1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NGỌC BẢO

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE

THAN Bacillus anthracis

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62420107

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015

2

Công trình đƣợc hoàn thành tại

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. TS. Đoàn Trọng Tuyên

2. TS. Lê Thu Hà

Phản biện 1: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện 2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Phản biện 3: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án

tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

vào hồi giờ ngày tháng năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Bệnh than là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do nhiễm trực khuẩn

than B.anthracis. B. anthracis thường gây bệnh cho các loại động vật móng guốc,

ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực

tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da,

lông[1]

. Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh

cảnh lâm sàng và đường lây phong phú, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngoài

môi trường. Chính vì, dễ sản xuất và tàng trữ nên B.anthracis thường được các

nước sử dụng như một loại vũ khí sinh học trong phòng chống và đánh trả, luôn có

nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [4]

.

Phòng chống bệnh than luôn là vấn đề mang tính cấp thiết, sử dụng kháng

chỉ là biện pháp ngắn hạn, tại chỗ. Biện pháp bảo vệ lâu dài và chủ động trên diện

rộng là tiêm phòng vắc-xin cho các nhóm nguy cơ cao: người dân trong vùng dịch,

nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân than, nhân viên xét nghiệm tại các

phòng thí nghiệm... Bên cạnh đó, dự phòng bệnh than cho quân nhân thực hiện

nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến có nguy cơ sử dụng trực khuẩn than cũng là vấn

đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra.

Hiện nay, quan điểm sử dụng vaccine phòng bệnh than cho người có hai xu

hướng khác nhau. Đối với các nước như: Anh, Mỹ, vaccine phòng bệnh than đã

đưa vào sử dụng là loại vaccine phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu

trúc tế bào với kỳ vọng gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, ít phản ứng phụ hơn so

với vaccine toàn tế bào. Trường phái của các nước như: Nga; Trung quốc, Ấn độ,,

thì sản xuất vaccine bào tử than, toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch

nhanh và sản xuất đơn giản đầu tư ít. Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về

hai phương pháp này để có được phương án phù hợp nhất với Việt Nam.

Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người

nhưng vẫn chưa có vaccine dự phòng cho người. Đến nay, chưa có nghiên cứu về

sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam và chủng dùng sản xuất vaccine.

Việc nhập vaccine phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và không đáp

ứng được yêu cầu chủ động phòng bệnh. Chính vì vậy để đáp ứng yêu cầu của

cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis” nhằm mục đích:

1. Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine và các chủng than gây bệnh đầy đủ

độc lực tại Việt Nam để đánh giá thử thách.

2. Sản xuất được hai loại vaccine phòng bệnh than với hai nguyên lý khác nhau ở

quy mô phòng thí nghiệm.

3. Đánh giá được tính an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ của hai loại

vaccine than trên động vật.

2

Những đóng góp mới của luận án:

1. Phân lập được các chủng than (B.anthracis) từ các ổ dịch mới và cũ, từ mẫu

lâm sàng có tính đại diện cho các vùng dịch (Lai Châu, Hà Giang). Các chủng phân lập từ

môi trường là bằng chứng khẳng định ổ dịch lưu hành trong tự nhiên tại các địa phương.

Đóng góp xây dựng ngân hàng chủng nhóm B. cereus, các chủng than độc lực và không

độc lực.

2. Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine phù hợp có tính tương đồng cao, có

hiệu lực bảo vệ với các chủng gây bệnh phân lập tại Việt Nam. Giải trình tự và đăng ký

vùng gene Pacủa chủng độc lực của Việt Nam trên ngân hàng gene NCBI.

3. Xây dựng quy trình và sản xuất hai loại vaccine phòng bệnh than, đánh giá tính

an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ trên mô hình động vật.

4. Nghiên cứu và sản xuất vaccine phòng bệnh than hấp phụ có thể sử dụng cho

người lần đầu áp dụng tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh than - anthrax

1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than trên thế giới

1.1.2. Đặc điểm lưu hành bệnh than trong nước

1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh than

1.1.4. Dự phòng và điều trị dự phòng bệnh than

1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn than B. anthracis

1.2.1. Phân loại

1.2.2. Hình thể

1.2.3. Tính chất phát triển

1.2.4. Khả năng đề kháng và phương thức tồn tại của vi khuẩn than

1.2.4.1. Sức đề kháng.

1.2.4.2. Phương thức tồn tại

1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên

1.2.6. Độc tố của trực khuẩn than

1.2.7. Cấu trúc hệ thống gene của B. anthracis

1.2.8. Đặc điểm của các chủng B. anthracis dự tuyển sản xuất vaccine.

1.3. Qui trình sản xuất vaccine phòng bệnh than

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu:

Chủng B.anthracis

+ 02 chủng độc lực (ký hiệu: Toxin) và không độc lực (Non Toxin) do Học viện

Quân y cung cấp.

+ 03 chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM1167 và chủng B. anthracis

VCM1166 và BaVCM1168; Hai chủng BaVCM1167 và BaVCM1166 có nguồn gốc từ

chủng 34F2 do FAO cung cấp.

+ 01 chủng ký hiệu Vaccine lưu giữ tại Khoa vi sinh vật- Viện Y học dự phòng

Quân đội

3

+ Chủng phân lập các từ mẫu môi trường và mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

+ Trình tự các chủng trên ngân hàng gene:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://patricbrc.org/portal/portal/patric/Blast? dm=result&pk=-466528958

Vaccine phòng bệnh than

- Vaccine bào tử than sống giảm độc lực, toàn tế bào (TTB) từ chủng dự tuyển.

- Vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) từ chủng dự tuyển.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Sinh phẩm, hoá chất nghiên cứu

a. Môi trường nuôi cấy, phân lập tuyển chọn chủng B. anthracis

b. Sinh phẩm PCR:

c. Sinh phẩm giải trình tự gene do hãng ABI cung cấp

d. Kháng huyết thanh và kháng nguyên:

e. Định lượng kháng thể:

f. Thanh định danh trực khuẩn bacillus API 50CHB/E và API 20E ( Pháp).

2.2.2. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.

2.2.2.1. Máy móc dụng cụ

- Tủ ấm 370C, Memmert, kính hiển vi Olympus, tủ lạnh âm (-20

0C).

- Máy đông khô Edward 3400 – Anh quốc.

- Buồng cấy vô trùng Class II Nuaire – USA.

- Máy Khuếch đại gene Parking Elmer 2400 ( Mĩ).

- Máy điện di Power pac 300 ( Bio - rad).

- Máy ly tâm, máy đo MacFanland, máy ủ (370C

).

- Máy sequencer 3130 genetic Analyzer –ABI (Mỹ).

- Cân điện tử, hộp Roux, đĩa Petri và các dụng cụ chuyên dùng.

2.2.2.2. Dụng cụ tiêu hao

2.2.2.3. Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: 18 – 22g/con.

- Chuột lang khỏe mạnh: 250 – 350 g/con.

- Thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2,5 – 3,5 kg/con (thỏ newzeland do Trung tâm

nghiên cứu dê, thỏ Xuân Canh Ba Vì cung cấp).

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:

2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vaccine và các chủng vi

khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách:

Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn:

Phƣơng pháp xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm:

- Phương pháp xác định độc tính cấp LD50 của chủng than độc lực.

Phƣơng pháp phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật sinh

học phân tử.

- Kỹ thuật PCR và semi-Nested PCR xác định các gene độc lực B.anthracis

- Kỹ thuật giải trình tự gene và so sánh trình tự các vùng gene:

4

2.3.2. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine

2.3.2.1. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine bào tử sống giảm độc lực

Hình 2. 1: Quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực.

.

Dsfdfgd

Fgfgh

Ghj

Chủng Bacillus anthracis

BaVCN1167 đông khô

Nhân chủng trong canh thang TSB

370C/15 giờ

3

Hoàn nguyên chủng với canh

thang TSB (370C/6h)

(370C/hhggggiờ)giờ)

Thạch dinh dưỡng (NA)

370C/24 giờ

Bất hoạt vi khuẩn (650C/1giờ)

Nuôi cấy thu sinh khối VK trên

Thạch NA trong hộp Roux 37oC/48

giờ

370C/48 giờ

Phân 0,5 ml dịch vi khuẩn vào lọ

đông khô

Gặt vi khuẩn bằng tá dược

(12ml/hộp Roux)

Đông khô vaccine trên máy đông khô

Vắc xin thành phẩm

- Kiểm tra thuần khiết

- Kiểm tra độ sống

- Kiểm tra vật lý, độ ẩm

- Kiểm tra an toàn chung

- Kiểm tra đáp ứng miễn dịch

và công hiệu

- Kiểm tra chủng giống

- Kiểm tra thuần khiết

- Chọn khuẩn lạc

5

2.3.2.2. Phƣơng pháp sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)

Hình 2. 2. Quy trình sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)

2.2.2.2.1. Các bƣớc thực hiện quy trình lên men:

2.3.2.2.2. Các phƣơng pháp áp dụng trong sản xuất và đánh giá độ tinh sạch

của protein PA của vaccine hấp phụ

Lựa chọn môi trường thích hợp lên men chủng dự tuyển sản xuất vaccine

Điều kiện môi trường sinh tổng hợp protein PA của B.anthracis

Kỹ thuật thu nhận protein PA [119]

Xác định độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %

Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Ethanol

phương pháp sắc ký trao đổi ion

Sắc ký lọc gel Biogel P100.

Phương pháp Western Blot [3, 25]

Môi trường

nhân giống Môi trường

lên men

Nhân giống

24 h

Lên men

Tiếp giống

10% Tối ưu điều kiện

môi trường

Kiểm tra tốc

độ sinh

trưởng

Xác định

lượng protein

tạo thành

Thu mẫu

sau 36h lên

men

Loại bỏ tế bào

Tủa bằng cồn 50 %

Kiểm tra protein

bằng phản ứng

Western, ELISA Chia nhỏ và

đông khô

Bổ sung

amluminum

hydroxide 0.1%

(1) (2)

(3)

(4b)

(5)

(6)

(9)

(7)

(10)

(4a)

(2)

(8)

6

2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vaccine

phòng bệnh than.

2.3.3.1. Kỹ thuật xác định độc tính cấp của vaccine trên động vật thực nghiệm

(LD50) .

- Cách xác định LD50 theo phương pháp Kaerker và behrens

- Cách tính LD50 theo công thức Spearman-Karber

2.3.3.2. Đánh giá tính an toàn của vaccine:

2.3.3.3. Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ Máu 1 Máu 2 Máu 3 Máu 4

0 tuần 4 tuần

2 tuần 6 tuần 8 tuần 10 tuần

Tiêm mũi 1 Tiêm mũi 2

Hình 2. 3: Lịch tiêm và thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ

tiêm vaccine

2.3.3.4. Định lƣợng kháng thể (anti-PA) kháng kháng nguyên bảo vệ Pa-83

Kda từ huyết thanh thỏ.

2.3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá vaccine phòng bệnh than và các tiêu chuẩn

kiểm định vaccine phòng bệnh than

Bảng 2. 1 Tiêu chuẩn chất lƣợng vaccine bào tử than, sống giảm độc lực

TT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn

1 Kiểm tra vật lý

- Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy

nước.

- Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng

nhất, không vẩn cặn.

2 pH 6,8-7,5

4 Thuần khiết (*) - Hình thái đặc trưng của trực khuẩn Than, Gram (+).

- Không có tạp nhiễm.

5 Độ sống (*) 1 x 108 – 5 x 10

8 CFU/ml

6 Độ ẩm tồn dư 3%

7 Độ ổn định Độ sống đạt 1x10

8 - 5x10

8 CFU/ml đến 2 năm, bảo quản ở nhiệt độ

2oC - 8

oC.

8 Chí nhiệt tố

- Đánh giá các yếu tố gây sốt gây viêm trong vaccine, tiêm trên

thỏ. Vết tiêm không có phản ứng viêm, Thỏ không tăng nhiệt sau

khi tiêm

9 Tính sinh miễn

dịch trên thỏ

- Liều tiêm:

+ TTB 0,5ml x 108tbvk/thỏ

- Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine (u/ml =

ng/ml)

7

10 Công hiệu, đánh

giá thử thách

- Sau 10 ngày thử thách (ngày 21-30), với phác đồ tiêm vaccine

0,14 ngày:

+ Chuột chứng: Chết 100%.

+ Chuột được tiêm vaccine liều:

+ 107btvk/ml/con: sống 90%

+ 108btvk/ml /con: sống 100%.

Bảng 2. 2. Tiêu chuẩn vaccine hấp phụ phòng bệnh than AVA TT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn

1 Kiểm tra vật lý

- Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không

chảy nước.

- Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch

đồng nhất, không vẩn cặn.

2 pH 6,8 - 7,5

3 Vô trùng - Không nhiễm vi khuẩn, nấm, vi sinh vật khác.

5 Độ sống Không

6

Aluminum hydrorid hoặc

aluminum potassium

sulfate

0,65mg / liều (AVA-Mỹ)

0,52 mg / liều (Merck)

7 formaldehyde 0,01% (AVA-Mỹ)

8 Benzethorium chlorid 0,0025% - 0,01%

9 Độ ẩm tồn dư 3%

10 Chí nhiệt tố

- Đánh giá các yếu tố gây sốt, gây viêm trong vaccine trên

thỏ. Vết tiêm không có phản ứng viêm, thỏ không tăng nhiệt

sau khi tiêm.

11 Tính sinh miễn dịch trên

thỏ

- Liều tiêm:

+ AVA 0,1ml x 50µg/thỏ

- Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine

(u/ml = ng/ml)

12 Công hiệu, đánh giá thử

thách.

- Hiệu lực bảo vệ của vaccine tăng theo liều tiêm và nồng độ

kháng nguyên PA83.

2.3.3.6. Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine AVA.

2.3.3.7. Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine TTB:

2.4. Quy trình, kỹ thuật đông khô vaccine.

2.5. Xử lý số liệu: Thống kê xử lý số liệu theo các thuật toán trong y học và các

phần mềm trong nghiên cứu.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG

THỬ THÁCH.

3.1.1. Kết quả phân lập định danh vi khuẩn than từ các loại mẫu khác nhau.

Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu môi trường được thu thập và phân lập

tại Khoa Vi sinh vật viện Y học dự phòng Quân đội. Mẫu được phân lập chọn lọc

trên môi trường thạch máu, sau đó lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm soi hình thể cấu

trúc, tính chất bắt màu và trình tự sắp xếp.

8

Các chủng nghi ngờ được định danh trên thanh API 50CHB/E và API 20E,

để xác định tính chất sinh vật hóa học và định danh trên phần mềm của hãng

BioMerieux.

Bảng 3. 1: Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm và

chủng đƣợc cung cấp bằng bộ kit API 50CHB/E

TT Ký hiệu

mẫu Nguồn mẫu

Số mẫu/

chủng Nguồn gốc Kết quả định danh

1 Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Bacillus anthracis

(99,7%)

2 Non Toxin Bệnh nhân HVQY 01 Chủng Bacillus cereus II

(99,9%)

3 Vaccine Viện VSPDQD 01 Chủng Bacillus cereus II

(99,9%)

4 BaVCM1167 Viện CNSH cung

cấp 01 Chủng

Bacillus anthracis

(99,9%)

5 Ba VCM

1168

Viện CNSH cung

cấp 01 Chủng

Bacillus anthracis

(99,6%)

6 1NS Niêm Sơn-Mèo

Mạc-Hà Giang 01 Thể da

Bacillus cereus 1

(99,9%)

7 4NS Niêm Sơn-Mèo

Vạc-HG 01

Thể dạ dày-

ruột

Bacillus anthracis

(99,8%)

8 3KV (3B) Khâu Vai - HG 01 Thể da Bacillus anthracis

(99,1%)

9 18C Tuần Giáo - Điện

Biên 01 Thể da VK không mọc

Kết quả bảng 2 cho thấy: Kết quả định danh xác định 05 chủng là trực

khuẩn than (B. anthracis) từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu chủng cung cấp với

độ tin cậy trên 99%: Toxin, BaVCM1167, BaVCM1168, 4NS, 3KV.

Bảng 3.2. Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu môi trƣờng bằng bộ

kit API 50CHB/E

T

T Điểm thu thập mẫu Loại mẫu

Số

mẫu Kết quả định danh

1

Niêm Sơn- Niêm Tòng –

Mèo Vạc – Hà Giang

Đất (nơi bò chết) 03 2/3 chủng B.anthracis

Đất (nơi chôn) 02 2 chủng B.anthracis

Phân bò mắc bệnh 01 B.cereus

2 Khâu Vai- Hà Giang Đất nơi bò chết 02 B.cereus

Lông bò 01 B.anthracis

Phân bò 01 B.anthracis

3 Quỳnh Nhai- Sơn La Đất nơi xung quanh nơi

trâu mắc bệnh

05 2/5 chủng B.anthracis

B.cereus

Phân trâu 01 B.anthracis

4 Trung Thu- Tủa chùa-

Điện Biên

Đất nơi ổ dịch cũ 03 B.cereus

Nước sinh hoạt 01 Âm tính

Lông, sừng trâu 06 3/6 chủng B.cereus

9

5 Tuần Giáo Điện Biên Đất chôn gia súc 06 B.cereus

Phân gia súc mắc bệnh 01 B.cereus

Tổng số 33

- Tống số chủng B. anthracis phân lập định danh từ mẫu môi trường là 9/33

chủng.

3.1.2. Kết quả phát hiện B.anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR

Kết quả phát hiện vùng gene đặc hiệu Ba813 trên các chủng vi khuẩn than

Kết quả phát hiện vùng pagA thuộc pXO1 của các chủng vi khuẩn than

Kết quả phát hiện các vùng gene capA, capB, capC thuộc pXO2

Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực từ các

chủng đƣợc cung cấp và chủng phân lập

TT Ký hiệu mẫu Chromosome Các vùng gene thuộc plasmide (pXO1 và pXO2)

Ba813 pagA CapA Cap B Cap C

1 Toxin (+) (+) (+) (+) (+)

2 Non Toxin (-) (-) (-) (-) (-)

3 Vaccine (-) (-) (-) (-) (-)

4 BaVCM1167 (+) (+) (-) (-) (-)

5 Ba VCM 1168 (+) (+) (+) (+) (+)

6 1NS (-) (-) (-) (-) (-)

7 4NS (+) (+) (+) (+) (+)

8 3KV (3B) (+) (-) (-) (-) (-)

9 A3 (+) (-) (-) (-) (-)

10 B1 (+) (-) (-) (-) (-)

11 B2 (+) (-) (-) (-) (-)

12 6B (+) (-) (-) (-) (-)

13 7C (-) (-) (-) (-) (-)

14 2C (+) (-) (-) (-) (-)

15 6C (-) (-) (-) (-) (-)

16 8C (-) (-) (-) (-) (-)

17 12C (-) (-) (-) (-) (-)

18 21C (-) (-) (-) (-) (-)

19 13C (-) (-) (-) (-) (-)

20 23C (-) (-) (-) (-) (-)

21 24C (-) (-) (-) (-) (-)

22 1C3 (+) (+) (+) (+) (+)

23 5C (-) (-) (-) (-) (-)

24 4C (+) (-) (-) (-) (-)

25 20C (-) (-) (-) (-) (-)

Kết quả bảng trên cho thấy:

Chủng BaVCM1167 chỉ có gene pagA nằm trên plasmide pXO1, không có

các gene trên plasmide pXO2. phù hợp tiêu chí của chủng sản xuất vaccine. [25]

[80]

.

Phát hiện 4 chủng độc lực ký hiệu Toxin, BaVCM1168, 4NS và 1C3 đầy đủ

độc lực sử dụng làm các chủng thử thách.

10

3.1.3. Kết quả thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên chuột nhắt trắng

Bảng 3.4: Thử nghiệm độc tính các chủng than trên chuột nhắt trắng

TT Tên chủng Nguồn gốc chủng Thời gian chuột chết

1 Toxin HVQY (BN thể da) 24 giờ - 48 giờ

2 4NS BN thể dạ dầy-ruột 24 giờ - 48 giờ

3 1C3 Môi trường 24 giờ - 48 giờ

4 Ba1167 Chủng được cung cấp không

5 Ba1168 Chủng được cung cấp 24 giờ - 48 giờ

3.1.4. Kết quả đánh giá chủng dự tuyển vaccine BaVCM1167

3.1.4.1. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc trƣng của chủng sản xuất

vaccine - BaVCM1167

Bảng 3.4. Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng BaVCM1167

Chủng

BaVCM1167

Đặc điểm

A B C D E F G H I

- + - + + + + + +

. h ển đ ng . inh le cithina e . T o acid trong môi trường ch a manitol . inh

catala e . h nitrat . hản ng . n men gl co e kị kh . hát triển trong môi

trường a l . háng 1% lysozyme

3.1.4.2. Kiểm tra khẳng định sự có mặt của gene pagA và protein PA của

chủng dự tuyển BaVCM1167

Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR

Đọc trình tự nucleotide của gene pagA của chủng VCM 1167.

3.1.4.3. Kết quả so sánh pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của chủng

BaVCM1167 với các chủng gây bệnh trong nƣớc.

Kết quả so sánh trình tự của chủng BaVCM1167 và các chủng than phân lập

được tại Việt Nam cho thấy độ tương đồng rất cao, phát hiện hai đột biến điểm

dẫn đến thay đổi 2 aa ở chủng Toxin và chủng 4NS của Việt Nam.

Hình 3.1: So sánh trình tự nucleotide vùng pagA của 3 chủng B.anthracis phân

lập tại Việt Nam và chủng dự tuyển sản xuất vaccine BaVCM1167 (Ba1167)

bằng phần mềm Mega5

11

3.1.5. Kết quả đánh giá chủng than độc lực sử dụng làm chủng thử thách.

Bảng 3.5. Kết quả xác định LD50 của chủng 4NS trên chuột lang

Liều tiêm chủng 4NS

(tbvk/ml)

(n) Số chuột sống

(%)

Số chuột chết (%) Tƣơng quan

sống/chết

10 tbvk/ml 5 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0.2

100 tbvk/ml 5 2 (40,0%) 3 (60,0%) 0.6

1000 tbvk/ml 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 1

10.000 tbvk/ml 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 1

∑Li =2.8

LD50 được tính theo phương pháp Kep∂epa

LD50 = lgDN - ∂ (∑Li – 0,5)

- lgDN: logarit của liều tiêm lớn nhất 10.000 = 4

- ∂ : log của hệ số pha loãng 10 = 1

Ta có : LgLD50 = 4 – 1(2,8 – 0,5) = 1.7 LD50 = 50 bào tử

3.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN

3.2.1. Nghiên cứu sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)

3.2.1.1. Chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp và khả năng sinh tổng hợp

protein PA của chủng BaVCM1167 phục vụ sản xuất vaccine hấp phụ.

Nghiên cứu sinh trưởng chủng BaVCM1166 và BaVCM1167 trên môi

trường 1, 2 dạng đặc và dạng lỏng, ở 37 oC trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn. Khả

năng sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp protein PA của các chủng khi nuôi

cấy trên cả hai môi trường 1, 2 dạng rắn rất tốt mật độ tế bào đạt 108

CFU/ml sau

36 h nuôi cấy. Trong khi đó, ở môi trường 1 (mt C) dạng lỏng các chủng vi khuẩn

phát triển yếu hơn môi trường 2 (mt R). Kết quả điện di kiểm tra protein trên gel

polyacrylamide 12,6%.

12

Hình 3.2: Điện di phát hiện sản phẩm protein Pa của chủng B.anthracis nuôi

cấy trên môi trường 1 và 2 sau 42 giờ.

3.2.1.2. Nghiên cứu thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA trên

môi trƣờng 1 và 2 dạng lỏng và rắn.

Hình 3.3: Điện di phát hiện sản phẩm protein PA của các chủng B.anthracis ở

các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h trên môi trường 2 dạng rắn.

Hình 3.4: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng

hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 1 dạng

lỏng

1 – 5: Protein chủng Ba VCM

1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ

nuôi cấy

6: Thang protein chuẩn

7 – 11: Protein chủng Ba VCM

1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ

nuôi cấy

1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166

sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy

6: Thang protein chuẩn

7 – 11: Protein chủng Ba VCM

1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi

cấy

83

kDa

100

70

1, 6: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi

trường 1 rắn và lỏng

2, 7: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi

trường 1 rắn và lỏng

3, 8: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi

trường 2 rắn và lỏng

4, 9: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi

trường 2 rắn và lỏng

5: Thang protein chuẩn

13

Hình 3.5: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng

hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 2dạng

lỏng

Môi trường 2 d ng lỏng, chủng BaVCM1166 tổng hợp protein PA và nhiều nhất sau 48 giờ

(giếng 3 hình 3.10); thời gian thích hợp để chủng BaVCM1167 tổng hợp PA l i là ở 36 giờ

(giếng 8 hình 3.10). Ở môi trường 2, chủng BaVCM1167 có thời gian tổng hợp PA dải hơn ở

môi trường 1 (từ 36 giờ đến 72 giờ so với 36 giờ – 48 giờ ).

Các kết quả trên cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp

protein PA của các chủng BaVCM1167 là 36 – 48 giờ, và sinh tổng hợp protein

PA tốt hơn khi được nuôi trong môi trường 2 dạng lỏng

3.2.1.3. Sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA của chủng

BaVCM1167

Biểu đồ động thái quá trình lên men

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 4 6 10 14 18 22 26 30 34 36

Thời gian

pH

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

OD

pH

sinh khối

protein

Hình 3.6: Động thái quá trình lên men chủng BaVCM1167 ở nhiệt độ 37 oC

trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn sản xuất vaccine AVA

1 – 5: Protein chủng Ba VCM

1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ

nuôi cấy

6: Thang protein chuẩn

7 – 11: Protein chủng Ba VCM

1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ

nuôi cấy

14

y = 0.0163x + 0.0246

R2 = 0.9828

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 5 10 15 20 25

BSA (mg/ml)

OD

Series1

Linear (Series1)

Đường chuẩn protein PA

y = 0.4299x + 0.0648

R2 = 0.9833

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 PA

OD

3.2.1.4. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein PA từ chủng BaVCM1167

Kết quả tinh sạch protein PA bằng phƣơng pháp tủa ethanol

Kết quả cho thấy ở nồng độ Ethanol 50 % các protein khác đã bị loại bỏ

đồng thời băng protein kích thước 83 kDa đã tăng lên rõ nét. Từ đó, chúng tôi tiến

hành tinh sạch hàm lượng lớn protein PA ở nồng độ này.

1

2

kDa

100 85 70

83

kD

a

1 2 3 4 5 6 7

83 kDa 85 kDa

Hình 3.8: Điện di protein tổng

số của chủng BaVCM 1167

Giếng 1: Protein PA tinh s ch sau khi

tủa băng thanol 5

Giếng 2: protein trước tinh s ch

Giếng 3: Thang protein chuẩn

85 kDa

83

kDa

Hình 3.7: Đường chuẩn Bradford cho xác định hàm lượng protein tổng số của

dịch lên men và phương trình đường chuẩn protein PA cho xác định hàm lượng

protein PA trong dung dịch sau ly tâm

.

Hình 3.9: Tinh sạch protein

PA bằng phương pháp tủa

ethanol ở các nồng độ khác

nhau

1-6: sản phẩm điện di tủa

protein ở các nồng đ cồn lần

lượt là 10 %, 20 %, 30 %, 40

%, 50 %, 60 %.

7: thang chuẩn protein.

1 2 3

15

Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 5 10 15 20 25 30 35

Hình 3.35. sắc ký đồ DEAE của các phân đoạn được đẩy ra khỏi cột

Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký biogel P100

Khẳng định sự biểu hiện của protein PA bằng phản ứng Western blot

85

KDa

83

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hình . : kết quản A xác đinh sự có mặt của protein PA trong các đỉnh

1-4: các đỉnh thu được tu sắc ký đồ P1 – P4

5: ĐC ( saline buffer)

1 2 3 4 5

Hình 3.10: Hình ảnh

điện di các phân đoạn

tinh sạch protein bằng

sắc ký biogel P100.

1: Marker

2: protein trước tinh s ch

3 - 9: các phân đo n tinh sạch

P1

P3 P2

P4

16

3..2.2. Sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực tại Công ty

Vaccine và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: Phụ lục 4

3.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN

AVA VÀ VẮC XIN TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM.

3.3.1. Kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vaccine

3.3.1.1. Yếu tố vật lý:

- Vaccine hấp phụ:

+ Bóc nhãn lọ đựng vaccine, nhìn và đánh giá bằng mắt thường: vaccine

được đóng trong lọ thủy tinh trắng, vaccine đông khô tạo thành bánh xốp, màu

trắng, bong, không teo, không chảy nước.

+ Cho 6ml nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch màu trong đồng nhất,

không vẩn cặn.

- Vaccine toàn tế bào: Lọ Vaccine phòng bệnh than đông khô có màu trắng, xốp,

bong ra, không bị chảy nước.

Hình 3.25a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin

với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF

Giếng 4. Thang chuẩn protein

Hình 3.25b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với

kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF

Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas)

Giếng 8: Đối chứng (Huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch)

17

3.3.1.2. Kiểm tra pH vaccine:

- Vaccine hấp phụ: Hút dung dịch nhỏ lên giấy quỳ so màu với thang màu kết

quả cho thấy ở khoảng màu pH=7,0

- Vaccine toàn tế bào: Các lô vaccine phòng bệnh than đông khô có giá trị pH

đạt 6,8 – 7,5

3.3.1.3. Kết quả kiểm tra vô trùng.

Vaccine hấp phụ: Cho 6ml nước muối sinh lý vô trùng vào lọ vaccine, lắc

đều. Tiến hành lấy 0,5 ml cho vào môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng

và thạch sabouraud. Lấy que cấy ria đều huyền dịch trên đĩa thạch, ủ đĩa cấy

trong nhiệt độ 370C/ 24 giờ.

+ Kết quả vi khuẩn hiếu khí: âm tính

+ Kết quả vi khuẩn tan huyết: âm tính

+ Kết quả nấm men, nấm mốc: âm tính

Vaccine toàn tế bào: thuần nhất

3.3.2. Kết quả đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vaccine:

3.3.2.1. Đánh giá phản ứng toàn thân và tại chỗ sau tiêm vaccine trên thỏ:

Bảng 3.6. Kết quả theo dõi nhiệt độ và phản ứng tại chỗ của thỏ sau tiêm 02

loại vaccine, so sánh với nhóm chứng và nhóm plascebo.

Mã số thỏ Trƣớc tiêm Sau tiêm T

0 dao

động

Vết tiêm

-2 -1 0 1 2

Vacc

ine

AV

A

Thỏ 1 Sáng 37,8 38,2

39 39,4 0,7

Bình

thường chiều 39 39,1 39,1 39,4

Thỏ 2

Sáng 38,8 38

38,2 38,2 0,0

Bình

thường chiều 38,2 38,1 38,4 38,3

Thỏ 3

Sáng 39,1 38,9

39 39 0,2

Bình

thường chiều 38,9 39 39,4 39,2

Thỏ 4

Sáng 39,5 38,9

38,1 38,1 -0,8

Bình

thường chiều 38,9 39 38,5 38,4

Thỏ 5

Sáng 38,9 39

39,5 39,5 0,2

Bình

thường chiều 39,1 39 38,9 39

Thỏ 6

Sáng 37,5 38,2

39 39 0,7

Bình

thường chiều 38,9 38,5 38,9 39

Thỏ 7

Sáng 38 39

38,9 38,9 0,2

Bình

thường chiều 39 39 39 39

Thỏ 8

Sáng 38 38.5

39 39 0,8

Bình

thường chiều 38.2 38 39 39

Vacc

ine

toàn

tế

bào

(TT

B)

Thỏ 9 Sáng 39,1 39

39,2 39 -0,1

Bình

thường chiều 39,2 39,3 39,1 39

Thỏ 10

Sáng 38,2 38,5

38,8 38,5 -0,2

Bình

thường chiều 39,1 39,2 38,5 38,5

Thỏ 11

Sáng 39,2 38,9

39,1 39,1 0,0

Bình

thường chiều 39,2 39 39,1 39

Thỏ 12

Sáng 37,6 38,1

39,3 39,3 1,1

Bình

thường chiều 38 38,2 38,5 39

Thỏ 13 Sáng 38,9 38,9

38,5 38,5 -0,4 Bình

18

3.3.2.2. Đánh giá độc cấp tính của vaccine (LD50) trên chuột nhắt trắng.

Độc tính cấp của vaccine AVA.

Bảng 3.7. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine AVA trên chuột nhắt trắng

Lô chuột thử

nghiệm

Nồng độ AVA (

µg/chuột)

Số lƣợng chuột Tỉ lệ chết (%)

Chết Sống Tổng số

Lô sô 1 (n=8) 1800.00 2 6 8 25,00

Lô sô 2 (n=8) 1440.00 2 6 8 25,00

Lô sô 3 (n=8) 1152.00 0 8 8 0,00

Lô sô 4 (n=8) 921.60 0 8 8 0,00

Lô sô 5 (n=8) 737.28 0 8 8 0,00

Áp dụng công th c:

logLD50 = Log X100 – Log Fd (∑t – n/2)

n

LD50 = 90.000 µg/kg

Kết qủa cho thấy độc tính của vaccine AVA rất thấp, ở hàm lượng PA cao nhất

mà chúng tôi có thể tạo ra không thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm.

Độc tính cấp của vaccine TTB.

Bảng 3.8. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine TTB trên chuột nhắt trắng

Số lô

chuột n

Số lƣợng tế

bào/ liều

Kết quả theo dõi số lƣợng chuột Tỉ lệ chết

(%) Chết Sống Tương quan

Lô sô 1 8 1,25 x10

8 7 1 7/8 87,50

chiều 39 39 38,5 38,6

thường

Thỏ 14 Sáng 38,7 39

39,2 39.2 0,3

Bình

thường chiều 39 39 39,2 39,2

Thỏ 15

Sáng 39 39

39 39 -0,1

Bình

thường chiều 38,9 39,2 39 38,9

Thỏ 16

Sáng 38,2 39

39,5 39,5 0,7

Bình

thường chiều 38,1 38,1 38,5 38,8

pla

sceb

o

Thỏ 17 Sáng 39 38,5

38,8 38,8 -0,1

Bình

thường chiều 38,8 39 38,7 38,6

Thỏ 18

Sáng 38,8 38,5

39,6 39,6 0,8

Bình

thường chiều 38,2 38 38,2 39,2

chứ

ng

Thỏ 19 Sáng 38,1 38,5

39 38,6 0,4

Bình

thường chiều 38,4 38,8 38,9 38,9

Thỏ 20

Sáng 39 39

38,9 39 0,2 Bình

thường chiều 38,2 38,5 39 38,7

19

Lô sô 2 8 1,00 x108

6 2 6/8 75,00

Lô sô 3 8 0,75 x108

4 4 4/8 50,00

Lô sô 4 8 0,50 x10

8 1 7 1/8 12,5

Lô sô 5 8 0,25 x10

8 0 8 8 0,00

Áp dụng công th c:

Từ công thức trên có thể áp dụng cụ thể trong trường hợp này là:

LD50 = 2,27 x 109 tbvk/kg

Kết qủa trên cho thấy độc tính của vaccine TTB tương đối cao. Liều an toàn

trên chuột là 0.25 x 108 tương đương 1,25 x 10

9 tbvk/kg.

3.3.2.3. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine AVA và TTB trên

thỏ

Kết quả đánh giá kháng thể nền trên thỏ và xác định ngƣỡng dƣơng

tính.

Bảng 3.9. Nồng độ kháng thể nền trong huyết thanh thỏ trƣớc khi tiêm

vaccine

Vaccine

thử

nghiệm dự

kiến

Số

thỏ Ký hiệu thỏ

Định lƣợng nồng độ anti-PA83 trên thỏ trƣớc

tiêm vaccine

OD GMT Xm ± SD P

(α=0,05)

Vaccine

hấp phụ

(AVA)

7

Thỏ 1 0,576

0,423 0,437 ± 0,121

0,889

Thỏ 2 0,365

Thỏ 4 0,533

Thỏ 5 0,584

Thỏ 6 0,365

Thỏ 7 0,334

Thỏ 8 0,305

Vaccine

toàn tế bào

(TTB)

8

Thỏ 9 0,416

0,435 0,45 ± 0,108

Thỏ 10 0,305

Thỏ 11 0,495

Thỏ 12 0,504

Thỏ 13 0,365

Thỏ 14 0,347

Thỏ 15 0,640

Thỏ 16 0,495

Tổng (16 thỏ) 0,429 0,442 ± 0,111 Ghi chú: n: số lượng thỏ th nghiệm; : đ lệch chuẩn. Xm giá trị trung bình c ng của kháng

thể. GMT: giá trị trung bình nhân của hiệu giá kháng thể

20

Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 6 sau tiêm 2 mũi

vaccine.

Bảng 3. 10. Nồng độ anti-PA83 của các lô thỏ vào tuần thứ 6 sau tiêm

vaccine.

Lô thỏ n Ký hiệu

Định lƣợng nồng độ anti-Pa 83 trên thỏ P

(α=0,05)

anti-PA

(µg/ml) Ln(PA)

GMT

(µg/ml)

Lô 1

(tiêm

vaccine

AVA)

8

Thỏ 1 59,926 11,000

13,065

P(1,2) =

0,0052

P(1;3) =

0,170

P(2;3) =

0,000547

Thỏ 2 6,240 8,738

Thỏ 3 8,713 9,072

Thỏ 4 6,862 8,833

Thỏ 5 49,752 10,814

Thỏ 6 6,272 8,743

Thỏ 7 11,848 9,379

Thỏ 8 10,280 9,237

Lô 2

(tiêm

vaccine

toàn tế bào)

8

Thỏ 9 36,004 10,491

39,518

Thỏ 10 51,740 10,854

Thỏ 11 36,702 10,510

Thỏ 12 33,224 10,411

Thỏ 13 45,634 10,728

Thỏ 14 24,478 10,105

Thỏ 15 50,544 10,830

Thỏ 16 46,380 10,744

Lô 3

(chứng

placebo)

3

Thỏ 17 7,732 8,953

5,648 Thỏ 18 3,460 8,149

Thỏ 19 6,738 8,815

Ghi chú: Mẫ dương t nh O >= 0,885; 1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= 1

µg/ml

Kết qủa sau 6 tuần gây miễn dịch nồng độ kháng thể trung bình của thỏ tiêm

vaccine TTB tăng cao, cao gấp 3 lần so với thỏ tiêm vaccine AVA

Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 8 sau tiêm hai mũi vaccine.

Bảng 3. 11. Nồng độ anti-PA83 của các lô thỏ tiếp nhận vaccine ở tuần

thứ 8

Lô thỏ n Ký hiệu

anti-Pa 83 trong huyết thanh thỏ P (1;2)

(α=0,05) Anti-PA

(µg/ml) Ln(PA)

GMT

(µg/ml)

Lô 1

(tiêm

vaccine

AVA)

8

Thỏ 1 50,512 10,830

15,179 0.636 Thỏ 2 33,984 10,434

Thỏ 3 7,126 8,872

Thỏ 4 5,154 8,548

21

Thỏ 5 59,926 11,001

Thỏ 6 9,782 9,188

Thỏ 7 12,564 9,439

Thỏ 8 6,070 8,711

Lô 2

(tiêm

vaccine

TTB)

8

Thỏ 9 12,174 9,407

18,383

Thỏ 10 19,554 9,881

Thỏ 11 15,158 9,626

Thỏ 12 9,550 9,164

Thỏ 13 15,670 9,660

Thỏ 14 14,458 9,579

Thỏ 15 42,776 10,664

Thỏ 16 39,064 10,573

Ghi chú: 1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= 1 µg/ml, n: số lượng : đ lệch

chuẩn, P: xác suất có điều kiện

Nồng độ kháng thể trung bình của nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao hơn

thời điểm 6 tuần, nhưng thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm.

Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 10 sau hai mũi vaccine.

Bảng 3.12. Định lƣợng anti-PA83 trong huyết thanh thỏ tiếp nhận vaccine

tuần thứ 10 (lấy máu lần 4)

Lô thỏ n Ký hiệu

anti-PA 83 trên thỏ

anti-Pa

(µg/ml) Ln(PA)

GMT

(µg/ml)

P (1;2)

(α=0,05)

Lô 1

(tiêm

vaccin

e AVA)

8

Thỏ 1 47,142 10,761

15,321

0,861

Thỏ 2 39,872 10,593

Thỏ 3 14,412 9,576

Thỏ 4 12,874 9,463

Thỏ 5 59,926 11,001

Thỏ 6 11,476 9,348

Thỏ 7 14,252 8,355

Thỏ 8 2,978 7,999

Lô 2

(tiêm

vaccin

e TTB)

7

Thỏ 9 8,182 9,010

16,599

Thỏ 10 11,056 9,311

Thỏ 11 16,244 9,695

Thỏ 13 16,820 9,730

Thỏ 14 15,172 9,627

Thỏ 15 31,172 10,347

Thỏ 16 29,712 10,299

Nồng độ kháng thể trung bình của nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao hơn

thời điểm 8 tuần, nhưng thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm.

22

Đáp ứng miễn dịch của của thỏ đối với hai loại vaccine AVA và TTB khác

nhau: Lô thỏ tiêm vaccine AVA đáp ứng miễn dịch không đều, đáp ứng mang tính

cá thể 3/8 thỏ có đáp ứng rất tốt. Lô thỏ tiêm Vaccine TTB đáp ứng miễn dịch sinh

ra đồng đều ở tất cả các thỏ.

Hình 3.12: Đáp ứng kháng thể thỏ anti-PA trung bình GMT theo thời gian.

Nồng độ kháng thể kháng PA83 trên thỏ đáp ứng với hai loại vaccine có xu

hướng khác nhau. Thỏ tiêm vaccine AVA nồng độ kháng thể có xu hướng tăng

dần, thỏ tiêm vaccine TTB nồng độ kháng thể tăng cao lúc đầu và giảm dần theo

thời gian.

Ngưỡng (+)

Hình 3.21. Đáp ứng miễn dịch của

cá thể thỏ tiếp nhận vắc xin ava Tính sinh miễn dịch không đều ở các cá thể thỏ

Hình 3.11: Đáp ứng miễn dịch của

cá thể thỏ tiếp nhận vaccine TTB Tất cẩ các cá thể thỏ đề có đáp ng MD tốt

23

3.3.3. Đánh giá công hiệu của vaccine trên chuột lang.

3.3.3.1. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB. (bảng 3.31)

3.3.3.1. Hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB

Hình 3. 13: Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB trên chuột lang

Biến đ ng số lượng chu t sống sót của các nhóm chu t lang, mỗi nhóm 10 con, 4 nhóm được

tiêm vaccine (từ nồng đ 105, 10

6, 10

7, 10

8 tbvk/ml, phác đồ 2 lần tiêm vào ngày 0 và ngày 14),

nhóm ch ng không tiêm vaccine. Chủng th thách đầ đủ đ c lực 4 được gây nhiễm ngày th

21 đường ổ bụng. Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x

LD50. Theo dõi trong 10 ngày.

3.3.3.2. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine AVA (Bảng 3.27)

Hình 3. 14:Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine AVA trên chuột lang

Biến đ ng số lượng chu t sống sót của các nhóm chu t lang, mỗi nhóm 10 con, 4 nhóm được

tiêm vaccine (từ nồng đ 50 µg, 100 µg và 200 µg, phác đồ 2 lần tiêm vào ngày 0 và ngày 14),

nhóm ch ng không tiêm vaccine. Chủng th thách đầ đủ đ c lực 4 được gây nhiễm ngày th

21 đường ổ bụng. Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x

LD50. Theo dõi trong 10 ngày.

24

- Vaccine TTB nồng độ 107tbvk/ml bảo vệ được 100% số chuột thử thách với chủng đầy

đủ độc lực 4NS.

- Vaccine AVA liều 200 µg/ml bảo vệ được 40% số chuột thử thách với chủng 4NS

KẾT LUẬN

1. Tuyển chọn đƣợc chủng BaVCM1167 đủ tiêu chuẩn sản xuất vaccine phòng

bệnh than và các chủng độc lực để đánh giá thử thách.

- Chủng dùng sản xuất vaccine có độ tương đồng cao với các chủng than gây bệnh

phân lập được tại các vùng dịch.

- Phân lập được 14 chủng B.anthracis, trong đó có 04 chủng B.anthracis mang đầy

đủ yếu tố độc lực ( Toxin, Ba1168, và 4NS, 1C3).

- lD50 = 50 bào tử (chủng 4NS, đường tiêm dưới da trên chuột lang)

2. Nghiên cứu sản xuất thành công hai loại vaccine dự phòng bệnh than:

vaccine hấp phụ (AVA) và vaccine toàn tế bào (TTB) từ chủng BaVCM1167.

- Môi trường thích hợp giúp vi khuẩn tổng hợp PA hiệu quả là môi trường 2 dạng

lỏng, và thời gian sinh tổng hợp protein PA tốt nhất là 36- 48h

- Phương pháp tinh sạch hiệu quả …..

3. Thử nghiệm thành công 2 loại vaccine trên mô hình động vật.

- Vaccine phòng bệnh than đảm bảo các tiêu chuẩn an toàn (LD50 AVA là 90000

µg/kg , TTB là 2,27 x 109 tbvk/kg).

- Vaccine TTB cho đáp ứng miễn dịch nhanh và đồng đều, hiệu lực bảo vệ trên

chuột lang là: 100% (2 mũi tiêm 0,5 x109 sau 20 ngày)

- Vaccine hấp phụ phòng bệnh than đáp ứng miễn dịch chậm và không đồng đều

(40% số chuột lang, 2 mũi tiêm x 200 µg/ml sau 20 ngày).

KIẾNNGHỊ

1. Nghiên cứu sản xuất hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than thử

nghiệm thêm trên động vật và nhóm nhỏ người tình nguyện.

2. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine phòng bệnh than trên nhiều mô hình thử

nghiệm động vật khác nhau với các chủng thử thách tuyển chọn được ở các vùng

địa lý khác nhau và với đường gây nhiễm khác nhau.

25

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân Thành (2013), “Nghiên

cứu đặc điểm di truyền phân tử một số yếu tố độc lực của chủng Bacillus anthracis

lưu hành ở khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam”, Kỷ yếu H i nghị Khoa học

Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công

nghệ, quyển 1, trang 594-598.

2. Nguyễn Ngọc Bảo, Nguyễn Minh Tiếp, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân

Thành (2014), “Nghiên cứu một số đặc điểm lưu hành bệnh than tại một số tỉnh

miền núi phía Bắc Việt nam”, T p chí Y học Quân sự, số 298, trang 25-30.

3. Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Cao Thị Minh Ngọc, Phạm Thị Kim

Nhung, Nguyễn Xuân Thành (2014), “Đánh giá tính an toàn, sinh miễn dịch và

hiệu lực bảo vệ của vacxin dự phòng bệnh than trên động vật thí nghiệm”, T p chí

Y học Quân sự, số 300, trang 13-17.