29 441 -2,081 -1,078 Protein có khả năng tương tác với

Hsp70/Hsp90 (ATHIP1 )

93 At4G32470.2 7 7 101 - - Có hoạt tính ubiquinol-cytochrome C

reductase

94 At4G33467.1 8.91 9 102 337,510 6,161 Protein chưa biết

95 At4G34590.1 6.33 10 159 8,256 3,271 Nhân tố phiên mã bZIP11, điều hòa biểu

hiện của ASN1 và ProDH2

96 At4G35070.2 6.22 13 210 - - Protein chưa biết

97 At4G37010.1 6.02 10 167 1,573 1,101 Protein caltractin / centrin

98 At5G09876.1 6.73 7 105 - - Protein chưa biết

ix

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

99 At5G19090.1 7 41 587 -51,320 -1,106 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng

100 At5G21990.1 7.59 42 554 2,228 1,064 Protein chứa vùng lặp lại tetratricopeptide

101 At5G23550.1 6.32 11 175 -3,809 1,203 Protein chưa biết

102 At5G26673.1 6.06 6 100 1,298 -1,832 Protein thionin kháng khuẩn

103 At5G37860.1 8.81 23 262 1,550 1,721 Protein liên kết với Cu

104 At5G39570.1 9.87 38 386 4,773 1,655 Protein chưa biết

105 At5G41170.1 6.27 33 527 4,180 -1,776 Protein chứa vùng pentatricopeptide lặp lại

106 At5G42325.1 6.03 14 233 2,702 2,448 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài

107 At5G42785.1 8.77 10 115 1,608 -4,315 Protein chưa biết

108 At5G44500.1 7.11 18 254 1,095 1,251 Protein B liên kết với ribonucleoprotein

trong nhân nhỏ

109 At5G46300.1 6.76 14 208 1,558 -2,234 Protein chưa biết

110 At5G47410.1 7.38 9 123 2,134 1,097 Protein chưa biết

111 At5G48485.1 6.93 7 102 -1,124 -2,399 Protein vận chuyển lipit và được giả định là

liên quan đến tính kháng bệnh

x

TT Tên gen

Met chiều dài

axit amin

Xử lý hạn và

đối chứng

(Số lần thay đổi)

Xử lý mặn

và đối chứng

(Số lần thay đổi)

Mô tả (%) (#)

112 At5G49500.1 6.85 34 497 1,175 -1,117 Protein nhận biết tín hiệu, có khả năng liên

kết với mRNA/7S RNA/GTP

113 At5G55410.2 7.34 8 110 -1,798 -1,060 Ức chế protease/protein dự trữ trong

hạt/protein vận chuyển lipid

114 At5G59030.1 8.28 14 170 -2,152 -1,427 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng

(COPT 1)

115 At5G59040.1 6.67 10 151 1,371 3,801 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng

(COPT 3)

116 At5G61710.1 8.44 13 155 1,852 -1,118 Protein chưa biết

117 At5G66815.1 6.73 7 105 1,777 -5,959 Protein chưa biết

118 At5G67060.1 6.25 15 241 1,500 -3,960 Nhân tố phiên mã HEC1

119 At5G67390.1 7.43 13 176 -4,172 -4,147 Protein chưa biết

120 ATMG00500.1 6.43 9 141 - - Protein chưa biết

121 ATMG00650.1 6.06 6 100 - - NADH dehydrogenase tiểu phần 4L