NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
Transcript of NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Văn Thu Huyền
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Văn Thu Huyền
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Lê Sơn
Hƣớng dẫn 2: TS. Đỗ Tiến Phát
Hà Nội - 2021
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu nhân giống các
dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi
cấy mô” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của TS. Lê Sơn và TS. Đỗ Tiến
Phát. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là do tôi trực tiếp thu
thập, đồng thời có kế thừa kết quả các đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo
lai sinh trưởng nhanh bằng chỉ thị phân tử‖ và đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo
giống Keo lai và Keo lá tràm phục vụ trồng rừng gỗ lớn ở một số vùng sinh
thái chính‖ do Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp –
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chủ trì thực hiện.
Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có)
đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ
tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công
bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam
đoan trên.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả
Văn Thu Huyền
Lời cảm ơn
Sau khi hoàn thành các môn học trong chƣơng trình đào tạo thạc sĩ,
đƣợc sự đồng ý của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, tôi tiến hành khóa luận ―Nghiên cứu nhân
giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương
pháp nuôi cấy mô’’. Khóa luận đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu Giống và
Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam,
Đức Thắng – Bắc Từ Liêm - Hà Nội.
Để hoàn thành khoá luận này tôi đƣợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình
về nhiều mặt của Ban lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên Viện Nghiên cứu
Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt
Nam cũng nhƣ cũng nhƣ cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy lớp BIO-19A
khóa 2019A, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàm lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam. Qua đây tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và
sâu sắc tới sự giúp đỡ và đóng góp vô cùng quý báu đó.
Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Đỗ Tiến Phát, TS. Lê
Sơn đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và
ngƣời thân đã giúp đỡ tôi có đƣợc bản luận văn này.
Trong quá trình thực hiện, do năng lực và điều kiện nghiên cứu còn hạn
chế nên khoá luận không tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự đóng
góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để khoá luận đƣợc hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Học viên thực hiện
Văn Thu Huyền
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Viết tắt Nghĩa đầy đủ
BAP 6- Benzyl Amino Purine
HSNC Hệ số nhân chồi
B5 Môi trƣờng Gamborg
Ca(OCl)2 Canxi Hypoclorit
GA3 Gibberellic Acid
HgCl2 Clorua thuỷ ngân
IAA Indol 3- Acetic Acid
IBA Indol Butiric Acid
Kn Kinetin
MS* Môi trƣờng MS cải tiến
NAA Naphthy Acetic Acid
NaClO Hypoclorit Natri
PVP Poly Vinyl Pyrrolidone
Tb Trung bình
TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu
TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu
WPM Môi trƣờng cho cây thân gỗ
Danh mục các bảng
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai ............................................ 44
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu ............................. 47
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản ............. 49
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn ở nồng độ
khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .................. 51
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi
Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .......................................................................... 53
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho nuôi
cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển ................................................ 56
Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp .............. 57
Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai dòng
BV376, BV586 và BB055............................................................................... 59
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai ............................. 62
Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai ............. 64
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào .................................. 18
Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai sau 25 ngày khử trùng ................................. 48
Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong các môi
trƣờng nhân chồi khác nhau ........................................................................... 50
Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai đƣợc nuôi cấy trong các công thức môi
trƣờng nhân chồi khác nhau ............................................................................ 52
Hình 3.4. Các chồi Keo lai dòng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy trong các công
thức thí nghiệm khác nhau. ............................................................................. 54
Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban đầu,
cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong môi trƣờng tối ƣu ................ 58
Hình 3.6. Các chồi Keo lai dòng BB055 ra rễ trong môi trƣờng có bổ sung
IBA và NAA .................................................................................................... 60
Hình 3.7. Các chồi Keo lai dòng BV376 ra rễ sau 10 ngày ........................... 61
Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai ............................................................................ 61
Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất .................................... 63
Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vƣờn ƣơm ........................................... 65
1
MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 6
1.1. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây rừng ...... 6
1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 6
1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống cây rừng
ở Việt Nam .................................................................................................. 12
1.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật ........................................................................................................ 15
1.2.1. Khái niệm .......................................................................................... 15
1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ..................... 17
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ................................................ 17
1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào ..................................... 17
1.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 19
1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy ......................................................................... 19
1.3.1.1. Môi trƣờng hóa học ........................................................................ 19
1.3.1.2. Môi trƣờng vật lý ........................................................................... 22
1.3.2. Vật liệu nuôi cấy ............................................................................... 23
1.3.3. Điều kiện vô trùng ............................................................................. 23
1.3.4. Buồng nuôi cấy ................................................................................. 24
1.4. Những vấn đề trong nhân giống in vitro .............................................. 25
1.4.1. Sự nhiễm mẫu ................................................................................... 25
1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền .......................................................... 25
1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy .................................................... 25
1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa .................................................................. 26
1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống .................................. 27
1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ............................................................................ 27
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ................................................................... 27
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ....................................................................... 28
2
1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ................................................................ 28
1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên ........................................................ 29
1.6. Một số kết quả nổi bật về chọn giống Keo lai và trồng rừng Keo lai ở
nƣớc ta ......................................................................................................... 30
1.7. Nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài keo .................................. 31
1.7.1. Trên thế giới ...................................................................................... 31
1.7.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 34
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 36
2.1. VẬT LIỆU nghiên cứu......................................................................... 36
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 36
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 37
2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm ............................................... 37
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.......................................................... 37
2.3.3. Xử lý số liệu ...................................................................................... 41
2.3.3.1. Tính toán các chỉ tiêu theo dõi ....................................................... 41
2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm ........ 42
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 44
3.1. Xác định Phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp cho các dòng Keo lai
nghiên cứu ................................................................................................... 44
3.2. Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho Keo lai .............................. 48
3.3. Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai ..................... 50
3.4. Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai ............... 52
3.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng ..................... 55
3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp .............................................. 55
3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai ............ 56
3.6. Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai ................................................ 58
3.7. Xác định thời gian huấn luyện cây thích hợp ...................................... 62
3.8. Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô ...................... 63
3.9. Xây dựng quy trình nhân giống cho các dòng Keo lai nghiên cứu ..... 65
3.9.1. Mục tiêu quy trình ............................................................................. 66
3
3.9.2. Phạm vi áp dụng ................................................................................ 66
3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình .......................................... 66
3.9.3.1. Điều kiện khí hậu ........................................................................... 66
3.9.3.2. Nguồn giống ................................................................................... 66
3.9.3.3. Điều kiện nhân lực ......................................................................... 66
3.9.3.4. Cơ sở vật chất ................................................................................. 66
3.9.4. Nội dung quy trình ............................................................................ 67
3.9.4.1. Khử trùng mẫu ............................................................................... 67
3.9.4.2. Nhân tạo mẫu ................................................................................. 67
3.9.4.3. Nhân nhanh .................................................................................... 68
3.9.4.4. Nâng cao chất lƣợng chồi .............................................................. 68
3.9.4.5. Cho ra rễ ......................................................................................... 68
3.9.4.6. Huấn luyện cây ............................................................................... 68
3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất: ..................................................... 69
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 70
4.1. Kết luận ................................................................................................ 70
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 78
4
MỞ ĐẦU
Giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm (thƣờng
đƣợc gọi tắt là Keo lai) đã đƣợc ghi nhận là có nhiều đặc điểm ƣu việt hơn so
với 2 loài bố mẹ nhƣ: sinh trƣởng nhanh, thích ứng đƣợc trên nhiều dạng lập
địa và kháng sâu bệnh. Từ năm 1991, các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát
hiện, nghiên cứu chọn lọc và đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Ở nƣớc
ta đến nay đã có trên 600.000 ha rừng Keo lai đã đƣợc trồng, trong đó nhu cầu
diện tích trồng rừng hàng năm của Keo lai đƣợc dự đoán từ 20.000 - 30.000
ha. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà cho đến nay mới chỉ có khoảng 10
dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Mặt khác,
rừng trồng các loài Keo nhiệt đới (bao gồm Keo lai và Keo tai tƣợng) gần đây
đƣợc ghi nhận là bị ảnh hƣởng nặng nề bởi nấm bệnh cũng nhƣ điều kiện bất
lợi của môi trƣờng và biến đổi khí hậu. Vì vậy, công tác chọn giống Keo lai
cần đƣợc liên tục tiến hành để vừa chọn tạo đƣợc các giống mới có năng suất,
chất lƣợng cao vừa đảm bảo đƣợc tính an toàn sinh học cho rừng trồng.
Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính Keo lai gần đây đã chọn đƣợc các
dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 là những dòng triển vọng và đã đƣợc
công nhận là giống Tiến bộ kỹ thuật nhằm đƣa các giống này vào sản xuất.
Để phát triển các giống này vào sản xuất thì việc nghiên cứu nhân giống bằng
phƣơng pháp nuôi cấy mô là hƣớng đi hiệu quả nhất. Mặc dù vậy, quy trình
nhân giống bằng nuôi cấy mô cho Keo lai trƣớc đây mặc dù đã đƣợc áp dụng
rộng rãi, nhƣng lại không thể áp dụng hoàn toàn cho các giống mới chọn lọc
này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các
kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trƣờng nên trong cùng
một loài, với các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau
cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền không đồng nhất), mặt khác
các công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào cho các dòng Keo lai mới
chọn tạo chƣa có. Do đó, xác định và tối ƣu hóa phƣơng pháp nhân giống cho
3 dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là
cần thiết và có ý nghĩa trong việc phát triển nhanh các giống có năng suất cao
này vào trồng rừng sản xuất.
5
Trên cở sở đó đề tài: ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng
suất cao BV376, BV586 và BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào‖
đã đƣợc tiến hành nhằm đáp ứng yêu cầu thiết yếu của thực tiễn sản xuất.
6
1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN
GIỐNG CÂY RỪNG
1.1.1. Trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực hiện bằng
nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc
biệt hoàn toàn vô trùng và đƣợc kiểm soát. Vì vật liệu nuôi cấy thƣờng rất nhỏ
và thực hiện trong môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống này còn
đƣợc gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro. Nuôi
cấy mô tế bào thực vật gồm: nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào,
nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy phôi, nuôi cấy các cơ quan (đỉnh sinh trƣởng, rễ,
lá, bao phấn, ...) [1].
Nuôi cấy in vitro đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
thƣơng mại ở nhiều nƣớc trên thế giới (Thụy Điển, Braxin, Australia,Trung
Quốc, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, ...) và đã thu đƣợc những thành công đáng
kể, đây là khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới
trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi
cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các
loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea abies),
Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus
caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Australia… [2].
Ở Thụy Điển vào cuối năm 1980 công ty Hilleshoge đã nhân giống cây
Vân sam (Picea abies) với số lƣợng 3 triệu cây/năm. Số lƣợng các loài Bạch
đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng,
đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy thành
công. Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây
trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E.
torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần
và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ [3].
7
Tại Australia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho
các cây đƣợc chọn lọc cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản
xuất trên quy mô lớn cho loài Bạch đàn trắng (E. camandulensis).
Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây
trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E.
torelliana. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng để nhân
nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc sản
xuất với quy mô lớn cho loài E. camandulensis [3].
Trung Quốc là nƣớc có nhiều thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô
cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ đƣợc nuôi cấy
nhƣ Dƣơng, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (Hông). Đến năm 1991 ở vùng Nam
Trung Quốc, ngƣời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai
của một số loài cây trồng rừng chủ yếu đã đƣợc chọn lọc qua khảo nghiệm.
Những cây mô này đƣợc dùng nhƣ là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các
vƣờn ƣơm địa phƣơng hoặc dùng thẳng vào trồng rừng [3].
Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55
loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân
nhanh loài Tre mạnh tông Dendrocalamus asper với số lƣợng khoảng 1 triệu
cây mỗi năm đáp ứng đƣợc nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng (dẫn theo
Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].
Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc
áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng
rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là:
Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài cây lá kim đƣợc nghiên
cứu nuôi cấy mô và đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể
đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách
xanh… Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có 4 loài đƣợc đƣa
vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp,
Thông ra-đi-a-ta (P. radiate) ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan;
Thông P. taera và P. seudotsuga menziesii ở Mỹ [3].
8
Gupta và các cộng sự đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của
cây non và từ mầm cây Tếch 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo đƣợc 500 cây nuôi
cấy mô từ một chồi ở cây trƣởng thành và 3.000 cây từ 1 cây non trong một
năm. Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986
cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [5].
Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đƣợc thử nghiệm nhân giống thành
công bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,
Carpinus... Các cây mô đã đƣợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy
chúng có kiểu hình tƣơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây
đƣợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài (Dẫn
theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn) [4].
Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng
nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng
dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là Pinus
nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim
đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong
đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria
japonica) Bách xanh. Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có
bốn loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia
sempevirens) ở Pháp; Thông P. radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New
Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [3].
Ngƣời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi
cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang
đƣợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trƣởng nhanh, kháng bệnh và cố
định đạm cao cho trồng rừng [3].
Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, báo cáo của McComb và Bennett (1986) cho
biết đã có trên 38 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy mô thành công từ
năm 1963, tiêu biểu là các công trình của Cresswell và Fossard (1974),
Cresswell và Nitsch (1975), Durnad – Cresswell và Nitsch (1977), Furze và
Cresswell (1985), Rao và Venkateswara (1985), Lakshmi Sita (1986), Warrag
9
và cộng sự (1987), (Warrag, và cộng sự, 1990). Các nhà khoa học Ấn Độ
thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus
camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana và cả từ các cây trội
có hàm lƣợng tinh dầu cao của bạch đàn chanh E. Citriodora [3]. Cây mô có
nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây
mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp
dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và
đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài E. camaldulensis [6].
Năm 1983, Gupta và cộng sự đã báo cáo rằng các chồi E. torelliana và
E. camaldulensis đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung Kn, BAP,
Cal.Pan và Biotin. NAA ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của E. torelliana trong
khi, với E. camaldulensis, IAA, IBA, IPA và NAA đều cho hiệu quả ra rễ.
Tác giả cũng đề cập đến vai trò thúc đẩy quá trình ra rễ in vitro của than hoạt
tính đối với 2 loài cây này. Kết quả là từ 1 đoạn chồi của cây trƣởng thành,
sau 1 năm đã tạo ra đƣợc 50.000 cây con in vitro E. torelliana và 20.000 cây
con đối với E. camaldulensis [6, 7].
Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ánh sáng đến kết quả nuôi cấy mô bạch
đàn Eucalyptus tereticornis của nhóm tác giả Das và Mitra (1990) cho thấy
không có chồi ra rễ trừ khi các chồi in vitro Eucalyptus tereticornis đƣợc
chuyển ra ngoài ánh sáng sau giai đoạn ủ tối [7]. Nghiên cứu của Warrag và
cộng sự (1990) đã chỉ ra khoảng thời gian ủ tối 4 tuần đã thúc đẩy sự hình
thành mô sẹo ở Bạch đàn lai [8].
Mullin và cộng sự (1997) đã thành công trong việc tái sinh chồi từ lá
cây Bạch đàn E. camaldulensis, môi trƣờng đƣợc tác giả sử dụng là môi
trƣờng cải tiến từ môi trƣờng của Muralidharan và Mascarenhas (1987) có bổ
sung 1,0 g/l Casein, 16,2 µmol/l NAA, 0,44 µmol/l BAP, 50g/l đƣờng và
0,5% Phytagar (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9].. Theo Ho và
cộng sự (1998), môi trƣờng MS bổ sung 16,2 µmol/l NAA và 4,44 µmol/l 6-
BAP có thể kích thích tạo mô sẹo và tái sinh chồi ở Bạch đàn E.
camaldulensis [10]
10
Đến năm 2000, cũng nghiên cứu trên cùng đối tƣợng là cây Eucalyptus
tereticornis, Sharma và cộng sự [11] lại thu đƣợc kết quả đối lập với kết quả của
Das và Mitra (1990) khi quan sát thấy xuất hiện sự hình thành rễ từ các chồi khi
ủ mẫu trong thời gian dài từ 8-10 ngày. Cùng thời gian này, Arezki và cộng sự
đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của Bạch đàn Caman trong môi trƣờng
MS bổ sung 5 µmol/l IBA, 30 g/l đƣờng, 0,5% agar và 0,2% than hoạt tính.
(dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9]. Báo cáo của González và
cộng sự (2002) đã nhấn mạnh tỷ lệ mô sẹo hình thành từ lá mầm của Bạch
đàn lai E. grandis x E. urophylla là cao nhất khi ở chế độ ủ tối 30 ngày [12].
Joshi và cộng sự (2003) đã nuôi cấy mô từ chồi nách của cây mẹ trƣởng
thành dòng FRI-6 Bạch đàn lai E. tereticornis x E. grandis. Môi trƣờng nhân
chồi MS bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA sau 150 ngày nuôi cấy, từ 1
chồi ban đầu có thể nhân ra đƣợc 20 - 25 chồi. 1/2MS là môi trƣờng tạo chồi
đủ tiêu chuẩn ra rễ mà nhóm tác giả đã xác định đƣợc, môi trƣờng này tạo
đƣợc 30 - 35 chồi/cụm, chiều dài chồi từ 1,5 - 2,0 cm, chồi xanh, sinh trƣởng,
phát triển tốt. Báo cáo cũng ghi nhận, có 75% chồi ra rễ trong môi trƣờng
1/2MS bổ sung 1,0 mg/l IBA [13].
Roberson Dibax và cộng sự (2005) [12] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi Bạch đàn E. camaldulensis,
kết quả cho thấy, các công thức phối hợp chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc thí
nghiệm có tỷ lệ phần trăm chồi hình thành từ mô sẹo là đạt cao nhất (90,2%)
với tất cả các nồng độ NAA khi ủ mẫu trong tối 30 ngày. Cũng theo tác giả, ở
chế độ này tỷ lệ mẫu bị hoại tử đã giảm đi đáng kể. Kết quả này cũng trùng lặp
với kết quả nghiên cứu trên Bạch đàn E. grandis của tác giả Laine và David
(1994) [14]. Trong báo cáo, Roberson Dibax và cộng sự cũng đƣa ra môi
trƣờng nhân nhanh chồi cho Bạch đàn Caman là MS bổ sung 2,7µmol/l NAA
và 4,44 µmol/l BAP, sau 30 ngày nuôi cấy thu đƣợc 11,8 chồi/cụm. Môi trƣờng
nâng cao chất lƣợng chồi và ra rễ là 1/2MS bổ sung 0,2% than hoạt tính sẽ tạo
ra các chồi non cao 1 - 8 cm, lá xanh thẫm; sau 10 - 15 ngày tỷ lệ ra rễ là 80%,
có 8 rễ/cây, cây cao từ 2 - 4 cm [15].
11
Năm 2007, Sotelo M và Monza J đã nuôi cấy mô cho E. maidenii từ
các đoạn chồi 50 x 3 cm, mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt bằng xà phòng và
dung dịch Benlate (2g/l ) và dung dịch Captan (2g/l) trong thời gian 60 phút
và dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl2) 0,1% trong 5 phút sau đó tráng
sạch 3 lần với nƣớc và ngâm trong Polyvinil pirrilidona (PVP) 1,5 g/l trong
vòng 60 phút ở 40C. Tác giả ghi nhận môi trƣờng nhân nhanh chồi cho E.
maidenii là QL (môi trƣờng do Quoirin và Lepoivre, 1977) đƣợc bổ sung 0,2
mg/l BAP và 0,02 mg/l IBA. Để nâng cao chất lƣợng chồi, nhóm tác giả đã
nghiên cứu hiệu quả của Cytokinin và Auxin khi kết hợp cùng nhau trong môi
trƣờng nuôi cấy, đồng thời nghiên cứu hiệu quả tăng chiều cao chồi nhờ GA3.
Kết quả cho thấy, môi trƣờng phù hợp là QL bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l
IBA cho 4 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình trên 2 cm. Đặc biệt, tác giả
còn nghiên cứu ảnh hƣởng của auxin và chế độ ánh sáng đến khả năng ra rễ
của các dòng Bạch đàn, kết quả chỉ ra rằng môi trƣờng 1/4QL bổ sung 10mg/l
Thiamine và 2mg/l IB, ủ tối 7 ngày là công thức ra rễ tốt nhất [16].
Trong báo cáo về ra rễ in vitro cho Bạch đàn lai E. urophylla x E.
grandis, Sophie Nourissier và cộng sự (2008) cũng đƣa ra nhận định, chế độ
ánh sáng ảnh hƣởng tới việc kéo dài chồi và ra rễ. Tỷ lệ ra rễ của Bạch đàn lai
E. urophylla x E. grandis đạt tới 81% khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng
1/2MS có bổ sung 5 μM IBA và 12.5 μM NAA [17].
Năm 2012, Girijashankar đã lấy các đoạn chồi từ cây mẹ 18 tháng tuổi
Bạch đàn E. camaldulensis để khử trùng. Mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt với
3 công thức: công thức 1 - dùng cồn 70% trong thời gian 1 phút; công thức 2 -
ngâm trong NaOCl2 1% có bổ sung 1 vài giọt Tween trong thời gian 15 phút,
sau đó tráng với 3 lần nƣớc sạch; công thức 3 - ngâm mẫu trong HgCl2 0,1%.
Kết quả cho thấy, sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 – 15 phút làm mẫu
bị hóa nâu, bị hoại tử và thậm chí bị chết. Sử dụng NaOCl2 trong thời gian 15
– 17 phút giúp giảm số lƣợng mẫu nhiễm tƣơng tự nhƣ khi sử dụng HgCl2
0,1% nhƣng phƣơng pháp này lại không làm tổn thƣơng mẫu. Môi trƣờng
nhân nhanh chồi đƣợc xác định là MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l
NAA cho 6,3 chồi/cụm. Môi trƣờng 1/2MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số
12
lƣợng chồi tăng lên 3 lần, chiều dài chồi trên 2 cm. Môi trƣờng 1/2MS bổ
sung 1 mg/l IBA cho 60% chồi ra rễ, có 2 - 8 rễ/cây, rễ dài 2 - 7 cm [6].
Khi nghiên cứu nuôi cấy mô cho Bạch đàn lai HFRI-5 (E.
camaldulensis Dehn x E. tereticornis Sm), Natasha Mahajan và cộng sự
(2012) đã thực hiện trên chồi đỉnh, chồi cành và lá cây mẹ 4 - 8 tuổi. Vật liệu
đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 1 – 2 h với một vài giọt Tween 20, sau đó
đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách lắc trong cồn 70% trong thời gian 30 giây,
tiếp theo vật liệu đƣợc ngâm trong HgCl2 trong 2 phút. Kết quả cho thấy việc
bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy MS với 10%
nƣớc dừa và 500 mg/l PVP có ảnh hƣởng lớn tới khả năng nhân chồi Bạch
đàn lai. Nồng độ 3,0 mg/l BAP là nồng độ thích hợp để nhân nhanh lƣợng
chồi bạch đàn, trong khi đó, không có chồi nào đƣợc tạo thành khi ở nồng độ
BAP nhỏ hơn 3,0 mg/l và ở nồng độ lớn hơn 5,0 mg/l. Tác giả cũng khẳng
định chế độ ánh sáng là nhân tố vô cùng quan trọng đối với sự tái sinh chồi ở
Bạch đàn [18].
Có thể nói nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các loài
cây nông lâm nghiệp đang đƣợc áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nƣớc trên
thế giới. Đối với ngành lâm nghiệp nƣớc ta, đây là phƣơng pháp tối ƣu để đƣa
nhanh các giống mới chọn lọc vào trồng rừng sản xuất.
1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống
cây rừng ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đƣợc phát triển từ những năm 70 và đã đƣợc
một số đơn vị nhƣ: Trƣờng Đại học Nông Nghiệp, Viện CNSH, Viện KHKT
NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Trung tâm Nghiên cứu
Giống cây rừng (nay là Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm
nghiệp), ... nghiên cứu ứng dụng thành công cho nhiều loài cây trồng nông
lâm nghiệp. Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy
mô lớn trong lâm nghiệp nƣớc ta là Công ty Giống lâm nghiệp Trung ƣơng,
Trung tâm Khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, Xí nghiệp giống
Thành Phố Hồ Chí Minh, Công ty CP Giống cây trồng Nguyên Hạnh, Công
13
ty Lâm nghiệp Quy Nhơn, Công ty Lâm nghiệp Tiền Phong… [4]. Hiện nay
một số tỉnh và địa phƣơng đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho
công tác giống cây trồng và đã đạt đƣợc những thành công đáng kể, góp phần
không nhỏ trong việc phát triển trồng rừng dòng vô tính ở nƣớc ta.
Trồng rừng bằng cây từ nuôi cấy mô hoặc cây hom lấy từ dòng mẹ vô
tính tốt nhất của cây lai đời F1 (đã qua chọn lọc và đánh giá) thì rừng trồng
vừa sinh trƣởng nhanh vừa khá đồng đều. Chính vì thế trong công văn số 268
BNN- KHCN ngày 13/01/1998, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã
khuyến cáo các đơn vị không dùng hạt Keo lai để gây trồng rừng sản xuất mà
nên dùng dòng vô tính Keo lai đã đƣợc khảo nghiệm và đánh giá để gây trồng
rừng [19].
Dƣơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài
Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và bạch đàn nâu (E. urophylla) từ cây trội
của 2 loài này đã tạo đƣợc một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2
lần [20].
Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai của Bạch đàn trắng đã
đƣợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1997) thực hiện thành công từ năm 1993
thấy rằng dùng BAP thêm vào môi trƣờng MS có thể tạo đƣợc 20-30 chồi/mẫu.
Môi trƣờng MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%. Tuy nhiên chất lƣợng các chồi
thu đƣợc chƣa cao, tỷ lệ sống cây con ngoài vƣờn ƣơm chƣa đáp ứng đƣợc yêu
cầu sản xuất (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].
Thông qua chƣơng trình hợp tác với Trung Quốc một số dòng Bạch đàn
có năng suất cao: U6, U16 và công nghệ nhân giống đã đƣợc chuyển giao cho
các đơn vị trong nƣớc nhƣ: Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, Trung tâm
Nghiên cứu Giống cây rừng, Trung tâm ứng dụng KHSX nông lâm nghiệp
Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó các
nghiên cứu nhân giống cho cây lâm nghiệp đã đƣợc nhiều đơn vị tiến hành.
Mai Đình Hồng (1995) đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn
dòng U6 là: môi trƣờng nhân chồi (MS + 3% đƣờng + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l
BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trƣờng tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đƣờng + 5g/l agar
14
+ 1mg/l IBA) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000) [21].
Kết quả nghiên cứu nhân giống thông qua hệ thống tái sinh mô sẹo phôi
hóa và nhân chồi in vitro cho Bạch đàn của Chu Bá Phúc, Đỗ Năng Vịnh,
Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự (2003) cho thấy môi trƣờng thích hợp để tạo
callus từ lá non của cây nuôi cấy mô đối với Bạch đàn là MS + 0,5mg/l BAP +
1,5mg/l 2,4-D, callus có chất lƣợng tốt, thích hợp cho tái sinh phôi, tỷ lệ callus
đạt 87,50%. Callus tạo ra từ đoạn thân cây non nuôi cấy mô của cây Bạch đàn
đều có tỷ lệ % thấp hơn so với tỷ lệ callus tạo ra từ mô lá non. Khả năng nhân
chồi Bạch đàn 5,20 lần ở môi trƣờng MS + 1,0mg/l BAP + 0,2mg/l Kinetin sau
20 ngày cấy chuyển.
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000, 2011) đã nghiên cứu nuôi cấy mô
thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị
nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5-8. Môi trƣờng MS có
bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6
chồi/cụm). Môi trƣờng ra rễ thích hợp là môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l
IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8 % [21,4].
Nghiên cứu nhân giống cho một số giống cây rừng nhƣ Trầm dó, Tre
tàu và Tre mạnh tông cũng đã đƣợc thực hiện và cho kết quả khích lệ [22,23].
Đoàn Thị Nga, Mai Đình Hồng thuộc Viện nghiên cứu Cây nguyên liệu
giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng U6 và
PN2. Tác giả cho rằng, môi trƣờng thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l
BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trƣờng ra rễ tối ƣu là 1/4 MS + 1mg/l IBA (Dãn
theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2003) [22].
Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và các cộng sự đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy
mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 hoá chất khử trùng thích hợp là chất kháng
sinh với nồng độ 4,5mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và
PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian
là 12 phút. Môi trƣờng nhân chồi thích hợp là môi trƣờng MS cải tiến (kí hiệu
MS*) + BAP 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l + các phụ gia khác [4].
15
Đối với các loài cây thân gỗ, có thể kể đến các công trình nhân giống in
vitro cây Cà phê của Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (1987); cây Điều
Anacardium occidentale L. của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2003); cây Ba
kích Morinda officinalis How của Vũ Hoài Sâm và cộng sự (giai đoạn 2001 -
2005); cây Tre tàu Sinocalamus latiflorus và Tre mạnh tông Dendrocalamus
asper của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2002); cây Tếch của Trần Văn Minh và
Bùi Thị Tƣờng Thu (2003); Thông Caribe Pinus caribaea của Trần Trung Hiếu
và cộng sự (2002 - 2003); cây Tếch, Trầm, Thông, Hông, Bạch đàn của Chu Bá
Phúc, Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (2003); cây Trầm của Đoàn Thị Mai và cộng
sự (2005); cây Hông Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (2005); Lát hoa Đoàn
Thị Mai và cộng sự (2006 - 2010) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và cộng
sự) [4].
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cho cây rừng ở nƣớc
ta là tƣơng đối đa dạng. Các kết quả này không những mang ý nghĩa khoa học
mà còn mang tính thực tiễn rất cao trong việc phát triển các giống cây rừng
mới đƣợc chọn lọc trong sản xuất. Hiện nay, nhu cầu về cây giống từ nuôi cấy
mô cho trồng rừng dòng vô tính ở nƣớc ta lên tới khoảng 50 triệu cây/năm,
theo chƣơng trình phát triển trồng rừng kinh tế của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn với mục tiêu sử dụng 10% cây giống vô tính trong trồng rừng
sản xuất (chủ yếu là nuôi cấy mô) thì số lƣợng cây giống cần thiết là khoảng
80 triệu cây/năm thì việc nghiên cứu nhân giống cho các giống cây rừng đã
đƣợc cải thiện về di truyền sẽ là hƣớng đi có ý nghiã lớn trong việc nâng cao
năng suất, chất lƣợng rừng trồng từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế của trồng
rừng, từ đó góp phần cải thiện cuộc sống của ngƣời làm nghề rừng [24].
1.2. KHÁI NIỆM VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.2.1. Khái niệm
Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (propagation by tissue
culture) hay vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các
phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ đƣợc tách khỏi cây đang
16
đƣợc dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các
bộ phận đƣợc dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh,
bao phấn, phôi và các bộ phận khác nhƣ vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl)
... [1].
Phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thƣờng dùng gồm các phƣơng pháp
sau: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào,
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần, nuôi cấy
phôi hữu tính và vô tính. Trong đó, nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định
[2] là những phƣơng pháp chính đƣợc dùng trong nhân giống cây rừng.
Nuôi cấy mô thƣờng đƣợc trẻ hoá cao độ và có rễ giống nhƣ cây mọc từ
hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Ví dụ: cây
mô Keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng nhƣ các loài cây bố mẹ là Keo tai
tƣợng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá
giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc nhƣ những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây
hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trƣởng thành và không có rễ
cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lƣu cục bộ thì biểu hiện rõ
rệt) [24]. Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ
hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây
mô, cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành và cây ghép của cây Bulô
(Betula sp.). Kết quả cho thấy, sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng
protein giống nhƣ cây mọc từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trƣởng
thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành sau 4-8
tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải
sau 8 năm mới có hoa [25]. Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ
trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành (chứ
không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ nhƣ cây mọc từ
hạt.
17
1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng
của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ
lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ
gen (genom). Đặc tính của thực vật đƣợc thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong
từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di
truyền tƣơng ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp,
trong mối tƣơng tác qua lại với điều kiện môi trƣờng, cơ quan, mô hoặc tế bào
đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di
truyền giống nhƣ cây mẹ [29].
1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và
phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống
nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế
bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có đƣợc cấu
trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào sự phân hoá.
Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.
Quá trình phân hoá có thể diễn nhƣ sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn
mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, ở điều kiện
thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống nhƣ tế bào phôi sinh và tiếp tục
thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế
bào.
18
Hình 1.1. Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen đƣợc hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức
chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa
trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp
điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ đƣợc xảy ra
theo một chƣơng trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [26].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô- tế bào thực chất là kết
quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách
định hƣớng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính
toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất
điều tiết sinh trƣởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng hai
nhóm chất này trong môi trƣờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái
khác nhau. Trong môi trƣờng nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA,
NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy theo hƣớng tạo chồi, ngƣợc lại nếu tỷ lệ cao thì mô
nuôi cấy sẽ theo hƣớng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hƣớng tạo
mô sẹo (callus) [1].
Tế bào phôi sinh
Phân hóa tế bào
Tế bào chuyên hóa Tế bào giãn
Phản phân hóa
19
1.3. CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau,
quá trình này thƣờng bị ảnh hƣởng bởi các nhân tố sau:
1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy
1.3.1.1. Môi trường hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy đƣợc coi là
các yếu tố chính quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy. Môi
trƣờng nuôi cấy chính là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự
tăng trƣởng và phân hoá mô nuôi cấy in vitro. Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm
thành phần sau:
+ Nguồn các bon: là nguồn cung cấp năng lƣợng chính cho các mẫu vật
nuôi cấy. Do trong giai đoạn này chúng chƣa có khả năng quang hợp để tổng
hợp nên chất hữu cơ phục vụ cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của
mình. Nguồn cácbon thƣờng đƣợc sử dụng là các loại đƣờng (chủ yếu là
saccarose và glucose) với nồng độ khoảng 20-30 mg/l. Nó có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, tăng sinh khối, ngoài ra nó
còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trƣờng [27].
+ Nguồn Nitơ: Thông thƣờng, nguồn nitơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở
hai dạng là HN4+ và NO3
- (nitrat) với tỷ lệ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái
phát triển mô. Qúa trình hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật có hiệu quả hơn
so với NH4+ [26].
+ Các nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này có chức năng cung cấp
nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc
giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trƣờng đƣợc
thuận lợi. Các nguyên tố đa lƣợng chính là những nguyên tố khoáng nhƣ: N,
P, K, S, Mg, Ca…. Nhìn chung, các nguyên tố này đƣợc sử dụng ở nồng độ
khá cao (trên 30 ppm) [26].
20
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: gồm các nguyên tố Fe, Cu, BO, Zn, Mn,
Co, I… đây là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát
triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động
của enzym. Chúng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố
đa lƣợng để đảm bảo sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của cây [28].
+ Các vitamin: Mặc dù mẫu vật nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp đƣợc
các Vitamin cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển, nhƣng sự đáp
ứng là chƣa đủ cho nhu cầu vì các mẫu đƣợc nuôi cấy mô thƣờng có sinh
trƣởng nhanh nên nhu cầu về dinh dƣỡng là khá lớn. Các Vitamin B1 và B6 là
những Vitamin cơ bản nhất thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy với nồng
độ thấp khoảng 0,1-1mg/l [29].
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch
chiết nấm men, cà rốt, chuối, khoai tây... đƣợc bổ sung vào môi trƣờng có tác
dụng kích thích sinh trƣởng mô sẹo và các cơ quan. Nƣớc dừa đã đƣợc sử
dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong các
môi trƣờng nhân nhanh in vitro. Trong nƣớc dừa thƣờng chứa các axit amin,
acid hữu cơ, đƣờng, ARN và ADN. Đặc biệt trong nƣớc dừa còn có chứa
những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô nhƣ: Myo Inositol, các hợp chất
có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin [27].
+ Chất làm đông cứng môi trường (giá thể trong nuôi cấy): Agar
(thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nƣớc khá cao 6-
12g/l. Độ thoáng khí của môi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rõ rệt đến sinh
trƣởng mô nuôi cấy. Trong nhân giống cho các đối tƣợng cây rừng, nồng độ
thạch dao động trong khoảng 4-8g/l tuỳ thuộc mục tiêu và đối tƣợng nuôi cấy
nuôi cấy [28].
+ Các chất điều hoà sinh trƣởng
Sinh trƣởng và phát triển của cây đƣợc đảm bảo bởi hai cơ chế sinh lý
trái ngƣợc nhau, tác nhân kích thích và tác nhân ức chế. Việc cân bằng giữa
các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng có ý nghĩa
quyết định trong việc điều hòa sự sinh trƣởng của cây [29].
21
Các Phytohormon là những chất điều hòa sinh trƣởng lá các chất có bản
chất hóa học khác rất khác nhau, nhƣng có cùng chức năng điều khiển sinh
trƣởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá
trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nhƣ: phân chia, biệt hoá tế bào…
ngoài ra còn có ảnh hƣởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác.
Các phytohormon thƣờng sử dụng cho nuôi cấy mô thuộc 3 nhóm: Auxin,
Cytokinin và Giberillin. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trƣờng
quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
* Auxin: là một loại phytohormon có khả năng kích thích sự phân chia
mạnh mẽ của tế bào, giúp cây phát triển chiều ngang và kích thích sự ra rễ ở
thực vật nhƣng lại kìm hãm sự phát triển của chồi phụ. Nhóm này gồm có các
chất chính là: IBA (3-Indol Butyric Acid), IAA (Indol Acetic Acid), NAA
(Nathyl Acetic Acid) … trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thƣờng đƣợc sử dụng
để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự
phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [1, 27].
* Cytokinin: đƣợc phát hiện sau GA và Auxin. Đây là một loại
phytohormon có tác dụng thúc đẩy sự phân chia tế bào, tạo chồi, rễ phụ; làm
chậm sự lão hóa của lá, tăng cƣờng các chất dinh dƣỡng về phía các bộ phận
đang phát triển. Các cytokinin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng chủ yếu để kích
thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo
và cơ quan. Các hợp chất thƣờng sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl Amino
Purine - C10H9N05), BAP (6-Benzyl Amino Purine), Zip (Izopentenyl
Adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP đƣợc sử dụng phổ
biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Ngƣời ta cũng chứng
minh đƣợc tỉ lệ về hàm lƣợng auxin/cytokinin đóng vai trò quyết định trong
việc phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Để tạo rễ thì tỉ lệ này cần lớn hơn một,
nếu nhỏ hơn 1 mô sẽ biệt hóa theo hƣớng tạo chồi. Còn nếu tỉ lệ
auxin/cytokinin gần bằng 1 thì mẫu nuôi cây sẽ biệt hóa tạo mô sẹo [1, 27].
* Gibberellin: Nhóm này có khoảng 50 loại hormone khác nhau nhƣng
quan trọng nhất là GA3 (Gibberellin Acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy
mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó
22
GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng nhƣ tạo
chồi phụ [1, 27]. Ngoài ra, nó còn có tác dụng ảnh hƣởng đến sự ra hoa của
một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng của
cây.
Ngoài ra, độ pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng khá rõ nét tới khả năng
hoà tan các chất khoáng trong môi trƣờng. Nếu pH thấp (<4,5) hoặc cao
(>7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro.
Nên việc xác định đƣợc độ pH ban đầu của môi trƣờng cho quá trình sinh
trƣởng và phát triển của mô cấy là cần thiết. Độ pH thƣờng đƣợc sử dụng
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.
Các yếu tố khác cũng cần đƣợc chú ý khác trong nuôi cấy in vitro là: sự
ổn định của môi trƣờng và khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây.
1.3.1.2. Môi trường vật lý
Sự sinh trƣởng và phát triển của các tế bào, mô đƣợc điều khiển bởi sự
kết hợp giữa điều kiện vật lý trong phòng và điều kiện dinh dƣỡng trong ống
nghiệm. Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trƣờng vật lý đƣợc
quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái
của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hƣởng tới mẫu cấy thông qua thời gian
chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng [27].
Chu kỳ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng cũng phải phù hợp với đặc
tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng biến
động từ 8 − 12 h/ngày.
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng thì chất lƣợng ánh
sáng cũng ảnh hƣởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh
sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh
sáng xanh thì ức chế sự vƣơn cao của chồi nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự
sinh trƣởng của mô sẹo.
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tƣơng đối luôn bằng 100%
nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
23
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hƣởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và
các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hƣởng tới sự
hoạt động của Auxin, do đó làm ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của cây mô.
Theo kết quả nghiên cứu của Von Arnold (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là
200C/15
0C hoặc 20
0C/18
0C tỷ lệ ra rễ đạt đƣợc khoảng 33%, thậm chí còn
thấp hơn [30]. Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở
nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô,
nhiệt độ thƣờng đƣợc duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ
17- 200C.
1.3.2. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành công của quá
trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá
đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Tuy nhiên, thực
tế nghiên cứu cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ
nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế
bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành
công càng cao. Nhƣ vậy, tế bào và phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế
bào của đỉnh sinh trƣởng nhƣ: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tƣợng
tầng… sau đó là các tế bào sinh dục nhƣ noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai
đoạn non [1].
1.3.3. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu
điều kiện này không đƣợc đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị
nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại.
Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phƣơng pháp khử
trùng mẫu thích hợp, phƣơng tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy
vô trùng. Chọn đƣợc đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi
trƣờng dinh dƣỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trƣởng nhanh [29].
Các phƣơng tiện khử trùng chính gồm:
24
Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trƣờng nuôi cấy,
dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nƣớc có áp suất và nhiệt độ cao (1,1 - 1,2
atm, 120 -1300C).
Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy
Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đƣa vào nuôi cấy ngƣời ta
thƣờng sử dụng các dung dịch nhƣ HgCl2 (Clorua thuỷ ngân), NaOCl
(Hypoclorit Natri), Ca(OCl)2 (Hypoclorit Canxi), H2O2 (ôxi già)…cồn
dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng
đƣợc ở nhiệt độ cao nhƣ dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà
sinh trƣởng. Hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng một hệ thống bơm khử
trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy
tế bào trần hay huyền phù tế bào.
Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng
phải đƣợc tiệt trùng liên tục trƣớc và sau khi làm việc bằng Foocmon
kết hợp chiếu đèn tử ngoại.
Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box.
Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng
và thổi không khí vô trùng về phía ngƣời ngồi thao tác.
1.3.4. Buồng nuôi cấy
Buồng cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải
đảm bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ 25 – 270C.
- Ánh sáng đạt 2000 – 3000 lux.
- Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.
25
1.4. NHỮNG VẤN ĐỀ TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO
1.4.1. Sự nhiễm mẫu
Nhiễm là vấn đề rất đƣợc quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực
vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây
nhiễm mẫu nhƣ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, môi trƣờng, dụng cụ và
các thiết bị (màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy)…
Để giảm khả năng nhiễm mẫu bằng cách:
- Có thể sử dụng một số chất kháng sinh (Amphostericin B,
Gentamicin, Penicillin…) để diệt vi khuẩn và nấm.
- Sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy.
1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây
trồng đồng nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những biến
dị soma qua nuôi cấy mô sẹo… Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không
lặp lại. Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng
bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thƣờng là biến dị về chất lƣợng, số lƣợng
và năng suất nhƣng biến dị này không di truyền [29]. Những nhân tố gây ra
biến dị mẫu vật nuôi cấy mô gồm:
- Kiểu di truyền của mô nuôi cấy: các loài cây khác nhau có tỷ lệ đột
biến khác nhau
- Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nhiều càng cho độ biến dị
cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyển
ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyển ngắn làm giảm sự biến dị.
1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy
Thƣờng chúng ta hay thấy hiện tƣợng hóa nâu hay hóa đen mẫu làm
sinh trƣởng của mẫu bị ngăn chặn. Hiện tƣợng này là do mẫu nuôi cấy có
chứa các hợp chất Tanin hay Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mô
26
non. Để khắc phục hiện tƣợng này ngƣời ta thƣờng hay áp dụng phƣơng pháp
sau đây:
− Than hoạt tính đƣợc đƣa vào môi trƣờng giúp cản quá trình hóa nâu
hay đen với nồng độ thƣờng dùng 0,1-0,3%.
− Poly Vinyl Pyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thụ
phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loài cây trồng khác
nhau.
− Nuôi cấy mẫu trong môi trƣờng lỏng, oxy thấp, không có ánh sáng
trong 1 - 2 tuần
− Cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trƣờng ngăn chặn quá
trình oxy hóa phenol, chất khử thƣờng đƣợc dùng nhƣ ascorbic acid, citric
acid, L- cystein hydrochloride…
− Sử dụng mẫu nuôi cấy rất non có ít tanin, phenol…
1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa
Trong nuôi cấy mô cũng thƣờng gặp hiện tƣợng này. Khi chuyển ra
khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nƣớc và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này
thƣờng thấy khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng hay môi trƣờng bán rắn, đặc
biệt là khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nƣớc tập trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh hóa có thể sử dụng một số phƣơng pháp
sau:
− Làm giảm ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy
bằng cách tăng nồng độ đƣờng và tạo điều kiện môi trƣờng nuôi cấy (nhiệt
độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp.
− Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy thông qua tạo môi trƣờng nuôi cấy
(thông gió tốt, tăng cƣờng ánh sáng, giảm nhiệt độ phòng cấy) thích hợp.
− Giảm nồng độ chất chứa N trong môi trƣờng nuôi cấy.
− Xử lý Acid Abxixic (ABA) hoặc các chất ức chế sinh trƣởng.
27
1.5. CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho
các bƣớc tiếp theo. Giai đoạn này coi nhƣ là một bƣớc thuần hoá vật liệu để
nuôi cấy. Cây giống đƣợc đƣa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích
ứng với môi trƣờng mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu
nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống. Trong trƣờng hợp cần thiết
có thể làm trẻ hoá vật liệu giống.
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy.
Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong
những điều kiện vô trùng. Ngƣời ta thƣờng dùng một hoá chất nhƣ HgCl2,
Ca(0Cl)2, Na0Cl, H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật
liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên
tắc, mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa,
quả…) nhƣng theo Blatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi
cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trƣởng thành khác [32]. Vì
vậy, ngƣời ta thƣờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.
Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng
thấp thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh
trƣởng mạnh của cây trong mùa sinh trƣởng cho khả năng tái sinh tốt hơn.
Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc
polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trƣờng [19]. Giai đoạn này cần đảm bảo
các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên
khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thƣờng kéo dài
từ 4 - 6 tuần.
28
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ƣu điểm của phƣơng pháp nhân giống in vitro so với
các phƣơng pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là
giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn
này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trƣờng và điều kiện
ngoại cảnh thích hợp. Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh
trƣởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lƣợng cây con
tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Theo nguyên
tắc chung thì môi trƣờng có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ
nuôi thƣờng là ở nhiệt độ 25-270C và 10-16h/ngày, cƣờng độ chiếu sáng
1.000-2.000lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lƣợng cây con tối đa
trong thời gian ngắn nhƣng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của
cây.
1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)
Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô
trùng khi đã đạt đƣợc kích thƣớc nhất định, các chồi đƣợc chuyển từ giai đoạn
3 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ
và trở thành cây hoàn chỉnh. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng giảm lƣợng Cytokinin
và tăng lƣợng Auxine để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Ngƣời ta
thƣờng dùng các chất NAA (Acid α- Naphthyl Acetic), IBA (Acid β - Indol
Butyric), IAA (Acid β - Indol Acetic) ở nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho
hầu hết các loại cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Giai đoạn này
thƣờng kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng Auxin để
rễ phát triển. Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do
hoạt động của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chƣa chuyển sang giai đoạn
tự dƣỡng.
Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy, đối với Keo lai và lát hoa, việc
cho ra rễ trực tiếp: dùng chồi nuoi cấy chấm bột kích thích ra rễ (là hỗn hợp
phụ gia và auxin), rồi chăm sóc trên luống cát nhƣ giâm hom có thể rút ngắn
đƣợc giai đoạn ra rễ trong phòng thí nghiệm với tỷ lệ ra rễ đảm bảo. Tuy
29
nhiên, cũng giống nhƣ với giâm hom, quá trình này phụ thuộc khá nhiều vào
điều kiện thời tiết [4].
1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngoài trời. Cây mô đƣợc chuyển từ môi trƣờng dị dƣỡng sang môi trƣờng tự
dƣỡng, nên phải tập cho cây quen dần với môi trƣờng tự nhiên, tránh sự thay
đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt
những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đƣa ra ngoài giá
thể. Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nƣớc và sạch
bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới đƣa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50%
để cây con không mất nƣớc và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau
2-3 ngày đƣa ra ngoài cây mô sẽ sinh trƣởng ổn định, chăm sóc cây mô tƣơng
tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.
Đối với nuôi cấy mô, chất kích thích ra rễ IBA, IAA và NAA ở các
nồng độ khác nhau (để bổ sung cho môi trƣờng MS) đã đƣợc thử nghiệm với
các đối tƣợng cây lâm nghiệp [4], kết quả cho thấy khi dùng IBA ở nồng độ 2
mg/l đối với ra rễ chồi trong ống nghiệm, còn ra rễ trực tiếp bằng cách ngâm
và chấm dung dịch ra rễ sử sụng nồng độ 3 ppm đã cho tỷ lệ ra rễ cao (80-
92%) ở các dòng Keo lai BV10, BV29, BV32 và BV33. Nồng độ cho tỷ lệ ra
rễ cao ở dòng BV16 (65%) và BV5 (50%) là 1ppm của IBA. Đồng thời đƣa
cây nuôi cấy mô ra rễ trực tiếp (bằng cách chấm thuốc bột TTG1) với giá thể
cát sông thực hiện thành công cho cây Lát hoa, Keo lai [4,21,23, 33,34].
Tuy vậy, kết quả xử lý ra rễ cho cây mô bằng thuốc bột TTG1 1,0%
trên môi trƣờng cát sông do Lê Đình Khả cùng kỹ sƣ lâm nghiệp Malaysia
thực hiện tại tập đoàn sản xuất gỗ dán Ta Ann ở Sarawak (Malaysia) vào ngày
1 tháng 12 năm 1999 và kiểm tra vào ngày 6 tháng 1 năm 2000 đã thấy các
dòng BV5, BV10, BV16, BV32 và BV33 đều có tỷ lệ ra rễ 100%, dòng BV29
có tỷ lệ ra rễ thấp nhất cũng đạt 86,7% đến ngày 24 tháng 1 (gần 2 tháng sau
khi cấy giâm) vẫn giữ đƣợc tỷ lệ sống là 81- 100% (với tỷ lệ chung là
91,51%) [19]. Điều đó cho thấy khi giâm trên môi trƣờng cát sông. IBA đƣợc
30
sử dụng ở dạng thuốc bột TTG1 1% là chất kích thích có hiệu quả ra rễ cao
nhất đối với các dòng keo lai đã đƣợc đánh giá và lựa chọn [35].
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngoài trời. Cây mô đƣợc chuyển từ môi trƣờng dị dƣỡng sang môi trƣờng tự
dƣỡng nên phải tập cho cây quen dần với môi trƣờng tự nhiên, tránh sự thay
đổi đột ngột làm cho cây có thể bị sốc hoặc bị chết. Khi cây con đã cứng cáp
và đạt đƣợc tiêu chuẩn về chiều cao, số lá và số rễ thì đƣa ra ngoài giá thể.
Giá thể tiếp nhận cây nuôi cấy mô phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nƣớc và
sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới đƣa cây từ bình nuôi ra, cần duy trì
độ ẩm trên 50% để cây con không mất nƣớc và làm giàn che để tránh ánh
sáng quá mạnh. Sau 2-3 tuần đƣa ra ngoài cây mô sẽ sinh trƣởng ổn định,
chăm sóc cây mô tƣơng tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.
Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể đƣợc chia thành các giai
đoạn nhƣ trên nhƣng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự
kế thừa của giai đoạn trƣớc. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị
môi trƣờng là đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hƣởng xuyên suốt và
quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nhân giống.
1.6. MỘT SỐ KẾT QUẢ NỔI BẬT VỀ CHỌN GIỐNG KEO LAI VÀ
TRỒNG RỪNG KEO LAI Ở NƢỚC TA
Keo lai (Acacia hybrid) là tên gọi tắt của giống lai tự nhiên giữa Keo tai
tƣợng và Keo lá tràm. Giống lai này lần đầu tiên đƣợc phát hiện nhờ công của
Messrs Herburn và Shim vào năm 1972 trong số các cây Keo tai tƣợng trồng
ven đƣờng ở Sook Telupid thuộc bang Sabah của Malaysia [19]. Đây là giống
cây sinh trƣởng nhanh, có khả năng thích ứng lớn, khả năng cải tạo đất tốt và
có tiềm năng bột giấy cao hơn Keo tai tƣợng và Keo lá tràm. Ở Việt Nam, vào
đầu những năm 1990, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng (nay là Viện
Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp) đã phát hiện, chọn lọc
và khảo nghiệm một số dòng Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá
tràm có năng suất trung bình từ 17 - 35 m3/ha/năm, cao gấp 1,5 - 3 lần các loài
cây bố mẹ [19]. Trong giai đoạn 1993 - 1999, một số giống keo lai tự nhiên đã
31
đƣợc Trung tâm Khoa học sản xuất lâm nghiệp Đông Nam Bộ phối hợp với
Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng (Nay là Viện Nghiên cứu Giống và
Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp) chọn lọc và khảo nghiệm tại Trảng Bom với
ký hiệu là TB (dẫn theo Viện Nghiên cứu Giống và CNSHLN, 2011). Từ 1996
- 2000 và 2001 - 2005, đề tài ―Nghiên cứu chọn các dòng keo và bạch đàn
chống chịu bệnh có năng suất cao‖ (PGS.TS Nguyễn Hoàng Nghĩa) cũng đã
chọn tạo đƣợc 2 dòng keo lai tự nhiên ký hiệu là AH1 và AH7, có mẹ là keo lá
tràm và bố là keo tai tƣợng, có dáng thân thẳng, chiều cao dƣới cành lớn, kích
thƣớc lá nhỏ và thƣa (giống keo lá tràm), dễ dàng tránh đƣợc sự xâm nhiễm của
nấm Corticium salmonicolor, một loài nấm gây bệnh phấn hồng rất nguy hiểm
cho Keo tai tƣợng và Keo lai [36]. Keo lai đang đƣợc coi là giống cây trồng
chính ở nhiều nơi trong nƣớc, đặc biệt là ở các tỉnh vùng Trung bộ và Đông
Nam bộ. Năm 1995, diện tích trồng Keo lai mới 160 ha thì đến cuối năm 2004
cả nƣớc đã trồng hơn 100.000 ha [19]. Đến 2020, diện tích rừng trồng Keo lai ở
nƣớc ta đạt khoảng 700.000ha với nhu cầu trồng mới hàng năm vào khoảng
15.000-20.000ha.
Cho tới nay, các kết quả của chƣơng trình chọn giống cho các loài keo
đƣợc Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thực hiện đã
chọn lọc đƣợc nhiều giống keo có tiềm năng sinh trƣởng và sức chống chịu tốt,
nhiều giống đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật và giống có triển vọng
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÁC LOÀI KEO
1.7.1. Trên thế giới
Cho tới nay, đã có rất nhiều loài Keo đã đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô
thành công. Có thể kể đến một số công trình của các tác giả: A. albida
(Duhoux E và cộng sự, 1985; Ahee J và cộng sự, 1994; Gassama Y K và cộng
sự, 1986, 1987, 1989, 1992; Ruredzo và cộng sự, 1993; ...); A. bivenosa
(Jones và cộng sự, 1990); A. catechu (Rout và cộng sự, 1995; Kaur và cộng
sự, 1997;); A. ligulata (Williams và cộng sự, 1985), A. senegal (Kathju và
Tewari, 1973; Badji và cộng sự, 1993; Palma và cộng sự, 1994, 1996; ...); A.
nicolata (Marthur và Chandra, 1983; Dewan và cộng sự, 1992; Gupta và cộng
32
sự, 1992; Singh và cộng sự, 1993; Garg và cộng sự 1996 ...); A. hybird
(Crawford và Hartney, 1987; Darus - Haji và cộng sự, 1992; Nor Asmah H.
và cộng sự, 2012; ...) [37].
Darus thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia đã tiến hành thí
nghiệm nuôi cấy mô tế bào cho cây Keo tai tƣợng (Acacia mangium) bằng
môi trƣờng MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP trong
giai đoạn nhân chồi. Sau đó, những chồi đạt chiều cao trên 0,5cm đƣợc cấy
vào môi trƣờng tạo rễ đƣợc bổ sung IBA nồng độ 1000 ppm, đã cho tỷ lệ ra rễ
là 40% [38].
Năm 1999, Gerard và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi Keo tai tƣợng
bằng cách nuôi cấy mô từ hạt, kết quả cho thấy môi trƣờng DKW bổ sung BAP
và thidiazuron hoặc N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea thích hợp cho quá
trình nhân chồi. Đồng thời, tác giả cũng khẳng định môi trƣờng ra rễ thích hợp
khi bổ sung 3 hoặc 6% đƣờng và 30,0 mg/l 2,4-D [39]
Cũng với cây Keo tai tƣợng, Hartney và cộng sự (Division of Forest
Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi
trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM
BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 4
0C),
giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối
hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút [3].
Năm 2001, De-Yu và Hong đã nghiên cứu nhân giống Keo tai tƣợng bằng
nuôi cấy mô bằng các bộ phận: phôi mầm, lá non, cuống lá, thân. Môi trƣờng nuôi
cấy cơ bản phù hợp là môi trƣờng MS bổ sung 9,05 µM 2,4-D và 13,95 µM Kn.
Môi trƣờng nhân chồi thích hợp là môi trƣờng MS bổ sung 4,55 µM TDZ và 1,43
µM IAA. Môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi trƣớc khi tiến hành ra rễ thích hợp
là môi trƣờng MS bổ sung 0,045 µM TDZ và 7,22 µM GA3. Môi trƣờng ra rễ
thích hợp là môi trƣờng MS có bổ sung 10,75 µM NAA và 2,33 µM Kn [40].
Năm 2003, Rashmi và cộng sự cũng đã nghiên cứu và thấy môi trƣờng
MS bổ sung 1,0 mg/l BAP, 1,0 mg/l GA3 và 0,05 mg/l IAA là môi trƣờng nuôi
cấy cơ bản cho Keo arabica; Khi bổ sung vào môi trƣờng MS 1,5 mg/l BAP,
33
0,05 mg/l IAA và 100 mg/l Adenine sulfate (Ads) thì tỷ lệ chồi thu đƣợc tăng
cao (1 đến 8 chồi phụ thuộc vào nồng độ đƣợc điều chỉnh). Môi trƣờng ra rễ
thích hợp là ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA hoặc 0,5 mg/l IAA và 20g/l đƣờng
sau chu kỳ nhân chồi 13 - 14 ngày [41].
Nanda và các cộng sự (2004) đã nghiên cứu nhân giống mô cho cây
Keo tai tƣợng 10 tuổi và đã thành công trong điều kiện nuôi cấy ở 16 h sáng /
8 h tối bằng ánh sáng đèn Neon ở cƣờng độ ánh sáng 50 μE m–2 s–1 trong
điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 °C, và độ ẩm 55%. Kết quả cho thấy hệ số nhân có
thể đạt 8 lần và ra rễ trong 13-14 ngày. Môi trƣờng cơ bản trong nhân giống
mô Keo tai tƣợng đã đƣợc các tác giả này xác định là môi trƣờng MS + BAP
(1,0 mg/L) + GA3 (1,0 mg/L) + IAA (0,05 mg/L), môi trƣờng nhân chồi MS
+ BAP (1,5 mg/L) +IAA (0,05 mg/L) + 100 mg/L adenine sulfate (Ads) và
môi trƣờng ra rễ là 1/2MS + IBA hoặc IAA (0,5 mg/L) + 20 g/L đƣờng
sucrose [42].
Năm 1989, Mittal và cộng sự [43] đã nuôi cấy mô cho Keo lá tràm (Acacia
auriculiformis) bằng môi trƣờng Gamborg’s (B5) bổ sung 5 - 10% nƣớc dừa và
(10-6 M) BAP. Những chồi này đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng bổ sung (10
-
7M) IAA hoặc (10
-6 - 10
-7M) NAA để thử nghiệm ra rễ. Kết quả cho thấy môi
trƣờng nhân chồi thích hợp cho Keo lá tràm là B5 bổ sung 5% nƣớc dừa và (10-6
M) BAP (tỷ lệ hình thành chồi đạt 76%, có 2-3 chồi/cụm). Hiệu quả ra rễ với
NAA là tốt hơn so với IAA. Mẫu đƣợc nuôi trong môi trƣờng B5 bổ sung (10-6
M) NAA sau 75 ngày cho tỷ lệ ra rễ cao nhất với 24%, rễ khỏe.
Nitiwattanachai (Theo Trindate và cộng sự, 1990) đã nuôi cấy thành
công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trƣờng nhân nhanh chồi là
MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trƣờng sử dụng cho tạo rễ là
White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA [44].
Shukor (2000) đã khẳng định chỉ cần nồng độ BAP rất thấp (0,1 - 0,5
mg/l) đã có thể hình thành chồi ở Keo lá tràm (Acacia auriculiformis), và môi
trƣờng nhân nhanh chồi cho Keo lá tràm thích hợp là MS bổ sung 0,5 mg/l
GA3 và 0,02 mg/l NAA cùng 0,25 mg/l BAP, trƣớc khi tiến hành ra rễ in
34
vitro, các chồi đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS bổ sung 2,0 mg/l IBA và 1,0
mg/l NAA [45].
Nuôi cấy mô phân sinh Keo lai đã đƣợc tác giả Darus thuộc Viện nghiên
cứu Lâm nghiệp Malaysia (1991; 1993) tiến hành lần đầu bằng môi trƣờng cơ
bản Murashige và Skooge (MS) có thêm 6-Benzylaminopyrine (BAP) 0,5mg/l
và cho ra rễ trong phòng ở nền cát sông 100% với tỷ lệ ra rễ có thể đạt 70%.
(dẫn theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) [4]. Darus cũng đã nuôi cấy in
vitro cho Keo tai tƣợng (Acacia mangium) bằng môi trƣờng MS có bổ sung
3% sucrose, 0,6% agar và 0,5mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi
có chiều cao trên 0,5 cm đƣợc cấy vào môi trƣờng tạo rễ và chất điều hoà sinh
trƣởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (dẫn theo
Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) [4]. Cũng trong giai đoạn này, Hartney và
cộng sự đã chính thức công bố có thể sản xuất cây con Keo tai tƣợng thành
công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng là WPM
+ 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá
trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 4
0C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu
ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian
20 phút [19].
1.7.2. Ở Việt Nam
Năm 1995, Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự đã có nghiên cứu nhân giống
đầu tiên cho Keo lai bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Keo lai nuôi cấy trong
môi trƣờng MS có bổ sung BAP 2mg/l cho hệ số nhân chồi cao hơn ở các
nồng độ khác từ 3-4 lần. Cây mô có thể cho ra rễ trực tiếp trên nền cát phun
sƣơng trong nhà kính bằng cách ngâm hoặc nhúng nhanh trong các chất kích
thích sinh trƣởng IBA hoặc ABT đều cho tỷ lệ ra rễ trên 70% đồng thời rút
ngắn đƣợc thời gian tạo rễ cho cây [46,47].
Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai tự nhiên dòng BV5,
BV10, BV16, BV29, BV32 và BV33 đã đƣợc giới thiệu khi tổng kết đề tài
KH03.03 năm 1996 [47], trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc
Tân Và cs (1996) [47], nhóm nghiên cứu nuôi cấy mô (Đoàn Thị Mai và cộng
sự 2000) [21] đã thực hiện một số nghiên cứu bổ sung cho các dòng Keo lai
35
này và thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1%
với thời gian 2,4,6,8,10,12 phút trong tháng 2, 5, 8, 10 và 12 cho thấy trong 8
- 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả
năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,05 ppm) và môi
trƣờng MS là công thức cho mẫu vật phát sinh chồi nhiều nhất. Ảnh hƣởng
của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là:
IBA (3ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29, BV16, BV33.
Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV10 (65%), BV5 (50%) [21]. Năm
2003, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã nhân giống thành công cho Keo lá tràm
dòng Clt83 [22].
Giai đoạn 2006 - 2010, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã nghiên cứu nhân
nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo bằng công nghệ tế bào. Đối với
Keo lai: Phƣơng pháp khử trùng thích hợp cho cả Keo lai tự nhiên và Keo lai
nhân tạo là sử dụng HgCl2 nồng độ 0,05% trong 8 - 10 phút; môi trƣờng nhân
nhanh chồi là MS* + 1,5mg/l BAP; môi trƣờng tiền ra rễ là MS
* + 1,5mg/l BAP
+ 0,5mg/l NAA; môi trƣờng tạo rễ thích hợp là ½ MS* có bổ sung IBA nồng độ
1,5mg/l. Keo lai có thể ra rễ bằng chấm thuốc bột TTG có gốc là IBA nồng độ
1,5% với tỷ lệ ra rễ trên 90% [4].
Giai đoạn 2011-2020, một loạt các quy trình nhân giống cho Keo lai và
Keo lá tràm trên quy mô công nghiệp đã đƣợc hoàn thiện và đƣợc triển khai áp
dụng vào sản xuất. Qua đó, hàng triệu cây mô cho các đối tƣợng này đã đƣợc sản
xuất đáp ứng đƣợc 1 phần nhu cầu cây con có chất lƣợng cho trồng rừng sản
xuất [48,49,50].
36
2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Các dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 do Viện Nghiên cứu
Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp rừng tuyển chọn có sinh trƣởng
trung bình 20-35m3/ha/năm đã đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
công nhận là giống cây trồng mới theo quyết định số 761/QĐ-BNN-TCLN
ngày 06/03/2019 ngày 06 tháng 03 năm 2018.
- Vật liệu nghiên cứu: vật liệu đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tạo
mẫu ban đầu (khử trùng) là các chồi bánh tẻ chƣa bật chồi nách thu từ cây mẹ
(cây vật liệu gốc) của các dòng Keo lai từ 6 tháng tuổi đƣợc trồng tại vƣờn
ƣơm Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu của khóa luận bao gồm những nội dung sau:
- Xác định loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp cho các dòng
Keo lai nghiên cứu
- Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai nghiên
cứu
- Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai
- Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai
- Tối ƣu hóa Phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng
+ Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp
+ Xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai
- Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai
- Xác định thời gian huấn luyện thích hợp
- Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô
37
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm
* Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào, Viện Nghiên cứu
Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt
Nam - Đức Thắng - Bắc Từ Liêm - Hà Nội.
* Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm đƣợc duy trì trong điều kiện
nhân tạo với các thông số:
- Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ ngày.
- Cƣờng độ ánh sáng 2.000- 3.000 lux.
- Nhiệt độ phòng nuôi 25- 270C.
* Các dụng cụ sử dụng và môi trƣờng nuôi cấy đƣợc hấp khử trùng
trƣớc khi đƣa vào thí nghiệm.
* pH của môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh ở 5,8.
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Các nội dung thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau:
* Nội dung 1: Xác định loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp
cho các dòng Keo lai nghiên cứu
Thí nghiệm sử dụng loại hóa chất khử trùng là HgCl2 (ở 2 nồng độ
0,05% và 0,1%) và Ca(OCl)2 (ở nồng độ 5% và 10%).
Thời gian khử trùng:
+ Đối với HgCl2: thời gian khử trùng 3, 5, 7, 9, 11 phút
+ Với Ca(OCl)2: thời gian khử trùng là 5, 10, 15, 20, 25 phút
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu nhiễm, số mẫu nảy
chồi.
38
* Nội dung 2: Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo
lai nghiên cứu
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4] môi trƣờng
MS đƣợc chọn lọc là môi trƣờng khoáng chất cơ bản để nuôi cấy cho các
dòng keo lai. Các loại môi trƣờng có sự thay đổi về tỷ lệ, thành phần các chất
đa lƣợng, vi lƣợng dựa trên môi trƣờng này đƣợc thí nghiệm, cụ thể nhƣ sau:
- Môi trƣờng MS cơ bản (MS): sử dụng môi trƣờng MS (Murashige
and Skoog, 1962) và thành phần Vitamin của Morel
- Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS1)
- Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS2)
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi.
* Nội dung 3: Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi Keo lai
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4], 7 công thức
thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng nhân chồi các
dòng Keo lai đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Công thức 1: Đối chứng
- Công thức 2: MS cải tiến + 1.0 mg Kinetin/ lít
- Công thức 3: MS cải tiến + 1.5 mg Kinetin/ lít
- Công thức 4: MS cải tiến + 2.0 mg Kinetin/ lít
- Công thức 5: MS cải tiến + 1.0 mg BAP/ lít
- Công thức 6: MS cải tiến + 1.5 mg BAP/ lít
- Công thức 7: MS cải tiến + 2.0 mg BAP/ lít
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ
2cm trở lên
39
* Nội dung 4: Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi cho Keo
lai
Sau khi đã xác định đƣợc môi trƣờng tốt nhất trong trong nội dung 3,
thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của sự phối hợp giữa Cytokinin và Auxin đến
sự phát triển chồi của Keo lai đƣợc tiến hành với các công thức:
- Công thức 1: Đối chứng (Môi trƣờng MS*)
- Công thức 2: MS* + 0,25 mg NAA/ lít
- Công thức 3: MS* + 0.5 mg NAA/ lít
- Công thức 4: MS* + 0,75 mg NAA/ lít
- Công thức 5: MS* + 1,0 mg NAA/ lít
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ
2cm trở lên
* Nội dung 5: Tối ưu hóa Phương pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng
- Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp
Thí nghiệm xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô Keo
lai đƣợc bố trí nhƣ sau:
+ Công thức 1 (đối chứng): Nuôi sáng 10-12h/ngày, trong 1 vòng cấy
chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.
+ Công thức 2: Nuôi sáng 7-9h/ngày trong 1vòng cấy chuyển là 25
ngày bằng ánh sáng nhân tạo.
+ Công thức 3: Nuôi sáng 5h/ngày bằng ánh sáng tự nhiên, 5h/ngày
bằng ánh sáng nhân tạo trong 25 ngày.
+ Công thức 4: Sử dụng 100% ánh sáng tự nhiên trong 25 ngày nuôi
cấy.
40
- Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai
Để xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên
cứu, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 3 công thức:
+ Công thức 1: Cấy các chồi đơn lẻ
+ Công thức 2: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 3-5 cụm chồi
+ Công thức 3: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 5 cụm chồi trở
lên (mỗi cụm chồi có từ 3-5 chồi)
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ
2cm trở lên
* Nội dung 6: Xác định ảnh hưởng của IBA và NAA đến ra rễ của
chồi Keo lai
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2,0cm cứng cáp khoẻ mạnh đƣợc cấy
vào môi trƣờng ra rễ là môi trƣờng có1/2 thành phần của MSA* đƣợc bổ sung
IBA hoặc NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l.
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số ra rễ, chiều cao rễ, số rễ/chồi
* Nội dung 7: Xác định phương pháp huấn luyện cây có hiệu quả nhất
trước khi đưa cây mô ra vườn ươm
Chồi nuôi cấy mô sau khi ra rễ (5-7 ngày) đƣợc chuyển ra khu huấn
luyện cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Để xác định thời gian huấn
luyện thích hợp, cây đƣợc huấn luyện ở 5 công thức thời gian khác nhau:
- 0-3 ngày sau khi cây bắt đầu ra rễ
- 4-6 này
- 7-10 ngày
- 11-14 ngày
41
- 15-20 ngày
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây
* Nội dung 8: Xác định loại giá thể phù hợp để cấy cây
Để xác đinh loại giá thể thích hợp cho cây nuôi cấy mô, khóa luận đã
tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau gồm:
- Cát sông
- 100% đất màu
- 50% đất màu + 50% than trấu
- 70% đất màu + 30% thanh trấu
- 70% đất màu + 20% than trấu + 10 xơ dừa
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây
2.3.3. Xử lý số liệu
2.3.3.1. Tính toán các chỉ tiêu theo dõi
Chiều cao trung bình của chồi (cm) =
Tổng chiều cao của chồi
Tổng số chồi
Hệ số nhân chồi =
Tổng số chồi mới hình thành
Tổng số chồi ban đầu
42
Tỷ lệ ra rễ (%) =
Tổng số chồi ra rễ
x 100
Tổng số chồi nuôi cấy
Chiều dài rễ trung bình (cm) =
Tổng chiều dài rễ
Tổng số rễ
Tỷ lệ sống (%) =
Tổng số cây sống
x 100
Tổng số cây huấn luyện
2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm
- Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố thí nghiệm đến số rễ và chiều dài
rễ bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai.
+ Tính FA: FA=VV
N
A
n
an.
1
Nếu FA < F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n –a thì nhân tố
A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm.
Nếu FA > F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n - a thì nhân tố A
tác động không đồng đều đến kết quả thí nghiệm. Khi đó, công thức thí
nghiệm có ảnh hƣởng trội nhất đƣợc xác định thông qua kết quả kiểm tra sai
dị về trị số trung bình giữa hai công thức có trị số lớn nhất theo tiêu chuẩn
của Student:
t =
ji nnS
XX11,,
2max1max
43
Trong đó:
S’’ =
an
VN
là sai tiêu chuẩn ngẫu nhiên.
Ni và nj là dung lƣợng mẫu tƣơng ứng với công thức thí nghiệm có số
trung bình lớn nhất và lớn thứ hai.
Nếu /t/ < t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho đƣợc chấp nhận, hay
sai khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và thứ hai là không rõ rệt, có
thể chọn công thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn thứ nhất hoặc số
trung bình lớn thứ hai.
Nếu /t / > t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho bị bác bỏ, hay có sai
khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và số trung bình lớn thứ hai vì thế
chọn công thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn nhất có ảnh hƣởng trội
nhất.
Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên phần mềm Excel và SPSS.
44
3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU THÍCH HỢP CHO
CÁC DÒNG KEO LAI NGHIÊN CỨU
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy in vitro, có vai
trò quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các giai đoạn nuôi
cấy tiếp theo. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để khử
trùng mẫu cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, AgNO3,
các chất kháng sinh, … cũng có thể bổ sung thêm Tween 20, Tween 80, ... hoặc
xử lý bằng cồn 700 để tăng độ xâm nhập và bám dính của các chất diệt khuẩn
vào bề mặt mẫu cấy.
Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của loại hóa chất và thời gian
đến kết quả khử trùng cho các dòng Keo lai đƣợc thể hiện tại Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai
Hóa
chất
Thời gian
(phút) CT
Tỷ lệ mẫu
sống (%)
Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
TLNCHH
(%)
HgCl2
0,05%
3 1 93,1±1,7 57,6±2,6 4,4±0,9
5 2 91,2±1,3 51,2±3,1 8,2±1,9
7 3 86,2±2,1 36,4±1,8 27,9±2,1
9 4 69,1±2,2 29,1±1,5 21,3±2,3
11 5 61,2±2,6 25,2±1,3 25,1±2,8
45
Hóa
chất
Thời gian
(phút) CT
Tỷ lệ mẫu
sống (%)
Tỷ lệ mẫu
nhiễm (%)
TLNCHH
(%)
HgCl2
0,1%
3 6 88,9±2,0 51,9±1,9 12,4±1,9
5 7 85,2±2,1 38,3±1,4 37,5±2,8
7 8 75,3±2,0 27,9±1,3 28,6±2,3
9 9 63,9±1,4 19,8±2,0 23,2±2,5
11 10 53,1±1,4 16,3±1,6 18,4±2,3
Ca(OCl)
2 5%
5 11 97,6±0,6 97,6±0,7 1,1±0,3
10 12 95,2±0,5 92,4±0,7 1,3±0,6
15 13 89,4±0,8 88,3±1,2 2,9±0,9
20 14 83,6±1,0 86,2±1,4 3,2±1,3
25 15 81,6±1,3 81,4±1,0 5,4±1,4
Ca(OCl)
2 10%
5 16 97,1±1,3 91,1±1,2 1,6±0,4
10 17 94,2±1,2 87,1±0,5 2,5±0,6
15 18 88,3±1,7 80,9±1,9 3,9±0,9
20 19 82,1±1,2 76,5±0,9 5,1±1,2
25 20 80,4±1,5 70,1±1,8 6,4±0,9
Ftính 22,90 71,84 6,22
Fbảng (.05; 19; 40) = 1,85
46
Đặc điểm mẫu vật nuôi cấy ở từng loài là khác nhau, ngay cả trong loài,
trên cùng 1 cây mẹ, các vị trí lấy mẫu vật khác nhau đƣợc sử dụng nồng độ và
thời gian khử trùng khác nhau cũng sẽ cho kết quả khác nhau. Do đó, cần lựa
chọn nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp để vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu
nhiễm thấp vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu nảy chồi cao, và chồi tạo đƣợc có khả năng
sinh trƣởng phát triển tốt. Nếu nồng độ hoá chất thấp và thời gian khử trùng
chƣa đủ, các nguồn bụi bẩn, nấm bệnh, khuẩn, ... trên mẫu vật sẽ không thể
đƣợc loại trừ hết; trái ngƣợc lại, nếu nồng độ hóa chất quá cao hoặc thời gian
khử trùng quá dài, hóa chất sẽ ngấm sâu và phá vỡ cấu trúc tế bào, ảnh hƣởng
đến sinh trƣởng, làm giảm khả năng tái sinh chồi.
Kết quả phân tích số liệu cho thấy: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và
tỷ lệ mẫu nảy chồi ở 20 công thức thí nghiệm với Keo lai đều có sự sai khác
rõ rệt (Ftính > F.05).
Trong 2 loại hóa chất đƣợc sử dụng thì HgCl2 cho hiệu quả khử trùng
cao hơn hẳn so với Ca(OCl)2 (Bảng 3.1). Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ một
số nghiên cứu trƣớc đây cho một số đối tƣợng cây rừng và các dòng Keo lai
mới đƣợc tuyển chọn.
Sử dụng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 5 phút đem lại hiệu quả
khử trùng tốt nhất (tiêu chuẩn Duncan). Cụ thể là: khi sử dụng HgCl2 0,1%
trong 5 phút thì tỷ lệ mẫu sống là 85,2%, tỷ lệ mẫu nhiễm là 38,3% và tỷ lệ
nảy chồi hữu hiệu đạt tới 37,5%.
Nhƣ vậy, HgCl2 mặc dù có những hạn chế nhất định (có tính độc mạnh
cho con ngƣời và môi trƣởng) nhƣng vẫn là chất rất thích hợp trong nghiên cứu
khử trùng mẫu vật cho các giống cây rừng. Một số nghiên cứu gần đây cho
thấy, sử dụng dung dịch Javen có thể là Phƣơng pháp thay thế mang tính an
toàn hơn so với sử dụng thủy ngân trong việc khử trùng mẫu vật cho một số
giống Keo và bạch đàn.
47
Giữa các giống khác nhau, hiệu quả khử trùng ở công thức tốt nhất
cũng có sự sai khác rõ rệt. (Ftính > F.05) (Bảng 3.2). Trong 3 giống Keo lai
nghiên cứu hiệu quả khử trùng tốt nhất ở giống BV376 với tỷ lệ nảy chồi hữu
hiệu đạt 51,6%, trong khi tỷ lệ nhiễm chỉ là 35,9%. Mặc dù vậy, khi tiến hành
sản xuất trên quy mô lớn, để tiết kiệm thời gian và chi phí việc sử dụng chung
1 công thức khử trùng cho cả 3 giống Keo lai nghiên cứu là hoàn toàn đáp
ứng đƣợc yêu cầu của sản xuất mà vẫn đảm bảo đƣợc hiệu quả của quá trình
khử trùng mẫu vật.
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu
Dòng CT khử trùng tốt nhất Tỷ lệ nhiễm (%) TLNCHH (%)
BV586 HgCl2 0,1% - 5 phút 31,7±1,2 44,2±1,5
BB055 HgCl2 0,1% - 5 phút 32,6±2,5 41,3±3,5
BV376 HgCl2 0,1% - 5 phút 35,9±0,6 51,6±1,7
Ftính 29,89 111,64
F05 tra bảng F (.05; 3; 8) = 4,06
Kết quả này tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống cho
các dòng Keo lai tự nhiên BV71, BV73, BV75 trong nghiên cứu của Đoàn Thị
Mai, Lê Sơn và cộng sự (2011) [4] cũng đã đƣợc khử trùng bằng HgCl2 nồng
độ 0,1% với 8 - 10 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (chỉ từ 58,52 đến 72,59%) và
tỷ lệ bật chồi khá cao (đạt từ 8,15 đến 11,11%). Tuy nhiên, ở một nghiên cứu
khác, tác giả Girijashankar (2010) [6] lại sử dụng dung dịch sodium
hypochlorite (NaOCl) 1,0% thêm một vài giọt Tween- 20 lắc trong 15 phút để
đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất cho các dòng Keo lai nghiên cứu.
48
Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày khử trùng
3.2. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY CƠ BẢN CHO KEO LAI
Môi trƣờng có vai trò quan trọng quyết định khả năng phân chia, phân
hóa và hình thái của các mẫu cấy vì nó là nguồn cung cấp dinh dƣỡng duy
nhất cho mẫu vật nuôi cấy. Việc xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là tiền
đề để có thể thiết kế các thí nghiệm nhằm xác định môi trƣờng nhân chồi, xác
định môi trƣờng ra rễ cho các đối tƣợng nghiên cứu.
Thí nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai
đƣợc tiến hành với 3 loại môi trƣờng khác nhau đó là: MS, MS1 (là môi
trƣờng đã đƣợc sử dụng cho nhân chồi các dòng Keo lai tự nhiên trong các
nghiên cứu trƣớc đây) [4]. Đây những môi trƣờng đã đƣợc sử dụng tƣơng đối
rộng rãi cho nghiên cứu nhân giống cho cây rừng bằng nuôi cấy mô. Kết quả
nhân chồi sau 30 ngày cấy thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trƣờng MS1 đã đƣợc sử dụng để nuôi
cấy các dòng Keo lai tự nhiên thành công trƣớc đây [4, 22, 33, 46, 47, 48]
song lại không cho kết quả cao khi sử dụng để nuôi cấy các dòng Keo lai mới
chọn tạo (Bảng 3.3). Trong các môi trƣờng đã thử nghiệm, môi trƣờng MS2 là
thích hợp nhất cho quá trình tái sinh trong nuôi cấy, từ đó môi trƣờng này
49
đƣợc sử dụng để cấy khởi động nhằm tạo ra một số lƣợng chồi đủ lớn, sạch
bệnh và tƣơng đối đồng đều về mặt sinh lý cho những thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản
Môi
trƣờng
Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055
HSNC Chiều dài
chồi (cm)
HSNC Chiều dài
chồi (cm)
HSNC Chiều dài
chồi (cm)
MS 2,3±0,8 2,7±1,2 3,1±1,2 3,1±0,9 2,2±1,0 2,8±1,1
MS1 2,5±0,6 3,1±1,1 2,6±1,1 2,7±1,0 2,4±1,1 3,1±1,1
MS2 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1
Ftính = 5,34>Ftra bảng = 3,42
Khi sử dụng môi trƣờng này, các đối tƣợng nghiên cứu có hệ số nhân
chồi cao hơn sử dụng các loại môi trƣờng còn lại, đạt từ 3,3 đến 3,7 và chiều
dài trung bình của chồi cũng đạt từ 3,2 đến 3,5cm. Các chồi mới tạo đƣợc khi
nuôi cấy trong môi trƣờng MS2 cũng có chất lƣợng khá tốt: thân chồi cứng
cáp, lá phát triển. Điều này cho thấy các môi trƣờng đƣợc cải tiến dựa trên
môi trƣờng MS cơ bản rất thích hợp cho nuôi cấy mô Keo lai do có thành
phần, tỷ lệ giữa các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng và vitamin phù hợp cho sự
sinh trƣởng và phát triển của Keo lai nói chung hơn là các môi trƣờng khác
[4]. Kết quả này một lần nữa cho thấy, đối với Keo lai nói chung, mỗi dòng
lại có phản ứng khác nhau với môi trƣờng nuôi cấy. Vì thế, các nghiên cứu
xác định môi trƣờng nhân giống thích hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu là
cần thiết
50
Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong
các môi trường nhân chồi khác nhau (MS, MS1 và MS2 theo thứ tự từ trái
sang phải)
3.3. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NHÂN NHANH SỐ LƢỢNG CHỒI KEO
LAI
Để xác định môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên
cứu, môi trƣờng MS đã đƣợc xác định ở thí nghiệm trên (ký hiệu là MS2 với
Keo lai ) đƣợc sử dụng làm môi trƣờng cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo. Để
kích thích tạo chồi trong nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trƣởng hay đƣợc sử
dụng là BAP và Kn. BAP và Kn là các chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm
Cytokinin, có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào, duy trì sự sống của
mô, định hƣớng phân hóa tế bào và tăng khả năng tổng hợp diệp lục ở lá cây.
Các loại chất này thƣờng đƣợc sử dụng để tạo cụm chồi trong nuôi cấy in vitro.
Việc lựa chọn chất kích thích sinh trƣởng cũng nhƣ các nồng độ khác nhau để
xác định môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên cứu trong
khóa luận đƣợc thiết lập dựa trên các kết quả nghiên cứu về nhân giống cho Keo
lai tự nhiên trƣớc đây của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự [47], Đoàn Thị Mai và
cộng sự với các nồng độ 1,0mg/l; 1,5mg/l và 2,0mg/l [4]. Kết quả thí nghiệm xác
51
định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng tạo chồi của các dòng Keo lai
đƣợc trình bày tại Bảng 3.4 sau đây.
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP và Kn ở
nồng độ khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy
Môi trƣờng
MS2 +
Ký
hiệu
Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055
HSNC
Chiều
dài
chồi
(cm)
HSNC
Chiều
dài
chồi
(cm)
HSNC
Chiều
dài
chồi
(cm)
BAP 1,0 mg/l 1 3,9±1,2 3,5±1,1 4,5±1,3 3,5±1,1 3,8±1,2 3,9±1,3
BAP 1,5 mg/l 2 4,5±1,3 3,9±1,3 4,6±1,4 3,6±1,2 4,4±1,3 4,4±1,2
BAP 2,0 mg/l 3 4,2±1,1 3,6±1,2 4,8±1,3 3,5±1,1 3,9±1,2 4,3±1,2
Kn 1,0 mg/l 4 3,4±1,2 3,2±1,1 4,1±1,3 3,5±1,2 3,6±1,1 3,5±1,1
Kn 1,5 mg/l 5 3,7±1,2 3,4±1,3 4,3±1,2 3,6±1,1 3,8±1,2 3,7±1,2
Kn 2,0 mg/l 6 3,5±1,1 3,3±1,2 4,2±1,3 3,4±1,3 3,5±1,3 3,6±1,1
0 ĐC 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1
Ftính=5,34 > Ftra bảng = 3,4
Kết quả thí nghiệm cho thấy, BAP có tác dụng rõ lên quá trình tạo chồi
của các dòng Keo lai khi so sánh với công thức đối chứng (không sử dụng
chất kích thích sinh trƣởng) hay khi sử dụng chất kích thích sinh trƣởng là Kn
ở cùng nồng độ.
Môi trƣờng bổ sung BAP ở nồng độ 1,5mg/l có hệ số nhân chồi đạt
đƣợc cao nhất là từ 4,4 đến 4,5 tuỳ thuộc vào các dòng thí nghiệm. Khi sử
dụng công thức này, các chồi tạo đƣợc cũng có chiều cao trung bình cao hơn
hẳn các công thức còn lại (3,9-4,5cm). Môi trƣờng đƣợc bổ sung BAP ở nồng
52
độ 2,0mg/l cũng cho hệ số nhân chồi tƣơng đối cao đối với dòng Keo lai
BV586 (HSNC đạt 4,8) tuy nhiên chiều cao chồi thu lại chỉ đạt 3,5 cm (trong
khi chỉ số này đạt 3,6cm khi nuôi cấy trong môi trƣờng bổ sung BAP nồng độ
1,5mg/l). Do đó, môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đƣợc
chọn làm môi trƣờng nuôi cấy chung cho cả 3 dòng Keo lai nghiên cứu. Kết
quả này cũng tƣơng tự nhƣ trong các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống các
dòng Keo lai, Keo lá tràm mới đƣợc chọn lọc [4, 46, 47,48] chính tỏ với Keo
lai nói chung môi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l hoặc 2 mg/l là
tƣơng đối phù hợp cho quá trình nhân chồi.
Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai được nuôi cấy trong các công thức môi
trường nhân chồi khác nhau
3.4. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG CHỒI CHO
KEO LAI
Đối với Keo lai nói chung và Keo lai nói riêng, để chuẩn bị cho quá
trình ra rễ cần phải nâng cao chất lƣợng chồi. Mục đích của giai đoạn này là
tăng số lƣợng chồi có đủ tiêu chuẩn cho quá trình ra rễ, thông thƣờng môi
trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc bổ sung thêm auxin ở các nồng độ khác nhau tuỳ
thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu.
53
Trong nhóm Auxin, NAA thƣờng đƣợc bổ sung thêm vào môi trƣờng
nuôi cấy để tăng chất lƣợng chồi thu đƣợc đặc biệt cho Keo lai tự nhiên [1].
NAA có tác dụng làm tăng khả năng hô hấp của mô, tăng hoạt tính Enzim và
ảnh hƣởng mạnh đến trao đổi Nitơ (N) và tiếp nhận các-bon trong môi trƣờng.
Ở nồng độ thích hợp. NAA còn có vai trò kích thích sinh trƣởng tế bào và
kích thích tạo rễ.
Môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đã đƣợc xác định
cho quá trình nhân nhanh số lƣợng chồi cho Keo lai. Tuy nhiên, khi sử dụng
môi trƣờng này, tỷ lệ chồi hữu hiệu thu đƣợc cho quá trình ra rễ là chƣa cao,
do đó để nâng cao chất lƣợng các chồi tạo đƣợc chuẩn bị cho ra rễ môi trƣờng
này còn đƣợc bổ sung thêm NAA ở các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 và
1,5 gm/l. Số liệu thu thập sau 30 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày tại Bảng 3.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm
chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy
MS2 +
BAP
1,5mg/l
+ NAA
(mg/l)
Ký
hiệu
Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055
HSNC
Chiều
dài
chồi
(cm)
HSNC
Chiều
dài
chồi
(cm)
HSNC
Chiều
dài chồi
(cm)
0,25 N1 3,8±1,2 4,1±1,1 4,7±1,4 4,2±1,2 4,5±2,1 4,5±1,3
0,5 N2 5,5±2,3 5,8±1,9 5,1±2,1 5,2±1,5 4,9±1,2 5,5±1,4
0,75 N3 5,3±2,5 5,6±1,8 4,7±1,3 4,8±1,1 4,7±1,3 5,2±1,5
1,0 N4 4,7±2,2 4,4±2,5 4,4±1,7 4,7±1,4 4,2±1,6 4,9±2,1
1,25 N5 4,5±1,4 4,2±1,9 4,3±1,3 4,2±1,1 6,1±2,1 4,6±1,6
1,5 N6 4,8±1,7 3,9±1,2 4,0±1,2 4,1±1,5 5,8±1,6 4,3±1,7
0 ĐC 4,5±1,3 3,9±1,3 4,6±1,4 3,6±1,2 4,4±1,3 4,4±1,2
Ftính=6,81 > Ftra bảng = 3,67 /t/=2,76>t0,5 = 1,96
54
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung thêm NAA vào môi trƣờng
nuôi cấy không chỉ có chỉ tiêu hệ số nhân chồi thu đƣợc cao hơn so với khi sử
dụng BAP riêng lẻ mà chất lƣợng các chồi thu đƣợc (số đốt lá, màu sắc và
hình thái chồi) cũng nhƣ chiều cao chồi cũng tăng lên đáng kể (Bảng 3.5).
Công thức môi trƣờng MS1* + BAP 1,5mg/l + NAA 0,5mg/l cho hệ số
nhân chồi chỉ từ 4,9 đến 5,8 tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng nghiên cứu đồng
thời số chồi thu đƣợc có chất lƣợng tốt, tƣơng đối đồng đều (thể hiện ở mức
độ sai dị thấp hơn so với công thức đối chứng), số chồi có chiều cao từ 3cm
trở nên đạt khoảng 60% của tổng số chồi thu đƣợc, có nghĩa là cứ 10 chồi tạo
đƣợc thì có trung bình 6 chồi đủ chất lƣợng cho quá trình ra rễ. Nếu trong môi
trƣờng không bổ sung NAA số chồi đủ chất lƣợng cho quá trình ra rễ chỉ đạt
30 đến 40%, thì rõ ràng việc bổ sung này có ý nghĩa rất lớn cho quá trình
nhân nhanh cuả các dòng Keo lai thí nghiệm.
Hình 3.4. Các chồi Keo lai dòng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy trong các
công thức thí nghiệm khác nhau.
55
3.5. TỐI ƢU HÓA PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ CHẾ ĐỘ CHIẾU
SÁNG
Ngoài ảnh hƣởng của loại môi trƣờng, thành phần và nồng độ các chất
kích thích sinh trƣởng có trong môi trƣờng nuôi cấy thì phƣơng pháp nuôi cấy
cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng nhân nhanh của các đối tƣợng nghiên
cứu. Đối với Keo lai nói chung, mặc dù không chịu ảnh hƣởng của chế độ ánh
sáng một cách rõ ràng nhƣ đối với Bạch đàn nhƣng sự thay đổi này cũng có
những tác dụng đáng kể trong quá trình nhân nhanh. Các thí nghiệm về thay
đổi chế độ chiếu sáng, phƣơng pháp nuôi dƣỡng và số lƣợng chồi nuôi cấy/
bình nuôi cấy (bình tam giác 250ml) đã đƣợc tiến hành nhằm tìm ra phƣơng
thức nuôi dƣỡng hiệu quả nhất. Môi trƣờng đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm
này là môi trƣờng nhân chồi thích hợp đã xác định đƣợc trong các thí nghiệm
trên.
3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp
Thí nghiệm xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô Keo
lai đƣợc bố trí nhƣ sau:
Công thức 1 (đối chứng): Nuôi sáng 10-12h/ngày, trong 1 vòng cấy
chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.
Công thức 2: Nuôi sáng 7-9h/ngày trong 1vòng cấy chuyển là 25 ngày
bằng ánh sáng nhân tạo.
Công thức 3: Nuôi sáng 5h/ngày bằng ánh sáng tự nhiên, 5h/ngày bằng
ánh sáng nhân tạo trong 25 ngày.
Công thức 4: Sử dụng 100% ánh sáng tự nhiên trong 25 ngày nuôi cấy.
Kết quả cho thấy, đối với các dòng Keo lai chế độ chiếu sáng thích hợp
là công thức 2: nuôi sáng 7-9h/ngày bằng ánh sáng nhân tạo (Bảng 3.6).
Kết quả thí nghiệm cho thấy, các công thức thí nghiệm có sự sai khác
rõ rệt về các chỉ tiêu theo dõi, với công thức thí nghiệm số 1 (là phƣơng pháp
nuôi dƣỡng đã đƣợc áp dụng trong hầu hết các nghiên cứu về nhân giống Keo
lai bằng nuôi cấy mô) tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt từ 80%. Tuy nhiên, với công
56
thức 2, tỷ lệ chồi hữu hiệu đã tăng lên trên 85% cho tất cả các dòng còn các
chỉ số khác nhƣ số chồi/cụm và chiều dài chồi là không có sự sai khác rõ rệt.
Ở các công thức thí nghiệm 3 và 4 các chỉ số theo dõi đều thấp hơn so với
công thức thí nghiệm số 2. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: với các công
thức có tỷ lệ sử dụng ánh sáng tự nhiên trên 50%, với cƣờng độ và thời gian
chiếu sáng thay đổi: cƣờng độ mạnh hơn (trên 5.000lux), thời gian chiếu sáng
không ổn định theo mùa vụ và thƣờng dài hơn (trên 12 tiếng) nên các chỉ số
theo dõi không đạt đƣợc nhƣ khi sử dụng công thức 2. Mặc dù vậy, nếu tận
dụng đƣợc ánh sáng tự nhiên cho quá trình nuôi cấy sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí
sản xuất. Vì thế, các nghiên cứu về sử dụng nguồn ánh sáng tự nhiên cần
đƣợc tiến hành một cách có hệ thống hơn trong tƣơng lai.
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho
nuôi cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển
Dòng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Công thức 4
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ
lệ
chồi
hữu
hiệu
(%)
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ
lệ
chồi
hữu
hiệu
(%)
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ
lệ
chồi
hữu
hiệu
(%)
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ
lệ
chồi
hữu
hiệu
(%)
BV376 5,2 4,3 80,6 5,3 5,2 86,4 4,8 4,7 82,6 4,7 4,8 76,3
BV586 5,4 4,2 82,3 5,2 5,3 85,8 4,7 4,6 83,3 5,4 4,7 72,4
BB055 5,3 4,2 81,5 5,5 5,1 88,2 4,5 4,3 85,1 4,5 4,6 75,5
3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai
Để xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên
cứu, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 3 công thức:
Công thức 1: Cấy các chồi đơn lẻ.
57
Công thức 2: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 3-5 cụm chồi.
Công thức 3: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 5 cụm chồi trở
nên (mỗi cụm chồi có từ 3-5 chồi).
Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với các dòng Keo lai nghiên cứu, số
lƣợng cụm chồi đƣợc cấy cho 01 bình tam giác 250ml có chứa 70-75ml môi
trƣờng nuôi cấy là từ 3 đến 5 cụm chồi với hệ số nhân chồi cũng nhƣ chất
lƣợng chồi thu đƣợc tốt nhất trong các công thức thí nghiệm (Bảng 3.7). Với
lƣợng cụm chồi nhƣ vậy, các chồi Keo lai vừa không có sự cạnh tranh nhau
về ánh sáng và dinh dƣỡng lại vừa tiết kiệm đƣợc không gian nuôi dƣỡng,
đảm bảo cho cây có thể hấp thụ tối đa nguồn dinh dƣỡng có trong môi trƣờng
nuôi cấy. Nếu chỉ cấy các chồi đơn lẻ, sẽ hạn chế quá trình nhân chồi do khả
năng tái sinh thấp và lãng phí nguyên vật liệu, nếu cấy quá nhiều cụm chồi
trong bình nuôi cấy, sẽ làm cho cây có sự cạnh tranh trao đổi chất và không
gian từ đó làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng cũng nhƣ sự đồng đều của các chồi
thu đƣợc.
Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phương pháp cấy thích hợp
Dòng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ lệ
chồi hữu
hiệu (%)
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ lệ
chồi hữu
hiệu (%)
Số
chồi/
cụm
Chiều
dài
chồi
(cm)
Tỷ lệ
chồi hữu
hiệu (%)
BV376 3,2 4,5 65,7 6,8 4,2 91,1 4,1 4,1 68,5
BV586 3,4 4,4 64,8 6,9 4,3 92,0 4,2 4,0 71,3
BB055 3,3 4,4 61,1 5,7 3,6 88,2 4,5 3,6 55,5
Ftính = 34,5>Ftra bảng
58
Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban
đầu, cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong môi trường tối ưu
3.6. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG RA RỄ CHO KEO LAI
Giai đoạn tạo rễ là một trong những khâu quan trọng nhất của nuôi cấy
mô, do đó việc xác định đƣợc phƣơng thức ra rễ thích hợp: môi trƣờng, thời
gian và phƣơng pháp huấn luyện sẽ giúp tăng tỷ lệ ra rễ, cũng nhƣ chất lƣợng
cây con từ đó nâng cao hiệu quả của quy trình nhân nhanh.
Để xác định môi trƣờng ra rễ thích hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu.
Môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng là một nửa các chất đa lƣợng và vi lƣợng
của môi trƣờng MS cải tiến (1/2MS2) đƣợc bổ sung thêm các Auxin: IBA và
NAA ở các nồng độ khác nhau. Các chồi có chiều cao từ 2,0cm có đủ chất
lƣợng đƣợc chọn lọc và cấy vào môi trƣờng ra rễ, nuôi cấy trong điều kiện
nhân tạo, sau 5-7 ngày rễ bắt đầu xuất hiện và sau 14 -16 ngày cấy, các chồi
ra rễ đƣợc đo đếm các số liệu về tỷ lệ ra rễ, chiều dài rễ và số rễ trên chồi.
59
Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai
dòng BV376, BV586 và BB055
Môi trƣờng 1/2
MS2 +
Ký
hiệu
Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055
Tỷ lệ
ra rễ
(%)
Chiều
dài rễ
(cm)
Số rễ
trung
bình
(cái)
Tỷ lệ
ra rễ
(%)
Chiều
dài rễ
(cm)
Số rễ
trung
bình
(cái)
Tỷ lệ
ra rễ
(%)
Chiều
dài rễ
(cm)
Số rễ
trung
bình
(cái)
IBA 0,5 mg/l I1 65,25 3,5 3,2 67,36 3,7 3,4 67,12 3,7 3,4
IBA 1,0 mg/l I2 71,23 4,2 3,5 73,48 4,8 3,7 73,4 4,3 3,9
IBA 1,5 mg/l I3 79,45 3,8 4,2 81,27 4,2 4,5 81,06 3,7 4,1
IBA 2,0 mg/l I4 73,36 3,2 4,5 79,24 3,5 4,6 82,45 3,2 4,3
NAA0,5 mg/l N1 55,24 4,2 2,6 62,47 3,7 3,1 58,14 3,8 3,2
NAA1,0 mg/l N2 58,35 3,5 3,1 65,46 3,9 3,5 60,53 4,2 3,6
NAA1,5 mg/l N3 60,48 3,2 3,4 67,23 4,4 3,6 65,45 3,6 3,8
NAA2,0 mg/l N4 58,52 3,3 3,7 62,6 3,8 3,8 62,18 3,2 4,0
0 ĐC 30,24 1,7 1,4 55,20 2,0 1,7 33,43 1,9 1,8
FA = 12,3> Ftra bảng = 6,2 /t/=22,1>tra bảng = 3,1
Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với các dòng Keo lai mới chọn tạo,
IBA có tác dụng mạnh mẽ đến quá trình tạo rễ. Tỷ lệ chồi ra rễ thu đƣợc của
tất cả các dòng nghiên cứu đều cao hơn so với NAA. Tỷ lệ ra rễ đạt từ 65,25
đến 82,45%, trong khi sử dụng NAA để kích thích tạo rễ thì tỷ lệ này chỉ đạt
từ 55,24 đến 67,23%, trong khi đó các công thức đối chứng chỉ cho tỷ lệ ra rễ
đạt từ 30,24 đến 45,20% (Bảng 3.8). Mặt khác, khi sử dụng IBA với nồng độ
cao, chỉ tiêu số rễ trung bình/chồi đạt cao hơn so với khi sử dụng chất kích
60
thích tạo rễ ở nồng độ thấp hơn nhƣng chiều dài rễ trung bình và chất lƣợng rễ
tạo đƣợc lại thấp hơn.
Môi trƣờng có bổ sung IBA nồng độ 1,5mg/l cho tỷ lệ ra rễ thấp nhất
đạt 79,45% và cao nhất đạt 81,27%, trong khi đó nếu sử dụng môi trƣờng có
IBA nồng độ 2,0mg/l thì tỷ lệ ra rễ lại giảm với hai trên ba dòng Keo lai
nghiên cứu, và chỉ tiêu chiều dài rễ cũng giảm đi. Điều này chứng tỏ, nồng độ
IBA cao làm ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình trao đổi chất, từ đó kìm hãm sự
phân chia tế bào và quá trình tạo rễ của các dòng Keo lai nghiên cứu. Mặc dù,
môi trƣờng 1/2 MS2 có bổ sung IBA nồng độ 2,0mg/l cho tỷ lệ ra rễ dòng
BB055 cao hơn so với nồng độ 1,5mg/l nhƣng sự khác nhau là không đáng kể
(82,45 và 81,06%). Từ đó, có thể kết luận với các dòng Keo lai thí nghiệm
môi trƣờng tạo rễ thích hợp nhất là môi trƣờng 1/2MS* + IBA nồng độ
1,5mg/l, thời gian cho quá trình ra rễ là từ 17 đến 20 ngày.
Hình 3.6. Các chồi Keo lai dòng BB055 ra rễ trong môi trường có bổ
sung IBA (hàng trên) và NAA (hàng dưới)
61
Hình 3.7. Các chồi Keo lai dòng BV376 ra rễ sau 10 ngày
Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai
62
Bảng số liệu cũng cho thấy, cùng loại chất, cùng nồng độ, các dòng
Keo lai khác nhau thì khả năng ra rễ cũng khác nhau, trong 3 dòng Keo lai thí
nghiệm, có thể nhận xét rằng dòng BV586 vẫn là dòng cho tỷ lệ ra rễ cao hơn
so với các dòng còn lại.
3.7. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN HUẤN LUYỆN CÂY THÍCH HỢP
Cây mô sau khi ra rễ trong điều kiện nhân tạo đƣợc huấn luyện để thích
nghi dần với các điều kiện tự nhiên. Thông thƣờng, sau khi ra rễ trong vòng 7
ngày, cây mô đƣợc chuyển ra khu huấn luyện trong thời gian nhất định để
thích nghi với điều kiện vật lý tự nhiên. Kết quả thí nghiệm về thời gian huấn
luyện cây đƣợc trình bày trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai
Thời gian huấn
luyện (ngày) Tỷ lệ cây sống (%)
Chiều cao trung bình
(cm)
0-3 46,4±8,5 5,3±2,1
4-6 63,2±12,1 5,7±2,1
7-10 73,8±11,7 6,2±1,9
11-14 78,9±8,6 6,3±2,0
15-20 69,5±9,2 6,1±1,9
Ftính = 14,1> Ftra
bảng
Ftính = 5,7> F tra bảng
Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với Keo lai ra rễ trong lọ (hay ra rễ in
vitro) thời gian huấn luyện tốt nhất là sau khi các chồi ra rễ đƣợc 11 -14 ngày
lúc này các chồi ra rễ đã đủ cứng cáp để có thể thích nghi dần với điều kiện tự
nhiên. Mặt khác, quá trình hình thành và hoàn thiện rễ đến thời điểm này cũng
63
là thích hợp nhất để chuyển cây con ra giá thể mới. Nếu thời gian huấn luyện
ít hơn 10 ngày, các rễ và bản thân cây mô còn non nên ảnh hƣởng đến khả
năng sinh trƣởng và phát triển tại vƣờn ƣơm. Trong khi, nếu thời gian huấn
luyện (từ 15 ngày trở nên), các rễ quá dài khi cấy vào bầu rễ rất bị cong, thời
điểm này đầu rễ bắt đầu chuyển sang màu đen sẽ kìm hãm việc sinh lông hút
và làm hạn chế quá trình phát sinh rễ mới sau khi cấy chuyển cây con vào giá
thể. Kết quả thí nghiệm này cho thấy, so với các dòng Keo lai tự nhiên đã
đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, các dòng Keo lai mới có yêu cầu cao hơn cả về
dinh dƣỡng lẫn chế độ và phƣơng pháp nuôi cấy (với các dòng Keo lai tự
nhiên, thời gian huấn luyện chỉ 7-10 ngày là cho tỷ lệ sống cao nhất [9]).
Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ được cấy vào bầu đất
3.8. XÁC ĐỊNH LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO KEO LAI NUÔI CẤY
MÔ
Để xác định loại giá thể thích hợp cho cây nuôi cấy mô, khóa luận đã
tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau. Các loại giá thể đƣợc thí
nghiệm là các loại giá thể đã đƣợc sử dụng rộng rãi, có sẵn và đƣợc sử dụng
64
rộng rãi trong sản xuất. Cây mô sau khi đƣợc huấn luyện từ 11-14 ngày, rửa
sạch thạch, ngâm trong dung dịch Benlat C 0,3% trong vòng 2-3 phút rồi cấy
vào các loại giá thể thí nghiệm. Cây đƣợc che nắng, tƣới phun sao cho đủ độ
ẩm và tránh ánh nắng gắt trực tiếp. Sau 40-45 ngày cấy, kết quả thu đƣợc
trình bày trong Bảng 3.10 sau đây.
Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai
Loại giá thể Tỷ lệ cây sống
(%)
Chiều cao
trung bình
(cm)
Cát sông 80,6±7,5 9,3±3,2
100% Đất mầu 73,5±8,1 10,6±4,7
50% Đất mầu + 50% than trấu 78,9±9,3 11,3±5,1
70% Đất mầu + 30% Than trấu 79,3±8,3 11,3±4,5
70% Đất mầu + 20% Than trấu +10%
xơ dừa 87,2±6,6 11,4±3,2
Ftính
=12,5>Ftra bảng
Ftính
=8,3>Ftra bảng
Kết quả thí nghiệm cho thấy, cây mô Keo lai đã ra rễ đƣợc cấy vào 5
loại giá thể khác nhau đều cho có tỷ lệ sống tƣơng đối cao (từ 73% trở nên)
nhƣng mỗi loại giá thể đều có những ƣu, nhƣợc điểm nhất định. Trong đó, với
giá thể cát sông, do khả năng thoát nƣớc tốt, rễ có thể phát triển nhanh nên tỷ
lệ cây sống đạt trên 80%, chiều cao cây trung bình cũng đạt trên 11cm, nhƣng
lại nghèo về dinh dƣỡng và sau đó lại phải cấy chuyển từ giá thể cát sang bầu
đất nên sẽ kéo dài thời gian chăm sóc và huấn luyện cây con.
Trong các giá thể bầu đất đƣợc sử dụng thì loại giá thể gồm hỗn hợp
giữa bầu đất, than trấu và xơ dừa có tỷ lệ sống cao nhất và chiều cao cây con
cũng đạt cao nhất trong các công thức thí nghiệm. Điều này có thể giải thích
65
nhƣ sau: trong thành phần ruột bầu có than trấu và xơ dừa (có 1 lƣợng phân
hữu cơ nhất định) sẽ làm cho bầu tơi, xốp và dễ thoát nƣớc nhƣng lại có độ
ẩm cần thiết cho quá trình sinh trƣởng của cây con nên cho tỷ lệ sống cao, cây
phát triển tốt hơn so với các loại giá thể còn lại.
Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vườn ươm
3.9. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO CÁC DÒNG KEO
LAI NGIÊN CỨU
Qua kết quả thí nghiệm, luận văn đã bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình
nhân giống cho các dòng Keo lai nghiên cứu với các nội chính sau đây:
66
3.9.1. Mục tiêu quy trình
Quy trình kỹ thuật này giới thiệu những kỹ thuật cơ bản về nhân giống
bằng nuôi cấy mô các cho giống Keo lai tự nhiên BV586, BV376, BB055 đã
đƣợc công nhận là giống cây trồng mới.
3.9.2. Phạm vi áp dụng
Bản hƣớng dẫn kỹ thuật này đƣợc áp dụng trong tất cả các thành phần
kinh tế, những nơi có điều kiện thích hợp cho sản xuất giống Keo lai tự nhiên
BV586, BV376, BB055
3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình
3.9.3.1. Điều kiện khí hậu
Nhiệt độ không khí trung bình hàng năm 21 - 27oC, tối cao tuyệt đối
dƣới 42oC, tối thấp tuyệt đối trên 0
oC.
3.9.3.2. Nguồn giống
Sử dụng dòng Keo lai BV586, BV376, BB055 đã đƣợc nhà nƣớc công
nhận và do cơ quan chuyên môn cung cấp.
3.9.3.3. Điều kiện nhân lực
Có đủ nhân lực đƣợc tập huấn về kỹ thuật nhân giống giống Keo lai nói
trên, có hiểu biết về kỹ thuật lâm sinh, kỹ thuật nhân giống và phòng chống
sâu bệnh.
3.9.3.4. Cơ sở vật chất
Có đủ các thiết bị và thuốc phòng chống sâu bệnh và các biện pháp bảo
đảm an toàn lao động
Nơi sản xuất hom phải có nhà giâm hom với hệ thống phun sƣơng đƣợc
vận hành tốt hoặc có khu giâm hom với đủ thiết bị tƣới phun
Nơi sản xuất cây mô phải có nhà nuôi cấy mô với đủ thiết bị cần thiết.
67
3.9.4. Nội dung quy trình
3.9.4.1. Khử trùng mẫu
Vật liệu khử trùng là các chồi đạt chiều cao 10 - 15 cm và chƣa xuất
hiện các chồi bất định bên nách là đƣợc thu từ cây giống gốc
Đoạn chồi đã cắt đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc chảy bằng tay, sau đó
đƣợc rửa bằng nƣớc xà phòng và tráng sạch dƣới vòi nƣớc chảy, sau đó lau
bằng bông tẩm cồn 70% rồi rửa lại thật sạch bằng nƣớc cất, cắt thành đoạn
mẫu có ciều dài 3-5cm và có ít nhất một mắt chồi ngủ.
Khử trùng mẫu vật bằng Clorua thuỷ ngân (HgCl2) 0,1% trong thời
gian từ 5 phút, tráng vài lần bằng nƣớc cất vô trùng cho sạch dung dịch khử
trùng bám trên bề mặt mẫu, rồi cấy cào môi trƣờng tạo mẫu.
3.9.4.2. Nhân tạo mẫu
Môi trƣờng nhân chồi ban đầu là MS (Murashige và Skooge) cải tiến
có bổ sung thêm Riboflavin 0,1 mg/lít, Biotin 0,1 mg/lít, đƣờng 30 g/lít,
Agar-Agar 7 g/lít, và Polyvinyl pyrroline (PVP) 1 g/lít. Điều chỉnh độ pH =
5,8. Môi trƣờng đƣợc hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC ở áp suất 1,1 atm trong
thời gian 20 phút. Môi trƣờng đã hấp vô trùng đƣợc cho vào bình cấy hình
hộp hoặc bình tam giác miệng rộng.
Chồi đƣợc nuôi trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000
lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2
oC, thời gian chiếu sang là 8h/ngày.
Trƣớc khi cấy chồi phải khử trùng cho panh gắp bằng cách đốt trên
ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy phải đậy lọ bằng nắp nhựa (bình hình hộp)
hoặc nút bông (bình tam giác miệng rộng).
Sau 30 - 35 ngày, khi chồi bất định dài 1,5 - 2,0 cm, cắt và cấy chuyển
sang môi trƣờng nhân chồi MS cải tiến (MS*) đƣợc bổ sung 6g/lít thạch, 1,5
mg/lít BAP và các chất phụ gia, vitamin, điều chỉnh pH = 5,8 và đƣợc hấp vô
trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút.
68
3.9.4.3. Nhân nhanh
Môi trƣờng nhân nhanh chồi cho giống keo lai tự nhiên là môi trƣờng
MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít đƣờng, 1,5 mg/lít BAP hoặc 2,0mg/l,
cùng các chất phụ gia, các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc
hấp vô trùng trong điều kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.
Chồi đƣợc nuôi trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000
lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2
oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.
Sau đó cứ 22 - 27 ngày cấy chuyển một lần cho đến lúc đủ lƣợng chồi
cần thiết để ra rễ.
3.9.4.4. Nâng cao chất lượng chồi
Môi trƣờng nhân nhanh chồi là MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít
đƣờng, 1,5mg/lít BAP (hoặc 2,0 mg/l) + 0,5g/lít NAA cùng các chất phụ gia,
các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc hấp vô trùng trong điều
kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.
Cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình nuôi cấy 250ml (có từ 60-75ml môi
trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm. Chồi đƣợc nuôi trong bình
đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000 lux, nhiệt độ trong phòng 25oC
2oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.
Sau 25 - 30 ngày cấy chuyển có thể cho các chồi ra rễ.
3.9.4.5. Cho ra rễ
Môi trƣờng ra rễ cho Keo lai là 1/2 thành phần môi trƣờng MS cải tiến,
bổ sung 7g/lít thạch có bổ sung IBA nồng độ 2 mg/lít, đƣờng 15g/lít và PVP 1
g/lít.
3.9.4.6. Huấn luyện cây
Các chồi keo lai sau khi đã ra rễ trong lọ (khoảng 7-10 ngày) đƣợc
chuyển ra khhu huấn luyện nhằm cho cây thích nghi dần với điều kiện tự
nhiên. Thời gian huấn luyện từ 11-14 ngày.
69
3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất:
Sau thời gian huấn luyện, cây mô đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất với
thành phần nhƣ sau: 70% đất mầu, 10% phân campot và 20% hỗn hợp ruột
bầu, có thể thay hỗn hợp ruột bầu bằng than trấu và xơ dừa.
Lấy cây mầm từ trong lọ, rửa hết thạch bằng nƣớc sạch rồi xử lý bằng
benlat C nồng độ 3% trong 3-5 phút.
Dùng que cấy cắm vào giữa bầu một lỗ có độ sâu 2-3cm, dùng ngón tay
cái và ngón trỏ giữ cho cây thẳng đứng, đƣa nhẹ cây vào lỗ có trên bầu, không
đƣợc làm cong rễ, lấy que cấy ấn nhẹ xung quanh gốc để rễ cây tiếp xúc với
đất, cấy đến đâu dùng ô doa tƣới nhẹ đến đó.
Sau khi cấy cây mô vào bầu cần chú ý che nắng và bảo đảm ẩm cho cây
trong một tuần đầu, sau đó theo chế độ chăm sóc thông thƣờng cho đến khi
cây đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn.
70
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
1- Phƣơng pháp khử trùng thích hợp cho các dòng keo lai nghiên cứu là
sử dụng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% trong vòng 5 phút cho tỷ lệ bật chồi
hữu hiệu đạt 37,5%.
2- Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai nghiên cứu là môi
trƣờng MS cải tiến về thành phần và nồng độ các chất đa lƣợng, vi lƣợng (kí
hiệu MS2).
3- Môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các dòng keo lai BV376,
BV586 và BB055 là môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l và
NAA 0,5mg/l.
4- Chế độ chiếu sáng thích hợp để nuôi cấy các dòng Keo lai nghiên
cứu là chiếu sáng 7-9h/ngày với cƣờng độ ánh sáng 2.000-2.500 lux trong cả
chu kỳ nuôi cấy (25 ngày/chu kỳ).
5- Phƣơng thức cấy có hiệu quả nhất trong việc kích thích tạo chồi
cũng nhƣ tiết kiệm đƣợc không gian dinh dƣỡng cho các dòng Keo lai nghiên
cứu là cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình nuôi cấy 250ml (có từ 60-75ml môi
trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm.
6- Môi trƣờng ra rễ thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên cứu là
1/2MS2 + IBA nồng độ 1,5-2,0mg/l cho tỷ lệ ra rễ trên 80%.
7- Thời gian huấn luyện cây con ra rễ trƣớc khi đƣa ra vƣờm ƣơm là từ
11-14 ngày.
8- Giá thể thích hợp nhất để cấy cây mô đã ra rễ là 70% Đất mầu +
20% Than trấu +10% xơ dừa cho tỷ lệ sống trên 80% cây sinh trƣởng tốt.
9- Từ các kết quả trên, đã đề xuất đƣợc quy trình nhân giống bằng nuôi
cấy mô cho các dòng Keo lai nghiên cứu nhằm từ đó chuyển giao giống và
quy trình nhân giống cho các đơn vị nghiên cứu và sản xuất giống cây lâm
nghiệp để phát triển các giống mới này vào trồng rừng sản xuất.
71
4.2. KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian tiến hành các thí nghiệm, các nghiên cứu trong
khuôn khổ luận án này mới chỉ là những kết quả bƣớc đầu. Vì thế, để xác định
phƣơng pháp nhân nhanh tối ƣu cũng nhƣ xây dựng quy trình nhân giống cho
các dòng Keo lai này với mục tiêu chuyển giao công nghệ nhân giống vào
thực tiễn sản xuất, thời gian tới cần có thêm các nghiên cứu bổ sung với quy
mô rộng hơn nhƣ:
+ Đánh giá sinh trƣởng bƣớc đầu của cây con trong giai đoạn vƣờn
ƣơm cũng nhƣ ảnh hƣởng cuả thời vụ tới kết quả huấn luyện cây con tại vƣờn
ƣơm.
+ Cải tiến, tối ƣu hóa môi trƣờng và Phƣơng pháp nuôi cấy cho phù
hợp với điều kiện sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm từ đó xây dựng và hàn
thiện quy trình nhân giống để áp dụng vào sản xuất thực tiễn.
+ Đánh giá khả năng nhân giống cho từng đối tƣợng riêng rẽ cũng nhƣ
nghiên cứu mở rộng về phƣơng pháp ra rễ chồi non bằng chấm thuốc bột kích
thích tạo rễ trong điều kiện vƣờn ƣơm.
72
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu và
ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai 2002, Một số phƣơng thức nhân giống sinh
dƣỡng trong sản xuất lâm nghiệp‖, Công nghệ nhân và sản xuất giống cây
trồng, giống cây lâm nghiệp và giống vật nuôi, Nhà xuất bản Lao động xã hội
(Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hƣng Quốc). Hà Nội, tr. 166-182.
3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2001, Nhân giống vô tính và trồng rừng dòng vô
tính, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 120 trang.
4. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp Nhà nước
―Nghiên cứu nhân nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn
uro, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào‖.
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
5. Gupta P.K., Nadgir A.L., Mascarenhas A.F., Jagannathan V, 1980,
Tissue culture of forest trees: Clonal multiplication of Tectona grandis L.
(teak) by tissue culture. Plant Science Letters, 7 (3): 259-268
6. Girijashankar, 2012, In vitro regeneration of Eucalyptus camaldulensis.
Physiol Mol Biol Plants, 18 (1): 79–87.
7. Das T, Mitra GC, 1990, Micropropagation of Eucalyptus tereticornis
Smith. Plant cell Tissue Organ Cult, 22: 95 - 103.
8. Warrag E.I., Lesney M. S. and Rockwood D. L., 1990.
Micropropagation of field tested superior Eucalyptus grandis hybrids. Kluwer
Academic Publishers. New Forests, 4: 67 – 79.
9. Roberson Dibax, Cristiane de Loyola Eisfeld, Francine Lorena Cuquel,
Henrique Koehler, Marguerite Quoirin, 2005, Plant regeneration from
cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis. Sci. Agric., 62 (4): 406 -
412.
73
10. Ho C. K., Chang S. H., Tsay J. Y., Tsay C. J., Chiang V. L., Chen Z. Z.,
1998, Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Eucalyptus
camaldulensis and production of transgenic plants, Plant Cell Rep., 17: 675-680.
11. Sharma S.K., Ramamurthy V., 2000, Micropropagation of 4-year-old
elite Eucalyptus tereticornis trees, Plant Cell Report, 19: 511 – 518.
12. González E.R., Andrade A., Bertolo A.L., Lacerda G.C., Carneiro R.T.,
Defávari V.A.P., Labate M.T.V., Labate C.A., 2002, Production of
transgenic Eucalyptus grandis × E. urophylla using the sonication-assisted
Agrobacterium transformation (SAAT) system, Functional Plant Biology, 29:
97-102.
13. Joshi I., Bisht P., Sharma V. K, Uniyal D. P., 2003, In vitro clonal
propagation of mature Eucalyptus F1 hybrid (E. tereticornis Sm x E. grandis
Hill ex. Maiden), Silvae Genetica, 52 (3-4): 110 - 113.
14. Lainé E., David A., 1994, Regeneration of plants from leaf explants of
micropropagated clonal Eucalyptus grandis, Plant Cell Rep., 13: 473-476.
15. Roberson D., Regina C. Q., Cleusa B., Quoirin M, 2010, Plant regeneration
from cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis dehn and histological
study of organogenesis in vitro, Braz. arch. biol. technol., 53 (2): 311-318.
16. Sotelo M. and Monza J. 2007, Micropropagation of Eucalyptus maidenii
elite trees, Agrociencia, 11: 81 – 89.
17. Sophie N. and Olivier M., 2008, In vitro rooting of two Eucalyptus
urophylla X Eucalyptus grandis mature clones, In Vitro Cellular and
Developmental Biology – Plant, 44(4): 263-272.
18. Natasha Ma, Manoj Kumar, Vikas Shrivastava, Vijayta Sharma, Uma
Bhardwaj, 2012, Direct regeneration of HFRI-5 from nodes internodes and
apical shoot explants, Asia Journal of Plant Science and Research, 2 (6): 653
- 658.
19. Lê Đình Khả, 1999, Nghiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên giữa Keo tai
tượng và Keo lá tràm ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
74
20. Dƣơng Mộng Hùng, 1993, Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy
mô tế bào cho hai loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. urophylla, Báo cáo
đề tài, trƣờng Đại học Lâm nghiệp, Hà Tây.
21.Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000, ―Kết quả bƣớc đầu về nhân giống Bạch
đàn lai bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô phân sinh‖, Tạp chí Lâm nghiệp, số
10, tr. 46-47.
22. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2003, Nhân giống cho một số giống cây rừng
mới chọn tạo bằng nuôi cấy mô, Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội - tháng
11 năm 2003.
23. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2005, Bƣớc đầu ứng dụng công nghệ mô -
hom trong nhân giống Trầm hƣơng, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr. 57-67.
24. Lê Đình Khả, Dƣơng Mộng Hùng (2003), Giống cây rừng, NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
25. Brand M., & Lineberger R., 1992, In vitro Rejuvenation of Betula
(Betulaceae): Biochemical Evaluation, American Journal of Botany, 79(6),
626-635.
26. Vũ Văn Vụ, 1994, Sinh lý học thực vật, Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ
thuật, Hà Nội.
27. Trần Văn Minh, 1994, Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công
nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
28. Nguyễn Văn Uyển, 1993, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống
cây rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
29. Đỗ Năng Vịnh, 2002, Công nghệ sinh học cây trồng, Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội.
30.Von Arnold S., 1982, Factors influencing formation, development and
rooting of adventitious shoots from embryos of Picea abies (L.), Plant Sci.
Lett. 27: 275-287.
75
31.Nguyễn Quang Thạch, 2000, Giáo trình sinh lý thực vật, Nhà xuất bản
Nông nghiệp, Hà Nội.
32.Bhat K. M. and Hwanok Ma (2004), Teak growers unite, in ITTO tropical
forest update.
33. Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh
Hƣơng, Văn Thu Huyền, 2009a, Nuôi cấy một số giống Keo lai mới chọn tạo,
Tạp chí khoa học Lâm nghiệp số 2/2009, trang 905 – 910.
34. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Ngô Thị Minh Duyên, Lƣơng Thị Hoan, 2009b,
Nhân giống sinh dƣỡng và xây dựng mô hình trồng một số dòng keo lá tràm
(Acacia auriculiformis) mới tuyển chọn, Báo cáo Hội nghị KHCN lâm nghiệp
khu vực phía Bắc.
35. Lê Đình Khả, 2003, Nghiên cứu chọn tạo giống và nhân giống cho một
số loài cây trồng rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
36. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài ―Nghiên cứu chọn
các dòng keo và bạch đàn chống chịu bệnh có năng suất cao‖, Viện Khoa học
Lâm nghiệp Việt Nam.
37. Beck S.L. and Dunlop R. W., 2001, Micropropagation of the Acacia
species – A review, In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant, 37:531–538.
38. Darus H. Ahmad (1994), Multiplication of Acacia mangium by stem
cutting and tissue culture techniques, Advances in tropical acacia research,
pp. 32-34.
39. Gerard C. Douglas and John Mcnamara, 1999, Shoot regeneration from
seedling explants of Acacia mangium Willd. In Vitro Cellular & Developmental
Biology - Plant, 36: 412–415
40. De-Yu Xie and Yan Hong, 2001, In vitro regeneration of Acacia
mangium via organogenesis, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 66(3):167-
173.
76
41. Nanda R.M., Rout G.R., 2003, In vitro somatic embryogenesis and plant
regeneration in Acacia arabica, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 73,
131-135.
42. Nanda R. M., Das P., Rout G. R., 2004, In vitro clonal propagation of
Acacia mangium Willd. and its evaluation of genetic stability through RAPD
markers. Ann. For. Sci. 61 (2004) 381–386.
43. Mittal A., Agarwal R. and Gupta S.C., 1989, In vitro development of
plantlets from axillary buds of Acacia auriculiformis — a leguminous tree,
Plant Cell Tiss Organ Cult 19, 65–70.
44. Trindate H. F., Pais J. G., Aloni M. S., 1990, The role of Cytokinin and
auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro,
Aust. For. 53(4), pp. 221-223.
45. Shukor N.A.A., Griffin A., Jainol J.E., Awang K., Basharuddin J.,
Ismail H., Yusoff A.M., 2000, Shoot proliferation of three potential tropical
plantation tree species, Proceedings of Forests and Society (2000): The Role
of Research, Posters IUFRO World Congress, Malaysia, p. 74.
46. Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự, 1995, Nhân giống Keo lai bằng nuôi cấy
mô phân sinh, In trong Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ giai đoạn
1990-1995, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
47. Nguyễn Ngọc Tân, Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên, 1997, Nhân
giống Keo lai bằng nuôi cấy mô phân sinh, In trong Kết quả nghiên cứu khoa
học về chọn giống cây rừng, Tập 2, Chủ biên Lê Đình Khả, NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
48. Lê Sơn và các cộng tác viên, 2013, Hoàn thiện quy trình nhân nhanh
bằng nuôi cấy mô cho 6 giống Keo lai đã được công nhận, Báo cáo dự án
SXTN cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
49. Cấn Thị Lan và cộng sự, 2017, Nghiên cứu nhân nhanh một số giống
Keo và Bạch dàn mới bằng công nghệ tế bào thực vật, Báo cáo tổng kết đề tài
cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
77
50. Cấn Thị Lan và cộng sự, 2020, Hoàn thiện công nghệ vi nhân giống
quy mô công nghiệp và sản xuất các giống Keo lá tràm Clt18, Clt57, Clt98,
Báo cáo tổng kết dự án sxtn cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt
Nam.
PHỤ LỤC
Bảng 1. Môi trƣờng MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962)
Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)
KNO3 1900
NH4NO3 1650
MgSO4.7H2O 370
KH2PO4 170
CaCl2 332
H3BO3 6,2
MnSO4.H2O 22,3
ZnSO4 8,6
Na2MO4 0,25
CuSO4.7H2O 0,025
CoCl2 0,025
Na2EDTA 37,3
FeSO4.7H2O 27,8
Glycin 2
Myo-inositol 100
Nicotinic acid 0,5
Thiamin HCl 0,1
Prydoxin HCl 0,5
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (kí hiệu MS1)
Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)
KNO3 1900
NH4NO3 1650
KH2PO4 170
CaCl2 220
MgSO4 180
Na2EDTA 37,3
FeSO4.7H2O 27,8
MnSO4.4H2O 16,7
H3BO3 6,2
ZnSO4.7 H2O 8,6
KI 0,83
Na2MoO4.2 H2O 0,25
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4 0,025
Glycin 2,0
Myo-Inositol 100
Nicotinic acid 5,0
Pyridoxine HCl (vitamin B6) 5,0
Thiamine HCl (vitamin B1) 1,0
Biotin 0,01
Axit ascorbic (Vitamic C) 100
PVP 1000
Casein 100
Bảng 3. Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (Kí hiệu MS2)
Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)
KNO3 1900
NH4NO3 1650
KH2PO4 225
CaCl2 440
MgSO4 370
Na2EDTA 37,3
FeSO4.7H2O 27,8
MnSO4.4H2O 33,75
H3BO3 9,3
ZnSO4.7 H2O 12,9
KI 1,25
Na2MoO4.2 H2O 0,3
CoCl2.6H2O 0,03
CuSO4 0,03
Glycin 2,0
Myo-Inositol 150
Nicotinic acid 1,0
Pyridoxine HCl (vitamin B6) 1,0
Thiamine HCl (vitamin B1) 1,0
Biotin 0,1
Axit ascorbic (Vitamic C) 150
PVP 1000
Casein 100
Bảng 4. Môi trƣờng MS* (là môi trƣờng MS giảm ½ Nitơ tổng số)
Thành phần Hàm lƣợng (mg/l)
KNO3 950
NH4NO3 825
MgSO4.7H2O 370
KH2PO4 170
CaCl2 332
H3BO3 6,2
MnSO4.H2O 22,3
ZnSO4 8,6
Na2MO4 0,25
CuSO4.7H2O 0,025
CoCl2 0,025
Na2EDTA 37,3
FeSO4.7H2O 27,8
Glycin 2
Myo-inositol 100
Nicotinic acid 0,5
Thiamin HCl 0,1
Prydoxin HCl 0,5
Bảng 5. Xử lý số liệu vào khử trùng mẫu
ANOVA Tỷ lệ sống (%)
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 984.3 19 523.4 22.90 .000
Within groups 121.5 40 144.65
Total 1105.8 59
ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 864.3 19 412.6 71.84 .000
Within groups 71.2 40 74.57
Total 935.5 59
ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%)
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 542.1 19 523.4 6.22 .000
Within groups 62.3 40 144.65
Total 604.4 59
Bảng 6. So sánh hiệu quả khử trùng từng giống
ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 864.3 2 412.6 71.84 .000
Within groups 71.2 4 74.57
Total 935.5 6
ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%)
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 542.1 2 523.4 6.22 .000
Within groups 62.3 4 144.65
Total 604.4 6
Bảng 7. Kết quả phân tích ANOVA this nghiệm xác định môi
trƣờng nuôi cấy cơ bản
ANOVA Hệ số nhân chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 64.2 2 151.2 5.34 .000
Within groups 41.7 4 81.9
Total 105.9 6
ANOVA chiều dài chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 182.4 2 478.1 7.28 .000
Within groups 63.7 4 157.3
Total 246.1 6
Bảng 8. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định môi
trƣờng nhân nhanh
ANOVA Hệ số nhân chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 684.1 6 452.2 5.34 .000
Within groups 411.3 12 180.2
Total 1095.4 18
ANOVA chiều dài chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 689.7 6 788.2 8.4 .000
Within groups 243.5 12 247.7
Total 933.2 18
Bảng 9. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định môi
trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi
ANOVA Hệ số nhân chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 745.2 6 234.1 6.81 .000
Within groups 214.6 12 167.9
Total 959.8 18
ANOVA chiều dài chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 871.2 6 647.3 5.77 .000
Within groups 321.4 12 189.2
Total 1192.6 18
Bảng 10. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu
sáng thích hợp
ANOVA Hệ số nhân chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 453.1 3 145.8 7.24 .000
Within groups 68.4 6 48.4
Total 521.5 9
ANOVA chiều dài chồi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 245.8 3 89.4 4.25 .000
Within groups 89.4 6 46.2
Total 335.2 9
ANOVA tỷ lệ chồi hữu hiệu
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 465.2 3 245.3 6.25 .000
Within groups 189.7 6 141.1
Total 654.7 9
Bảng 11. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu
sáng thích hợp
ANOVA Tỷ lệ ra rễ
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 897.2 8 258.1 12.3 .000
Within groups 124.6 16 68.4
Total 1021.8 24
ANOVA chiều dài rễ
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 342.5 8 108.5 7.4 .000
Within groups 121.4 16 62.1
Total 463.9 24
ANOVA số rễ trung bình
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 415.3 8 312.4 9.46 .000
Within groups 99.4 16 105.8
Total 514.7 24
Bảng 12. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định thời gian
huấn luyện
ANOVA Tỷ lệ cây sống
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 245.8 5 152.7 5.2 .000
Within groups 64.7 10 57.3
Total 309.5 15
ANOVA chiều cao trung bình
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between groups 264.1 5 106.7 4.4 .000
Within groups 98.6 10 72.6
Total 362.7 15