Nataša V. Cvetković · mleko dobar supstrat za rast ove kulture. Ispitivanjem uticaja inokuluma...
Transcript of Nataša V. Cvetković · mleko dobar supstrat za rast ove kulture. Ispitivanjem uticaja inokuluma...
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET, ODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Nataša V. Cvetković
FERMENTACIJA SOJINOG MLEKA
PROBIOTSKOM STARTER KULTUROM
MASTER RAD
Niš, 2015.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET, ODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
MASTER RAD
FERMENTACIJA SOJINOG MLEKA
PROBIOTSKOM STARTER KULTUROM
Kandidat: Mentor:
Nataša Cvetković dr. Nataša Joković
Niš, 2015.
UNIVERSITY OF NIS
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS, DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
MASTER THESIS
SOYBEAN MILK FERMENTATION WITH
PROBIOTIC STARTER CULTURE
Candidate: Mentor:
Nataša Cvetković Nataša Joković, PhD
Niš, 2015.
Biografija
Ime i Prezime: Nataša Cvetković
Datum rodjenja: 19.12.1991.
Mesto rodjenja: Niš
Osnovna Škola: Dositej Obradović, Niš 1998 - 2006
Srednja škola: Gimnazija ”Svetozar Marković” Niš
2006 – 2010.
Osnovne studije: PMF Niš, Odsek za biologiju i ekologiju
2010 – 2013.
Master studije: PMF Niš, Odsek za biologiju
2013 – 2015.
Sažetak
U ovom radu je ispitivana mogućnost rasta probiotske starter kulture ABY-6
sastavljene od bakterija Streptococcus thermophilus (80%), Lactobacillus acidophilus
(13%), Bifdobacterium bifidum (6%) i Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (1%),
u sojinom mleku. Proces fermentacije je praćen merenjem pH vrednosti
fermentacionih podloga, dok je broj bakterija tokom fermentacije određivan metodom
sukcesivnog razblaživanja na M17 i MRS podlozi. ABY-6 starter kultura smanjuje pH
vrednost sojinog mleka sa 6, 4 na 4, 03 nakon 24 sata fermentacije tako da je sojino
mleko dobar supstrat za rast ove kulture. Ispitivanjem uticaja inokuluma (1% , 3% i
6%) na proces fermentacije, pokazano je da količina inokuluma ne utiče značajno na
pH vrednost sojinog mleka nakon 4,5 sata fermentacije kao ni na broj ćelija određenih
na M17 podlozi. Broj ćelija na MRS podlozi je veći sa povećanjem količine
inokuluma. Broj ćelija streptokoka određivan na M17 podlozi bio je veći nakon 4,5
sata fermentacije u odnosu na broj bakterija na MRS podlozi. U daljem radu, ispitivan
je uticaj dodatka surutke u sojino mleko na proces fermentacije. Rezultati su pokazali
da surutka ne utiče značajno na pH vrednost fermentisanog sojinog mleka, kao ni na
broj bakterijskih ćelija na M17 i MRS podlozi. Fermentisano sojino mleko i sojino
mleko sa dodatkom surutke imaju stabilne vrednosti pH i broja ćelija u periodu od 20
dana čuvanja na 4C.
Ključne reči: sojino mleko, probiotska starter kultura, surutka
Abstrakt
The growth of probiotic starter culture ABY-6 consisting of Streptococcus
thermophilus (80%), Lactobacillus acidophilus (13%), Bifdobacterium bifidum (6%)
and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (1%), in the soymilk was studied. The
fermentation process was monitored by measuring the pH value of the fermentation
media, while the number of bacteria during fermentation was determined by the
method of successive dilutions on M17 and MRS media. ABY-6 starter culture
reduced the pH of soymilk from 6, 4 to 4, 03 after 24 hours of fermentation, so that
the soymilk is a good substrate for the growth of this culture. Investigation of the
effect of the inoculum (1%, 3% and 6%) on the fermentation process, showed that the
amount of the inoculum didn’t affect the pH of soymilk significantly after 4.5 hours of
fermentation as well as the number of cells on M17 medium. Number of cells on
MRS medium was greater with increasing amounts of inoculum. The number of
streptococcal cells determined on M17 medium was higher than number of cells on
MRS medium after 4.5 hours of fermentation. In further work, we investigated the
influence of whey addition on fermentation of soymilk. The results showed that the
whey didn’t affect significantly the pH values of the fermented soymilk, as well as the
number of bacterial cells determined on the M17 and MRS media. Fermented soymilk
and soymilk with added whey had a stable pH values and the number of cells over a
period of 20 days of storage at 4C.
Keywords: soymilk, probiotic starter culture, whey
Sadržaj
1. Uvod ........................................................................................................................... 8
1.1. Funkcionalna hrana ............................................................................................. 9
1.1.2. Probiotska hrana ......................................................................................... 10
1.2. Probiotske bakterije .......................................................................................... 14
1.2.1. Bakterije mlečne kiseline ........................................................................... 16
1.2.2. Bifidobakterije ........................................................................................... 19
2. Fermentisana hrana .................................................................................................. 20
2.1. Soja ................................................................................................................... 22
2.1.2. Fermentisani proizvodi od soje .................................................................. 23
2.1.3. Sojino mleko .............................................................................................. 24
3.Ciljevi rada ................................................................................................................ 26
4.Materijali i metode .................................................................................................... 27
4.1.Materijal ............................................................................................................. 27
4.1.1 Fermentacione podloge ............................................................................... 27
4.1.2 Probiotska kultura i podloge ....................................................................... 27
4.2.Metode rada ....................................................................................................... 28
4.2.1 Fermentacija sojinog mleka ........................................................................ 28
4.2.2 Merenje pH vrednosti ................................................................................. 28
4.2.3 Brojanje bakterijskih ćelija ......................................................................... 28
5.Rezultati i diskusija ................................................................................................... 29
5.1. Rast probiotske kulture u sojinom mleku ..................................................... 29
4.2 Uticaj inokuluma na rast probiotske kulture .................................................. 31
4.3 Uticaj dodavanja surutke na rast probiotske culture .......................................... 34
4.4 Stabilnost fermentisanih napitaka tokom skladištenja ....................................... 36
Zaključci: ..................................................................................................................... 38
Literatura ...................................................................................................................... 39
8
1. Uvod
Funkcionalne namirnice, usled svog specifičnog i izmenjenog sastava u
odnosu na klasične namirnice iste vrste, imaju pozitivne efekte na zdravlje ljudi. U
funkcionalnu hranu spada i probiotska hrana ( Huffnagle, 2008.). Probiotik je
proizvod koji sadrži žive organizme koji ingestijom (od strane ljudi i životinja) u
određenom broju pokazuju pozitivne efekte po zdravlje iznad delovanja vezanih za
normalnu ishranu. Probiotici su nam uglavnom dostupni putem kiselo-mlečnih
proizvoda koji imaju veliku ulogu u ishrani zdravih i bolesnih ljudi.
Na području Srbije su zastupljeni fermentisani mlečni napitci sa probiotskim
bakterijama mada u poslednje vreme sve je učestalija upotreba soje i sojinih
proizvoda u ishrani. Soja i njeni proizvodi veoma su cenjeni i traženi u svetu zbog
visokog sadržaja nezasićenih masnih kiselina, lecitina, izoflavona i minerala (gvožde,
magnezujum, kalijum). Od svih proizvoda posebnu pažnju privlači sojino mleko
(Nenadić, 1982.).
9
1.1. Funkcionalna hrana
Funkcionalna hrana je hrana koja ima povoljan uticaj na ljudsko zdravlje
pored svojih uobičajenih nutritivnih funkcija. To je hrana koja sadrži biološki aktivna
jedinjenja koja je čine funkcionalnom jer pozitivno utiču na određene funkcije u
organizmu, što je naučno potvrđeno. Ove namirnice se, najčešće, koriste u očuvanju
optimalnih gastrointestinalnih funkcija, podizanju nivoa aktivnosti antioksidativne
odbrane organizma, smanjenju faktora rizika uključenih u etiologiju
kardiovaskularnih oboljenja i kancera (Martirosyan, 2011.).
Funkcionalnom hranom se može smatrati:
Namirnica kojoj je komponenta sa povoljnim delovanjem dodata (probiotik,
biljni steroli), ili kojoj je komponenta sa nepovoljnim delovanjem oduzeta
(smanjenje sadržaja zasićenih masti, uklanjanje fitata enzimskim putem)
Namirnica u kojoj je priroda jedne ili više komponenti modifikovana
(hidroliza proteina mleka u bebi formulama);
Uobičajena namirnica za koju se pokazalo da ima povoljan efekat po ljudsko
zdravlje (proizvodi od ovsa);
Novi proizvod sa funkcionalnim sastojkom.
Pozitivne efekte funkcionalne namirnice često pokazuju usled prisustva jedne
ili više bioaktivnih komponenti u svom sastavu, za koje je naučnim istraživanjima
utvrdjeno da, u količinama u kojima su prisutne u namirnici, imaju pozitivne efekte na
pojedine fiziološke ili biohemijske procese u organizmu.
Jedinjenja koja čine hranu funkcionalnom prolazana su u tableli 1.
Funkcionalna hrana Efekat po zdravlje
Kalijum Nizak nivo natrijuma
Smanjen rizik od povišenog krvnog pritiska i šloga
Biljni steroli i estri stanola
Proteini soje Voće, povrće i žitarice koje sadrže vlakna
Smanjen rizik od srčanih oboljenja
Kalcijum Smanjen rizik od osteoporoze
Beta karoten slobodne radikale i tako sprečava oštećenje ćelija
Likopen smanjuje rizik od raka prostate
Fitoestrogeni iz soje i proizvoda od soje olakšavaju simptome menopauze, štite od bolesti srca i snižavaju nivo
LDL i ukupnog holesterola
Flavonoidi i druge materije u voću/citrusima i
povrću
Neutrališu slobodne radikale i snižavaju rizik od raka
10
1.1.2. Probiotska hrana
U funkcionalnu hranu spada i probiotska hrana (Miletić et al. 2011.).
Fuler (Fuller) je 1989. godine definisao termin probiotik kao proizvod koji
sadrži žive organizme koji ingestijom (od strane ljudi i životinja) u određenom broju
pokazuju pozitivne efekte po zdravlje iznad delovanja vezanih za normalnu ishranu.
Pod ovom definicijom on obuhvata nekoliko zahteva koja treba da ispunjavaju
mikroorganizmi da bi se smatrali probioticima (na primer, mikrobne ćelije moraju biti
žive i konzumirane u velikom broju, obično 109 ćelija dnevno). Medjutim, Filerova
definicija ne uključuje koji mikroorganizmi (da li samo intestinalni ili neki drugi)
treba da budu konzumirani i koliko dugo (dnevno kao preventiva ili 2 i više nedelja
kao lek). Definicija ne ukazuje da li povoljni efekti po zdravlje moraju biti dokazani
naučnim kliničkim studijama u nezavisnim i renomiranim naučnim istraživačkim
grupama, a rezultati da budu objavljeni u recenziranim časopisima. Definicija takodje
ne obuhvata objašnjenje mehanizma na koji način probiotske bakterije povoljno
deluju na organizam. Iako su neke naučne studije pokazale da se povoljni efekti po
zdravlje mogu postići konzumiranjem proizvoda koji sadrže cele mrtve ćelije ili samo
ćelijske delove (Saad, 2013.). uobičajeno je da se termin probiotici koristi i primenuje
za proizvode koji sadrže žive ćelije mikroorganizama.
Pozitivan efekat probiotika zavisi od njihovog prisustva u velikom broju u
gastrointestinalnom traktu. Ovo se može postići konzumiranjem velikog broja
viabilnih ćelija probiotskih mikroorganizama ili stimulisanjem brzog rasta poželjnih
bakterija snabdevanjem odgovarajućim nutritijentima. Najčešće su to izvori ugljenika
koji ne mogu biti metabolisani od bakterija u debelom i tankom crevu što probiotskim
bakterijama daje prednosti u rastu i dostizanju velike brojnosti.
Ovi nutritijenti se nazivaju prebiotici i definišu se kao nesvarljivi sastojci
hrane koji imaju pozitivne efekte na domaćina stimulisanjem rasta i/ili aktivnosti
jedne ili više vrsta bakterija u debelom crevu.
11
Na slici 1 prikazana je razlika izemdju prebiotika i probiotika.
Slika 1: Razlika izmedju probiotika i prebiotika
Termin simbiotik uključuje oba termina: prebiotik i probiotik. On
podrzumeva da, umesto korišćenja probiotika i prebiotika odvojeno, proizvod sadrži
obe komponente, to jest, korisne mikroorganizme u velikom broju i nutritijente koji
im omogućavaju da se brzo razmnožavaju u gastrointestinalnom traktu i izazivaju
korisne efekte.
Žive ćelije probiotika mogu biti konzumirane na tri načina:
proizvodi fermentisanog mleka (jogurt sa živim ćelijama Lactobacilus
delbrueckii ssp. bulgaricus i Streptoccocus thermophilus, acidofilno mleko sa
Lactobacillus acidophilus),
hrana i piće obogaćena živim ćelijama poželjnih intestinalnih bakterija
(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei i
Bifidobacterium vrste)
farmaceutski proizvodi aktivnih ćelija u obliku tableta, kapsula i granula
(Shantanu, 2011.)
Probiotici su nam uglavnom dostupni putem kiselo mlečnih proizvoda koji
imaju veliku ulogu u ishrani zdravih i bolesnih ljudi. Oni se odlikuju lakom
svarljivošću i odgovarajućim dijetetskim svojstvima. Dobijaju se mlečno kiselinskom
fermentacijom pod dejstvom bakterija mlečne kiseline koje zauzimaju značajno
mesto u mikroflori intestinalnog trakta. Smatra se da svakodnevno unošenje kiselo-
mlečnih proizvoda omogućava funkcionisanje i ponovno uspostavljanje normalnog
12
balansa gastrointenstinalnog trakta. Danas postoji veliki broj fermentisanih mlečnih
napitaka sa probiotskim bakterijama koje potiču iz gastrointestinalnog trakta, a
pripadaju rodovima Bifidobacterium i Lactobacillus. Na području Srbije su
zastupljeni fermentisani mlečni napitci sa probiotskim bakterijama (Versalovic,
Wilsson, 2008.). Jogurt i kefir pripadaju grupi melčno kiselinskih proizvoda koji
mogu da sadrže probiotike.
Jogurt je polutečni mlečni proizvod koji se dobija fermentacijom mleka na
temperaturi od 42-45oC tokom 2-4 sata. Fermentaciju vrše bakterije Lactobacillus
delbrueckii ssp.bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Nakon fermentacije jogurt se
hladi čime se usporava kiseljenje i produžava trajnost. Jogurt sadrži oko 0,7% mlečne
kiseline. U jogurt se dodaju probiotske bakterije, najčešće su to to laktobacili i
bifidobakterije (Maćej, Marković, 2009.).
Kefir je mlečno alkoholno- fermentisani probiotski i prebiotski napitak
bogat enzimima, sa mikroorganizmima koji balansiraju ekosistem domaćina i čije
redovno korišćenje poboljšava zdravlje. Kefir se dobija nakon ubcivanja kefirovih
zrna u mleko. Nakon fermentacije, kefirova zrna se odvajaju filtracijom i mogu se
koristiti za novu fermentaciju. Kefirova zrna se sastoje od miliona ćelija različitih
mikroorganizama. U kefirovim zrnima nalaze se bakterije mlečne kiseline iz rodova
Lactobacillus, Leuconostoc i Lactococcus. Neke od njih imaju probiotske
karakteristike (Puđa, 2009.).
Iako neki proizvodjači tvrde da probiotski proizvodi imaju veliki broj
pozitivnih dejstava po ljudsko zdravlje, većina nije dokazana u naučnim studijama
(Sacks, 2006.). Kao što je napomenuto, mnogi proizvodi ne sadrže vrste i sojeve koji
su istraživani za moguće pozitivne efekte i nemaju dovoljan broj viabilnih ćelija
neophodnih za postizanje pozitivnih efekata. Zbog toga, postoje ozbiljne sumnje o
pozitivnom delovanju ovih proizvoda. Ne postoji dilema da pojedini mikroorganizmi
zaista imaju pozitivan efekat na gastrointestinalni trakt i, generalno, ljudsko zdravlje.
Međutim, sve to mora biti određeno i potvrđeno kroz validne naučne studije.
Do sada su potpuno naučno dokazana dva pozitivna efekta probiotske hrane-
ublažavanje simptoma netolerancije laktoze i prevencija i redukcija simptoma diaree.
Poboljšanje digestije laktoze je posledica delovanja živih ćelija bakterija
mlečne kiseline koje se koriste kao starter kulture, a sastoji se u stimulaciji aktivnosti
crevne laktaze, u digestiji laktoze u crevnom lumenu jogurtnom laktazom. Zbog toga
13
laktoza intolerantne osobe tj. osobe alergične na mleko, u većoj meri podnose mlečno
kisele proizvode nego mleko (Schiffin, 2014.).
U prevenciji i terapiji dijareja (akutna diareja, rota virusi, putnička diareja,
profilaksa i terapija dijareje izazvane antibiotskom terapijom, Kronova bolest i
iritabilni kolon). Probiotske bakterije unete u obliku kiselo mlečnih proizvoda
kolonizuju intestinalni trakt i deluju kao prirodna barijera za infektivne bakterije i na
taj način imaju značajnu ulogu u terapiji dijareja tj. u uspostavljanju ravnoteže crevne
mikroflore; Lactobacillus acidofilus je efikasnijija od vrste Lactobacillusa bulgaricus
koja je sposobna da u digestivnom traktu ostane živa 10 dana pa i duže. Laktobacili
stvaraju nepovoljne uslove za opstanak raznih uzročnika bolesti, na primer,
mikrokoka, klostridija i raznih kolibakterija (Otles, 2013.).
Pored dokazanih pozitivnih efekata probiotskih bakterija na ljudsko zdravlje,
ispitivanje potencijlnih pozitivnih efekata je u eksperimentalnoj fazi.
Smatra se da probiotske bakerije mogu biti korišćene u lečenju alergija, koje
po jednoj od hipoteza nastaju zbog smanjenog izlaganja dece bakterijskim i viralnim
patogenima što dovodi do promena u imunom sistemu. Kasnija kolonizacija
gastrointestinalnog trakta dece sa vrstama laktobacila i bifidobakterija, takođe, može
biti jedan od razloga pojave alergija. Pored toga i sastav mikroflore može dovesti do
pojave alergijskih reakcija. Kod dece čija je mikrofloru slična mikroflori odraslih
osoba češće su alergije nego kod dece u čijem je gastrointestinalnom traktu
Bifidobactericum bifidum dominantna bakterija. Delovanje probiotika na smanjenje
alergijskih reakcija je preko regulacije imunog odgovora (Cho, Finocchiaro, 2009.).
Antikancerogena aktivnost bakterije mlečne kiseline moguća je inhibicijom
delovanja enzima koje sintetišu fekalni mikroorganizmi u kolonu, a koji redukuju -azo
i aromatična jedinjenja u kancerogene supstance. Pored prevencije karcinoma
gastrointestinalnog trakta, posebno debelog creva takođe smanjuju rizik od drugih
karcinoma. Mehanizam dejstva se ogleda u tome što smanju produkciju kancerogena-
nitrozamina i smanjuju resorpciju aflatoksina (Pessione, 2014.).
Jedna od mogućih primena probiotika je u smanjenju koncentracije
holesterola koji je osnovni faktor rizika za koronarne srčane bolesti. Probiotske
bakterije smanjuju koncentraciju holesterola asimilacijom holesterola ili vezivanjem
holesterola za površinu bakterijske ćelije čime direktno smanjuju njegovu
14
koncentraciju u organizmu. Drugi mehanizam podrazumeva da probiotske bakterije
mogu da inhibiraju enzime koji učestvuju u sintezi holesterola (Makinen, 2012.).
1.2. Probiotske bakterije
Najveći broj probiotskih mikroorganizma pripada rodu Lactobacillus i
Bifidobacteria ali je za neke sojevi enterokoka, laktokoka, streptokoka, leukonostoka i
sporolaktobacila pokazano da mogu da imaju probiotski efekat. Takođe, određeni
sojevi bakterija iz roda Bacilus (B. subtilis i B. cereus), vrsta Clostridium butyricum,
Propionibacterium freuderneichii i Esherichia coli kao i kvasci roda Saccharomyces
pokazuju pozitivan efekat na zdravlje ljudi (Vidhyalakshmi, 2009.).
Da bi se neki mikroorganizam mogao koristiti u probiotičke svrhe mora da
ispunjava sledeće uslove:
Da je poreklom iz digestivnog trakta čoveka;
Da nije patogen ni toksičan za ljude;
Da preživljava uslove koji vladaju u digestivnom traktu, u prvom redu veliku
kiselost želudačnog soka, a i da je otporan prema žučnim kiselinama u tankom
crevu;
Da proizvodi antimikrobne supstance aktivne prema nepoželjnim
mikroorganizmima u digestivnom traktu;
Da tokom tehnoloških postupaka proizvodnje i čuvanja ima visok stepen
preživljavanja (Silva, Freitas 2014.).
Pošto genetičke karakteristike probiotskih sojeva eventualno mogu da dovedu do
patogenosti ili infektivnosti soja potrebno je znati tačno poreklo soja kao i genetičke
karakteristike. Takodje je bitno utvrditi i prisustvo virulentnih faktora koji mogu da
dovedo do toksičnosti soja, njihove rezistencije na antibiotike ili sintezu metabolita
koji mogu da izazovu nepoželjne reakcije u ljudskom organizmu.
Probiotski mikroorganizmi ostvaruju svoje dejstvo prolaskom kroz
gastrointestinalni trakt čoveka i vezivanje za epitelne ćelije gastrointestinalnog trakta.
Funkcionalna svojstva probiotskih bakterija odnose se na mogućnost njihovog
prolaska kroz gastrointestinalni trakt i vezivanje za ćelije gastrointestinalnog trakta.
Najznačajnije karakteristike probiotskih sojeva su poželjna fiziološka svojstva ovih
sojeva koja utiču pozitivno na ljudsko zdravlje (Makinen, 2012.).
Poželjna fiziološka svojstva su sledeća:
15
delovanje na imuni sistem (imunomodulacija),
inhibitorno delovanje na gastrointestinalne patogene bakterije,
delovanje na metabolizam holesterola i laktoze
antimutagena
antikancerogena svojstva.
16
1.2.1. Bakterije mlečne kiseline
Bakterije mlečne kiseline su opisane tek krajem XIX veka, iako postoje dokazi
da je fermentisana hrana bila prisutna u ljudskoj ishrani i pre 5000 godina. Prema
nekim fosilim ostacima, utrvdjeno je da su postojale na zemlji pre oko tri milijardi
godina, pre nego što je kiseonik bio prisutan u atmosferi (Stojiljković, 2010.).
Bakterije mlečne kiseline rastu uglavnom u nutritivno bogatim sredinama.
Mogu se naći na istrulelom bilju i voću, u mlečnim proizvodima, fermentisanom mesu
i ribi, na repi, krompiru, kiselom kupusu, ukiseljenom povrću, piću, biljkama, vodi,
sokovima, mulju kao i telesnim dupljama (usta, genitalije, intestinalni i respiratorni
trakt) ljudi i životinja. Oni predstavjaju deo zdrave mikroflore ljudskih creva
(Marković, Maćej, 2008.).
Tipične bakterije mlečne kiseline koje rastu pod standardnim uslovima
(nelimitirajuće koncentracije glukoze, limitacija faktora rasta i kiseonika) su Gram-
pozitivne, nesporogene, katalaza negativne u odsustvu porforinoida, aerotolerantne,
acidotolerantne, organotrofne i striktno fermentativne štapićaste ili kokoidne bakterije
koje produkuju mlečnu kiselinu kao glavni krajnji proizvod. Nemaju citohrome i ne
mogu da sintetišu porfirine. Ove karakteristike mogu da variraju pod određenim
uslovima. U prisustvu hema moguća je katalaza i proizvodnja citohroma, tako da se
mlečna kiselina može dalje metabolisati, što rezultuje nižim koncentracijama mlečne
kiseline kao krajnjeg proizvoda (Lahtinen et al, 2011). Deoba ćelija se dešava u jednoj
ravni, osim kod pediokoka. Ćelije su uglavnom nepokretne. Imaju potrebu za
kompleksnim faktorima rasta kao što su vitamini i aminokiseline (Lahtinen et al,
2011.).
Na osnovu katabolizma glukoze koji je glavni izvor energije za bakterije
mlečne kiseline, bakterije mlečne kiseline mogu biti podeljene u dve grupe -
homofermentativne i heterofermentativne. Homofermentativne vrste bakterija mlečne
kiseline produkuju < 85% mlečne kiseline kao jedini krajnji produkt, dok
heterofermentativne vrste proizvode mlečnu kiselinu, CO2 i etanol/acetat. Najmanje
polovina ugljenika u krajnjem proizvodu je u vidu laktata. Homofermentativne
bakterije mlečne kiseline vrše glikolizu i mlečnu fermentaciju. Heterofermentativne
bakterije mlečne kiseline koriste pentoza fosfatni put, koji se alternativno naziva još i
put fosfoketolaze ili fosfoglukonata (Glišić, 2006.).
17
Streptococcus
Streptococcus je rod Gram-pozitivnih bakterija iz familije Streptococcaceae
koje su široko rasprostranje u prirodi. Deo su normalne bakterijske flore
gastrointestinalnog trakta čoveka, a neke vrste su i uzročnici različitih bolesti.
Streptokoke su okruglog oblika, povezane u parove (slika 3), obično nepokretne, ne
stvaraju spore te su najčešći fakultativni anaerobi (Prudja, 2009.).
U okviru roda Streptococcus, jedina vrsta koja je važna u industriji mleka i
fermentisanih mlečnih proizvoda je Streptococcus thermophilus. Ova bakterija je
izolovana iz mnogih sireva i fermentisanih mlečnih proizvoda, ali i sa biljnog
materijala. S. thermophilus je termofilna bakterija mlečne kiseline, koja raste na 45oC,
čak i preko 50oC, dok na temperaturi od 10oC ne raste. Ćelije su okruglog oblika i
javljaju se u paru i u dugim lancima. Pripada grupi homofermentativnih bakterija
mlečne kiseline i sintetiše L oblik mlečne kiseline. Ulazi u sastav starter kultura za
proizvodnju jogurta i sireva (Harrington, 2012.).
Pored S.thermophillus se veoma često u mlečnoj industriji. Tipična mlečna
bakterija, termofilna, opstaje do temperature od 43oC. Zajedno sa L.bulgarigus je
starter kultura za proizvodnju jogurta u odnosu 1:1. Nalaze se u simbiozi gde je
L.bulgarigus jači proteolit i stvara jedinjenja manje molekulske mase koja
S.thermophilus koristi (Duraković, 2002.).
Slika 3: Streptococcus sp.
18
Lactobacillus
Najbrojni rod BMK je rod Lactobacillus sa 135 vrsta i preko 25 podvrsta.
Lakotobacili su štapićaste bakterije duge ili kokoidne (slika 4). Većina laktobacila
raste na temperaturi od 2-53oC i na pH=3,0-7,0. Ove bakterije mogu biti
mikroaerofilne ili fakultativno anaerobne, dok starije kulture rastu u aerobnim
uslovima. Metabolizam laktobacila je respiratorni ili fermentativni. Laktobacili se
mogu naći u različitim vrstama namirnica (sveže voće, voćni sokovi, sveže povrće,
konzervisano povrće, mlečni proizvodi, vino, pivo, meso i proizvodi od mesa.),
zemljištu, vodi, u crevima ljudi i domaćih životinja.
Koriste se kao starter kulture za proizvodnju kobasica (Lb. plantaruni, Lb.
brevis), kao i mlečno fermentisanih proizvoda (Lb. acidophilus, Lb. lactis, Lb. casei,
Lb. debrueckii) (Božanić, 2000.).
Slika 4: Lactobacillus sp.
19
1.2.2. Bifidobakterije
Bifidobakterije su Gram pozitivne bakterije štapićastog oblika. Rod
Bifidobacterium obuhvata više od 28 vrsta koje su normalna komponenta crevne flore
donjeg dela gastrointestinalnog trakta. Pored gastrointestinalnog trekta mogu se naći i
kao deo mikroflore vagine i usne duplje sisara i drugih životinja. To su anaerobne
bakterije koje nemaju katalaze, ne formiraju spore i nemaju flagele. Bifidobakterije su
po morfologiji granati štapići karakterističnog oblika (u obliku slova V, X ili Y) (slika
5) ali oblik bifidobakterija varira u zavisnosti od podloga na kojima se gaje i
spoljašnjih uslova gajenja. Rastu na podlogama koje su bogate nutritijentima i
faktorima rasta.
Produkti metabolozima bifidobakterija inhibitorno deluju na rast pathogenih
vrsta. Bifidobakterije u debelom crevu razlažu ugljene hidrate i tako stvaraju umereno
kiselu sredinu koja suprimira rast bakterija i drugih patogenih mikroorganizama.
Imaju uticaj na metabolizam masnih kiselina, žučnih kiselina, holesterola i steroidnih
hormona u crevnom traktu. Bifidobakterije produkuju veliki broj vitamina,
uključujući vitamine B grupe kao i vitamin K, koji se apsorbuju i ulaze u cirkulaciju.
Pored toga masne kiseline kratkih lanaca koje sintetišu bifidobakterije iz ugljenih
hidrata su primarni izvor energije za epitelne ćelije debelog creva. Ne učestvuju u
fermentacijama pri proizvodnji fermentisane hrane već se dodaju mlečnim
fermentisanim proizvodima kao probiotici. Najznačajniji predstavnici roda
Bifidobacterium su: B. bifidum, B. longum, B. breve, B. adolescensis i B. infantis.
Ove vrste mogu se izolovati iz debelog creva u različitom broju u zavisnosti od
starosnog perioda života. B. longum je bakterija koja se može izolovati iz gastro
intestinalnog trakta ljudi svih starosnih grupa (Marković, 2013.).
Slika 5: Biffidobacterium sp.
20
2. Fermentisana hrana
Fermentisana hrana predstavlja tip hrane u kojoj rastom mikroorganizama i
njihovim metabolizmom dolazi do konverzije organskih jedinjenja iz supstrata u
produkte metabolizma mikroorganizama. Fermentisana hrana se najčešće dobija
fermentacijom sirovina koju vrše mikroorganizmi. Konzumiranjem fermentisane
hrane u organizam unosimo žive i mrtve mikroorganizme koji su rasli u hrani, njihove
produkte metabolizma kao i ostatak supstrata koji nije iskorišćen od strane
mikroorganizama. Osnovne karakteristike fermentisane hrane su:
konzervacija,
povećanje nutritivnih vrednosti,
organoleptička svojstva.
Mikroorganizmi koji vrše konzervaciju hrane produkuju različita jedinjinja
koja inhibitorno deluju na rast drugih mikroorganizama. Najčešće su to organske
kiseline, ali mogu da sintetišu i H2O2, O2, etanol, diacetil i mnoge druge organske
molekule sa antimikrobnim dejstvom. Konzervancija hrane omogućava produženje
roka trajanja hrane kao i veću bezbednost hrane (Martinoć et al, 2006).
Mikroorganizmi vrše konverziju supstrata u organske molekule koji imaju
veću nutritivnu vrednost, te tako povećavaju nutritivnu vrednost fermentisane hrane.
Npr. bakterije koje se nalaze u jogurtu vrše konverziju laktoze u mlečnu kiselinu,
tako da ljudi koji su intolerantni na laktozu mogu da usvajaju sve hranljive supstance
iz mleka preko jogurta (Obradović, 2001.).
Organoleptička svojstva prehrambenih proizvoda se određuju ljudskim čulima,
a ne mogu se odrediti instrumentalnim analitičkim tehnikama i egzaktnim merenjima.
Kvalitet prehrambenih proizvoda određen je njihovim fizičko-hemijskim
karakteristikama, nutritivnom i energetskom vrednošću i drugim karakteristikama kao
što su izgled, boja, miris i ukus. Ove karakteristike kao i viskoznost, čvrstoća, tvrdoća,
rastegjivost, plastičnost, hrskavost proiyvoda predstavljaju organoleptička svojstva
proizvoda. Danas se primenjuju različiti proizvodni procesi za istu početnu sirovinu
što je omogućilo postojanje oko 3500 različitih fermentisanih proizvoda (Zaid et al,
2007.).
21
Mikroorganizmi koji učestvuju u proizvodnji hrane mogu se podeliti u 3
grupe:
bakterije (bakterije mlečne kiseline, bakterije sirćetne kiseine, bakterije iz
rodova Bifidobactericum, Propinobacterium i Brevibacterium) najčešće se
koristi prilikom proizvodnje fermentisanih proizvoda od mesa, mleka i
proizvoda biljnog porekla,
kvasci ( rod Saccaharomyces) učestvuju u fermentaciji žitarica i koriste se u
pekarskoj industriji,
plesni (rodovi Aspergillus i Penicillium)-koriste se za proizvodnju različitih
sireva kao i fermentisane hrane biljnog porekla.
22
2.1. Soja
Soja sadrži 37-50 % proteina (meso ima 12 - 22 %), nezasićene masne kiseline,
lecitin, izoflavon (izuzetno efikasan u prevenciji raka i osteoporoze) i veoma korisne
minerale (gvožde, magnezujum, kalijum) (Nenadić, 1995.). Soja ne sadrži holesterol i
laktozu. Pedeset grama soje namiriće skoro u potpunosti dnevnu potrebu za
vitaminom E, B1, folnom kiselinom i vitaminom B6, polovinu dnevne potrebe za
kalijumom i trećinu potrebe za magnezijumom. Od ugljenih hidrata soja sadrži
polisaharid dekstrin koji ima važnu ulogu u ishrani dijabetičara jer onemogućava
naglo povećanje sadržaja glukoze u krvi. Soja je izvor lecitina i vitamina E. Ovi
prirodni antioskidansi sprečavaju oksidaciju LDL holesterola (Djordjević, 1980.). Sve
ove karakteristike kao i niska cena proizvodnje i prerade čine soju i njene proizvode
sve popularnijim namirnicama.
Soja ima višestruku upotrebu u ishrani ljudi i životinja, ali i u različitim
granama industrije (slika 6).
Slika 6: Različiti proizvodi od soje (Riaz, 2005.)
23
2.1.2. Fermentisani proizvodi od soje
Fermentisani proizvodi od soje ranije su uglavnom bili popularni na azijskom
tržištu, medjutim danas se sve više koriste i kod nas.
Cheonggukjang je fermentisani proizvodi koji se pravi od zrna soje. To je
pasta koja se koristi u korejskoj kuhinji. Sadrži cela, ali i samlevena zrna
soje.Fermentaciju vrši Bacillus subtilus na 40oC tokom 48-72h bez dodatka soli
(Shurtleff, 2011.).
Doubanjiang je ljuti, slani fermentisani proizvod koji se pravi od boba,
pirinča i soje. Fermentacija je spontana i vrše je uglavnom BMK (Hosking, 1995.).
Tempeh je tradicionalni proizvod od soje, poreklom iz Indonezija. Dobija se
prirodnom fermentacija zrna soje. Fermentaciju vrše gljive Rhizopus oligosporus ili
Rhizopus oryzae (McCloud, 1992.).
Miso je tradicionalni japanski proizvod koji se dodaje prilikom pravljenja
različitih supa ili soseva. Fermentaciju vrši Aspergillus oryzae i Tetragenococcus
halophilus. Ovaj proizvod ima visok sadržaj vitamina i proteina (Katz, 2012.).
Nato je tradicionalna japanska hrana poreklom iz Kine koje nastaje
fermentacijom soje koju vrši Bacillus subtilis. Ima visok sadržaj proteina, jak miris i
ukus, i “klizavu” tekstura (Buerk, 2010.).
Soja sos nastaje fermentacijom koju vrše Aspergillus oryzae i Aspergillus
sojae. Ranije se koristio pre svega u kuhinji Istočne Azije mada je danas veoma
popularan proizvod na svim kontinentima. Sadrži 10 puta više antioksidanasa od vina
(Schueller, 1997.).
Tempeh je fermentisani proizvod poreklom iz Indonezije gde je starter
Rhizopus oligosporus, bogat je vitaminom B12 i polisaharidima (Tan, 2006.).
Sufu nosi još i naziv “Kineski sir”, po ukusu je sličan plavom siru i veoma je
bogat proteinima. Fermentaiju vrše plesni Actinomucor elegans, Mucor sufu, Mucor
rouxanus, Mucor wutuongkiao, Mucor racemosus, Rhizopus spp. (Tan, 2006.).
Poslednjih godina ispituje se mogućnost proizvodnje novih fermentisanih
proizvoda od soje. Tako se fermentisano sojino mleko proizvodi dodavanjem bakterija
mlečne kiseline u sirovinu kako bi se izvela mlečno kiselinska fermentacija. U sojino
mleko, takođe, se dodaju probiotski mikroorganizmi kako bi se dobio napitak sa
funkcionalnim karakteristikama.
24
2.1.3. Sojino mleko
Soja i njeni proizvodi veoma su cenjeni i traženi u svetu zbog visokog sadržaja
nezasićenih masnih kiselina, lecitina, izoflavona i minerala (gvožde, magnezujum,
kalijum). Od svih proizvoda posebnu pažnju privlači sojino mleko (Nenadić, 1995.).
Prvi podaci o sojinom mleku pojavljuju se u Kini 82. godine p.n.e. dok se u
Evropi prvi put spominje 1793 godine.
Sojino mleko je mutna beličasta tečnost prijatnog ukusa koja se proizvodi od
celog zrna soje (slika 7). Suva zrna se potapaju preko noći u vodu, zatim se melju i
dodaje im se još vode. Odnos vode i zrna je 10:1. Dobijena mešavina se potom kuva
kako bi povišena temperatura aktivirala inhibitobor tripsina, poboljšala ukus i da bi
proizvod bio pasterizovan. Zagrevanje se vrši 15-20 minita na temperaturi od oko
100oC. Potom se vrši uklanjanje nerastvornih ostataka (okara) filtracijom. Tokom
proizvodnje dodaje se inulin i morska so. U 100 g proizvoda ima oko 3,3 g proteina, 1
gr ugljenih hidrata, 1,3 g masti i 2,2 gr inulina. Energetska vrednost sojinog mleka je
32 Kcal (134 KJ).
Sojino mleko je zdrav i hranljiv napitak koji može da zamenjuje kravlje mleko.
Lako je svarljivo, ne sadrži holesterol niti mlečni šećer, koji je uzrok raznih
alergijskih smetnji. Pošto ne sadrži sirovine animalnog porekla, proizvod je pogodan
za dane posta kao i za vegetarijance i vegane.
Sva mleka od soje nisu ista, već se razlikuju u zavisnosti od sorte i kvaliteta
zrna soje. Starost semena i načini njegovog skladištenja, kao i kvalitet zemljišta gde je
biljka gajena, znatno utiču n kvalitet sojinog mleka. Pojedini enzimi u soji proizvode
isparljive sastojke, koji mogu da imaju neprijatan miris, što umanjuje kvalitet
proizvoda. Ukupna količina isparljivih materija je u direktnoj vezi sa aktivnošću
enzima lipokigenaze. Duže skladištenje izaziva promenu boje.
Slika 7: Proizvodnja sojinog mleka
25
Sojino i kravlje mleko se razlikuju po svom hemijskom sastavu (tabela 2).
Sojino i kravlje mleko su bogat izvor proteina ali kravlje mleko ih sadrži nešto više (6
gr/ 250ml) -u odnosu na sojino mleko (4 gr/ 250ml). Biološka vrednost sojinih
proteina je za oko 20 odsto niža od proteina kravljeg mleka. Sojino mleko ne sadrži
laktozu, mlečni šećer koga ima u kravljem mleku, dok je procenat masti dva put manji
u sojinom mleku u odnosu na kravlje. Kalcijum se u sojinom mleku nalazi u maloj
količini i vezan je za nerastvorno vlakno iz pulpe mahunarke tako da je njegova
apsorpcija 75 % u odnosu na kalcijum iz kravljeg mleka.
Visok nivo fitinske kiseline u soji smanjuje apsorpciju kalcijuma,
magnezijuma, bakra, gvožđa i cinka.
Kravlje mleko Sojino mleko
Informacije o proizvodu 2% mast Vanila
Zapremina 240 ml 240 ml
Kalorije 120 100
Kalorije iz masti 45 30
Ukupno masti 5 g 3,5 g
Trans masti ? 0 g
Zasićene masti 3 g 0,5 g
Holestorel 20 mg 0 mg
Natrijum 125 mg 95 mg
Kalijum 0 mg 300 mg
Ukupno ugljenih hidrata 12 g 10 g
Dijetalna vlakna 0g 1 g
Šećeri 11 g 7 g
Proteini 8 g 6 g
Vitamin A 10% 10%
Vitamin C 4 % 0%
Kalcijum 30% 30%
Gvoždje 0% 6%
Vitamin D 25% 30%
Riboflavin 0% 30%
Folna kiselina 0% 6%
Vitamin B12 0% 50%
Cink 0% 4%
Fosfor 20% 0%
Tabela 2: Hemijski sastav sojinog i kravljeg mleka (Brandon, 2004.)
26
3.Ciljevi rada
Imajući u vidu, eksperimentalno i naučno, dokazane činjenice o zdravstvenom
značaju i hranljivim svojstvima sojinog mleka, ciljevi ovog rada su:
ispitivanje mogućnosti rasta probiotske ABY-6 kulture u sojinom mleku,
ispitivanje uticaja količine inokuluma na rast probiotske starter kulture,
ispitivanje uticaja surutke na rast probiotske starter kulture,
određivanje stabilnosti fermentisanog sojinog mleka u toku čuvanja na 4C.
27
4.Materijali i metode
4.1.Materijal
4.1.1 Fermentacione podloge
Za ispitivanje procesa fermentacije u toku ovog istraživanja korišćeno je sojino mleko
proizvođača Delhaize (Belgija). Nutritivne vrednosti ovog sojinog napitka, u 100 ml
proizvoda, su:
Proteini 3,3g
Ugljeni hidrati 1g
Lipidi 1,3g
Inulin 2,2g
Energetska vrednost 32 Kcal
Za obogaćivanje sojinog mleka korišćena je komercijalna surutka u prahu (Lučar,
Srbija). Sastav surutke je bio sledeći: proteini min. 11%, laktoza min. 61%, mast maks.
2%, suva meterija min. 95% i pepeo maks. 9.5%.
Inokulum kojim je zasejavano sojino mleko pripremljen je od kravljeg mleka sa 0,5%
mlečne masti (Imlek, Srbija). Kravlje mleko, sojino mleko i sojino mleko obogaćeno
surutkom su pasterizovani kuvanjem na 80C 30 minuta.
4.1.2 Probiotska kultura i podloge
Probiotska kultura Laktoferm ABY-6 (Biochem, Italija) dobijena u obliku
liofiliziranog praha korišćena je za fermentaciju sojinog mleka. Ova starter kultura je
mešavina bakterijskih vrsta Streptococcus thermophilus (80%), Lactobacillus
acidophilus (13%), Bifdobacterium bifidum (6%) i Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus (1%). Starter kultura je aktivirana rastvaranjem 0.1 gr praha u 10 ml
sterilnog kravljeg mleka, nakon čega je mleko inkubirano 5 sati na 42C. Inokulum za
fermentaciju sojinog mleka dobijen je dvostrukim sukcesivnim zasejavanjem
pasterizovanog kravljeg mleka (1,5% v/v) aktiviranom starter kulturom ABY-6.
Početni inokulum dobijen je zasejavanjem sterilnog kravljeg mleka aktiviranom
starter kulturom dok je radni inokulum dobijen zasejavanjem početnog inokuluma u
kravlje mleko. Kravlje mleko zasejano ABY-6 kulturom inkubirano je 24 sata na
42C i nakon inkubacije, merena je pH vrednost. U radu je za inokulaciju
fermentacionih podloga uvek korišćen inokulum čija je pH vrednost bila 4,20.
Brojanje bakterijskih ćelija tokom fermentacije rađeno je na selektivnim podlogama
za BMK. Korišćena je MRS čvrsta podloga (Torlak, Srbija) koja favorizuje rast
laktobacila i M17 čvrsta podloga (Merck, Nemačka) obogaćena 5% glukozom (Zorka,
Srbija) za rast streptokoke.
28
4.2.Metode rada
4.2.1 Fermentacija sojinog mleka
Čisto sojino mleko i sojino mleko sa dodatkom surutke (1%, 2%, 4% w/v) su
korišćeni za fermentaciju sojinog mleka. Prekonoćnim inokulumom probiotske
kulture zasejavane su fermentacione podloge. Za ispitivanje uticaja količine
inokuluma na fermentaciju sojinog mleka ABY-6 starter kulturom korišćen je 1%, 3%
i 6% (v/v) radni inokulum probiotske kulture. 3% inokulum je korišćen za ispitivanje
uticaja surutke na rast probiotske kulture. Nezasejano sojino mleko je korišćeno kao
kontrola tokom svih eksperimenata. Fermentisane podloge koje su zasejane i
nezasejane kontrolne podloge su inkubirane tokom 24 sata na 42C.
Tok fermentacije je praćen merenjem pH vrednosti fermentacionih podloga i
određivanjem broja ćelija u određenim vremenskim periodima. Uzorci su uzimani
prvih 5 sati od početka fermentacije u vremenskim intervalima od 1,5 sati i nakon 24
sata. Dobijeni fermentisani napici su čuvani u frižideru na 4C i njihova stabilnost je
određivana merenjem pH vrednosti i brojanjem ćelija na svaka 4 dana u periodu od 20
dana.
4.2.2 Merenje pH vrednosti
Zbog gustine uzorka, uzorci su prvo razblaživani sa 10 ml destilovane vode, a
pH vrednosti fermentacionih podloga i kontrola merene su pH metrom (Eutech
Instrument, Singapur).
4.2.3 Brojanje bakterijskih ćelija
Indirektnom metodom brojanja odredjivan je broj bakterijskih ćelija u uzorcima iz
fermentacionih podloga. Početni uzorak je razblaživan u fiziološkom rastvoru (0,85%
NaCl) zbog velikog broja ćelija. Iz uzorka sa većim razblaženjem je radjeno
zasejavanje MRS i M17 podloga da bi na svakoj Petri ploči bilo izmedju 30 i 300
kolonija. Zasejane Petri ploče inkubirane su 48 sati na 37C, nakon čega su brojane
kolonije. Množenjem broja kolonija sa korišćenim razblaženjem je dobijen broj ćelija
u uzorku i prikazan je kao logN u 1 ml uzorka (logN/ml) gde je N broj kolonija na
podlozi.
29
5.Rezultati i diskusija
5.1. Rast probiotske kulture u sojinom mleku
Soja je namirnica sa visokim sadržajem proteina, esencijalnih amino kiselina,
nezasićenih masnih kiselina i izoflavona, dok ne sadrži holesterol i laktozu (Lin et al.,
2004.). Sa druge strane, soja i proizvodi od soje imaju specifičane organoleptičke
karakteristike koje potiču od n-heksanala i pentanala kao i nesvarljive oligosaharide
kao što su rafinoza i stahioza što ograničava upotrebu soje i njenih proizvoda u ishrani
mnogih ljudi (Božanić et al., 2011., Chengcheng et al., 2014). Jedan od načina
prevazilaženja ovih ograničenja i poboljšanja organoleptičkih karakteristika proizvoda
od soje jeste proizvodnja fermentisanih napitaka od soje. Karakteristična aroma i
miris fermentisanih proizvoda od soje, najčešće, se postižu korišćenjem BMK u
fermentaciji (Chengcheng et al., 2014).
Sojino mleko je vodeni ekstrak sojinih zrna i predstavlja dobru podlogu za rast
različitih vrsta BMK pri čemu su bakterijske vrste iz roda Lactobacillus najčešće
korišćene za fermentaciju sojinog mleka (Chengcheng et al., 2014). Probiotske BMK,
takođe, su korišćene za dobijanje fermentisanog sojinog mleka (Chiang i Pan, 2012).
Komercijalna probiotska starter kultura Laktoferm ABY-6 sastoji se od
bakterijskih vrsta St. thermophilus (80%), Lb. acidophilus (13%), B. bifidum (6%) i
Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (1%). Vrste St. thermophilus i Lb. delbrueckii ssp.
bulgaricus ulaze u sastav starter kulture za proizvodnju jogurta, dok vrste Lb.
acidophilus i B. bifidum se dodaju kao probiotici u fermentisane napitke. Starter
kultura Laktoferm koristi se komercijalno za proizvodnju mlečnih fermentisanih
napitaka, kao i fermentisanih napitaka na bazi mleka i surutke (Rakin et al., 2015). U
pregledanoj literature nisu pronađeni podaci o fermentaciji sojinog mleka sa
probiotskom starter kulturom ABY-6.
Na početku eksperimenta, ispitivana je mogućnost rasta probiotske starter
kulture ABY-6 u čistom sojinom mleku i sojinom mleku sa dodatkom surutke (1%,
2%, 4% w/v). S obzirom da BMK koriste laktozu kao osnovni izvor energije za rast i
kazein kao izvor amino kiselina, u sojino mleko je dodata surutka kao izvor ovih
hranljivih materija. Fermentacione podloge su zasejana 3% aktiviranom ABY-6
starter kulturom i inkubirane su 24 sata na 42C. Nakon inkubacije merena je PH
vrednost fermentacionih podloga i određivan je broj ćelija u njima.
30
pH vrednost sojinog mleka zasejanog ABY- 6 kulturom nakon 24 sata
inkubacije bila je 4,03 (Tabela 1). Kako je pH vrednost nezasejanog sojinog mleka
6,56, smanjenje pH vrednosti zasejanog sojinog mleka ABY-6 kulturom ukazuje da
bakterije u korišćenoj starter kulturi sintetišu organske kiseline. BMK sintetišu
mlečnu kiselinu kao glavni produkt energetskog metabolizma tokom svog rasta što
dovodi do smanjivanja pH vrednosti supstrata u kome rastu (Axelsson, 1998). U
frementacionim podlogama gde je dodata surutka pH vrednost je bila nešto niža u
odnosu na sojino mleko. Najniža pH vrednost izmeren je u sojinom mleku sa
dodatkom 2% surutke (Tabela 1).
Tabela 1. pH vrednosti i broj ćelija sojinog i obogaćenog sojinog mleka nakon
fermentacije sa probioskom kulturom
Uzorak pH vrednost Broj ćelija (logN/ml)
M17 MRS
Sojino mleko 4,03 4,5 4,85
Sojino mleko + 1% surutka 3,95 5,6 5,7
Sojino mleko + 2% surutka 3,86 5,5 5,7
Sojino mleko + 4% surutka 3,94 5,7 5,7
Broj bakterijskih ćelija određivan na M17 i MRS podlozi bio je veći u svim
fermentacionim podlogama u kojima je dodata surutka u odnosu na neobogaćeno
sojino mleko gde je broj ćelija na obe korišćene podloge bio oko 1 logN/ml manji
(Tabela 1). Najveći broj ćelija na M17 podlozi koja je selektivna za rast streptokoka
bio je u sojinom mleku sa 4% surutke. Na MRS podlozi, broj ćelija bio je isti u svim
fermentacionim podlogama sa surutkom (5,7 log N/ml). MRS podloga je selektivna za
rast laktobacila ali na njoj mogu da rastu i bifidobakterije. S obzirom da je veći broj
bakterijskih ćelija na MRS podlozi u odnosu na broj ćelija na M17 podlozi, hemijski
sastav sojinog mleka favorizuje rast laktobacila i bifidobakterija. Ovi rezultati su u
suprotnosti sa rezultatima drugih istraživanja koj su pokazali da je sojino mleko
pogodniji supstrat za rast streptokoka u odnosu na laktobacile (Božanić et al., 2011.
2008.). U sojinom mleku kao izvori ugljenika nalaze se saharoza, rafinoza i stahioza
koje mogu da koriste laktobacili i bifidobakterije kao izvore energije ali ne i vrsta St.
thermophilus što objašnjava njihov bolji rast u odnosu na streptokoke. Osim toga, u
31
radu je korišćeno sojino mleko sa inulinom koji, takođe, pospešuje rast laktobacila i
bifidobakterija (Arzu i Bakirci, 2014, Stijepić et al., 2013). Na osnovu dobijenih
rezultata pokazano je da je sojino mleko pogodan supstrat za rast probiotske starter
kulture ABY-6 tako da je u daljem radu korišćeno čisto sojino mleko.
4.2 Uticaj inokuluma na rast probiotske kulture
Prilikom optimizacije fermentacije sirovina bakterijskim starter kulturama
potrebno je ispitati kako određeni parametri utiču na tok fermentacije i kvalitet
finalnog proizvoda. Jedan od parametara koji značajno može da utiče na proces
fermentacija i broj ćelija tokom fermentacije je količina inokuluma, pre svega zato što
od količine inokuluma zavisi početni broj ćelija unešen u određenu fermentacionu
podlogu. Zato je u daljem radu ispitivan uticaj inokuluma (1%, 3%, 6% ) na proces
fermentacije sojnog mleka. Fermentacija je praćena 4,5 sata jer je to dovoljno vreme
za snižavanje pH vrednosti sojinog mleka na 4,6 što predstavlja izoelektričnu tačku
proteina soje (Vissesanguan et al., 2005).
Na slici 1 prikazana je promena pH vrednosti sojinog mleka tokom 4 sata
fermentacije sa različitom količinom inokuluma ABY-6 starter kulture. pH vrednosti
fermentacionih podloga su nakon 4 sata fermentacije bile približno iste, pri čemi je
najmanja pH vrednost dostignuta sa 6 % inokulumom (6%). U radu Bulatović i
saradnika (2014) koji su koristili ABY-6 kulturu za fermentaciju surutke, postignuta
je pH vrednost 4,5 za 4,5 sata fermentacije sa 6% inokulumom. Sojino mleko sadrži
veliku količinu proteine ali su oni drugačije strukture u odnosu na kazein iz surutke.
BMK iz starter kulture sporije razlažu proteine soje što usporava rast bakterija i
sintezu kiselina. Osim toga, laktoza koja je prisutna u surutki a nema je u sojinom
mleku, predstavlja bolji supstrat za bržu sintezu mlečne kiseline u odnosu na ugljene
hidrate iz sojinog mleka.
32
Slika 1. Promena pH vrednosti sojinog mleka tokom fermentacije
u zavisnosti od količine inokuluma
Određivanje broja ćelija tokom fermentacije rađeno je na M17 i MRS podlozi (Slika 2
i 3). Broj ćelija vrste St. thermophilus određen na M17 podlozi nakon 4, 5 sata
fermentacije najveći je sa 6% inokulumom (6,2 logN/ml), nešto manji sa 3%
inokulumom (6,1 logN/ml), dok je sa 1% inokulumom 5,8 logN/ml najmanji. Na
početku fermentacije broj ćelija streptokoka je za oko 1 logN/ml manji u odnosu na
broj unetih ćelija sa 3% i 6% inokulumom zbog čega je na kraju praćenog perioda
fermentacije njihov broj manji.
Slika 2. Promena broja ćelija na M17 podlozi tokom fermentacije sojinog
mleka u zavisnosti od količine inokuluma
33
Broj ćelija laktobacila i bifidobakterija određivan na MRS podlozi je različit nakon
4,5 sata fermentacije sojinog mleka iako je njihov broj približno isti na početku
fermentacije (Slika 3). Na kraju praćenog perioda fermentacije, broj ćelija na MRS
podlozi gde je korišćen 6% inokulum iznosi 5 logN/ml, dok je sa 1% inokulumom 3,9
logN/ml. sa 6% inokulumom 5 logN/ml.
Slika 3. Promena broja ćelija na MRS podlozi tokom fermentacije sojinog
mleka u zavisnosti od količine inokuluma
Broj ćelija streptokoka je za oko 1,5 logN/ml veći u odnosu na broj ćelija
određen na MRS podlozi nakon 4,5 sata fermentacije sojinog mleka. Probiotska
starter kultura ABY-6 sastoji se od 80% ćelija vrste St. thermophilus, dok laktobacili i
bifidobakterije čine preostalih 20%. Osim toga, radni inokulum korišćen u ovom radu
dobijen je u kravljem mleku, u kome streptokoke mnogo bolje rastu u odnosu na vrste
Lb. acidophilus i B. bifidum tako da je njihov početni broj u sojinom mleku veći
(Slika 2 i 3). Broj streptokoka konstantno raste od početka fermentacije sa
eksponencijalnim rastom nakon 1,5 sata od početka fermentacije. Kod laktobacila i
bifidobakterija, logaritamska faza rasta počinje tek nakon tri sata. Sve ovo dovodi do
manjeg broja laktobacila i bifidobakterija nakon praćenog perioda fermentacije.
Fermentacijom surutke obogaćene mlekom sa ABY-6 starter kulturom, dobijen je veći
broj ćelija u fermentacionim podlogama (Bulatović et al, 2014; Rakin et al., 2015). U
jednom prethodnom istraživanju sa jogurtnom starter kulturom pokazano je da
streptokoke brže rastu u odnosu na laktobacile nakon 4 sata fermentacije sojinog
mleka (Božanić et al, 2011).
34
4.3 Uticaj dodavanja surutke na rast probiotske culture
Surutka sadrži proteine surutke (20% od ukupnih proteina), laktozu, vitamine
rastvorljive u vodi i minerale. Proteini i peptide surutke imaju važna biološka svojstva
u organizmu, tj. imaju uticaj na imuni,kardiovaskularni, nervni i gastrointestinalni
sistem, kao i osećaj sitosti (Rakin et al., 2015). Zbog toga se surutka dodaje mnogim
fermentisanim napicima kako bi se povećale njihove funkcionalne karakteristike.
Kako bi se ispitao uticaj dodavanja surutke na fermentaciju sojinog mleka, rađena je
fermentacija obogaćenog sojinog mleka sa 1 % surutkom. U ovim fermentacijama
korišćen je 3% inokulim probiotske starter kulture ABY-6. Proces fermentacije praćen
Na slici 4 prikazane su dobijene pH vrednosti fermentisanog sojinog mleka (SM) i
sojinog mleka sa dodatkom surutke (SMS) nakon 6 sati fermentacije. Dodavanje
surutke u sojino mleko ne utiče mnogo na pH vrednosti fermentacionih podloga jer su
dobijene vrednosti slične ( 4,5 za sojino mleko sa surutkom i 4,6 za sojino mleko). U
sojinom mleku sa surutkom je pH vrednost bila manja u prvih četiri sata fermentacije
u odnosu na sojino mleko bez surutke.
Slika 4. Promena pH vrednosti sojinog mleka (SM) i sojinog mleka obogaćenog
surutkom (SMS) tokom fermentacije K-kontrola
35
Dodavanje surutke u sojino mleko nema veliki uticaj na broj ćelija određivan
na M17 i MRS podlozi (Slika 5). Broj ćelija streptokoka je na kraju praćenog perioda
fermentacije u sojinom mleku 7,1 logN/ml, dok je u sojinom mleku sa surutkom 7,3
log N/ml. Slična razlika u broju ćelija dobijena je i na MRS podlozi gde je broj ćelija
laktobacila i bifidobakterija za 0,3 logN/ml veći u fermentacionoj podlozi sa surutkom.
Ovakav rezultat je malo neočekivan za streptokoke koje koriste laktozu kao osnovni
izvor energije za rast. Laktobacili i bifidobakterije mogu da koriste rafinozu i stahiozu
iz sojinog mleka za rast (Božanić et al, 2011) čime se može objasniti njihov sličan
broj na korišćenim podlogama za fermentaciju.
Slika 5. Promena broja ćelija tokom fermentacije sojinog mleka (SM) i sojinog mleka
obogaćenog surutkom (SMS) određivana na M17 I MRS podlozi
36
4.4 Stabilnost fermentisanih napitaka tokom skladištenja
Da bi neki proizvod mogao da se smatra probiotskim mora da sadrži 8
logN/ml ćelija. S obzirom da se fermentisani napici čuvaju u određenom vremenskom
period pre konzumiranja, potrebno je da broj ćelija probiotika ostane stabilan. Osim
toga, fermentisani poizvodi moraju da zadrže fizičkohemijske karakteristike i
organoleptička svojstva u period skladištenja. Fizičkohemijski parametri kao što su
pH vrednost, viskoznost i kapacitet zadržavanja vode su osnovni pokazatelji
stabilnosti proizvoda tokom čuvanja u dužem vremenskom periodu (Stijepić et al.,
2013).
Fermentisano sojino mleko i sojino mleko obogaćeno surutkom su odmah
nakon 6 sati fermentacije prebečeni u frižider. Na slici 6 prikazana je pH vrednost
fermentisanih napitaka od soje tokom skladištenja na 4C u period od 20 dana. Nakon
manjeg početnog pada pH vrednosti fermentisanih napitaka, njihova pH vrednost
ostaje stabilna do 20. dana. S obzirom da su u probiotskoj starter kulturi ABY-6
termofilne bakterije, one ne mogu da rastu na niskoj temperraturi od 4C u frižideru.
Takođe, stabilnost pH vrednosti dobijenih napitaka ukazuje da nije došlo do kvarenja
proizvoda tokom skladištenja.
Slika 6. pH vrednosti fermentisanog sojinog mleka (SM) i sojinog mleka sa dodatkom
surutke (SMS) tokom čuvanja na 4C
37
Na slici 7 prikazan je broj ćelija probiotskih bakterija određivan na MRS
podlozi u sojinom mleku i sojinom mleku obogaćenom surutkom u period od 20 dana
čuvanja na temperature od 4C. Broj ćelija malo varira u ispitivanom period. S
obzirom da su varijacije u broju ćelija od 0,02 do 0,06 logN/ml mogu se smatrati
eksperimentalnom greškom.
Slika 7. Broj bakterijskih ćelija u sojinom mleku (SM) i sojinom mleku obogaćenom
surutkom (SMS) na MRS podlozi u toku perioda čuvanja
38
Zaključci:
Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:
Sojino mleko je dobar supstrat za rast probiotske starter kulture ABY-6.
Količina inokuluma ne utiče značajno na pH vrednost sojinog mleka nakon 4,5
sata fermentacije kao ni na broj ćelija određenih na M17 podlozi. Broj ćelija
na MRS podlozi je veći sa povećanjem količine inokuluma.
Broj ćelija streptokoka je veći nakon 4,5 sata fermentacije u odnosu na broj
dobijenih bakterijskih ćelija na MRS podlozi.
Dodavanje surutke u sojino mleko ne utiče značajno na pH vrednost
fermentisanog sojinog mleka, kao ni na broj bakterijskih ćelija na M17 i MRS
podlozi.
Fermentisano sojino mleko i sojino mleko sa dodatkom surutke imaju stabilne
vrednosti pH i broja ćelija u periodu od 20 dana čuvanja na 4C.
39
Literatura
Axelsson, L., 1998: Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In
Lactic Acid Bacteria - Microbiology and Functional Aspecta. - Marcel Dekker,
USA: 1 - 72.
Arzu K., Ihsan Z., 2014: Influence of inulin and demineralised whey powder
addition on the organic acid profiles of probiotic yoghurts. - International
Journal of Dairy Technology, 67.
Božanić R. et al., 2000: Senzorska svojstva i prihvatljivost jogurta i
aromatiziranog jogurta proizvedenog od kozjeg i kravljeg mlijeka. -
Mljekarstvo 50: 199-208.
Božanić R. et al., 2011: Optimising Fermentation of Soymilk with Probiotic
Bacteria Czech J. - Food Sci., 29: 51–56.
Božanić R. et al., 2008: Influence of temperature and glucose addition on
growth and survival of BCT culture in soymilk. - Mljekarstvo, 58: 171–179.
Brandon U. Hansen, 2004: Health Benefits of a Soy Milk Switch. – OmniNerd
http://www.omninerd.com/articles/Health_Benefits_of_a_Soy_Milk_Switch
Bulatović M. Lj. et al., 2014: Quality attributes of a fermented whey-based
beverage enriched with milk and a probiotic strain. - RSC Adv., 4: 55503–
55510.
Chengcheng L. et al., 2014: Microbiological, physicochemical and
rheological properties of fermented soymilk produced with exopolysaccharide
(EPS) producing lactic acid bacteria strains. - LWT - Food Science and
Technology, 57: 477 – 485.
Chiang, S. Pan, T., 2012: Beneficial effects of Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei NTU 101 and its fermented products. - Applied Microbiology and
Biotechnology, 93: 903 - 916.
Cho, S.S., Finocchiaro, T., 2009: Handbook of Prebiotics and Probiotics
Ingredients: Health Benefits and Food Applications. - CRC press, USA.
Chou, C., Hou, J., 2000: Growth of bifidobacteria in soymilk and their
survival in the fermented soymilk drink during storage. - International Journal
of Food Microbiology, 56: 113 - 121.
Duraković, K., 2009: Primena kombuhe u tehnologiji funkcionalnih
fermentisanih mlečnih proizvoda. - Časopis saveza hemičara i tehnologa 20:
65-70.
Enders, J. G., 2001: Soy Protein Products: Characteristics, Nutritional Aspects,
and Utilization. - CRC press, USA.
Glišić, Z., 2006: Proizvodnja sira na tradicionalan način. - Kairos, Sremski
Karlovci.
Harrington. D.J., Chanter, N., 2002:The molecular basis of Streptococcus equi
infection and disease. - Microbes and Infection 4: 501-510.
Huffnagle, G.B., 2008: The Probiotics Revolution: The Definitive Guide to
Safe, Natural Health Solutions Using Probiotic and Prebiotic Foods and
Supplements. - Batman Dell, New York.
Katz. S.E., 2012: The Art of Fermentation: An In - Depth Exploration of
Essential Concepts and Processes from Around the World. - Foreword,
London.
Lahtinen, S. et al, 2011: Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional
Aspects. - CRS press, USA.
40
Lin, F. et al, 2004: Fermentation of a milkesoymilk and Lycium chinense
Miller mixture using a new isolate of Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei NTU101 and Bifidobacterium longum. - Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, 31: 559 - 564.
Maćej, O., Marković D., 2008: Tehničko - tehnološki priručnik za mlekarstvo.
- Poljoprivredni fakultet, Zemun.
Makinen, K., 2012: Science and technology for the mastership of probiotic
applications.- Journal of biotechnology 162: 356-365.
Marković, D., 2003: Priručnik za mlekarstvo. - AD „Imlek“, Beograd.
Martinović, A. et al, 2006: Biotechnology in Animal Husbandry. - Institute for
Animal Husbandry, Belgrade.
Martirosyan, M.D., 2011: Functional Foods and Chronic Diseases: Science
and Practice. - Food Science Publisher, Texas, USA.
McCloud, T., 1992: Natto: A Breakfast Dish That's An Acquired Taste. -
Daily press.
http://articles.dailypress.com/1992-12-07/news/9212070016_1_natto-soybeans-
vinegar-flavored
Miletić, I. et al., 2009: Specijalne formulacije mleka za osobe sa posebnim
nutritivnim potrebama. - Farmaceutski fakultet, Institut za bromatologiju,
Beograd
Nenadić, N., 1982: Soja- Gajenje i upotreba. - Mala poljoprivredna biblioteka,
Beograd.
Otles, S., 2013: Probiotics and Prebiotics in Food, Nutrition and Health. -
CRC press, USA.
Pessione, E., 2014: Interactive Probiotics.- CRC press, USA.
Puđa, P., 2009: Tehnologija mleka i sirarstvo - Opšti deo. - Graph Style, Novi
Sad.
Rakin M. B., et al., 2015: Kvalitet fermentisanog napitka od surutke i mleka. -
Hemijska industrija
Riaz, M.N., 2005: Soy Applications in Food. - CRC press, USA.
Saad, N. et al, 2013: An overview of the last advances in probiotic and
prebiotic field. - LWT - Food Science and Technology 50: 1-16.
Silva, J.P.S., Freitas, A. C., 2014: Probiotic Bacteria: Fundamentals, Therapy,
and Technological Aspects. - CRC press, USA.
Schiffin, E.J., 2014: Intestinal Microbiota in Health and Disease: Modern
Concepts. - CRC press, USA.
Shurtleff, W., Aoyagi,A., 2011: History of Fermented Black Soybeans (165
B.C. to 2011). - Lafayette, California.
Stijepić M. et al., 2013: Physicochemical characteristics of soy probiotic
yoghurt with inulin additon during the refrigerated storage. - Romanian
Biotechnological Letters, 18.
Stojiljković, J., 2009: Prehrambena industrija- mleko i mlečni proizvodi. -
Časopis saveza hemičara i tehnologa 20: 130-133.
Versalovic, J., Wilson M., 2008: Therapeutic Microbiology: Probiotics and
Related Strategies. - CRC press, USA.
Vidhyalakshmi, R. et al, 2009: The Future of Probiotics. - Advances in
Biological Research 3: 96-103.
41
`Vissesanguan W. et al., 2005: Accelerated proteolysis of soy proteins during
fermentation of Thua - Nao innoculated with Bacillus subtilis. - Journal of
Food Biochemistry, 29: 349–366.
Xiaomi, T., 2006: Stand back! Stinky tofu chain stores arrive in Shenzhen. -
Shenzhen Daily.
http://paper.sznews.com/szdaily/20060602/ca2324508.htm
Zaid, A. et al, 2007: Biotehnološki rečnik za hranu i poljoprivredu. – Partenon,
Beograd