Nachweis von Drogen und Medikamenten in humaner

Glasköperflüssigkeit mittels LC-MSn

Jürgen Kempf, Christine Stronczek, Laura M. Huppertz, Volker Auwärter, Susanne Vogt

Institut für Rechtsmedizin Freiburg, Forensische Toxikologie, Albertstraße 9, 79104 Freiburg

Institut für Rechtsmedizin Forensische Toxikologie

[1] Pelander et al.: Vitreous Humor as an Alternative

Matrix for Comprehensive Drug Screening in Post-

mortem Toxicology by LC-TOF-MS, JAT 2010 34(6):

312-8

[2] Huppertz et al.: Ein automatisiertes MSn-basiertes

Screening Verfahren für die klinische und forensische

Toxikologie, Toxichem Krimtech 2013(80): 299-303

Die hier vorgestellte Screening-Methode ist ein geeignetes Verfahren zum Nachweis körperfremder Substanzen in Glaskörperflüssigkeit.

Abgesehen von den bekannten physiologischen Limitierungen dieser Matrix sind die erhaltenen Nachweisgrenzen für die Bearbeitung

forensischer Fälle ausreichend niedrig. Die Methode stellt durch die im Vergleich zu Organmaterial einfachere Proben-Handhabung in

Kombination mit der schnellen LC-MSn-Analyse und der automatischen Datenauswertung des Toxtypers eine zeit- und kostensparende

Screening-Alternative für post-mortale Fälle, in denen kein Urin und/oder nur eine geringe Menge Blut asserviert werden konnte, dar.

Humane Glaskörperflüssigkeit kann nicht im Rahmen kontrollierter Studien asserviert werden. Die Analyse dotierter Glaskörperflüssigkeit

von Rindern zur Bestimmung der Nachweisgrenzen weiterer Substanzen bzw. der systematische Vergleich von Urin-, Blut- und

Glaskörperbefunden in realen Fällen ist daher die einzige praktikable Alternative, die Möglichkeiten und Grenzen dieses neuen Screening-

Ansatzes zu bestimmen.

Die allgemeine Suchanalyse ist ein entscheidender Teil der systematischen toxikologischen Analyse (STA) bei der Untersuchung von post-mortem Fällen. Die Probenmaterialien der Wahl sind hierfür Urin

und/oder Blut. Die im Rahmen der Obduktion asservierbare Probenmenge ist in einigen Fällen jedoch sehr begrenzt. In diesen Fällen kann die Analyse von Organmaterial wie z.B. Leber eine adäquate

jedoch sehr arbeitsintensive Alternative sein. Glaskörperflüssigkeit hingegen ist eine einfach asservierbare, in der Regel nur in geringem Maße von Fäulnisprozessen beeinflusste Körperflüssigkeit und daher

eine clevere Alternative falls kein bzw. nur wenig Urin und Blut asserviert werden können. Auf Grund der Blut-Retina-Schranke ist die Interpretation quantitativer Werte in der Glaskörperflüssigkeit sehr

schwierig, für qualitative Analysen stellt sie jedoch eine gute Alternative dar. Geht es um den Nachweis körperfremder Substanzen in Körperflüssigkeiten hat sich die Flüssigkeitschromatographie-

Massenspektrometrie (LC-MS) als Methode der Wahl für eine große Zahl analytischer Fragestellungen etabliert. Zur Erweiterung der Anwendbarkeit bei post-mortalen Fragestellungen wurde ein bereits

entwickeltes LC-MSn Screening-Verfahren zum Nachweis von Drogen- und Medikamentenwirkstoffen für die Analyse von Glaskörperflüssigkeit evaluiert.

Probenaufarbeitung[1] (zwei-stufige SPE)

1 ml bovine

Glaskörperflüssigkeit

1 ml humane

Glaskörperflüssigkeit

Coc

aine

Am

phet

amin

e+

57 Analyten

(je 3 Konzentrationen)

Eluieren I:

3 ml Hexan /

Ethylacetat (75/25)

Eluieren II:

3 ml Ethylacetat /

Ammoniak (98/2)

Isolute®

HCX-5

Waschen Waschen

Beladen:

1 ml Probe

+ 2 ml Puffer

+ Dx

IS

Lösen des Rückstandes

in 25 µl Fließmittel

ToxtyperTM Screening[2]

- Screening Methode (wechselnde Polarität)

- UltraScan 70-800 Da (32.000 Da/s)

- Data Dependend Acquisiton

FM A: 0.1 % HCOOH + 2 mM Ammoniumformiat

FM B: Acetonitril + 2 mM Ammoniumformiat

Säule: Acclaim® RSLC 120 C18 2,2 µm 120A 2.1x100 mm

Quelle: ESI

amaZ

onsp

eed

B R U K E R

amaZ

onsp

eed

B R U K E R

Trap Trapinski

LM BLM A

POWER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Pump

0.5 354 bar

D

mlmin

. . . .

POWER

VACUUM

STATUS

D

UltiMate 3000

POW ER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Autosampler

R-A1 2.00 ul

D

. . . .

!

POWERCONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Column Compartment

40 C -

D

. . . .

LM BLM BLM ALM A

POWER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Pump

0.5 354 bar

D

mlmin

. . . .

POWER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Pump

0.5 354 bar

D

mlmin

. . . .

POWER

VACUUM

STATUS

D

UltiMate 3000POWER

VACUUM

STATUS

D

UltiMate 3000

POW ER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Autosampler

R-A1 2.00 ul

D

. . . .

!

POW ER

CONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Autosampler

R-A1 2.00 ul

D

. . . .

!

POWERCONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Column Compartment

40 C -

D

. . . .

POWERCONNECTED

STATUS

UltiMate 3000 RS Column Compartment

40 C -

D

. . . .

Serum

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3

03901

2016-04

Serum

Serum

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3

03901

2016-04

Blut / Urin / Mageninhalt

GC-MS LC-MS/MSIA

Routine post-mortem

Toxikologie

Abdampfen

GS

12

3-13

Vitr

eou

s

GS

12

3-13

Vitr

eou

s

5,0 ng/ml:

10 ng/ml:

25 ng/ml: Amphetamin, Fluoxetin, Fluvoxamin,

Risperidon, Sotalol, Tramadol

12,5 ng/ml: 6-Monoacetylmorphin, Atenolol, Clozapin,

Diltiazem, MDEA, MDMA, Midazolam, Morphin,

Nortriptylin, Oxycodon

50 ng/ml: Carvedilol, Chloroquin, Citalopram, Doxepin,

Paroxetin, Verapamil, Zopiclon

150 ng/ml: BE, Dixyrazin, Olanzapin, Phenytoin, Sildenafil

Buprenorphin, Carbamazepin, Cocain, Diazepam,

Melperon, Methadon, Metoprolol, Phenazon,

Propranolol, Venlafaxin, Zolpidem

Acebutolol, Amitriptylin, Bisoprolol, Codein,

Fentanyl, Flunitrazepam , Methamphetamin,

Mianserin, Mirtazapin, Moclobemid,

Phencyclidin, Trimipramin, Sulpirid, Warfarin

Nachweisgrenzen

Bestimmung der Nachweisgrenzen in

Glaskörperflüssigkeit von RindernRealproben

Insgesamt wurden 57 Substanzen, gruppiert in 6

Gemische, in jeweils niedriger, mittlerer und hoher

Konzentration gemessen. Die mittleren

Konzentrationen wurden an Glaskörper-

Konzentrationen aus der Literatur bzw. den Cut-

Offs einer bereits etablierten Screening-Methode

angepasst[1].

Ca. 94 % der dotierten Substanzen konnten in allen

drei untersuchten Konzentrationen detektiert und

korrekt identifiziert werden. Mirtazapin konnte

nur in mittlerer (10 ng/ml) und hoher

Konzentration (20 ng/ml), Tramadol und Olanzapin

lediglich in hoher Konzentration (25 bzw.

150 ng/ml) nachgewiesen werden. LSD war die

einzige Substanz, die - vermutlich auf Grund ihrer

Lichtempfindlichkeit - nicht nachgewiesen werden

konnte.

Die niedrigste Konzentration, die bei

Doppelbestimmung noch korrekt identifiziert

werden konnte, wurde als Nachweisgrenze

definiert. In einigen Fällen konnte die Aufnahme einer Substanz weder

durch Analyse der zugehörigen Köperflüssigkeiten noch

anhand der Fallgeschichte bestätigt werden:

In Fall c3 verstarb ein 21-jähriger einen Tag nach einem

Herzanfall im Krankenhaus. Dies könnte den Nachweis des

Antiarrhythmikums Flecainid im Glaskörper erklären, es

ergaben sich jedoch keine weiteren Hinweise für die

Aufnahme des PDE-5-Hemmers Sildenafil.

Im Fall c12 konnte neben weiteren Wirkstoffen zusätzlich

Zopiclon in der Glaskörperflüssigkeit nachgewiesen werden.

Laut der Polizeiunterlagen befand sich der Verstorbene in

Behandlung bzw. unter Selbst-Medikation mit

verschiedensten Schmerzmitteln.

Zur endgültigen Methoden-Evaluierung ist eine quantitative

Bestätigungsanalyse mittels LC-MS/MS, zumindest für die

am häufigsten in Glaskörperflüssigkeit nachgewiesenen

Wirkstoffe, erforderlich.

c10

Diazepam Diazepam

Nordazepam Nordazepam

Temazepam Temazepam

Sertralin Sertralin

Lorazepam Lorazepam

Oxazepam

Buprenorphin + M.

THC + M.

c11

Citalopram Citalopram

Methadon + EDDP Methadon + EDDP

THC-Metaboliten

GHB (endogen)

c15

Trimipramin Trimipramin + M.

Zopiclon Zopiclon

Quetiapin Quetiapin + M.

7-Amiflunitrazepam Flunitrazepam + M.

Oxazepam Oxazepam

Olanzapine Olanzapin

Desmethylvenlafaxin Venlafaxin + M.

Promethazin

Die Probe c15 zeigt, dass auch die

Aufnahme mehrerer Wirkstoffe

problemlos nachgewiesen werden

kann. Promethazin war hier die einzige

Substanz, die in der Glaskörper-

flüssigkeit nicht nachgewiesen werden

konnte. Die Konzentration im Femoral-

Blut lag jedoch zum Zeitpunkt des Todes

unter 10 ng/ml.

Obwohl Norbuprenorphin und THC-

Carbonsäure bei einigen der Fälle in der

Glaskörperflüssigkeit nachgewiesen

werden konnten, scheint zum Nachweis

von niedrig dosierten Wirkstoffen, wie

z.B. Buprenorphin (cSerum < 0,8 ng/ml in

Fall c10) und einiger anderer

Substanzen wie z.B. THC und GHB, eine

gezielte LC-MS Analyse notwendig.

Die Ergebnisse von Realfällen deckten sich weitgehend mit denen der routinemäßig

durchgeführten forensisch-toxikologischen Untersuchungen. Bei 24 Obduktionsfällen

(c1 - c24) konnten 76 % der von den Verstorbenen aufgenommenen Wirkstoffe in der

Glaskörperflüssigkeit nachgewiesen werden. Die nahezu ubiquitär vorkommenden

Substanzen Coffein, Nicotin und deren Metaboliten sowie Alkohol und dessen

Metabolit Ethylglucuronid wurden nicht in diese Auswertung mit eingeschlossen. In

sechs Fällen deckten sich die Screening-Ergebnisse in der Glaskörperflüssigkeit

komplett mit den Befunden der Routine-Toxikologie.

In den Fällen c2, c6 und c24 waren Paracetamol und/oder Ibuprofen die einzigen

Wirkstoffe, die nicht in der Glaskörperflüssigkeit detektiert werden konnten. Es ist

jedoch bekannt, dass Substanzen mit hoher Polarität (z.B. Paracetamol oder

Oxazepam) und/oder einer hohen Plasmaprotein-Bindungsrate (z.B. Ibuprofen) die

Blut-Retina-Schranke nur schlecht passieren und daher durch ein allgemeines

Screening nicht zwingend erfasst werden.

Olanzapin war die einzige aufgenommene Substanz, die in den Fällen c9 und c22

nicht in der Glaskörperflüssigkeit nachgewiesen werden konnte. Die Serum-

Konzentration (Femoralblut) lag in diesen Fällen bei 94 bzw. 190 ng/ml. Der Fall c15

zeigt jedoch, dass Olanzapin in der Glaskörperflüssigkeit grundsätzlich nachweisbar

ist, obwohl es in diesem Fall lediglich in Urin und Mageninhalt des Verstorbenen

nachgewiesen werden konnte.

75/01

SARSTEDT

GS 1

23

-1

3u

rin

e

75/01

SARSTEDT

GS 1

23

-1

3st

om

ach

Forensisches

Gutachten

Seru

m

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3039

01 2016- 04

Seru

m

Seru

m

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3039

01 2016- 04

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Seru

m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Seru

mSe

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

Seru

m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Seru

mSe

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Seru

m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Seru

mSe

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9 ml

-

7 -

-

5 -

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Se

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-

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-

5 -

-

LOT 3

03901 2

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rum

Se

rum

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-

7 -

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-

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Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

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m

9 ml

-

7 -

-

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-

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3901 20

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Seru

mSe

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

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m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

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Seru

mSe

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

Seru

m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

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mSe

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

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16-04

Seru

m

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

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mSe

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-

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-

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LOT 30

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-

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LOT 3

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Se

rum

Se

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9 ml

-

7 -

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-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

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-

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-

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-

LOT 3

03901 2

016-04

Se

rum

Se

rum

9 ml

-

7 -

-

5 -

-

LOT 3

03901 2

016-04

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m

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-

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-

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-

LOT 30

3901 20

16-04

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mSe

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-

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LOT 30

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Seru

m

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-

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-

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3901 20

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mSe

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-

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-

5 -

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LOT 30

3901 20

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Seru

m

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-

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-

LOT 30

3901 20

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Seru

mSe

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-

7 -

-

5 -

-

LOT 30

3901 20

16-04

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

c1

c2

c3

c4

c5

c6

c7

c8

c9

c10

c11

c12

c13

c14

c15

c16

c17

c18

c19

c20

c21

c22

c23

c24

Anzahl gefundener Wirkstoffe

Ob

du

kti

on

sfä

lle

(n

= 2

4)

Glaskörperflüssigkeit

Routine Toxikologie

Ser um

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3039

01 2016- 04

Ser um

Ser um

9 ml-

7 --

5 --

LOT 3039

01 2016- 04

Schlussfolgerungen Referenzen

Einleitung

Ergebnisse

Experimenteller Teil