T.C.

SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

İN VİTRO ÇİNKO UYGULAMASININ DNA HASARI,

ERİTROSİT FRAJİLİTE VE LİPİT PEROKSİDASYONU

ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Tuğba DEMİRAL

Danışman

Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU

YÜKSEK LİSANS TEZİ

KİMYA ANABİLİM DALI

ISPARTA - 2018

©2018 [Tuğba DEMİRAL]

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa İÇİNDEKİLER .................................................................................................................... i ÖZET ................................................................................................................................. iii ABSTRACT ....................................................................................................................... iv TEŞEKKÜR ........................................................................................................................ v ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................. vi ÇİZELGELER DİZİNİ ...................................................................................................... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ....................................................................... viii 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ .................................................................................................... 3

2.1. Çinko ....................................................................................................................... 3 2.1.1. Çinkonun kimyasal ve fiziksel özellikleri ............................................................ 4 2.1.2. Çinkonun kullanım alanları ve maruziyeti ........................................................... 5 2.1.3. Çinko maruziyeti ................................................................................................ 5

2.2. Çinko Biyokimyası ................................................................................................... 7 2.3. Çinko Elementinin Emilimi ve Metabolizması .........................................................10 2.4. Çinko Hemeostazı ...................................................................................................11 2.5. Çinkonun Hücre Ölümündeki Rolü ..........................................................................14

2.5.1. Çinkonun apoptozise etkisi ............................................................................... 14 2.6. Çinko ve Oksidatif Stres .........................................................................................16

2.6.1. Çinkonun oksidatif stress ile ilişkili kronik hastalıklardaki rolü ......................... 23 2.7. Eritrositler ve Redoks Düzenlemesi .........................................................................25

2.7.1. Eritrositlerde oksidan kaynaklar ........................................................................ 27 2.7.2. Eritrositlerdeki antioksidan sistemler................................................................. 29 2.7.3. Oksidasyon reaksiyonlarının ve redoks düzenleme bozukluklarının sebep

olduğu eritrosit hasarı ....................................................................................... 29 2.7.4. Eritrosit hemolizin biyokimyasal sonuçları ........................................................ 30

2.8. DNA Hasarını Belirlemede Kullanılan Yöntemler....................................................30 2.8.1. Comet testi (tek hücre jel elektroforezi) ............................................................. 31

3. MATERYAL ve YÖNTEM ...........................................................................................33 3.1. Deneylerde Kullanılan Cihazlar ...............................................................................33 3.2. Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler ..................................................................33 3.3. Eritrosit Membran Stabilizasyonunun Belirlenmesi ..................................................33 3.4. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu Tayini .........................................................35 3.5.Tek Hücre Jel Elektroforezi (Comet ) Tayini.............................................................36

3.5.1. Kan örneklerinin alınması ................................................................................. 36 3.5.2. Lenfosit örneklerinin hazırlanması .................................................................... 36 3.5.3. Çinko çözeltilerinin hazırlanması ve lenfositler ile muamele ............................. 36 3.5.4. Hücre sayımı..................................................................................................... 37 3.5.5. Comet tekniği ................................................................................................... 37 3.5.6. Boyama ............................................................................................................ 37 3.5.7. Değerlendirme .................................................................................................. 37 3.5.8. Comet sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi ............................................... 38

4. ARAŞTIRMA BULGULARI .........................................................................................39 4.1. Eritrosit Membran Stabilizasyonunu Bulguları .........................................................39 4.2. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu ....................................................................42 4.3. İn-Vitro Comet Bulguları .........................................................................................43

5. TARTIŞMA VE SONUÇLAR .......................................................................................45 6. ÖNERİLER....................................................................................................................53

ii

KAYNAKLAR ..................................................................................................................55 ÖZGEÇMİŞ .......................................................................................................................70

iii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

İN VİTRO ÇİNKO UYGULAMASININ DNA HASARI, ERİTROSİT

FRAJİLİTE VE LİPİT PEROKSİDASYONU ÜZERİNE ETKİLERİNİN

ARAŞTIRILMASI

Tuğba DEMİRAL

Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU

Zn2+, büyüme, hücre bölünmesi, metabolizma, yara iyileşmesi, bağışıklık, üreme, tat

ve görme fonksiyonlarının işleyişi gibi birçok fizyolojik süreç için gerekli olan iki

değerli bir geçiş iyondur. Çinko maruziyetinin insan eritrosit membranının bazı

özellikleri üzerindeki etkisi in vitro olarak çalışıldı. Ayrıca, insan periferal kan

lenfositlerinde çinkonun genotoksik potansiyelini ortaya koymak için alkali comet

analizi yapılmıştır. Bu çalışmada, değişen konsantrasyonlardaki tüm Zn2+

çözeltilerinin, doza bağımlı bir şekilde lipit oksidasyonunu inhibe etmede oldukça

zayıf bir etki göstermiştir. Eritrositlerin çinko ile inkübasyonunun ardından,

çinkonun hücrelerin hemolitik direncindeki belirgin azalmaya yol açtığını da

saptadık. Çalışmalarımız, yüksek konsantrasyonlarda çinkonun insan eritrositleri için

toksik olabileceğini ve hemolitik direncin değişmesine neden olabildiğini

göstermektedir. Comet sonuçları, kontrolle karşılaştırıldığında yüksek dozlardaki

çinko doz-bağımlı olarak istatistiksel anlamlı düzeyde DNA hasarı oluşturdu (p

<0.05). Bu çalışmanın in vitro verileri yüksek dozda çinko alımının faydadan daha

fazla zarara neden olabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: Çinko, Mebran stabilizasyonu, Genotoksisite, Lipid

peroksidasyonu

2018, 70 sayfa

iv

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF IN VITRO ZINC TREATMENT

ON DNA DAMAGE, ERYTHROCYTES OSMOTIC FRAGILITY AND LIPID

PEROXIDATION

Tuğba DEMİRAL

Süleyman Demirel University

Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Mustafa CALAPOĞLU

Zn2+is a divalent transition ion essential for many physiological processes including:

the growth and cell division, metabolism, wound healing, immunity, reproduction,

functioning of taste and eyesight. The effect of zinc exposure on some properties of

the human erythrocyte membrane was studied in vitro. In addition, the alkaline

comet assay was used to investigate genotoxicity potential of the zinc in dte

peripheral blood lymphocytes. In this study, all the various concentrations of Zn2+

solutions showed quite weak efficacy to inhibit lipid oxidation in dose dependent

manner. We also detected that incubation of erythrocytes with zinc lead to the

marked decrease of hemolytic resistance of the cells. Our studies demonstrate that

zinc at higher concentrations may be toxic to human erythrocytes causing changes in

the hemolytic resistance. The comet results indicated a significant DNA damage at

higher doses after treatment with zinc when compared to controls showing a clear

dose-dependent response (p<0.05). The in vitro data of the present study suggest that

high dosage intake of zinc may cause more harm than benefit.

Keywords: Zinc, Membrane Stabilizing, Genotoxcicity, Lipid peroxidation

2018, 70 pages

v

TEŞEKKÜR

Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile

aşmamda yardımcı olan değerli Danışman Hocam Prof. Dr. Mustafa

CALAPOĞLU’na teşekkürlerimi sunarım.

Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme sonsuz sevgi ve saygılarımı

sunarım.

Tuğba DEMİRAL

ISPARTA, 2018

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 2.1. Çinko zehirlenmesi ile eksikliği etkilerinin karşılaştırılması ............ 5

Şekil 2.2. Zn homeostazisi. ............................................................................. 10

Şekil 2.3. Hücrelerdeki çinko dağılımı şeması. ................................................ 12

Şekil 2.4. Hücresel çinko homeostazı ve çinkonun sitotoksisite üzerindeki

etkisi ............................................................................................... 13

Şekil 2.5. Çinkonun antioksidan mekanizmalardaki rolü ................................. 22

Şekil 2.6. RBC'lerde redoks regülasyonu ......................................................... 27

Şekil 2.7. Comet Metodunun Genel Basamakları ............................................ 32

Şekil 3.1. Tuz konsantrasyonundaki azalma ile oluşan tipik eritrosit hemoliz

eğrisi ............................................................................................... 35

Şekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin

zamana göre H50 değerleri ............................................................... 41

Şekil 4.2 Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin

zamana göre dX değerleri ................................................................ 42

Şekil 4.3. Çinkonun H2O2 aracılıklı lipid oksidasyonu üzerine etkisi ............... 43

Şekil 4.4. Farklı konsantrasyonlarda çinko’ya maruz kalan lenfosit

hücrelerinden elde edilen % kuyruk DNA kometi hata çubuk grafiği 44

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa

Çizelge 2.1. Çinkonun fonksiyonlarına örnekler .............................................. 9

Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinkonun zamana göre insan eritrosit

membranının osmotik stabilitesi üzerine etkisi. ............................ 40

Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele edilen insan

lenfositlerinin comet verileri ........................................................ 44

Çizelge 5.1. Plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve

açlık durumuna göre cutoff değerleri. .......................................... 49

Çizelge 5.2. Olası, yeni geliştirilen ve yararlı olmayan çinkonun biyolojik

belirteçleri. .................................................................................. 52

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

AE Akrodermatisis entropatika

ASC Askorbik asit

CRP C-reaktif protein

GI Gastrointestinal

GPx Glutatyon peroksidaz

Hb Hemoglobin

MT Metallotiyoin

MTF Metal transkripsiyon faktör

NMDAR N-metil-D-aspartat reseptör

PBS Fosfor tamponlu tuz çözeltisi

PÇK Plazma çinko konsantrasyonu

PRx Peroksiredoksin

ROS Reaktif oksijen türleri

SOD Süperoksit dismutaz

T Tiyonin

TBA Tiyobarbütirik asit

TBS Trisin tamponlu tuz çözeltisi

1

1. GİRİŞ

Çinko insan metabolizmasında çeşitli enzimler aracılığı ile yaşam için normal

büyüme ve gelişmede çok önemli rol oynar. Hücre büyümesi, bölünme ve

farklılaşmasında yeralan çinkonun özellikle bebeklik, çocukluk, adelosan ve

hamilelik gibi hücre üretiminin arttığı hızlı büyüme dönemlerinde çok önemli olduğu

gösterilmiştir. Gebelikte yeterli miktarda çinko, bakır değerleri gebeliğin normal

seyrinde, komplikasyonsuz bir doğum ile anne ve bebek sağlığı için önem

taşımaktadır.

Çinko insan sağlığı için kritik olan bir elementtir ve çok az eksikliğinde dahi birçok

hastalık ortaya çıkar. Çinko eksikliği anoreksi, iştah kaybı, tat ve koku kaybı gibi

birçok semptoma yanı sıra immün sistemi etkileyebilmekte, aterosiklorozu

tetikleyebilmekte ve anemi oluşturabilmektedir. Çinko eksikliği fitomitojenlere T-

lenfosit cevabında azalma, T hücre sayısında azalma ve trombosit kümelenmesindeki

kusura bağlı olarak baskılanmış hemostasis oluşumuna yol açar. Çinko yegâne doğal

olarak oluşan lenfositik mitojendir (Keen ve Gershwin, 1990; Tapiero ve Tew,

2003). Çinko eksikliği ayrıca gastrointestinal bozukluklara, böbrek hastalığına, orak

hücre anemisine, alkolizme, bazı kanser tiplerine, yaşlanmaya da eşlik etmektedir

(Keen ve Gershwin, 1990)

Çinko bütün canlı organizmalarda birçok fizyolojik olaylar için gerekli olan halk

sağlığı ve klinik anlamlılığı açısından önemli olan bir esansiyel eser elementtir.

Çinko desteği için son yıllarda yapılan geniş çaplı randomize kontrollü çalışmalar,

popülasyonlarda çinko eksikliğinin yaygın olduğunu ve bu duruma bağlı olarak

oluşan halk sağlığı sorununun çözümünde çinko desteğinin önemli olduğunu

göstermektedir. Beslenme açısından esansiyel elementlerin alım aralıkları, alımın

çok düşük (eksiklik) veya çok yüksek (toksisite) olduğu durumlarda ortaya çıkan

sağlık üzerine olumsuz etkileri genellikle basit bir model çerçevesinde

tartışılmaktadır. Bir çok yerleşim birimlerini, popülasyonları ve araştırma

dizaynlarını içeren çalışmaların ortaya koyduğu genel konsensüs, diyare, pnömoni ve

büyüme bozukluğu görülen hastalara uygulanan çinko desteğinin olumlu tepkiler ile

ilişkili olduğudur. Ayrıca bu durum, sağlık masraflarının karşılanmasında bireysel

veya toplumsal olarak fon eksikliği ile karakterize edilen sağlık sistemlerinin geçerli

2

olduğu toplumlarda hafif ila orta şiddette çinko eksikliğinin nispeten yaygın olduğu

sonucuna yönelik temel kanıtlar ortaya koymaktadır.

Tahmini olarak ABD'de nüfusunun % 15'i çinkoyu diyet takviyesi olarak

kullanmaktadır (Briefel vd., 2000). Karışık bir diyetle beslenen sağlıklı yetişkinlerde

çinko dengesi oluşabilmekte veya günlük 11 mg çinko alımıyla da pozitif çinko

dengesi sağlanmaktadır. Çinko, et, bazı sebzeler (fasulye ve nohut) ve fıstık gibi

gıdalarda bulunur. Çoklu vitamin formüllerine eklenmesiyle, çinko alınımı tavsiye

edilen günlük alınım değerlerinin birkaç katına kadar ulaşabilmektedir. Ayrıca,

alternatif dergilerde ve kitaplarda tanıtılan sağlık yararları nedeniyle yüksek

miktarlarda ilave çinko tüketilebilmektedir. Bununla birlikte, kronik yüksek doz

çinkonun insan sağlığı üzerinde ne gibi etkileri olduğu açık değildir.

Çinko ve diğer metallerin biyolojisi, insan hastalıklarıyla ilişkilidir. Örneğin, metal

taşıyıcıları kodlayan genlerdeki genetik defektler, metal eksikliğine veya fazlalığına

yol açarak hastalıklara neden olabilmektedir (Clayton, 2017). Buna ek olarak,

kontamine olmuş içme suyunun tüketilmesinden sonra veya mesleki maruziyet

yoluyla ortaya çıkabilecek yüksek seviyeli metallerin birikmesi insan gelişimini

olumsuz yönde etkileyebilmekte ve hastalığa neden olabilmektedir.

Günümüzde çinko preparatları çeşitli hastalıklar için terapötik ajan olarak

kullanımının yanı sıra besin desteği olarak ta yoğun tıbbi kullanıma sahip olduğu

bilinen bir gerçektir. Ayrıca çinko preparatlarının kullanımı herhangi bir klinik

değerlendirme yapılmadan özellikle de çocuklarda besin desteği olarak da

kullanılabilmektedir. Çalışmamızda çinko kullanımının in-vitro genotoksik, oksidatif

ve eritrosit membran stabilizasyonu üzerine etkileri hücresel seviyede

değerlendirilerek, gereksiz çinko veya aşırı çinko kullanımının toplum sağlığı

üzerine etkilerini belirleme amacıyla düşük veya yüksek çinko alınımına bağlı olarak

ortaya çıkabilecek patolojik durumların araştırılmasının yanı sıra çinko ile ilgili

oluşabilecek olumsuzlukları tanımlama ve maruziyet ile sonuç arasındaki ilişkiyi

ortaya koyulması hedeflemektedir.

3

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1. Çinko

Mineraller yer kabuğunda doğal olarak oluşan inorganik maddelerdir. Çoğu

mineraller sağlığın sürdürülmesi, hayatın devamı ve çeşitli biyolojik fonksiyonlar

için gereklidirler ve “esansiyel besinler” olarak adlandırılırlar.

Çinko sağlıklı bir yaşam için duyulan mineral miktarına göre iki gruba

ayrılmaktadırlar.

1. Makro mineraller: Sodyum (Na), kalsiyum (Ca), potasyum (K), klor (Cl),

fosfor (P), mağnezyum (Mg) ve kükürt (S) gibi yüksek miktarlarda (>100

mg/gün) ihtiyaç duyulan minerallerdir.

2. Mikro mineraller veya iz elemnetler: Demir (Fe), çinko (Zn), bakır (Cu),

selenyum (Se), molibden (Mo), krom (Cr), brom (Br), flor (F) ve kobalt (Co)

gibi düşük miktarlarda (< 100 mg/gün) ihtiyaç duyulan minerallerdir (Van

Schoor, 2008).

Mikro mineraller gurubuna dahil olan çinko elementi organizmaların tüm

organlarında, dokularında ve vücut sıvılarında yer almaktadır. Çinko canlılardaki

proteinlerin yapısına girmesinin yanı sıra enzimlerin aktif bölgelerine bağlanarak,

enzim katalizinde anahtar rol oynar. Çinko ayrıca intraselüler bir düzenleyici olup,

moleküler etkileşimlerde proteinler için yapısal destek sağlar. Biyolojik

membranların ve iyon kanallarının stabilitesini ve bütünlüğünü korur. Nükleik asit

veya diğer gen düzenleyici proteinlerde yapısal element olarak rol oynar. Redoks

aktivitesinin olmaması nedeniyle bağlandığı proteini dayanıklı hale getirir.

Karbonhidrat, protein, lipid, nükleik asit, hem sentezi, gen ekspresyonu, üreme ve

embriyogeneziste de görevleri vardır (Arcasoy, 2002; Rostan vd., 2002).

Perreira ve Parise (1993), ısı pompalarında kullanılan pistonlu kompresörlerde

kapasite kontrolü üzerine bir araştırma yapmışlardır. İnceledikleri sistem, açık tip

birpistonlu kompresör, su soğutmalı kondanser, su soğutmalı evaporatör ve genleşme

4

valfinden oluşmaktadır. Evaporatörün sabit aşırı kızdırma sıcaklığında ve sabit

basınçta çalıştığı kabul edilmiştir. Sistemde R12 soğutucu akışkanı kullanılarak beş

farklı kontrol yöntemini incelemişlerdir. Bu kontrol yöntemleri, değişken hız,

değişken hacim, basma gazının by-pass edilmesi, emiş gazının kısılması ve emiş

valfinin kapatılmasıdır. Yaptıkları simülasyonda, değişken hız ile değişken hacim

değerleri için kompresör verileri kullanılmıştır. Diğer parametreler için matematiksel

model oluşturulmuştur. Beş farklı sistem parametresinin karşılaştırılabilmesi için

ısıtma performans katsayısı ve kompresör basma sıcaklığı değerleri tespit edilmiştir.

Model sonuçlarına göre kapasite kontrolü için en iyi sonuçları değişken hız ve

değişken hacim kontrol mekanizmaları vermiştir. Değişken hızlı kapasite

kontrolünde, soğutucu akışkan debisi arttıkça volümetrik verim düşmüş, güç tüketimi

ile basma sıcaklığı artmıştır. Diğer bir sonuca göre, kondanser suyu çıkış sıcaklığı

kompresör hızıyla beraber artmıştır.

2.1.1. Çinkonun kimyasal ve fiziksel özellikleri

Çinko periyodik çizelgenin geçiş elementlerinin II B grubunda yer alan bir

elementtir. Çinkonun atom numarası 30, atom ağırlığı ise 65,39’dur. Çinko ilk kez

1746 yılında kimyacı S. Margraaf tarafından kömür ve kalaminin ısıtılması ile izole

edilmiştir. Canlılarda çinkonun önemini ilk olarak 1869 yılında Raulin ortaya

atmıştır (Özçelik, 1998).

Çinko iki elektronunu kaybetme eğiliminden dolayı +2 değerlikli katyon olarak sulu

çözeltilerinde değişen çözünürlükte tuzlar oluşturmaktadır. Çinko azot, sülfür ve

oksijen gibi elektronegatif ligandlar ile nispeten kararlı koordine bağlar yapmaktadır.

Çinko sulu alkali ortamda [Zn(OH)4]-2 gibi zinkatları oluşturmaktadır.

Farklı çinko bileşiklerinin çözünürlükleri birbirinden farklıklılar göstermektedir.

Örneğin çinko klorürün (ZnCl2) 25°C’de sudaki çözünürlüğü 432g/100mL olmasına

rağmen çinko oksidin (ZnO) 29°C’deki çözünürlüğü ise 0,00016 g/100 mL’dir

(Walsh vd., 1994). Çinko doğada asla serbest olarak bulunmaz. Mineral zinkitte ZnO

olarak, hemimorfitte çinko silikat (Zn2SiO4) olarak, simitsonit mineralinde çinko

karbonat (ZnCO3)olarak, fraklinit mineralinde karışık ZnO ve Fe2O3 (demir oksit)

olarak ve sfalerit mineralinde ise çinko sülfür (ZnS) olarak bulunmaktadır.

5

2.1.2. Çinkonun kullanım alanları ve maruziyeti

Çinkonun en önemli uygulaması galvanizasyondur. Çinko kaplama, daha çok çelik

malzemelere uygulanmakta ve çinko ile galvanizlenen malzemenin korozyona karşı

dayanımını ve ömrünü artırmaktadır. Çinkonun diğer kullanımları ise çeşitli

alaşımlar-özellikle pirinç-motor ekipmanları, elektrikli ev aletleri, yapı malzemeleri,

farmasötikler, tıbbi cihazlar, kozmetik, boya pigmentlerinin üretimi, tıpda antisptik

merhem olarak, elektroluminesansın yer aldığı uygulamalarda, fotokonduktivitede ve

diğer elektronik uygulamaları içermektedir.

Çinko metali tüm canlı organizmalar için vazgeçilmezdir. Çinko hücrelerin yapısal

ve fonksiyonel bütünlüğünün sağlanmasında kritik rol oynayan esansiyel bir besindir

(Arcasoy, 2002).

2.1.3. Çinko maruziyeti

İnsan vücuduna çinko girişi teneffüs, deri ve sindirim olmak üzere üç ana yoldan

oluşur. (ATSDR, 2005). Her maruz kalma türü, vücudun belirli bölümlerini

etkilemektedir (Şekil 2.1.).

Şekil 2.1. Çinko zehirlenmesi ile eksikliği arasındaki etkilerin karşılaştırılması. Aşırı çinkoya maruz

kalma veya aşırı çinko alınımı (sol taraf) sonucu oluşan intoksikasyonunun ve yetersiz

beslenme veya tıbbi koşullarla (sağ taraf) bağlı çinko eksikliğinin farklı organ sistemlerinde

meydana getirdiği zararlı etkileri. Belirli bir organ sistemine atfedilemeyen veya birkaç

organın etkilenmesi, sistemik semptomlar olarak sınıflandırılmıştır (Plum vd., 2010).

6

2.1.3.1. Teneffüs yolu ile maruziyet

Çinko içeren dumanın teneffüs edilmesi genellikle galvanizleme gibi endüstriyel

işlemlerden kaynaklanmakta olup başta üretim işçilerini etkilemektedir. Askeri

duman bombaları çinko oksit veya çinko klorür içermektedirler. Homma ve

meslektaşları çinko klorür içeren duman bombasına maruz kalan kişilerin erişkin

solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) geliştiğini rapor etmişlerdir (Homma, 1992).

Çinko içeren dumanın teneffüs edilmesi ile ilgili en yaygın bilinen etki, çoğunlukla

çinko oksitin teneffüs edilmesiyle oluşan metal duman ateşidir (MFF). Bu akut

sendrom, çoğunlukla çinko eritme veya kaynak yapma gibi mesleki durumlarda 1

μm'den küçük partikül boyutu olan taze metal dumanlarının teneffüs edilmesi ile

ortaya çıkan endüstriyel bir hastalıktır (Vogelmeier, 1987). Bu geri dönüşümlü

sendromun belirtileri genellikle akut maruziyetten birkaç saat sonra başlamaktadır ve

ateş, kas ağrısı, mide bulantısı, yorgunluk, göğüs ağrısı, öksürük ve solunum güçlüğü

görülmektedir (Rohrs, 1957). Genelde MFF hayatı tehdit edici değildir ve solunum

etkileri bir ila dört gün içinde kaybolmaktadır (Brown, 1988).

2.1.3.2 Deri yolu ile maruziyet

Çinko dermal yolla absorbe edilebilmektedir, ancak bu konuda yapılan çalışmaların

sayısı sınırlıdır ve mekanizma hala açıklığa kavuşturulamamıştır. Agren ve

arkadaşları cildin pH'sının, uygulanan çinko miktarının ve kimyasal

spesifikasyonunun çinko emilimini etkilediğine dikkat çekmişlerdir (Agren, 1999;

Agren vd., 1991).

Yüzde yirmibeşlik çinko oksit yamasının (2.9 mg / cm2) 48 saat boyunca insan

derisine yerleştirildiği bir çalışmada, dermal tahriş olduğuna dair herhangi bir kanıt

bulunmamaktadır (Agren, 1999). Farelerde, tavşanlarda ve gine domuzlarında farklı

çinko bileşiklerinin dermal etkisini karşılaştıran başka bir çalışmada, çinko klorür’ün

en fazla tahriş edici olduğu ve ardından orta derecede çinko asetat ve çinko sülfata

ise en düşük tahrişe neden olmuştur. Çinko oksit ise herhangi bir tahriş edici etki

göstermemiştir (Landsdown, 1991).

7

2.1.3.3. Oral maruziyet

Çinko, esansiyel bir iz element olarak doğası gereği, düşük miktarlarda çinkonun oral

alımı, hayatta kalmak için şarttır. Çinko için önerilen günlük alım miktarı (RDA)

erkekler için 11 mg/gün ve kadınlar için 8 mg/gün'dür (Trumbo vd., 2001). Daha

düşük ortalama vücut ağırlıkları nedeniyle bebekler için 2-3 mg / gün ve çocuklar

için ise 5-9 mg/gün çinko alımı önerilmektedir (Trumbo vd., 2001). RDA değerleri,

sıçanlarda ve farelerde yapılan eşdeğer çalışmaların karşılaştırılması ile insanlar için

tahmini olarak belirlenen 27 g çinko/gün LD50 değerinin önemli ölçüde altındadır

(ATSDR, 2005). Genel olarak, bu kadar yüksek miktarda Zn alımı pek mümkün

değildir, çünkü yaklaşık 225-400 mg çinko, emetik doz olarak saptanmıştır (Brown

vd., 1964). Oral yolla 28 g çinko sülfat bir kadın hastada alımın hemen ardından

kusma, taşikardi hiperglisemi gelişdiği ve alımdan 5 gün sonra hemorajik pankreatit

ve böbrek yetmezliği nedeniyle de öldüğü rapor edilmiştir (Fox, 1989).

Gastrointestinal sistem, vücutta dağıtılmadan önce doğrudan tüketilen çinkodan

etkilenmektedir. Bu nedenle çinkonun oral alınımı sonrasında çoklu gastrointestinal

semptomlar ortaya çıkabilmektedir. Galvanizlenmiş kaplarda depolanan yiyecek

veya içecek tüketilmesine bağlı olarak yüksek miktarda çinko alınımı. Yutma,

yiyecek veya içeceklerin orta derecede asitli doğasından kaynaklanır ve galvaniz

kaplamadan yeterli miktarda çinko çıkartılabilir. Ortaya çıkan belirtiler mide

bulantısı ve kusma, epigastrik ağrı, abdominal kramplar ve ishali kapsar (Brown vd.,

1964).

2.2. Çinko Biyokimyası

Demir ve bakırdan farklı olarak, çinko redoks nötr bir elementtir ve biyolojik

reaksiyonlarda Lewis asidi olarak reaksiyon verir. Bu özelliğinden dolayı çinko,

yapısal, katalitik ve sinyal bileşenleri olarak anahtar rol üstlenmektedir. Proteinlerin

yapısal bir bileşeni olarak, çinkonun protein/peptitlerle olan ilişkisi, ilk önce çinko ile

insülinin kristallenmesiyle doğrulanmıştır (Scott ve Fisher; 1938). İlk bulunan

"Çinko parmak" motifi, Xenopus'un transkripsiyon faktörü TFIIIA'dır (Miller vd.,

1985). Çinko parmaklar artık 20'den fazla yapısal olarak farklı modül grubuna

ayrılmıştır ve çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitlerle etkileşen işlevsel bir motif

8

olarak bilinmektedir (Andreini vd,, 2011; Berg ve Shi, 1996; Krishna vd., 2003)

(Çizelge 2.1).

Katalitik fonksiyonlarda, çinko güçlü Lewis asidi özelliğinden dolayı negatif yükleri

stabilize ederek enzimatik katalizde önemli rol oynar (Maret, 2004). Çinkoya bağımlı

bir enzim olarak eritrosit karbonik anhidraz enziminin ilk olarak tanımlanmasından

ardından enzim komisyonunca (EC) belirlenen altı sınıftaki birçok enzimde çinko

varlığı saptanmıştır (Çizelge 2.1).

Proteinlerin içinde, çinko azot, oksijen ve sülfür atomları ile koordine olabilir ve

çinko farklı koordinasyon sayılarına da sahip olabilir (Maret, 2012). Çinko proteomu,

ökaryotlarda proteinlerin % 9'unun çinko proteini olduğunu ve yüksek

organizmalarda bu sayının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. İnsanlar tarafından

kodlanan çinko proteinlerin sayısı ~% 10'dur (Andreini vd., 2006).

9

Çizelge 2.1. Çinkonun fonksiyonlarına örnekler

Çinko fonksiyonları Açıklama

Yapısal bileşenler Çinko parmaklar

C2H2-benzeri parmak; klasik çinko parmak motif, transkripsiyonel faktör

TFIIIA, 20–30 amino asit sekansı

Çinko kurdele; bir çok transkripsiyon faktörü, ribozomal proteinler,

RanBP

Sol anahtarı; HALKA parmak domeni, Arf-GAP domeni, LIM domeni,

FYVE domeni, PHD domeni, MYND domeni, nükleer reseptör DNA-

bağlayan domen, GATA, PKC

Çinko kolyeler; transkripsiyonel adaptör proteininde TAZ domeni

CBP/p300

Proteinler arası bağlama mediatörü (örnek, çinko hock motifi)

İnsülin gibi peptidlerin kristalizasyonu

Katalitik faktör Altı ana enzim sınıfında enzim kofaktörleri

Oksidoredüktazlar; alkol dehidrogenaz, sorbitol dehidrogenaz

Transferaz; bu sınıfta çinkonun temel fonksiyonu katalitik özelliği

değildir (sadece %34 katalitiktir)*

Hidrolaz; karboksipeptidazlar, alkalin fosfatazlar, anjiotensin-konverting

enzim

Liyaz; karbonik anhjidraz, δ-aminolevulinik asit dehidrataz

İzomeraz; fosfomannoz izomeraz

Ligaz; bu sınıfta çinkonun temel fonksiyonu katalitik özelliği değildir

(sadece %39 katalitiktir)*

Sinyalizasyon

mediatörü

(Çinko

sinyalizasyonu)

Ekstraselüler çinko sinyalizasyonu

Merkezi sinir sisteminde nöromodülasyon fonksiyonları

Çinko ile aktive olan reseptörler (ZnR/GPR39)

insülin salınımını azaltma ve hepatik insülin temizlenmesini baskılama

İntraselüler çinko sinyalizasyonu

İkincil mesajcı fonksiyonları

Enzim aktivitesinin inhibisyonu (kaspazlar, protein trozin fosfatazlar,

fosfodiesterazlar)

Sinyalizasyon yolunun düzenlenmesi (PKC, ERK, JAK/STAT,

BMP/TGF-β, NF-κB, cAMP-CREB, PI3K/Akt, B-hücre rreseptörü)

Çinko dalgasıı; perinüklear bölgeden sitocole çinko salınımı.

Çinko kıvılcımı; oositlerden çinko atımı. Çinko kıvılcımı yumurta

embriyo dönüşümü için gereklidir

* Yüzdeler bilinen yapıların çinko enzimleri ile ilişkilendirilen EC numaralarını ifade

etmektedir.

10

2.3. Çinko Elementinin Emilimi ve Metabolizması

Zn, duodenumda ve proksimal jejunumda emilir ve apikal membranda ifade edilen

spesifik taşıyıcılar aracılığı ile eritrositlere taşınır (Turnlund vd., 1984). Sitrik asit Zn

emilimini artırmaktadır. Lif, demir ve fitat gibi Zn şelatörleri ise zinko emilimini

inhibe etmektedirler (Kenny vd., 1989; Cousins, 1985). Biyolojik kullanılabilir

fraksiyon, vücut tarafından tutulan ve kullanılan kısmıdır. Çinko miktarı et

bakımından zengin diyetlerde yüksek ve vejetaryen diyetlerde ise fitat içeriğinden

dolayı düşüktür. Sıkı vejetaryen diyetlerinde -diyet içeriğinde bulunan fitatdan

dolayı- % 50’den daha fazla Zn ilavesini gerektirebilmektedir. Emilen Zn, ya portal

sistem vasıtasıyla karaciğere taşınır ya da enterosit içinde intraselüler olarak bulunan

metalotiyoinine (MT) bağlanır. MT'ye bağlı fraksiyon daha sonra enterosit

dökülmesi esnasında barsağa geri döner. Zn, yaklaşık olarak 4 μg/mL

konsantrasyonda safra atılmaktadır (Lech ve sadlik, 2011). Salgılanan Zn'nin bir

kısmı, enterohepatik dolaşıma girerek emilir ve net gastrointestinal (GI) kaybı 2-4

mg/gün’dür. Yetişkinlerde idrar Zn atılımı ise yaklaşık olarak 0,5 mg/gün’dür. Diğer

fizyolojik kayıplar ise cilt ve saçda oluşmaktadır.

Şekil 2.2. Zn homeostazisi. Diyetsel Zn eritrositlere üst kastrointestinal yolda absorblanır. Zn’nin bir

kısmı eritrositlerde şelatlanır ve fizyolojik olarak mukozal dökülme ile gastrointestinal yola

geri döner. Emilen Zn plazma havuzuna geçerek buradan vucut dokularına tekrar dağıtılır.

Zn dengesi başlıca net gastrointestinal emilimin düzenlenmesi yoluyla sürdürülür. Adaptif

mekanizmalar diyetsel Zn’da artış veya azalışa rağmen normal Zn durumunu idame

ettirirler. Zn dağılımı üzerine adaptif ve terapötik etkiler: +, pozitif etki; -, negatif etki

olarak ifade edilmiştir. APR, akut faz cevabı; GI, gastrointestinal; IV, intravenöz; Zn, çinko.

11

2.4. Çinko Hemeostazı

Çinko homeostazı, 11-25 μmol / L (0.7-1.6 mg / L) referans aralığında sabit bir hücre

içi Zn konsantrasyonunu ve plazma konsantrasyonunu sürdürülür. Homeostatik

regülasyon bağırsak emilimi, GI salgılanması, idrar boşaltımı ve hücresel retansiyon

düzeylerinde ortaya çıkar ve regülasyonun en önemli hedef düzeyi net bağırsak

emilimidir. Diyetteki Zn içeriği azaldığında, dışkı kayıpları azalır, emilim verimliliği

hemen hemen% 100'e yükselir. Ayrıca idrar Zn atılımında azalma ve hücresel

retansiyonda artma meydana gelir. Doku Zn miktarı, dolaşımdaki IGF-I'in neden

olduğu büyümede azalma ile korunmaktadır. Bununla birlikte, adaptif mekanizmalar

kayıpları tamamen ortadan kaldıramaz. Dolayısıyla, adaptasyon esnasında dahi Zn

desteği gereklidir. Deplesyon çalışmaları, hemen hemen tamamı yavaşça turnover

havuzundan salınım hız sabitinin azalmasın bağlı olarak plazma Zn'nin % 65

oranında azaldığını göstermiştir. Bu havuz muhtemelen iskelet kasında

bulunmaktadır ve Zn alınımına karşı hassastır.

İnsan vücudu 2-3 g çinko içerir ve yaklaşık olarak çinkonun % 60'ı iskelet kasında,

%30’u kemikte, %5’i karaciğer ve deride geri kalan %2-3’lük kısmı ise diğer

dokularda bulunur (Şekil 2.2.) (Wastney vd., 1986). Çinko içeren diğer organlar

arasında prostat, karaciğer, gastrointestinal sistem, böbrek, cilt, akciğer, beyin, kalp

ve pankreas bulunur (Bentley vd., 1991; He vd., 1991; Llobet vd., 1988). Çinkonun

oral yolla alınımında incebağırsaktan emilir ve albümin, a-mikroglobülin ve

transferin gibi çeşitli proteinlere bağlı olarak serumda dağıtılır (Scott ve Bradwell,

1983).

12

Şekil 2.3. Hücrelerdeki çinko dağılımı şeması. ZnT (yeşil oklar) ve ZIP (kırmızı oklar) taşıyıcıları,

hücresel çinko homeostazını düzenlemek için koordine eder. Toplam hücre çinko

konsantrasyonu 10s-100s μM olarak kabul edilir, ancak sitoplazmadaki hemen hemen tüm

çinko iyonları (Zn2+), bir dizi metaloproteinler ve MT'lere sıkıca bağlanır veya ZnT veya

ZIP yoluyla hücre içi organel/vesiküllere kenetlenir veya serbest bırakılırlar. Bu nedenle,

sitosoldeki labil ("serbest") Zn2+ konsantrasyonu çok düşüktür (pikomolar ve düşük

nanomolar seviyeler arasında değiştiği düşünülmektedir). Bazı hücre altı bölmelerindeki

kararsız Zn2+ konsantrasyonları da gösterilmiştir. Aynı zamanda, ER ve Golgi'deki değerler konusunda mevcut görüş birliği bulunmamaktadır. Labil Zn2+, mitokondride de mevcuttur,

ancak yolu açıklığa kavuşturulmamıştır. Yüksek miktarda labil çinko, bir çok hücrede

sinaptik veziküller ve insülin granülleri gibi özelleşmiş yapılarda birikmektedir. Hücresel

çinko konsantrasyonu, çinko dalgaları ve ani çinko salınımı “çinko kıvılcımları” gibi çeşitli

yollarla dalgalanmaktadır. Sarı halkalar, Zn2 +; pembe halkalar, glutamat (Kambe vd.,

2015).

Aynı taşıyıcı aileleri çinkonun endoplazmik retikulum, mitokondri ve golgi içindeki

dağılımını da düzenler. Buna ek olarak, birçok memeli hücre tipi ayrıca “çinko

vezikülleri” şeklinde adlandırılan membrana-bağlı veziküler yapılar içerir. Bu

veziküller yüksek miktarlarda çinkoyu yakalarlar ve büyüme faktörleri gibi faktörler

ile uyarıldıklarında ise serbest bırakırlar (Haase ve Maret 2003; Taylor vd., 2008)

(Şekil 2.3)

Son olarak, metalotiyoninler (MT), çinko homeostasisinde hücre içi çinkonun hemen

hemen % 20'si ile kompleks oluşturarak belirgin bir rol oynamaktadırlar (Şekil 2.4)

13

(Chimienti vd., 2003; Tapiero ve Tew, 2003). MT, düşük molekül ağırlıklı 6-7 kDa,

yüksek sistein içeriği ve metal iyonlarını kompleksleştirme kabiliyeti ile karakterize

olan ubiquitöz proteinlerdir. Bir MT molekülü yedi çinko iyonuna bağlanabilir.

Metal iyonu bağlama bölgelerinin farklı afiniteleri sayesinde, hücresel çinko

tamponu gibi davranabilir (Krezel ve Maret, 2007). MT ile hücresel çinkonun

dinamik olarak düzenlenmesi, metal transkripsiyon faktör (MTF) -1’in tetiklenmesi

ile artan hücre içi çinko düzeyine cevaben apo-form tiyonin (T) sentezinden

kaynaklanmaktadır (Laity veAndrews 2007). Ayrıca, sistein kalıntılarının

oksidasyonu, redoks ve çinko metabolizmasını birleştiren metal bağlama tiyollerinin

sayısını değiştirebilir. (Maret, 2006).

Şekil 2.4. Hücresel çinko homeostazı ve çinkonun sitotoksisite üzerindeki etkisi. (A) Hücresel çinko

homeostazı, üç ana mekanizma aracılıdır. İlk olarak, Zip ailesinden olan hücre içine alan

taşıyıcılar tarafından plazma membranından geçişinin sağlanması ve ZnT ailesinden olan taşıyıcı proteinler de Zn’yi hücre içinden dışarıya doğru taşınması. İkincisi, metalotiyonin

gibi çinko bağlayıcı proteinlerin bu olayda yer alması. Üçüncü olarak da, endoplazmik

retikulum, Golgi ve lizozomlar dahil olmak üzere hücre içi organellere transporter aracılıklı

çinko tutulum yolunun olması. Çinko homeostazın sıkı kontrolü, hücresel canlılığın

korunması için gereklidir, buna karşın deregülasyon hücre ölümüne yol açmaktadır. (B)

Hücre içi çinko homeostazına diğer bir yol metalotiyonnin/tiyonin sistemidir. Serbest ve

zayıf bağlı çinko iyonları, metalotiyonin (MT) oluşturmak için apo-protein tiyonin (Tred)

ile bağlanır. Yüksek seviyedeki serbest çinko iyonları metal-düzenleyici transkripsiyon

faktörü (MTF) -1’in çinko parmak yapılarına bağlanması tiyonin ekspresyonunu indükler.

Ayrıca, tiyollerin reaktif oksijen (ROS) veya azot (RNS) türleri ile oksidasyonu, çinkonun

eşzamanlı salınımı yoluyla oksitlenmiş protein tiyoninin (Tox) oluşumunu tetikler.

14

2.5. Çinkonun Hücre Ölümündeki Rolü

Çinkonun sistemik toksik etkilerine ek olarak, çinko metali hücresel seviyede

sağkalım ve ölüm mekanizmalarının düzenlenmesinde de yer alır.

2.5.1. Çinkonun apoptozise etkisi

Çinkonun apoptozun düzenlenmesindeki rolü belirsizdir. Çeşitli çalışmalar, çinko

konsantrasyon -bağımlı olarak hem pre-apoptotik hem de anti- apoptotik etki

gösterebilir. Aynı şekilde hem çinko eksikliği ve hem de fazlalığı aynı hücre hattında

apoptozu indükleyebilmektedir (Cummings vd., 2009; Formigari vd., 2007; Haase

vd., 2001; Truong-Tran vd., 2001).

Yüksek hücre içi çinko düzeyleri ile apoptozun indüksiyonu farklı dokularda ve

hücre tiplerinde gösterilmiştir (Truong-Tran vd., 2001; Fraker vd., 1997; Watjen vd.,

2002). Yapılan çalışmalar, gerek ekzojen uygulama sonucu, gerekse hücre içi

depolardan ROS veya nitrosasyon aracılıklı çinko salınımı hücre içi çinko birikimine

yol açarak p38 ve potasyum kanalları gibi pro-apoptotik molekülleri aktive olmasına

sebep olarak hücreyi ölüme getirebilmektedir (Truong-Tran vd., 2001; Kim vd.,

1999; McLaughlin vd., 2001; Wiseman vd., 2006). Artmış intrasellüler çinko

seviyeleri aynı zamanda enerji metabolizmasının inhibisyonuyla da hücre ölümünü

indükleyebilmektedir (Brown vd., 2000; Sheline vd., 2000).

Anti-apoptotik Bcl-2-benzeri ve pro-apoptotik Bax-benzeri mitokondriyal membran

proteinleri çinko toksisitesinden etkilenmektedirler. Apoptozu indükleyen özellikler

bağlamında düşünüldüğünde, çinkonun Bax ekspresyonunu arttırdığını ve bu artışın

da Bcl-2/Bax oranında azalmaya neden olmaktadır. Bu durum sonuçta,

mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasına ve mitokondriden sitozole

sitokrom-c'nin salınmasına yol açarak hücreyi apoptoza götürmektedir (Kim vd.,

1999; Feng vd., 2008; Dineley vd., 2003; Feng vd., 2002; Mills vd., 2002;

Bitanihirwe vd., 2009).

Çinko'nun anti-apoptotik özellikleri muhtemelen iki ana mekanizmadan

oluşmaktadır. Birincisi, çinko, oksidatif stres sırasında oluşan hasarı sınırlar ve

15

böylece apoptoz ile sonuçlanan sinyal yollarını bastırmasıdır. İkincisi ise, çinkonun

doğrudan apoptozu düzenleyen çeşitli proteinleri ve yolları etkilemesidir.

Birinci mekanizma ile tutarlı olarak, çinko eksikliğinin oksidatif stres oluşturduğu

gösterilmiştir (Cui vd., 2000; Cui vd., 1999; Oteiza vd., 2000). Redoks-inert

çinkonun hücreleri oksidatif hasara karşı koruduğu mekanizmalar, proteinlerdeki

sülfhidril gruplarının oksidasyona karşı korunma özelliklerini içermektedir (Williams

vd., 1987). Çinko ayrıca, lipidleri ve proteinleri stabilize ederek, hücresel zarları ve

makromolekülleri oksidatif hasardan korur. Öte yandan, yüksek çinko düzeyleri

oksidatif strese neden olabileceği ve redoks homeostaz üzerindeki etkisi,

kullanılabilirliğine bağlı olarak, koruyucu veya teşvik edici olabilmektedir (Maret

vd., 2006).

İkinci mekanizma ile ilgili olarak çinkonun bazı apoptoz-düzenleyici moleküller ile

etkileşebilmektedir. Çinko, ICso değeri 10 nM'nin altında olan güçlü bir kaspaz-3

inhibitörüdür (Perry vd.,1997; Maret vd., 1999). Ayrıca, düşük çinko

konsantrasyonlarında kaspaz-6, -7 ve -8'in inhibisyonu da gösterilmiştir (Stennicke

vd., 1997).

Çinko eksikliği, ERK ve Akt gibi büyüme faktörü sinyal moleküllerini bozarak

apoptozu indükleyebilmektedir (Clegg vd., 2005). Çinko için diğer moleküler

hedefler, anti-apoptotik Bcl-2-benzeri ve pro-apoptotik Bax-benzeri mitokondriyal

membran proteinleridir. Çinkonun, Bcl-2/Bax oranını arttırdığı ve böylece hücrelerin

apoptosise karşı direncini arttırdığı gösterilmiştir (Fukamachi vd., 1998). Buna

uygun olarak, Zalewski ve meslektaşları tarafından yapılan bir çalışmada hidrojen

peroksit ile premonositik hücrelerde apoptozu indüklemişlerdir. Premonositik

hücrelerine yapılan 1 mM’lık çinko ilavesi, aktif kaspaz-3'ün inhibisyonuna ve Bcl-

2'nin Bax'a oranında artış ile sonuçlanmıştır (Zalewski vd., 1991). Çinko aracılı

apoptoz, N, N, N′, N′-tetrakis (2-pyridylmethyl)-ethyenediamine (TPEN) ilavesi

sonucu oluşan şelasyon sonucu durduğu gösterilmiştir (Zalewski vd., 1993). Fakat

başka bir çalışmada ise çinkonun Bax'ın ekspresyonunu artırabileceği gösterilmiştir,

bu da Bcl-2/Bax oranının azalmasına ve sitokrom c’nin mitokondriden salınmasına

yol açarak apoptozu indükleyebilmektedir (Feng vd., 2008).

16

Çinkonun apoptoz üzerindeki etkisi çok karmaşıktır ve veriler kısmen çelişkilidir.

Diğerleri arasında, bu kompleks ağdaki değişkenler doku ve hücre tipi, çinko

konsantrasyonu, çinko taşıyıcılarının ve çinko bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu,

oksidatif veya nitrosatif stres gibi diğer çevresel koşullar ve zıt fonksiyonlu çoklu

moleküler hedeflerin bu olaylarda yer almasıdır.

2.6. Çinko ve Oksidatif Stres

Oksidatif stres, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimi ve antioksidan savunma

sistemi tarafından uzaklaştırılma oranındaki düşüşten dolayı oksidanlar ve

antioksidanlar arasındaki dengesizlik ile karakterizedir. Bu metabolik bozukluk,

biyomoleküllerin oksidasyonuna, hücrelerdeki ve dokulardaki oksidatif hasara,

dolayısıyla da obezite, diyabet ve kanser gibi çeşitli kronik hastalıkların gelişimine

katkıda bulunur (Butterfield vd., 2014; Feng vd., 2013; Pisoschi vd., 2015).

Çinko özellikle 300'den fazla enzim ve 2000 transkripsiyon faktörü için ko-faktör

olarak görev yaptığı için insan sağlığı için gerekli minerallerden biridir. Çinko,

hücresel sinyalizasyon için önemli aracıdır (Roshanravan vd., 2015; Jurowski vd.,

2014). Öncelikle insülin hareketini artırmada önemli rolü vardır. Çinko

antienflamatuvar bir madde olarak hücre zarlarına yapısal kararlılık sağlar ve aynı

zamanda gen ekspresyonunun önemli bir regülatörüdür (Foster vd., 2014; Fung vd.,

2015; Jansen vd., 2012).

Çinko, antioksidan savunma sisteminin düzgün işleyişine katkıda bulunan önemli

enzimler için ko-faktör görevi görür. Buna ek olarak, çinko zarların stabilizasyonunu,

prooksidan enzim olan nikotinamid adenin dinükleotit fosfat-oksidaz enzimini

(NADPH-Oksidaz) inhibisyonunu ve metalotiyonein sentezini başlatarak hücreleri

oksidatif hasara karşı korumaktadır. Metalotiyonin, hidroksil radikallerinin (OH)

azaltılması ve stres koşulları altında üretilen reaktif oksijen türlerinin tutulmasında

yer alır (Ruz vd., 2013; Chasapis vd., 2012).

Çinkonun antioksidan savunma sistemindeki rolü araştırılmaktadır. Yapılan

çalışmalarda, çinkonun glutatyon peroksidazının düzenlenmesindeki ve metalotiyoin

17

sentezindeki rolünün yanı sıra süperoksit dismutaz için de kofaktör rolü olduğu

vurgulanmaktadır. Ayrıca, çinko hücre zarında demir ve bakır ile yarışarak NADPH-

oksidaz enziminin inhibe olmasına ve dolayısıyla da kronik enflamasyonu ve

hiperglisemiyi azaltıcı yönde etki göstermektedir (Cruz vd., 2015; Lima vd., 2011).

Çinko, hücrelerin sitoplazmasında bulunan süperoksit dismutaz enziminin yapısal bir

bileşenidir. Süperoksit dismutaz, bakır ve çinko iyonunun birlikte bulunduğu aktif

merkeze sahiptir. Bu enzim, iki süperoksit radikalinin hidrojen peroksit ve moleküler

oksijene dönüşümünü katalizlemekte ve oldukça reaktif türün daha az zararlı türe

dönüşümünü sağlaması yoluyla ROS'un toksisitesini düşürmektedir (Cruz vd., 2011).

Bu nedenle, hücre içi kompartımanlarında yeterli konsantrasyonda çinkonun

sağlanması ve devam ettirilmesi antioksidan savunma sisteminin düzgün bir şekilde

çalışması için gereklidir. Homma vd, (2013) yaptıkları çalışmada çinko eksikliğinin

süperoksit dismutaz enziminin mutant benzeri bir konformasyona dönüşümüne yol

açarak kronik endoplazmik retikulum stresini indüklediğini bulmuşlardır. Sonuç

olarak, endoplazmik retikulum stresindeki artış protein sentezini inhibe etmekte olup

özelikle çinko taşıyıcı Zip-14'ün indüksiyonu ile sonuçlanmaktadır.

Çinkonun bir antioksidan olarak işlev görmesini sağlayan bir başka mekanizma,

glutatyonun de novo sentezinin hız sınırlayıcı enzim olan glutamat-sistein ligazın

ekspresyonunu etkilemesidir. Bu durum dikkate alındığında, serbest radikallerin

direk olarak glutatiyon veya dolaylı olarak glutatiyon peroksidaz kofaktörü yoluyla

nötralize edilmesinde çinkonun etkisi yadsınamaz durum ortaya koymaktadır (Eide,

2011). Ha ve arkadaşları. (2006) kültüre edilmiş insan retinal pigment epitelyal hücre

hattı ARPE-19 hücrelerine 100-150 mM konsantrasyonunda çinkonun ilave edilmesi,

bir nükleer faktör eritroid 2 (NFE2)-ilişkili faktör 2 (Nrf2)-bağımlı metabolik yolu

vasıtasıyla glutamat-sistein ligaz mRNA seviyelerini upregüle olduğunu

bulmuşlardır. Bu yolla, çinko toplam hücre glutatyon konsantrasyonunu düzenleyici

role sahiptir (Foster vd., 2010).

Çinko güçlü bir metalotiyoin indükleyicisidir. Çinko, normal fizyolojik koşullar

altında metalotiyoinine bağlanır. Oksidatif stres altında, çinko metalotiyonin

kompleksinden salınarak hücrelerde yeniden dağıtılır (Maret vd., 2007; Özçelik vd.,

18

2012). Liang et al. (2015) çinko takviyesi alan sıçanların (günde 5 mg/kg vücut

ağırlığı) karaciğerlerinde metalotiyonin ekspresyonunda artış olduğunu

gözlemlemişlerdir. Karaciğerde metalotiyonin artışı ise metalotiyonin aracılıklı

antioksidan ve antienflamatuar olaylara katkı sağlamaktadır.

Metalotiyonin'in, çinko, bakır, krom, kadmiyum, cıva gibi ağır metal iyonlarını etkili

bir şekilde tutma kabiliyetine sahiptir (Coyle vd., 2002; Günther vd., 2012a; Günther

vd., 2012b). Bu nedenle, bu enzim aşırı miktarda metal iyonuna karşı hücre

korumasında önemli bir rol oynar ve böylece toksik ağır metallere karşı

detoksifikasyonun ana sistemi olarak işlev görerek oksidatif strese karşı etkin rol

oynamaktadır (Andrews vd., 2000).

Metal-düzenleyici transkripsiyon faktör-1 (MTF-1) aynı zamanda metal

homeostazına ve oksidatif strese verilen hücresel yanıtların koordinasyonunda

önemli bir role sahiptir. MTF-1, çinko konsantrasyonu arttığında metalotiyonin ve

çinko taşıyıcı-1 (ZnT-1) genlerinin sentezlenmesini uyaran çinkoya bağımlı bir

transkripsiyon faktörüdür. ZnT-1, hücresel membranlarda bulunur ve hücreden fazla

çinkonun çıkışına sağlar. ZnT-1’in bu fonksiyonu sayesinde, sitozoldeki çinko

toksisitesi azaltır. Ayrıca, metalotiyonin de sitoplazmadaki fazla çinko iyonlarını

bağlayabilmektedir. Bu nedenle metalotiyonin ve ZnT-1 ekspresyonunun

indüksiyonu artmış çinko seviyelerine karşı etkili olan bir mekanizmadır (Günther

vd., 2012b; Andrews vd., 2000; Secler vd., 2007).

MTF-1, redoks hücre durumundaki dalgalanmalara karşı hassasiyetinden ve

stimülasyondan sonra hedef genlerin ekspresyonunu artırarak oksidatif stresten

hücreleri koruyabmektedir. MTF-1 serbest radikalleri temizleyen bir antioksidan olan

glutatiyon bağlayıcı proteini kodlayan Selenoprotein 1'in (Sepw1) ekspresyonunu

aktive etmektedir (Bonaventura vd., 2015). MTF-1 aynı zamanda, inflamatuvar

sitokinleri kodlayan genlerin ekspresyonunu aktive ederek veya baskılayarak immün

yanıtı düzenler (Grzywacz vd., 2015).

Çinko hücre zarında bulunan bağlanma bölgelerine bağlanmada demir ve bakır ile

yarışmalı olarak bağlanmaktadır. Demir ve bakır iyonları, lipit peroksitlerden radikal

üretimini katalizleyebilmektedir. Katalitik olarak oldukça aktif olan demir ve bakırın

19

katalitik olarak inaktif olan çinko ile yer değiştirebilmesi, oldukça reaktif radikallerin

oluşumunu bu yolla önleyebilmektedir (Cruz vd., 2015;Oteiza vd., 2012).

Kronik düşük dereceli inflamasyon ile oksidatif stres arasında yakın bir ilişki vardır.

Nükleer faktör κB (NF-κB) ve aktivatör protein-1 (AP-1) de dahil olmak üzere çeşitli

pro-inflamatuar transkripsiyon faktörleri, inflamatuar sitokinlerin salınmasına neden

olan ROS üretimini indükleyebilirler. Bu durum oksidatif stresin artışına yol

açabilmektedir (Bryan vd., 2013). Çinkonun anti-inflamatuar bir besin olarak

oksidatif stresi azaltması önemli olsa da mekanizması tam olarak açıklığa

kavuşturulamamıştır. Çalışmalar, çinkonun NF-κB transkripsiyonunu anti-

enflamatuar protein A20 ve peroksizom proliferatör ile aktive edilen reseptör

(PPAR-α) ile aktive olan reseptör sinyal yolağı yoluyla düzenlediğini göstermektedir

(Prasad vd., 2011).

Prasad ve ark. Tarafından yürütülen hücre kültürü çalışmasında (Prasad vd., 2011),

yüksek çinko konsantrasyonuna sahip olan hücrelerin A20 proteininin artmış

ekspresyonunun yanı sıra IκB kinazı (IKK-α) / NF-κß sinyalizasyonunda ve pro-

inflamatuar sitokinlerin aktivasyonunda azalma olduğunu göstermişlerdir. Bao ve

ark. (2010), çinko desteğinin, interlökin 6 (IL-6), TNF-a, monosit kemoatraktan

protein-1 (MCP-1), C-reaktif protein (CRP), hücreler arası adezyon molekülü 1

(ICAM-1) ve E- selektin gibi inflamatuar molekülleri azalttığı, PPAR-α ve A20’nin

ekspresyonunu ise artırttığını belirlemişlerdir.

Çinko eksikliğinin oksidatif hasara ve dolayısıyla endotel disfonksiyonuna neden

olduğu bilinmektedir. Endotel hücrelerindeki çinko eksikliği, muhtemelen artmış

hücresel oksidatif stres ile ilişkili mekanizmalar yoluyla sitokinler ve lipidlerin

aracılık ettiği inflamatuvar cevabı tetiklemektedir. Buna karşın, çinko takviyesi,

vasküler sistemin hasar görmesine karşı koruyucu bir rol oynar. Çinkonun kan

damarlarını koruduğu mekanizmaların en başında, antioksidan enzimleri şifreleyen

genlerin sentezlenmesi ve metalotiyoninin ekspresonu ve indüksiyonu için önemli

olan önemli olan transkripsiyon faktörü eritroid-2 ile ilişkili faktör-2’nin (Nrf2)

düzenlenmesi gelmektedir (Biagiotti vd., 2016; Jenner vd., 2007; Miao vd., 2013).

20

Çalışmalar aynı zamanda çinkonun, hücre dışı ortamdan sitozole kalsiyum taşınımını

sağlayan N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörlerinin inhibisyonunda rol oynadığını

göstermiştir. Çinkonun bu fonksiyonu göz önüne alındığında, çinko eksikliği

durumunda NMDA reseptörlerinin aktivasyonununda ve dolayısı ile de hücre içi

kalsiyum konsantrasyonun artış meydana gelmektedir (Weglicki vd., 2011). Hücre

içi kalsiyum konsantrasyonundaki artış, nöronal hücrelerden substant P’nin

salınımına yol açar. Nöronlardan salınan substant P mediyatörü lökositleri ve

makrofajları aktive ederek oksidatif stresin oluşumuna katkı sağlayan inflamatuar

sitokinlerin salınmasına ve serbest radikallerin üretilmesine yol açmaktadır

(Weglicki vd., 2011). Ayrıca çinko eksikliği durumunda, NADPH oksidaz ve nitrik

oksit sentaz aktive edilerek reaktif oksijen ve azot türlerinin üretimine katkı

sağlanmaktadır (Oteiza vd., 2012), (Şekil 2.5).

Çinko aynı zamanda hiperglisemik koşullar altında ROS sentezini azaltmaya,

dolayısıyla oksidatif stres yollarının aktivasyonunu inhibe etmeye katkıda bulunarak

insülin duyarlılığını ve glisemik kontrolü artırmaktadır (Lima vd., 2011). Çinko

glikozun hücre içerisine alınımında rol oynayan pankreasın beta hücrelerinden

insülin salınımının uyarılmasına, insülin reseptörünün β alt biriminin

fosforilasyonuna ve fosfatidilinositol protein 3-kinaz ve protein kinaz B veya Akt'in

aktivasyonuna yol açarak glikozun hücre içersine taşınmasınına katkı sağlamaktadır

(Ranasinghe vd., 2015; Vardatsikos vd., 2013).

Çinko taşıyıcı proteinlerin hücresel oksidatif stres üzerindeki etkisine bakan son

araştırmalar, bu taşıyıcı proteinlerin hücresel hasarın hafifletilmesinde koordineli

hareket ettiklerini göstermiştir. Liang ve ark. (2013) çinko taşıyıcısı ZnT-7'nin

oksidatif stres koşulları altında osteoblastik hücre hattı MC3T3-E'nin hayatta

kalmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu araştırmacılar aynı zamanda

hidrojen peroksidin hücre içi çinkonun artışını indükleyebildiğini bulmuşlardır. ZnT-

7, serbest çinko iyonlarının toplanmasını azaltması ve hidrojen peroksit-indüksiyonlu

apoptozu engellemesinden dolayı hücreleri koruyabilmektedir. ZnT-7'nin bu işlevi,

tirozin kinaz proteinlerinin aktivasyonuna bağlanmaktadır. Tirozin kinaz proteinleri

aktive edildiklerinde pro-apoptotik proteinlerin fosforilasyonu yoluyla apoptosisi

inhibe ederler.

21

Oksidatif stres, çinko taşıyıcı proteinlerin ekspresyonunu değiştirebilmektedir. Sun

ve ark. (2014), kronik alkol maruziyetinin, hepatositlerde Zip-5 ve Zip-14 çinko

taşıyıcılarının ifadesini azalttığını göstermişlerdir. Kronik etanol maruziyetinin yine

hepatositlerde Zip-7 ve ZnT-7 çinko taşıyıcılarının ekspresyonunu arttırdığı ve aynı

şekilde hepatositlerin in vitro hidrojen peroksit ile muamelesinde de protein

ekspresyonunda artış olduğu gözlemlenmiştir (Sun vd., 2014). Karaciğer çinko

taşıyıcılarının etanol maruziyeti ile değişebilen ekspresyonu, karaciğerdeki çinko

homeostazını bozabilmektedir. Zip-5 ve Zip-14 hepatositlerin plazma zarında

bulunurlar ve bu nedenle, bu transporterlerin etanol maruziyeti ile azaltılmış

ekspresyonu, karaciğerdeki çinko seviyelerinin azalmasına neden olabilmektedir.

Zip-7 ve ZnT-7 endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı gibi organellerin üzerinde

bulunurlar. Dolayısıyla, bu çinko taşıyıcılarının değişmiş ekspresyonu, organellerde

çinko homeostazı ile etkileşime girmekle kalmaz aynı zamanda organel

fonksiyonlarında bozukluğa da neden olabilirler (Sun vd., 2014; Aydemir vd., 2012;

Kirschke vd., 2003; Taylor vd., 2004).

Kronik etanol tüketiminde izole karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulum ve

mitokondrideki çinko seviyeleri önemli ölçüde azalmaktadır. Bu durumda, çinko

takviyesi ile yapılan muamele, çinkoyu mitokondri ve endoplasmik retikülumdan

sitozole taşıyan Zip-8 ve Zip-13'ün ekspresyonunda artışa yol açar. Çinko takviyesi,

çinkoyu sitozoldan mitokondriaya nakleden ZnT-4 ifadesini de arttırmaktadır (Sun

vd., 2015). Bu organellerdeki çinko eksikliği ökaryotik başlatam faktörü 4'ün (eIF4)

fosforilasyonu, C/EBP'nin artmış ekspresyonu, sitokrom c'nin salınması ve kaspaz-3

ve apoptosisin müteakip aktivasyonu ile hücre ölümünü aktive eden Bcl-2 ailesinin

bir proteini olan Bax’ın aklenmesinin dahil olduğu oksidatif stres yollarıyla ilişkili

gibi görünmektedir (Sun vd., 2015).

22

Şekil 2.5. Çinkonun antioksidan mekanizmalardaki rolü. GPx: Glutatyon peroksidaz; MT:

Metalotiyonin; MTF-1: Metal-düzenleyici transkripsiyon faktör-1; NADPH:

Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat; NMDAR: N-metil-D-aspartat reseptör; SOD:

Süperoksit dismutaz; Zn: Çinko (Marreiro vd., 2017).

Çinko, metalotiyonin'in güçlü bir uyarıcısıdır ve metalotiyonine bağlanır. Çinko,

oksidatif stres altında metalotiyonin kompleksinden salınır. Çinko-bağımlı

transkripsiyon faktörü olan MTF-1, hücreleri oksidatif strese karşı koruyabilen

metalotiyoninin gen ifadesini aktive eder. Çinko, süperoksit dismutaz enziminin

yapısal bir bileşenidir ve bu metaloenzim iki süperoksit radikalinin hidrojen peroksit

ve moleküler oksijene dönüşmesini katalizler. Çinko, glutatyonun sentezinde rol alan

ve serbest radikallerin nötralleştirilmesine doğrudan katkı sağlayan glutamat-sistein

ligazın ifadesini etkiler. Çinko ayrıca hücre dışı ortamdan kalsiyumun sitozole

girişini sağlayan NMDA reseptörlerini inhibe eder. Böylece, çinko eksikliği NMDA

reseptörlerinin aktivasyonuna yol açar ve bu da hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu

arttırır. Çinko eksikliğinde, NADPH oksidaz enzimleri ve nitrik oksit sentaz

aktifleşerek oksijen ve reaktif azot türlerinin üretilmesine katkıda bulunurlar

(Marreiro vd., 2017).

Öte yandan çinko konsantrasyonu düşük veya yüksek olduğunda ise pro-oksidan

görevi görür ve pro-inflamatuar ve pro-apoptotik roller üstlenir. Çinko fazlalığı

ayrıca bakır eksikliğine yol açarak bakır eksikliği ile ilişkili birçok yan etkilere sebep

olabilmektedir. Bu yan etkiler, anti oksidan savunmada önemli olan süperoksit

dismutaz ve seruloplasmin gibi bakır bağımlı enzimlerin azalmış ekspresyonunu

23

içermektedir (Maret, 2013; Maret vd., 2006). Dahası, çinko iyonlarının

metalotiyoinine bağlanma yeteneği sınırlıdır. Bu durumda oksidatif stres yüksek

serbest çinko konsantrasyonlarına neden olur ve pro-oksidatif durum oluşturur.

Düşük çinko konsantrasyonu oksidatif strese neden olarak hücre ölümüne sebebiyet

verir ve ayrıca ROS üretimini de tetikler (Cleg vd., 2005; Maret, 2008 ).

2.6.1. Çinkonun oksidatif stress ile ilişkili kronik hastalıklardaki rolü

Araştırmalar, artmış oksidatif stres ile ilişkili olan hastalıklar gibi patofizyolojik

koşullar altında çinko durumunun değişebileceğini göstermiştir. Özellikle, obez

bireyler ortaya çıkan çinko eksikliğinin oksidatif stresi artırdığı ortaya koyulmuştur

(Martins vd., 2014; Sulibuska vd., 2014). Habib ve ark. tarafından yürütülen bir

çalışma. (Habib vd., 2015), obez bireyler kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, obez

grubunda lipid peroksidasyonunun bir belirteci olan malondialdehiti kontrol grubuna

göre yüksek bulmuşlardır. Bununla bağlantılı olarak, araştırmalar, düşük seviyedeki

glutatyonun ve süperoksit dismutaz aktivitesindeki azalışı, çalışılan hastalarda

gözlenen çinko eksikliklerine bağlı olabileceğine işaret etmektedir.

Tip 2 diabetes mellitus'taki kronik hiperglisemi, tip 2 diyabetli hastalarda antioksidan

savunmayı zayıflatan lipid peroksidasyonu ve hücrelerdeki oksidatif hasar ile

ilişkilendirilmiştir. Lima ve diğ. (Lima vd., 2011), tip 2 diyabetli hastaların

plazmasında çinko konsantrasyonlarında azalma olduğunu göstermişlerdir.

Muhtemelen, hiperglisemi ve poliüri sonucu çinkonun idrarla yüksek oranda

kaybedilmesinden kaynaklanabilmektedir. Bu araştırmacılar ayrıca, tip 2 diyabetik

hastalarda uygun çinko durumu ve yüksek süperoksit dismutaz aktivitesi ile ilişkili

oksidatif strese karşı cevabın arttığını göstermişlerdir. Serum insülin

konsantrasyonları çinko ve süperoksit dismutaz aktivitesi etkileyebilmektedir.

Çinko eksikliği, gıda alımı ve bağırsaklardaki emiliminin azalması, kalsiyum ve

demir ile etkileşim ve diyaliz sırasında mineral kaybının artması ile ortaya çıkan

kronik böbrek hastalığında da görülebilmektedir. Bu hastalıkta, çinko albumin gibi

üremi ile modifiye edilmiş proteinlere bağlanarak eksikliği daha da artabilmektedir

(Tonelli vd., 2009; Magalhães vd., 2011). Magalhães ve ark. Tarafından yürütülen

bir çalışmada (Magalhães vd., 2011) süperoksit dismutaz enzimi aktivitesinde azalma

24

ve antioksidan savunmada bozulma ile korelasyon gösteren kronik böbrek

hastalarında çinko konsantrasyonlarının azaldığını da göstermişlerdir.

Guo ve Wang (2013) tarafından yapılan çalışmada günde 11 mg çinko takviyesi, bu

mineralin plazma konsantrasyonunu artırabilmede yeterli olduğunu ve kronik böbrek

yetmezliği için hemodiyalize giren hastalarda bakır konsantrasyonunu da

düşürebildiğini ifade etmişlerdir. Çinko takviyesi aynı zamanda kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında bir oksidatif ürün olan malondialdehitin plazma

konsantrasyonunu düşürmekte ve süperoksit dismutaz aktivitesini ise artırmaktadır.

Ekstraselüler çinko konsantrasyonlarının düzenlenmesi, sinir ağının homeostazını

korumak için son derece önemlidir, çünkü bu mineral beyin fizyolojisinde ve

patofizyolojisinde rol oynamaktadır (Sensi vd., 2011). Sinapslarda, çinko havuzu

presinaptik veziküllerde oluşur; burada serbest çinko nöral aktivite sırasında glutamat

ile birlikte serbest bırakılır ve sinaptik yarıktaki NMDA reseptörlerini bastırmaya

çalışır (Vergnano vd., 2014). NMDA reseptörlerinin inhibisyonu, nöronal hücreler

tarafından substant P’nin serbest bırakılmasını azaltarak organizmayı oksidatif strese

karşı korur (Oliveira vd., 2015).

Ayrıca, çinko homeostazı ile bağlantılı antioksidanlar ve anti-kanserojen

mekanizmalar, neoplastik hücrelerin büyümesinde önleyici rol oynamaktadır. Çinko,

genetik kararsızlık ve genetik mutasyonlara karşı koruma sağlar. Bu anlamda,

süperoksit dismutaz antikanserojenik bir enzimdir. Meme kanseri oluşumunda

başlatma, ilerletme ve ilerleme evrelerini inhibe eder (Prabasheela vd., 2011).

Diyetteki çinko eksikliği meme kanseri riskinde artış ile bağlantılıdır (Chasapis vd.,

2012; Bostancı vd., 2015). Çinko eksikliğinden kaynaklanan oksidatif stres, bu

bölgedeki meme bezi dokusunda değişikliklere ve makrofaj infiltrasyonuna yol

açarak toksik bir mikro çevreye yol açar. Bu mekanizmalar, mineral

hiperakümülasyonuna yol açar ve bu hiperakümülasyon ise östrojen reseptörü-

alfa’nın (ERα) ekspresyonunda artış, organizasyonda duktal değişiklikler ve meme

bezinde fibrozis artışı ile ilişkilidir (Bostancı vd., 2015).

25

Metalotiyonin sentezinin, kemoterapiye direnç ve kötü prognoz gösteren meme

kanserinde bozulduğu dikkat çekicidir. Metalotiyonin, kemoterapi ve radyasyona

dirençli tümör hücrelerinin gelişimini promote eden mekanizmalar yoluyla

karsinogeneze katılır. Kanser hücrelerinde yüksek metalothionein seviyeleri, serbest

radikalleri inhibe ederek, apoptozu ve hücre proliferasyonunu arttırarak hasara karşı

koruma sağlar. Metalotiyonin ile çinko iyonları arasındaki etkileşim, karsinogenezise

katkıda bulunan çeşitli transkripsiyon faktörlerinin düzenlenmesinde rol

oynamaktadır (Alam vd., 2012).

Epilepsi, şizofreni, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları gibi hastalıklarda çinkonun

zararlı etkileri de gözlemlenebilmektedir. Bu koşullarda, çinko, presinaptik nöronlar

ve astrositler tarafından aşırı miktarda salınımı, mikrogliaların aktivasyonua,

nöronlarda NADPH oksidaz ve ROS üretimine yol açarak nöronal ölüme sebebiyet

verebilmektedir (Kim vd., 2002; Higashi vd., 2011; Furuta vd., 2016). Ayrıca çinko,

hipoksi veya iskemi ile indüklenen beyin hücrelerinin apoptozuna da neden olur

(Wang vd., 2015). Hücre kültürü ve deney hayvanı çalışmalarında N, N, N’, N’-

Tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamin (TPEN) olarak adlandırılan çinko şelatörü

uygulamalarında, nörolojik tutulumu azalttığı, serebral infarktüs alanını ve nöronal

apoptoz oranını azalttığı, süperoksit dismutaz aktivitesinde artma ve plazma

malondialdehit ve interlökin-6 (IL-6) seviyelerinde azalma gösterilmiştir. Sonuç

olarak, çinkonun, apoptozun önlenmesinde, başlıca oksidatif stres ve inflamatuar

yolaklar yoluyla rol oynamaktadır (Marreiro vd., 2017).

2.7. Eritrositler ve Redoks Düzenlemesi

Eritrositlerin başlıca işlevi oksijeni akciğerlerden dokulara taşımaktır. Dokulara

taşınan oksijen buradan hücre içerisindeki mitokondrilere geçerek elektron alıcısı

olarak ATP sentezinde kullanılmaktadır. Buna ek olarak, eritrositler dokulardaki

katabolik süreçlerin sonucunda üretilen karbondioksiti (CO2) bağlayarak

akciğerlerden atılmak üzere akciğerlere taşımaktadır. CO2, Hb zincirlerinin amino

gruplarının reaksiyonu ile karbaminohemoglobin oluşumu yoluyla eritrositlerdeki Hb

tarafından taşınabilmektedir. Fakat dolaşımdaki CO2'nin büyük bir kısmı, eritrosit

içersine difüze olarak H2O ile karbonik anhidraz enzimi katalizörlüğünde karbonik

26

asit (H2CO3) oluşturmakta ve oluşan karbonik asit ise bikarbonat iyonlarına (HCO3-)

dönüştürülerek plazmada taşınmaktadır. Akciğerlerde ise tekrar oluşan H2CO3,

karbonik anhidraz enzimi ile deprotonize edilerek alveollerden atılır. Bu işlevler

birbirine yakından bağlantılıdır ve Hb'nin demirli heme (Fe2+) grubuna O2 bağlanma

afinitesi, oksijen kısmi basıncı (pO2), asit/baz dengesini (pH) ve 2,3-difosfogliserat

seviyeleri ile düzenlenir. CO2 taşınımı, karbonik anhidrazın aktivitesine bağlıdır ve

doğrudan eritrositlerin pH’sı ve tamponlama kapasitesinin kontrolü ile ilgilidir.

Hb'nin prostetik grubunda bulunan ferröz heme (Fe2+) demiri, methemoglobin

(metHb) oluşturmak üzere ferrik (Fe3+) heme oksitlendiğinde, hemoglobinin oksijene

olan afinitesi önemli ölçüde azalır. Hb’nin fonksiyonelliğini sürdürebilmesi için

indirgenmiş durumda tutulması gerekir. Bu durumun sağlanmasında üç temel zorluk

şu şekildedir: İlk olarak, eritrositler sayısız oksidan kaynağa (Hb'ye bağlı yüksek

moleküler O2 seviyeleri dahil) maruz kalmaları ve içermeleri (Johnson vd., 2005);

İkinci olarak, eritrositler, Hb'nin (Johnson vd., 2005) prostetik grubunda yüksek

seviyelerde demir taşımaları; demir serbest çözünebilir formunda, Fenton reaksiyonu

ile güçlü bir ROS üretimi katalizörüdür; ve üçüncü olarak, eritrositlerin, eritropoetik

olgunlaşma sırasında protein ekspresyonu kaybı nedeniyle hasar gören elementlerin

yenilenmesinde sınırlı kapasiteye sahip olmasıdır (Şekil 2.6).

27

Şekil 2.6. RBC'lerde redoks regülasyonu. ROS'un sürekli oluşumu, oksiHb'nin metHb'ye heme oksidasyonu ve süperoksit anyonların salınması (Hb'nin otoksidasyonu) ile

gösterilmektedir. SOD1 enzimi süperoksit anyonlarını hidrojen peroksite

dönüştürmektedir. RBC'de, GPx ve Prx2 yolakları, glikoz alımıyla sentezlenen

NADPH'ye bağlı olarak, üç ana detoksifikasyon yolu mevcuttur. Glikoz, Glut-1 taşıyıcısı

ile hüçre içersine alınarak glikolitik yola girer. Glikolitik yolda oluşan glikoz-6-fosfat

metabolik ihtiyaca göre kısmen pentoz fosfat yoluna yönlendirilir ve okside NADP+

indirgenmiş NADPH’ya dönüştürülür. NADPH/glutatyon (GSH) bağımlı yol: NADPH,

okside ve dimer haldeki GSH'yi (GSSG) indirgen formdaki GSH'ye geri dönüşümünü

sağlayan glutatyon redüktaz (GSH redüktaz) enziminin substratı olarak gereklidir. GSH

iki enzim tarafından kullanılır: Birincisi, hidrojen peroksitin doğrudan parçalanması

sağlayan GPx enziminde; ikinci kullanıldığı enzim ise GPx enzimidir ve bu enzim plazma

membran redoks sistemi ve difüze olan ROS etkisi ile oluşan ASC’nin DHA’ya rejenerasyonunda görev yapar. NADPH/Trx-bağımlı yol: NADPH, kofaktör Trx'i

indirgenmiş durumda [Trx (SH) 2] tutan Trx redüktazın substratı olarak da gereklidir.

Trx(SH)2 disülfid köprüleri (TrxS2) oluşturma esnasında okside olan aktif merkez

içersinde membran-ilişkili Prx2 ve tiyollere elektron verici sistem olarak görev yapar.

NADPH'dan bağımsız yol: 3. Yol ile hidrojen peroksitin parçalanması NADPH'den

bağımsızdır ve hidrojen peroksitin parçalanması katalaz enzimi tarafından gerçekleştirilir.

ASC, askorbik asit; CAT, katalaz; DHA, dehidroaskopik asit; GPx, glutatyon peroksidaz;

GRx, glutaredoksin; GSSG, glutatyon disülfid; metHb, methemoglobin; NADPH,

nikotinamid adenin dinükleotid fosfat; Prx2, peroksiredoksin 2; ROS, reaktif oksijen

türleri; Trx, tiyoredoksin (Kuhn vd., 2017).

2.7.1. Eritrositlerde oksidan kaynaklar

Her 24 saatte bir, Hb'nin % 3'ü otomatik otooksidasyona uğrayarak metHb ve

süperoksit radikal anyonu üretir (Denk. 2.1) (Eder vd., 1949). Bu nedenle,

eritrositlerde (10 mM heme karşılık gelen) Hb'nin bolluğunu göz önüne alındığında,

hemoglobin otoksidasyonu reaksiyonu eritrositlerde başlıca ROS kaynağıdır.

HbFe2+ + O2 → HbFe3+ + O2∙ − (2.1)

28

Fakat, Hb'nin sadece % 1'i metHb (Fe3+) durumundadır. Hb-Fe3+, elektron donörü

olarak NADH’ı kullanan sitokrom b5 redüktaz tarafından katalize edilen reaksiyonla

Hb-Fe2+'ye geri indirgenebilmektedir. Sitokrom b5 redüktaz geni mutasyonu,

çocukluk çağında nöron miyelinasyonunun bozulması nedeniyle siyanoz ve ciddi

nörolojik problemlere neden olabilmektedir.

Bir başka oksidan kaynağı, serbest demir (Fe3+) olup metHb'den ayrılabilmektedir

(Bunn vd., 1968). Serbest demir varlığında hidroksil radikalleri üretimine yol açan

Fenton reaksiyonunu da içeren (Denklem 2.3) Haber-Weiss (Denklem 2.2 ve 2.3)

reaksiyonu vuku bulmaktadır.

Fe3+ + O2∙ − → Fe2+ + O2

(2.2)

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ∙OH + OH− (2.3)

Eritrositlerde ferritin bulunması serbest demirin temizlenmesine ve dolayısıyla

eritrositlerde Haber-Weiss reaksiyonunun oluşumunun sınırlamasına katkı

sağlamaktadır.

Bir diğer önemli oksidatif yol ise H2O2 ile hem demir hem de ferrik Hb arasındaki

reaksiyondur ve heme bozunması ve serbest demirin serbest bırakılmasıyla

sonuçlanmaktadır (Alayash vd., 2001). Bu reaksiyonlar, H2O2 ile ya oksiHb ya da

metHb arasındaki reaksiyondan ikincil radikallerin yanı sıra potent oksitleyici

ferrilHb türünün oluşmasına neden olur. Bu yolun hemolitik yaralanmaya aracılık

etmede önemli olduğu da öne sürülmüştür (Brownlee vd., 1977). Otooksidasyon ile

birlikte, bir başka önemli oksidatif yol, H2O2 ile hem demir hem de ferrik Hb

arasındaki reaksiyondur ve heme bozunması ve serbest demirin (Alayash vd., 2001)

serbest bırakılması ile sonuçlanmaktadır.

Hb − Fe2+ + H2O2 → Hb − Fe4+ = O2− + H2O (2.4)

Hb − Fe3+ + H2O2 → Hb∙ + − Fe4+ = O2− + H2O (2.5)

Hb − Fe4+ = O2− + H2O2 → Hb – Fe3+ + O2 ∙ − + H2O (2.6)

Hb − Fe3+ + O2 ∙ −→ heme yıkım ürünleri + Fe3+ (2.7)

29

Eritrositlerin ölçülebilir seviyelerde NO ürettiği düşünülmektedir. Bu nedenle, NO ve

O2•− arasındaki reaksiyon için hemen hemen difüzyon-sınırlı hız sabitini dikkate

alarak, en azından Denk. 2.8’e göre peroksinitritin oluşabileceği makul olarak

görülebilmektedir.

NO + O2 ∙ − → ONOO− (2.8)

Prx ve GPx de dahil olmak üzere eritrositlerde bol miktarda bulunan antioksidan

sistemlerin yanı sıra metHb'nin de güçlü peroksinitrit süpürücüleridir.

2.7.2. Eritrositlerdeki antioksidan sistemler

Eritrositlerin antioksidan sistemleri hem enzimatik hem de enzimatik olmayan

mekanizmalara dayanmaktadır. Eritrositler, askorbik asit (vitamin C), α-tokoferol

(vitamin E) ve glutatyon (GSH) gibi antioksidan molekülleri (I), NADH ve NADPH

gibi indirgenmiş ekivalent kaynakları (II) ve SOD1, Kedi, GPx ve tiyoredoksin (Trx)

sistemi de dahil olmak üzere antioksidan enzimler (III) ihtiva etmektedirler.

Eritrositlerdeki antioksidan sistemler, oksidan seviyelerini (O2 •, H2O2 ve diğer

reaktif türler dahil) çok düşük düzeyde tutmaya katkı sağlamaktadırlar.

2.7.3. Oksidasyon reaksiyonlarının ve redoks düzenleme bozukluklarının sebep

olduğu eritrosit hasarı

Tüm antioksidan sistemlerin eşgüdümlü faaliyetleri, eritrositlerin oksidasyona karşı

oldukça dirençli olmasını ve aynı zamanda etkili bir sistemik redoks tamponlama

sistemi oluşturmasını sağlamaktadır. Antioksidan savunmanın bozulması ve/veya

artmış oksidan üretiminin artması, subselüler düzeyde eritrositler için ciddi sonuçlar

doğurmaktadır. Bu sonuçlar, Hb'nin (Denklem 4-7) ve diğer proteinlerin yıkılması,

iyonik homeostazın bozulması (Ca2+) (Duranton vd., 2002), yeni antijenlerin

oluşumu (Kay vd., 1986), kısıtlı eritrosit deformasyonu (Clemens ve Waller, 1987),

eritropoezde pozumla (Schrier vd., 2003) ve fosfatidilserin (PS) maruziyetinde artma

(Jain vd., 1985). eritrosit zarındaki yüksek seviyedeki çoklu doymamış yağ asitlerin

peroksidasyona karşı duyarlılığının artması ve eritrosit membran bütünlüğünün

kaybedilmesine ve membran enzimlerinin aktivitesinde azalmaya neden olamaktadır

30

[örn., ATPaz (Yesilkaya ve Yegin, 1998) ve asetilkolinesteraz (Van der Zee vd.,

1989)].

2.7.4. Eritrosit hemolizin biyokimyasal sonuçları

Dolaşımdaki hemolizin, özellikle kardiyovasküler sistem üzerinde derin patolojik

etkiler bıraktığı gösterilmiştir. Hemoliz özellikle hemolitik anemilerde belirgindir ve

redoks dengesizliği veya hemoglobinopatiler eritrosit membranında krılganlığa yol

açmaktadır. Eritrosit’lerin patlaması veya yırtılması sonucu, hücre içi içeriğinin -

özellikle Hb ve arjinaz 1- salınmasına yol açar. Hb bölümlenmesinin kaybedilmesi,

sistemik NO atımına neden olabilmekte ve buna bağlı oalarak endotel işlevini de

etkileyebilmektedir (Gladwin vd., 200; Risbano vd., 2015). Denklem 4-7’ye göre;

Hb ayrıca H202 ile reaksiyona girerek (örneğin enflamasyon koşulları sırasında

üretilen) feril Hb oluşumunu ve lipid peroksidasyonunu indükleyebilmektedir

(Alayash vd., 2001). Hb veya heme, Toll-benzeri reseptör 4'ü aktive ettiği ve

preinflamatuar NF-kB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B

cells) -bağımlı sinyalizasyonu indüklediği ileri sürülmüştür (Belcher vd., 2016,

Ghosh vd., 2013). Ayrıca, arjinaz 1'in eritrositlerden salınması, arginin tükenmesine

katkıda bulunduğu ve endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) aktivitesinde de

azalmaya neden olduğu ifade edilmiştir (Morris vd., 2003).

2.8. DNA Hasarını Belirlemede Kullanılan Yöntemler

Alkali elüsyon, alkali unwinding, GC-MS, HPLC (elektrokimyasal dedektör ile) ve

comet analizi günümüzde oksidatif DNA hasarını belirlemede kullanılan

yöntemlerdir. Alkali elüsyon ve alkali unwinding güvenilir ve duyarlılığı yüksek

metodlar olmasına rağmen, komet analizine göre daha kısıtlı uygulama alanına

sahiptirler. HPLC ve GC-MS, DNA hasarını belirlemede ileri teknikler olmalarına

rağmen işlem süresinin uzun olması, daha maliyetli olmaları ve analize hazırlık

aşamasında numunelerde, oksidasyon reaksiyonlarının gelişebilmesi sebebiyle,

komet analizine göre nispeten daha az tercih edilmektedirler (Azgueta vd., 2009).

31

2.8.1. Comet testi (tek hücre jel elektroforezi)

"Tek Hücre Jel Elektroforezi" veya "Comet Metodu" DNA hasarını düşük dozlar için

bile hassas bir şekilde ortaya koyabilecek, hızlı, güvenilir ve ekonomik bir metotdur.

Radyoaktif işaretleme gerektirmemesi, özellikle insanlarda yapılan in vivo

çalışmalarda DNA hasar ölçümünde tercih sebebidir.

Alkali ortamda DNA süperkoil yapısının açılması ve kırıkların ortaya çıkmasının

ardından uygulanan elektroforezde kırılmış DNA zincirlerinin anoda doğru göçerek

bir kuyruklu yıldız görüntüsü oluşturması prensibine dayanmaktadır. Oluşan kuyruk

ne kadar fazla ise hasar derecesi de o kadar yüksek olarak kabul edilir (Dinçer ve

Kankaya, 2010). Mikroskobik incelemede hasarlı DNA’ların “kuyruklu yıldız”

şeklinde görünmesi sebebi ile “Comet Metodu” olarak isimlendirilmiştir. Metot,

günümüze kadar geliştirilerek ve çeşitli modifikasyonları üretilerek gelmiş ve DNA

hasarının tespitinde çok kullanılan, güvenilir metotlardan biri olmuştur (Dikilitaş ve

Koçyiğit, 2010)

Mikroskop lamı üzerindeki agaroz jel içine gömülen hücreler, zarların parçalanıp

çekirdekte bulunan süperkoil DNA’nın serbestleşmesi için lizis işlemine tabi tutulur.

Alkali ortamda süperkoil yapının gevşeyerek açılması ve kırıkların ortaya çıkması

sağlandıktan sonra uygulanan elektroforezde, kırılmış DNA zincirleri anoda doğru

göçerek bir kuyruklu yıldız görüntüsü oluşturur. Gerekli floresan boyama işlemi

yapıldıktan sonra boyamaya uygun mikroskop altında gerçekleştirilen inceleme ile

ortaya konan veriler, uygun istatistik yöntemler kullanılarak değerlendirilmektedir

(Dinçer ve Kankaya, 2010). Comet metodunun genel basamakları Şekil 2.7’de

gösterilmiştir.

32

2.7. Comet Metodunun Genel Basamakları (Fidan AF., 2008)

Günümüzde Comet metodu insanlarda, hayvanlarda, bitkilerde, hücre kültüründe,

deney hayvanlarında ve hatta funguslar ve bakteriler gibi çeşitli biyolojik

materyallerde farklı amaçlar ile uygulanmaktadır. Bu çalışmaların başında insanlarda

çeşitli amaçlar ile uygulan biyo-izleme (biomonitoring) çalışmaları gelmektedir.

Comet metodu, çevresel ve mesleki maruziyetlerin (kimyasal ya da radyoaktif

maruziyet gibi) izlenmesinde, biyolojik materyallerden faydalanılarak kullanılabilir.

Comet, yüksek risk altındaki bireylerin belirlenmesinde, hastalıklara neden olan

ajanlara maruziyet seviyesinin izlenmesinde veya besinlerin koruyuculuklarını

belirlemede kullanılabilir ya da bu faktörlere cevapta bireysel farklılıklar hakkında

bilgi verebilir (Yavuz , 2013).

33

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1. Deneylerde Kullanılan Cihazlar

Soğutmalı Santrifüj (Eppendorf MR 5415, Germany).

Manyetik karıştırıcı (IKAMAG RH, Janke&Kunkel Company GmbH und Co. KG,

IKA. Labortechnik, Staufen, Germany).

Hassas Terazi (Precisa 205A SCS, Switzerland).

Saf Su Cihazı (Millipore Progard 2, USA).

Derin Dondorucu (Liebherr, G 1211 Comfort, Germany).

Otamatik pipetler (Eppendorf, Hamburg, Germany).

Güç kaynağı (BIO-RAD POWER. PAC 1000).

PH Metre (Metler Toledo MA235 pH/Ion Analyzer, Schwerzenbach, Switzerland).

UV Spektrofotometre (Shimadzu UV 1601, Japonya).

Vorteks (Velp Scientifica, Usmate, Italy).

3.2. Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler

Tris (Tris-HCl), Etilendiamin tetra asidik asit (EDTA), Sodyum klorür (NaCl),

Potasyum klorür (KCl), Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4), Potasyum dihidrojen

fosfat (KH2PO4), Sodyum Hidroksit (NaOH), Hidrojen Klorür (HCl) Merck

firmasından, Sodyum bikarbonat (NaHCO3), Tris baz (NH2C(CH2OH)3), Sodyum

mono hidrojen fosfat (Na2HPO4.7H20) Sigma firmasından temin edilmiştir.

3.3. Eritrosit Membran Stabilizasyonunun Belirlenmesi

Eritrosit paketi oluşturmak için sağlıklı kişiden alınan heparinli’lı kan örneği 3000

rpm’de santrifüjlenerek plazma kısmı atıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu Tirisin

tamponlu tuz çözeltisi (TBS) ile (146 mM NaCl; 20mM trisin pH=7,4) 1:1 (v/v)

oranında seyreltilerek 3 kez yıkandı. Her bir yıkama ardından 10 dakika 3000 rpm’de

santrifüjlendi ve süpernatan kısımları atıldı. Son yıkamanın ardından elde edilen

eritrosit paketi 1:1 oranında TBS ile seyreltildi. H2O2

34

Daha önce yıkanan eritrosit hücrelerinden 100 µL (% 50 hematokrit) alınarak TBS-

çinko (138,56 mM NaCl, 7,64 mM ZnSO4, 20 mM tirisin, pH= 7,4) çözeltisinin

ddH2O ile seyreltilmesi sonucu faklı osmolarite (300-33,33 mOsm/L) ve farklı çinko

konsantrasyonlarında hazırlanan 10 mL çözeltilerine (40 -0,078 µg/mL) ilave edildi.

Tüpler karıştırıldıktan sonra 37˚C’deki su banyasında inkübe edildiler ve her 15

dakikada bir yavaşça karıştırıldı. Farklı zaman aralıklarında tüpler homojenize

edildikten hemen sonra ependorf tüplere alınan 1 mL’lik eritrosit süspansiyonları

1600 x g’de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüz sonrası oluşan süpernatan kısmı 540

nm’deki absorbansları okundu.

TBS konsantrasyonunun (X) fonksiyonu olarak 540 nm’de ölçülen (A540) absorbans

grafikleri Boltzmann eşitliğine göre (E1) belirlenen sigmoidal regresyon doğrusuna

(Şekil 3.1 ) göre yapıldı.

(E1)

Burada, Amin ve Amax grafik eğrisinin sırasıyla minimum ve maksimum platosu,

H50 (g/dL TBS) %50 hemolizin gerçekleştiği TBS konsantrasyonu ve dX (g/dL

NaCl) tam hemoliz geçişinden sorumlu olan tuz konsantrasyonundaki değişkendir.

Eritrosit membranının osmotik stabilitesinin değerlendirilmesinde dX ve 1/H50

parametreleri kullanıldı. % hemoliz aşağıdaki eşitliğe göre belirlendi.

% Hemoliz =100 x (OD1-OD2)/OD1

OD1= Hipotonik tampon tuzu çözeltisinin optik yoğunluğu

OD2=Hipotonik Test örneği çözeltisinin optik yoğunluğu

35

Şekil 3.1.Tuz konsantrasyonundaki azalma ile oluşan tipik eritrosit hemoliz eğrisi. Veriler sigmoidal

regresyon ile düzeltilmiştir. H50, % 50 hemolizi oluşturmak için gereken tuz

konsantrasyonudur ve 4dX, rezidüel değerden (Amin) maksimum absorpsiyon değerine

(Amax) geçiş ile ilişkili % 100 hemoliz için gerekli olan tuz konsantrasyonundaki

değişimdir.

3.4. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu Tayini

TBS-çinko (138,56 mM NaCl, 7,64 mM ZnSO4, 20 mM tirisin, pH= 7,4) stok

çözeltisi kullanılarak değişen konsantrasyonlarda (40 -0,078 µg/mL) çözeltiler

hazırlandı. Negatif kontrol olarak TBS (146 mM NaCl; 20mM trisin pH=7,4)

kullanıldı. Değişen miktarlarda çinko ihtiva eden tüplere son hemoglobin

konsantrasyonu 3g/dL olacak şekilde eritrosit paketinden ilave edildi. Tüm

seyreltmeler TBS çözeltisi ile yapıldı.

Hazırlanan çalışma ve kontrol tüpleri üzerine son konsantrasyonu 10 mM olacak

şekilde H2O2 ilave edildi. Çalışma tüpleri 37 °C’de su banyosunda inkübasyona

bırakıldı. Değişen zaman aralıklarında MDA tayini yapıldı.

MDA tayini Stocks ve Dormandy ‘ye göre yapıldı. 37 °C’de su banyosunda inkübas

İnkübasyona bırakılan tüpleri yavaşca homojenize edilmesinin hemen ardından 900

μL alınarak üzerine 0,2 M sodyum meta arsenid ihtiva eden % 28 lik’ TCA

36

çözeltisinden 600 μL ilave edildi ve 4500 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi.

Santrifüjün ardından 800 μL süpernatan alınarak üzerine 400 μL günlük taze olarak

hazırlanan 0,069 M’lık TBA çözeltisi ilave edildi ve 15 dakika kaynar su banyosunda

bekletildi. Oluşan renkli çözeltinin absorbansı 532 ve 600 nm’de spektrofotometrede

(Shimadzu UV 1601) okundu ve MDA konsantrasyonları aşağıdaki formüle göre

hesaplandı (3.1).

[MDA] = (A532 – A600) x 900 = nmol MDA / g Hb (3.1)

3.5.Tek Hücre Jel Elektroforezi (Comet ) Tayini

3.5.1. Kan örneklerinin alınması

Kan örneği sağlıklı ve sigara içmeyen kişiden heparinli tüpe yaklaşık 10 mL olacak

şekilde alınmıştır.

3.5.2. Lenfosit örneklerinin hazırlanması

Alınan kan örneği PBS ile 1:1 oranında seyreltildi, 1’er mL ependorflara bölündü ve

üzerine 400 μL Hystopaque-1077 (Sigma, Almanya) çözeltisi eklenerek +4˚C’de 400

g’de 10 dak. santrifüj edildi. Lenfosit tabakasının 400 μl si ependorf tüplere otomatik

pipetle alındı ve PBS ile 1 mL’ye tamamlanarak +4˚C’de 200 g’de 10 dak. tekrar

santrifüj edildi ve üst kısım atıldı.

3.5.3. Çinko çözeltilerinin hazırlanması ve lenfositler ile muamele

Hazırlanan stok TBS-çinko çözeltisinden (138,46 mM NaCl, 7,74 mM ZnSO4, 20

mM tirisin, pH= 7,4) 40-0,078 µg/mL çözeltiler hazırlandı ve lenfosit örneklerinin

hazırlanması aşamasındaki son basamakta santrifügasyonla dibe çöktürülen lenfosit

hücrelerinin üzerine 1 mL ilave edildi. Nagatif çözücü kontrol olarak TBS (146,2

mM NaCl, 20mM trisin, pH= 7,4) çözeltisi kullanıldı. Farklı konsantrasyonlarda

çinko içeren lenfosit süspansiyonları, sadece TBS içeren negatif çözücü kontrol

lenfosit süspansiyonu ve pozitif kontrol olarak TBS-H2O2 içeren lenfosit

süspansiyonu 370C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı.

37

3.5.4. Hücre sayımı

Lenfosit canlılık oranları tripan blue yöntemi ile belirlendi. Hücreler 1:1 oranında

tripan blue ile boyandı ve Thoma lamına yayılarak ışık mikroskobunda sayıldı.

Hücre canlılığı %90’ın üzerinde olan lenfositlerle COMET testi değerlendirilmesi

yapıldı.

3.5.5. Comet tekniği

Lamlar % 1’lik NEDA ile kaplandı ve oda sıcaklığında kurutuldu. 50 μL hücre

süspansiyonu (yaklaşık 5x104 hücre), 37 0C’deki 50 μL % 0.75’lik DEDA ile

karıştırıldı ve kaplanmış lamlara yayıldı. Lamel kapatılarak buzdolabında agaroz

katılaşıncaya kadar 15 dak. beklendi. Lameller, agaroz zedelenmeden alındı. Lamlara

üçüncü tabaka olarak 100 μL DEDA yayıldı ve lamel ile kapatılarak buzdolabında

agaroz katılaşıncaya kadar 20 dak. beklendi. Lameller agaroz zedelenmeden alındı.

Lamlar, lizis çözeltisi (62.3 mL stok lizis çözeltisi, 7 mL DMSO, 0.7 mL Triton X)

içinde 2 saat buzdolabında bekletildi. Daha sonra taze hazırlanmış soğuk elektroforez

çözeltisinde (90 mL 5 M NaOH, 7.5 mL 0.2 M EDTA) 20 dak. bekletildi.

Elektroforez tankı elektroforez çözeltisi ile dolduruldu. Elektroforez tankı buz ile

soğutularak sıcaklık +4 0C’de tutuldu. Lamlar, agaroz yayılan kısımları üste gelecek

Ģekilde tanka yerleştirildi ve sabit 15 V ve 300 mA akımda 30 dak. elektroforez

işlemi gerçekleştirildi. Oluşturulan elektrik akımı sayesinde negatif yüklü DNA

sarmal kırıklarının anoda doğru göç etmesi sağlandı. Lamlar cam şaleye yerleştirilip

nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris) ile 3 kere + 4 0C’de 5 dak. nötralize edildi.

3.5.6. Boyama

Her lam, floresan renk vermesi için 50 μL etidium bromür (20 μL/mL) ile boyandı.

Lamel ile kapatıldı ve 15 dak. bekletildi.

3.5.7. Değerlendirme

Lamlar bekletilmeden floresan mikroskobunda (Zeiss Axio Imager A1). 400x,

büyütme ile tarandı. Her bir örnek kullanılarak başına 100 hücre Open Comet

38

software (Gyori vd., 2014) kullanılarak değerlendirmeye alındı. DNA hasarının

değerlendirilmesinde OpenComet ile ilde edilen kuyruk momenti, kuyruk uzunluğu

ve kuyruk yoğunluğu parametreleri kullanıldı.

3.5.8. Comet sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi

İstatistiksel analiz IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)

paket program kullanılarak yapıldı DMSO ile muamele edilen negative control,

H2O2 ile muamele edilen pozitif control BHA ve sentez bileşikleri ile muamele

edilen test gruplarının istatistiksel karşılaştırılması ANOVA (tek yönlü varyans)

analizi ile yapıldı. Gruplar arası farklılığı ortaya koymak için LSD post-hoc testi

kullanıldı.Bütün değerler ortalama ± SD olarak ifade edildi. İstatistiksel anlamlılık

düzeyi için p<0.05 kabul edildi.

39

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

Tez kapsamında 40-0,039 μg/mL ranjında 10 farklı konsantrasyonda çinko çözeltileri

hazırlanmıştır. Çalışmada çinkonun in vitro eritrosit membran stabilizasyonu, lipit

oksidasyonu ve genotoksik etkileri sırasıyla eritrosit osmotik direnç, MDA tayini ve

comet testi ile değerlendirilmiştir.

4.1. Eritrosit Membran Stabilizasyonunu Bulguları

Çizelge 4.1. Farklı çinko konsantrasyonları ile muamele edilen insan eritrositlerinin

membran stabilitesi ile ilgili parametreleri, Şekil 4.1. % 50 hemolizi oluşturmak için

gereken tuz konsantrasyonlarını ve Şekil 4.2 ise ve tam hemoliz geçişinden sorumlu

olan tuz konsantrasyonundaki değişimin ¼’ünü göstermektedir.

40

Çizelge 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinkonun zamana göre insan eritrosit

membranının osmotik stabilitesi üzerine etkisi.

Konsantrasyon Değişkenler 0.Saat 2.Saat 3.Saat 8. Saat

TBS (20 mM) Solvent kontrol

Amax (AU) 94,66±3,26 97,98±4,09 98,25±3,55 99,22±3,88

Amin (AU) 0,04±1,89 0,47±2,45 0,77±2,16 1,19±2,38

H50 (g/dL NaCl)

0,415±0,006 0,422±0,008 0,425±0,007 0,428±0,007

dX (g/dL NaCl) 0,017±0,006 0,021±0,007 0,024±0,006 0,028±0,006

Zn (10 μg/mL) Amax (AU) 96,49±1,51 96,77±4,83 99,15±3,45 99,52±2,55

Amin (AU) 0,73±0,90 1,11±1,21 7,88±2,67 26,76±2,92

H50 (g/dL NaCl)

0,448±0,002 0,460±0,009 0,489±0,009 0,570±0,011

dX (g/dL NaCl) 0,029±0,002 0,037±0,008 0,062±0,008 0,069±0,011

Zn (5μg/mL) Amax (AU) 98,53±0,35 98,96±0,50 100,334±1,35 101,37±3,23

Amin (AU) 1,34±0,21 1,78±0,32 4,62±0,93 16,36±2,40

H50 (g/dL NaCl)

0,446±0,001 0,459±0,001 0,477±0,002 0,487±0,008

dX (g/dL NaCl) 0,019±0,001 0,025±0,001 0,034±0,002 0,053±0,007

Zn (2,5 μg/mL) Amax (AU) 96,19±0,55 96,84±0,77 98,62±1,45 100,38±0,86

Amin (AU) 1,92±0,33 2,70±0,54 4,33±0,84 5,77±0,65

H50 (g/dL NaCl)

0,444±0,001 0,454±0,001 0,468±0,002 0,475±0,002

dX (g/dL NaCl) 0,021±0,001 0,024±0,001 0,034±0,001 0,035±0,001

Zn (1,25 μg/mL) Amax (AU) 96,47±0,29 96,61±1,19 98,14±0,71 100,35±0,73

Amin (AU) 1,64±0,18 2,15±0,85 2,35±0,52 6,40±0,53

H50 (g/dL

NaCl)

0,443±0,001 0,448±0,001 0,465±0,001 0,472±0,001

dX (g/dL NaCl) 0,020±0,001 0,023±0,001 0,027±0,001 0,031±0,001

Zn (0,625 μg/mL) Amax (AU) 96,81±0,66 98,56±0,97 100,32±0,82 100,61±1,173

Amin (AU) 1,65±0,39 2,75±0,62 6,35±0,52 6,83±0,75

H50 (g/dL NaCl)

0,438±0,001 0,446±0,001 0,452±0,001 0,459±0,001

dX (g/dL NaCl) 0,019±0,001 0,022±0,001 0,025±0,001 0,031±0,001

Zn (0,313 μg/mL) Amax (AU) 93,60±1,34 95,03±1,30 96,97±1,33 97,99±1,33

Amin (AU) 1,69±0,79 1,49±0,83 3,20±0,87 5,41±0,88

H50 (g/dL NaCl)

0,436±0,001 0,444±0,002 0,448±0,002 0,450±0,002

dX (g/dL NaCl) 0,018±0,001 0,022±0,001 0,025±0,002 0,030±0,002

Zn (0,156 μg/mL) Amax (AU) 91,65±0,83 93,98±1,38 98,83±1,51 100,02±1,56

Amin (AU) 0,77±0,51 1,33±0,88 2,45±1,01 6,03±1,04

H50 (g/dL NaCl)

0,424±0,001 0,438±0,002 0,446±0,002 0,447±0,002

dX (g/dL NaCl) 0,017±0,001 0,021±0,001 0,026±0,002 0,029±0,002

Zn (0,078 μg/mL) Amax (AU) 95,72±0,93 97,04±1,25 98,34±1,70 99,02±1,78

Amin (AU) 1,46±0,55 1,62±0,78 2,03±1,11 3,12±1,17

H50 (g/dL NaCl)

0,426±0,001 0,443±0,001 0,448±0,002 0,449±0,002

dX (g/dL NaCl) 0,018±0,001 0,024±0,001 0,027±0,002 0,029±0,002

Zn (0,039 μg/mL) Amax (AU) 96,83±1,91 96,89±1,74 97,93±1,54 99,11±1,42

Amin (AU) 0,74±1,21 2,03±1,19 2,46±1,06 4,13±0,98

H50 (g/dL

NaCl)

0,435±0,002 0,446±0,002 0,455±0,002 0,458±0,002

dX (g/dL NaCl) 0,021±0,002 0,025±0,002 0,027±0,002 0,03±0,002

Sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir.

Çizelge 4.1’deki verilere göre zamana bağlı olarak tüm çinko konsantrasyonlarına

eritrisit membran stabilitesi azalmaktadır. Yüksek ve düşük çinko

41

konsantrasyonlarında eritrositlerin membran stabilizasyonunda azalma meydana

gelmektedir.

Osmotik frajilite testi ile eritrosit membran stabilitesi üzerine çinkonun etkilerinin

değerlendirilmesinde kullanılan H50 ve dX değerleri sırasıyla Şekil 4.1 ve 4.2’de

verilmiştir.

Şekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin zamana göre H50

değerleri

Şekil 4.2 ve 4.3’deki verilere göre farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele

edilen eritrositlerin membran stabilitesi hem zamana ve hem de çinko

konsantrasyonuna bağımlı olarak membran stabilitesinde azalma görülmektedir.

Ayrıca, yüksek (>0,313) μg/mL ve düşük (<0,078 μg/mL) çinko

konsantrasyonlarında eritrositlerin membran stabilizasyonundaki azalma dikkat

çekmektedir.

42

Şekil 4.2. Farklı konsantrasyonlardaki çinko ile muamele edilen eritrositlerin zamana göre dX değerleri

4.2. H2O2 – Aracılıklı Lipit Peroksidasyonu

Eritrosit süspansiyonlarının (3g/dL Hb) H2O2 ile oksidasyonun indüklenmesi üzerine

değişen çinko seviyelerinin etkisini gösteren grafik Şekil 4.3.’de ortaya koyulmuştur.

43

Şekil 4.3. Çinkonun H2O2 aracılıklı lipid oksidasyonu üzerine etkisi.

Şekil 4.3’deki grafiğe göre çinko ve H2O2 içermeyen eritrositlerin (kontrol 1) zamana

bağlı olarak oksidasyonun arttığı görülmektedir. Çinko içermeyen ancak H2O2 içeren

eritrositlerin ise zamana bağlı olarak diğer çinko içeren ve içermeyen örneklere göre

lipid peroksidasyonu düzeylerinin diğerlerine göre yüksek çıkmıştır. Çinko ihtiva

eden eritrosit süspansiyonlarında ise lipit peroksidasyonu artan çinko

konsantrasyonuna göre azalma göstermiştir.

4.3. İn-Vitro Comet Bulguları

Çinkonun periferal lenfosit DNA hasarı alkalin comet tayini yöntemi ile ortaya

koyulmuştur.

44

Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda çinko ile muamele edilen insan lenfositlerinin

comet verileri (% kuyruk DNA).

Bileşikler Konsantrasyon Kuyruk DNA Yüzdesi1,2

TBS (Solvent kontrol) 20 mM 1,30 ± 1,39c

PBS (Negatif kontrol) 10 mM 0,95 ± 1,45b

NaCl (Negatif kontrol) %0,9 0,56 ± 0,38a

Zn

40 μg/mL 2,17 ± 2,79abc

20 μg/mL 1,87 ± 2,87abc

10 μg/mL 1,28 ± 2,04

5 μg/mL 0,85 ± 0,96

2,5 μg/mL 0,70 ± 0,76c

1,25 μg/mL 0,50 ± 0,67c

0,625 μg/mL 0,26 ± 0,31c

0,313 μg/mL 0,21 ± 0,16c

0,156 μg/mL 0,34 ± 0,40c

0,078 μg/mL 0,42 ± 0,54c

0,039 μg/mL 0,51 ± 0,56 1Ortalama ± SD; Bütün değerler pozitif kontrolün (H2O2) maksimum DNA hasarı

miktarına göre belirlenen göreceli skorlarıdır. 2Aynı kolondaki farklı üstsimgeli

ortalamalar en küçük anlamlı farklar testine (LSD testi) göre anlamlı farklılıklardır.

Çinkonun periferal lenfosit DNA hasarı, alkalin comet tayini yöntemi ile ortaya

koyulmuştur. Farklı konsantrasyonda hazırlanan çinko çözeltilerinin (40 - 0,039

μg/mL) periferal lenfosit DNA hasarı, negatif kontrollere göre istatistiksel anlamlılık

düzeyleri Çizelge 4.2.’de ve farklı çinko dozlarına göre elde edilen comet’lere ilişkin

hata çubuk grafiği Şekil 4.4.’de verilmiştir.

Şekil 4.4. Farklı konsantrasyonlarda çinko’ya maruz kalan lenfosit hücrelerinden elde edilen %

kuyruk DNA kometi hata çubuk grafiği. Sonuçlar doz başına 100 comet skorlanarak

değerlendirme yapılmıştır ve ortalama değer ± standart hata olarak ifade edilmiştir.

45

5. TARTIŞMA VE SONUÇLAR

Bu tez çalışmasında farklı konsantrasyonlarda hazırlanan ZnSO4’ün eritrosit

membran bütünlüğü, lipit oksidasyonu ve DNA hasarı üzerine etkileri sırasıyla

osmotik fragilite, MDA tayini ve comet tekniği ile değerlendirilmiştir.

Çalışmamızda ZnSO4’den hazırladığımız farklı çinko konsantrasyonları, plazma

çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve açlık durumuna göre cutoff

değerleri göz önüne alınarak hazırlanmıştır ve ayrıca hazırladığımız çinko çözeltileri

çinko eksikliği ve fazlalığı durumlarında ortaya çıkacak etkileri gözlemleyebilmek

açısından da 10 faklı konsantrasyonda çözelti hazırlanmıştır. Çinko iyonlarının neden

olduğu membran hasarının bir ölçüsü olarak eritrosit hücrelerinin hemolitik direnci

belirlendi. Çizelge 4.1’de farklı inkübasyon (0-8 saat) ortamındaki çinko

konsantrasyonundaki artışın (>0,156 µg/mL), hücrelerin hemolize daha duyarlı

olmasını sağladığını göstermektedir. Ayrıca düşük konsantrasyondaki Zn (<0,078

µg/mL) ile inkübasyona bırakılan eritrositlerin hemolize duyarlılıklarının artttığı

görüldü. % 50 hemoliz oluşturan NaCl konsantrasyonları kontrolde 0. saatte

0,415±0,006 olarak bulundu. Bu değer ve tüm çinko ile muamele edilen eritroit

süspansiyonlarındaki değerlerden daha düşük olduğu göze çarpmaktadır. Ayrıca

farklı saatlerde yapılan ölçümlerden elde edilen H50 değerleri kontrole göre diğer

zinkolu eritrosit süspansiyonlarında yüksek bulundu. Çalışılan koşullar altında, 0,156

µg/mL Zn ihtiva eden eritrositler hemolize karşı diğer yüksek ve düşük Zn ile

muamele edilen eritrositlerden daha yüksek direnç gösterdikleri belirlendi (Çizelge

4.1).

Çinko iyonlarının eritrositlerinde hemoliz düzeyine olan etkisi, çinko iyonlarının,

Band 3 proteininin sitoplazmik alanına bağlanabilme, anyon transport aktivitesini

inhibe etme yeteneğine sahip olması (Tu ve Xu, 1994) nedenyle hücreler ve hücreleri

çevreleyen medyum arasında iyon değişiminin bozulması ve sonuç olarak da hücre

hemolizininin artmasına yol açmaktadır.

Şekil’4.3’deki verilere göre 40-0,078 µg/mL aralığında değişen konsantrasyonlarında

hazırlanan çinko çözeltilerinin H2O2 indüksiyonlu eritrosit lipit oksidasyonu üzerine

zamana bağlı etkileri negatif kontrol ve pozitif kontrole göre değerlendirmesi

46

görülmektedir. Şekil 4.3.’deki verilere göre artan çinko konsantrasyonuna bağlı

olarak lipit peroksidasyonunda azalma gözlenmiştir. Çalışmamızda eritrosit

süspansiyonlarına enzim inhibiörü olarak NaN3 ilave edilmemiştir. Dördüncü saatte

kadar yapılan MDA ölçümlerinin yüksek çıkması negatif ve pozitif kotrole göre

değerlendirildiğinde H2O2’ninkatalaz aracılıklı elimine edilmesindeki sürece bağlı

olabileceğini göstermektedir. Bir mikro besin olan çinkonun eritrositlerde hidrojen

peroksit-aracılıklı lipit peroksidasyona bakıldığı bu çalışmada çinkonun bir lipit

peroksidasyonu ürünü olan MDA’nın oluşumunu azalttığı dolayısıyla eritrositlerdeki

oksidatif hasarı önlemede etkili olduğu sonucu ortaya çıkmaktadır.

Comet yöntemi, besin maddeleri veya mikro besin maddelerinin genotoksik etkinin

belirlenmesi çalışmalarında comet tekniği hassas, ekonomik, pratik, tek hücrede

DNA hasarını ortaya koyması ve kısa sürede yapılabilmesi açısından tercih edilen ve

sıklıkla kullanılan genotoksik testlerden biridir.

Görüntü analizinde operatör tarafından seçilen comet’ler için flüoresan

parametrelerini değerlendiren çok sayıda yazılım paketi var. Yazılım paketlerinde

comet’lerin değerlendirilmesinde en sık kullanılan parametreler, kuyruk uzunluğu,

baş ve kuyrukların göreli floresan yoğunluğu (normal olarak kuyrukta DNA'nın bir

yüzdesi olarak ifade edilir) ve kuyruk momentidir. Ortalama kuyruk uzunluğu, ilk

belirleme aşamasında nispeten düşük hasar seviyelerinde artış gösterebildiğinden çok

yararlı değildir. Akabinde, kuyruk yoğunluğu artar, ancak hasar dozu arttıkça

uzunluk artmaz. Kuyruk uzunluğu arka plan üzerinde belirli bir aşırı flüoresan

yoğunluğu ile tanımlandığından, görüntü analizi programının arka planına veya eşik

ayarına da duyarlıdır. Göreceli kuyruk yoğunluğu parametresi, kırılma frekansı için

doğrusal bir ilişki ortaya koyduğundan eşik ayarlarından nispeten etkilenmez ve

mümkün olan en geniş aralıkta hasarın ayrımcılığına imkan sağladığından (teoride,

kuyrukta %0 ila %100 DNA) en yararlı parametre olarak gözükmektedir. Bunun

aksine, kuyruk momenti parametresi (aslında kuyruk uzunluğu ve kuyruk yoğunluğu

ürünüdür) doza göre doğrusal değildir ve comet görünümüne dair herhangi bir

izlenim ortaya koymaz. Slayt başına 50 comet analizinin yapılması önerilmektedir

(Collins, 2004).

47

Yaptığımız çalışmada çinkonun lenfosit DNA’sı üzerine etkileri ortaya koyma

amacıyla yapmış olduğumuz comet analizindeki konsantrasyonları, düşük-normal ve

yüksek plazma çinko seviyelerini yansıtacak şekilde ayarlandı. Çalışmamızın

verilerine göre, Çözücü kontrolün (TBS) negatif kontrollere ve 5-0,078 µg/mL çinko

ihtiva eden örneklere göre yüksek seviyede DNA hasarı oluşturduğu gözlenmiştir.

TBS’ye bağlı DNA hasarı muhtemelen trisinden kaynaklanmaktadır ve 5-0,078

µg/mL çinko ihtiva eden örneklere göre oluşan DNA hasarı istatistiksel olarak da

anlamlıdır (p<0,05). Yüksek çinko konsantrasyonunda (20-40 µg/mL) oluşan DNA

hasarı konsantrasyona bağımlı olarak hem solvent ve hem de negatif kontrollerden

yüksek çıkmış olup, DNA hasarındaki bu artış istatistiksel olarak da anlamlı

bulunmuştur (p<0,005). En düşük DNA hasarına ise 0,313 µg/mL çinko

konsantrasyonunda ulaşılmıştır ve DNA hasarındaki azalma solvent kontrole göre

istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Çinko konsantrasyonunun 0,313

µg/m’nin altında olduğu durumlarda ise DNA hasarı çinko konsantrasyonundaki

azalmaya bağımlı olarak artış göstermiştir. Çizelge 4.4’de çinko seviyelerinin DNA

hasarı üzerine etkileri istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.

Çinko, çok sayıda makromolekülün yapısı ve fonksiyonunun yanı sıra 300'den fazla

enzimatik reaksiyon için esansiyel bir elementtir. Toplam insan vücudundaki çinko

içeriğinin 30 mmol (2 g) olduğu tahmin edilmektedir ve turnoveri tamamen

homeostatik kontrol altındadır. Diyetteki bu mikro besin maddesinin eksikliği ile

ilgili çalışmalar yapılmış olup eksikliğinde büyüme yetersizliği, nöropati, diyare,

dermatit, hipotansiyon ve hipertermi ortaya çıkmaktadır (Jenner vd., 2007; Tapiero

ve Tew, 2003; Taysi vd., 2003).

Çinkonun genellikle toksik olmadığı düşünülmektedir. Aşırı çinko bakır toksisitesine

neden olduğu düşünülmekle birlikte çoğu klinik durumda pratik bir öneme sahip

olmadığı ileri sürülmektedir. Örneğin, bebeklerde 4 ay süreyle günde 10 mg'lık çinko

takviyesinin, hipokupremi ile ilişkili olmadığı bulunmuştur (Yakoob vd., 2011).

Ergenlik dönemindeki erkek çocuklarda yapılan dört aylık deneme çalışmasında, 5 -

10 mg/gün olarak verilen ilave çinkonun bakır statüsü ile ilişkili olumsuz etkilere

dair hiçbir kanıt elde edilememiştir (Buhutta vd., 2000; Lazzerini ve Ronfani, 2013).

Aşırı çinko alınımının, otizmde bir faktör olduğu öne sürülmesine rağmen, yapılan

48

kontrollü çalışmalarda böyle bir ilişkinin olduğu ispatlanamamıştır (Galvao vd.,

2013).

Birçok çalışma ve meta-analizler, çinko desteğinin plazma çinko konsantrasyonunu

arttırdığını ifade etmektedirler. Bu araştırmalara ilaveten, plazma çinko

konsantrasyonunun ek çinkoya tepkisinin doz-yanıtını veya zaman sürecini inceleyen

birkaç çalışma mevcuttur. Bu çalışmalar, plazma çinkosundan sağlanan doz veya ek

çinko miktarı ile ilişkili olarak hem çocuklarda hem de yetişkinlerde çinko desteğine

sürekli ve oldukça hızlı tepki verdiğini göstermektedir. Çinko desteğinin geri

çekilmesinden sonra plazma çinko konsantrasyonunu 1-2 hafta içinde başlangıç

seviyesine geri dönmektedir (King vd., 2015).

Plazma çinko konsantrasyonu ile çinko eksikliğinin klinik bulguları arasındaki

ilişkiyi değerlendirmek için, deneysel çinko deplesyon/replesyon çalışmaları ve

akrodermatitis enteropatika (AE) tanısı alan bireylerde yapılmış olan çalışmalardan

elde edilen veriler incelenmiştir (Wessells vd., 2014). Aynı çalışmada, deneysel

çinko deplesyon/replesyon çalışmalarında olduğu gibi, AE'li hastalarda klinik

bulguların varlığı ile düşük plazma çinko seviyesi arasında açık bir ilişki mevcuttur.

Spesifik olarak, AE'nin klinik belirtilerinin bulunduğu günlerde ortalama 6 SD

plazma çinko konsantrasyonu (PÇK) 38 ± 21 mg/dL iken tedavi sonrasında klinik

bulguların artık mevcut olmadığı günlerde ortalama 6 SD PÇK 102 ± 35 mg/dL

olarak bulunmuştur. Wessells ve arkadaşları (2014) 6 SD PÇK değerinin, çinko

eksikliği ile ilişkili klinik belirtileri geliştiren, diyetteki çinko tükenmesine maruz

kalan hastalarda anlamlı olarak düşük olduğunu ve cutoff değerinin 50 mg/dL olarak

uygulandığında, eksikliğin klinik belirtilerini saptamaya yönelik PÇK'nin duyarlılığı

ve özgüllüğü sırasıyla % 82 ve % 92 olarak belirlemişlerdir. Çinko eksikliği

riskininin değerlendirilmesinde önerilen plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş

gruplarına, cinsiyete ve açlık durumuna göre cutoff değerleri Çizelge 5.1. de

verilmiştir.

49

Çizelge 5.1. Plazma çinko konsantrasyonlarının, yaş gruplarına, cinsiyete ve açlık

durumuna göre cutoff değerleri (King vd., 2015; Hotz ve Brown, 2004;

Pilch ve Senti, 1984)

Açlık durumu ve

günün zamanı

Plazma çinko konsantrasyonu µg/dL

Çocuk < 10 yaş Bayan ≥ 10 yaş Erkek ≥ 10 yaş

Sabah, açlık - 70 74

Sabah, tokluk 65 66 70

Öğleden sonra 57 59 61

Tam kandaki çinko konsantrasyonu 4-8 mg/mL'dir. Eritrosit paketinin çinko içeriği

normalde 8-14 mg/g yaş ağırlık veya 10-11 mg/1010 hücre'dir (Brown vd., 1998).

Çinko beslenmesinin biyolojik belirteçleri olarak kan hücresel çinko

konsantrasyonlarının kullanışlılığı üzerine yapılan çalışmalar karmaşık sonuçlar

ortaya koymaktadır. Deneysel insan çinko deplesyon/replesyon çalışmaları veya

uzun süreli çinko desteği (örneğin 50 mg/gün), eritrosit çinko, eritrosit zar çinkosu,

lökosit çinko veya lökosit alt popülasyonlarının çinko içeriğinde çinko seviyeleri ile

uyumlu değişiklikler göstermemektedir (Raiten ve Comps, 2015). Gerçekten de, bazı

çinko deplesyon çalışmalarında fonksiyonel çinko deplesyonunun iki potansiyel

biyobelirteci olan tat duyarlılığının ve bağışıklığın baskılanmasına rağmen eritrosit

veya lökosit çinko konsantrasyonlarında kayda değer herhangi bir cevap

belirlenememiştir. Bu duruma ilaveten, hücresel çinko konsantrasyonları için

belirlenmiş referans değerlerinin olmaması, kan hücrelerinin ayrımı ve fazla

miktarda kana ihtiyaç duyulması sonuçların yorumlanmasını da zorlaştırmaktadır.

Gıda ve Beslenme Kurulu, diyetteki çinko alımları için tolore edilebilir üst alım

seviyesini (UL) belirlemişlerdir. UL'nin üstündeki uzun-süreli alımlar olumsuz sağlık

etkileri riskini artırdığı bilinmektedir (Akhtar, 2013). UL, yetişkinlerde> 50 mg/gün

çinko alınımının, bakır bağımlı enzim eritrosit Cu, Zn süperoksit dismutaz

aktivitesini azalttığını gösteren verileri temel almaktadır. Belirsizlik faktörü için

düzeltme yapıldıktan sonra, UL yetişkinler için 40 mg/gün olarak ayarlanmıştır.

Çocuklar için UL, 6 - 11 ay arasında bebeklerde 5 mg/gün ve 14 - 18 yaşları arasında

ergenlerde ise 34 mg/gün arasında değişmektedir (Bertinato vd., 2013).

Tüm vücut çinkosunun yaklaşık % 99'u hücre içindedir (Jackson, 1989). Dokulardaki

toplam çinko miktarı, plazmadan çok daha fazla olduğu için, karaciğer gibi dokuların

çinko içeriğindeki nispeten küçük değişiklikler PÇK üzerinde çarpıcı bir etkiye sahip

50

olabilmektedir. Örneğin glukokortikoid tedavisi, hepatik MT'yi indükleyerek

çinkonun karaciğere girişini artırmakta ve dolayısıyla da plazma çinkosunda belirgin

bir düşüşe neden olmaktadır (Cousins, 1989). Bu durum, tam kan konsantrasyonları

ve PÇK'leri içeren çinko durumunun sistemik belirteçlerinin neden orta düzeyde

çinko eksikliğini yansıtmadığını açıklayabilmektedir. Yakın tarihli çalışmalar,

hücresel çinkonun düzenlenmesinin kompleks olduğunu ve hücresel çinko

turnoverini ayarlamak için hızlı ve yavaş mekanizmaların yer alabileceğini

göstermektedir (Maret, 2013). Lökosit veya eritrosit çinko konsantrasyonları

diyetteki çinko değişikliklerine cevap vermese de, hücre altı birimlerinin çinko

konsantrasyonları ve çeşitli hücresel fonksiyonlar ile ilgili araştırmalar, yeni çinko

statüsü için biyolojik belirteçlerin ortaya koyulmasına yol açabilir.

Çinko terapisi akrodermatitis enteropatika ve Wilson’s hastalığı olan bireylerde

oldukça başarılıdır ve sağlığa bağlı yaşam kalitesi üzerinde oldukça etkilidir. Çinko

süplementasyonunun olumlu terapötik çevapları çocuklarda akut diyare, kronik

hepatit C, Shigella enfeksiyonu, cüzam, şark çıbanı ve nezlede gözlenmiştir.

Çinkonun bu yegane özellikleri insanlarda görülen çeşitli hastalıklarda anlamlı olarak

yararlı terapötik etkilere sahiptir. Özellikle çinko eksikliği ile seyreden hastalıklar

oldukça karmaşık hale gelebilir ve immünolojik durumu olumsuz olarak, oksidatif

stresi artırarak ve enflamatuar sitokinlerin üretimini artırarak klinik taployu karmaşık

hale getirebilir. Oksidatif stres ve kronik inflamasyon eterosikleroz, çeşitli

malignansiler, nörolojik bozukluklar ve otoimmün hastalıklar gibi birçok kronik

hastalıkta önemli nedensel rol oynamaktadır (Prasad 2009). Diğer taraftan aşırı çinko

alınımına bağlı olarak akut ve kronik çinko zehirlenmesi oluşabilmektedir. Aşırı

çinko hücreler için toksiktir (Pagani vd., 2007). Dolayısıyla hücresel çinko seviyesi

uygun ranjlar (0,1 ve 0,5 mM) içersinde tutulması gerekmektedir (Eide, 2006).

Çinko, vücut sıvılarında ve hücrelerde çinko (II) iyonu olarak bulunur ve redoks-

inerttir. Yine de, antioksidan özelliklere sahip olduğu yaygın olarak kabul

edilmektedir (Bray ve Bettger, 1990; Prasad vd., 2007). Çinko antioksidan özellikleri

dolaylı bir antioksidan görevi görebileceğinden, "pro-antioksidan" terimi daha

uygundur (Maret, 2008). Bununla birlikte, çinko, sınırlı çinko konsantrasyonları

aralığında anti-oksidan fonksiyonları kolaylaştırır. Bu aralığın dışında, çinko bir pro-

oksidandır. Dolayısıyla da çinko eksikliği ve çinko aşırılığı oksidatif strese ve reaktif

51

oksijen türlerinin fazla üretilmesine neden olabilmektedir (Eide, 2011; Oteiza vd.,

1995).

Çinko eksikliğine bağlı oksidatif stresden sorumlu moleküler mekanizmalar, pro-

antioksidan çinko fonksiyonlarının sürdürülmesinin yetersizliğinden

kaynaklanmaktadır. Çinko eksikliğinde, genellikle çinkoyu bağlayan ve çinko

tamponlamasına katılan hücresel sülfidriller reaktif oksijen türleri oluşturmak üzere

bakır ve demir ile tepkimeye girerler. Buna ek olarak, çinko eksikliğinde antioksidan

savunmaya katılan MT ve enzimlerin uyarılması sonucu durumu daha da

kötüleştirmektedir. Yüksek çinko konsantrasyonlarında ise, çinko, tioredoksin ve

glutatyon redüktaz gibi antioksidan enzimleri ve reaktif oksijen türlerinde eş zamanlı

artışlarla birlikte mitokondriyal solunum zincirinin bileşenlerini (kompleks II ve III)

inhibe etmektedir. Ek olarak, yüksek, uzun süreli çinko takviyesi, bir pro-oksidan

olan ikincil bakır eksikliğine neden olabilmektedir (King vd., 2015).

Çinkonun anti-oksidan özelliği birçok insan çalışmaları ile ortaya koyulmaya

çalışılmıştır. Sağlıklı erişkin gönüllülere 8 hafta boyunca 45 mg çinko/gün olarak

yapılan çinko takviyesinin oksidatif stres biyobelirteçlerinde azalmaya yol

açmaktadır (Prasad, 2004). Orta yaşlı ya da yaşlı gönüllülere 12 ay boyunca 45 mg

çinko/gün verilmesi durumunda inflamatuar biyobelirteçlerde de azalma görülmüştür

(Prasad vd., 2007). Çinkonun oksidatif stres veya inflamasyon belirteçleri üzerindeki

ılımlı artış ve azalma hassasiyetini belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç

olduğu yapılan çalışmalarda ifade edilmektedir.

Çinko aynı zamanda çinko eksikliğinin DNA mutasyonları üzerindeki etkisiyle

kanser ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Birçok DNA onarım mekanizmasında

çinko önemli yer tutmaktadır. Örneğin, tümör süpresör proteini p53 düşük hücre içi

çinko ile işlev kaybına uğramaktadır ve DNA onarımı için sorun oluşturmaktadır

(Ho, 2004). Çinko eksikliğinde, oksidatif stres ve DNA hasarında artma meydana

gelmektedir. Bu durum, artan DNA hasarı ile birlikte yetersiz DNA onarım

mekanizmaları sinyali nedeniyle daha da kötüleşir. Deney hayvanları ve insanlar

üzerindeki çalışmalar, aşırı çinko eksikliğinin veya yetersizliğinin DNA onarımını

bozduğunu ve DNA zincir kırıklıklarının sayısını arttırdığını göstermektedir (Song

vd., 2009). Yapılan diğer çalışmalarda, Çinko eksikliğine bağlı olarak DNA zincir

52

kırıklarındaki artışın çinko alımındaki değişiklikler ile ortaya çıkmış gibi görünse de,

bu kırılmalar çinko eksikliği için spesifik bir biyobelirteç olamayacağını ifade

etmektedirler ve bu duruma ilaveten kolin, folat ve niasin'in yetersizliği durumunda

da DNA hasarında artış olabileceği vurgulanmaktadır (Kirkland, 2012; Zeisel, 2011).

Diğer bir araştırıcı, özetle, kişilerin çinko ve redoks durumu birbirleri ile bağlantılıdır

ve bu bağlantı durumunun ise hastalık etiyolojisi ve patogenezinde önemli bir faktör

olduğunu ileri sürmekle birlikte çinko durumunun oksidatif stres belirteçleri ile

değerlendirmesinde ikincil veya ikame faktörü olarak kabul edilmesi gerektiğini ve

birçok başka etkenin redoks durumunu değiştirdiğinden, bu oksidatif stres

biyobelirteçlerinin çinko durumunun değerlendirilmesi için spesifik olmadığını ifade

etmektedir (King vd., 2015).

Çizelge 5.2. Olası, yeni geliştirilen ve yararlı olmayan çinkonun biyolojik belirteçleri

(King vd., 2015).

Potansiyel Yeni geliştirilen Kullanışsız

Tanımlar Umut vaad eden biyolojik

belirteçler; ancak veriler,

popülasyonlarda çinko

yetersizliğini gösteren

spesifik cutoffların belirlenmesi için

yetersizdir

Çinko alınımı veya

durumu ile ilişkisi için

bazı teorik temellerin

bulunduğu

biyobelirteçler; ancak bu testler ilişkiyi

doğrulamada yetersizdir.

Çinko alımına

veya durumuna

sürekli olarak

bağlı olmayan

biyolojik belirteçler

Biyobelirteçler İdrar çinkosu Tırnak çinkosu Çinko-bağımlı

enzimler

Saç çinkosu Çinko-bağımlı proteinler Eritrosit ve

lökosit çinkosu

Nörodavranışsal

fonksiyonlar

Oksidatif stres ve DNA

bütünlüğü

Çinko kinetikleri

Tat keskinliği

Çeşitli popülasyonlardaki ve patofizyolojik olaylarda çinko beslenme düzeyini

yansıtan spesifik, hassas bir çinko biyobelirteçinin yetersizliği göz önüne alındığında,

yeni biyolojik belirteçleri tanımlamak veya doğrulamak için araştırmalara ihtiiyaç

duyulmaktadır. Halihazırda sıklıkla çinko durumunu belirlemede kullanılan

biyobelirteçler Çizelge 5.2.’de verilmiştir. Bu biyobelirteçlerin hepsi, çinko alımıyla

veya durumuyla teorik bir ilişkiye sahiptir, ancak çinko beslenmesindeki

değişikliklere duyarlılıkları ve özgüllükleri daha fazla çalışmaya ihtiyaç

duymaktadır.

53

6. ÖNERİLER

İnsan biyolojik sistemlerinde çinkonun tüm vücut sıvılarında ve ayrıca doku ve hücre

bölümlerinde bulunması, yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçların birbirinden

farklılıklar arzetmesi ve yetersiz çinko alımının yanıtlarının karmaşıklığını

açıklamaktadır. Marjinal çinko eksikliği, çocuklarda fiziksel gelişim geriliği ile

bağlantılı olmasına rağmen, marjinal çinko alımına metabolik cevap konusunda

kapsamlı çalışmalar yalnızca erişkinlerde yürütülmüştür; çinko eksikliğine karşı daha

savunmasız olan bebekler ve çocuklar için karşılaştırılabilir bilgiler mevcut değildir.

Ayrıca, doku çinko konsantrasyonlarını ve düşük çinko alımı sonucunda fonksiyonel

işlevi sürdürmek için oluşan güçlü homeostatik mekanizmalar, çinko eksikliğini

tespit etme kabiliyetimizi ciddi şekilde etkilemektedir.

Günümüzde, popülasyonlara özgü çinko durumunu belirlemede aşağıdaki 3 gösterge

kullanılır. Bu üç gösterge; Çinko alımının tahmini ortalama ihtiyacın (EAR)

altındakilerin prevalansı, düşük PÇK'lilerin yüzde oranı ve yaşı 5'in altında olan

büyüme geriliği ile karakterize çocukların yüzdesidir. Klinik ortamda çinko

açısından beslenmeyi iyileştirmek için PÇK'lerden daha hassas olan çinko statüsünde

bir biyobelirteç gereklidir. Çeşitli potansiyel veya klinik olarak ortaya çıkan çinko

biyolojik belirteçleri tespit edilmiştir (örneğin saç, tırnak ve üriner çinko

konsantrasyonları, çinkoya bağımlı protein konsantrasyonları, çinko kinetik

belirteçleri ve DNA onarım işlevleri).

Yukarıda bahsedilen durumlar göz önünde bulundurulduğunda, bu biyolojik

belirteçlerin bireylerin veya popülasyonların çinko durumunu değerlendirmesi

amacıyla kullanılmasından önce önemli ölçüde araştırma yapılması gerekmekteve

yapılan araştırmaların sonucuna göre ve spesifik, hassas bir çinko biyobelirtecine

ihtiyaç vardır.

Günümüzde, ulusal veya uluslararası düzeyde koruyucu çinko programı faaliyetleri

yoktur. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), yetersiz çinko beslenmesini önlemek için

tasarlanmış büyük ölçekli çinko grişimleri için yönergeler oluşturmamıştır.

Dolayısıyla, hassas, spesifik çinko biyobelirteçleri olmadan program planlamacıları,

koruyucu çinko müdahalelerine olan ihtiyaç ve etkilerini ölçmek için nasıl mücadele

ediyorlar. Buna ek olarak, en uygun dozun, doz sıklığının, farmasötik formununun,

54

dağıtım organizasyonların (örneğin, Çocuk Sağlığı Günleri, büyüme izleme veya

çoklu mikro besin tozlarının dağıtımı gibi), etkili olan dağıtım platformlarının

(örneğin, klinikler, sağlık merkezleri, pazar temelli erişim noktaları, topluluk

merkezleri veya sosyal koruma programları) uygulanabilirliği ve etkinliğinin

belirlenmesi gerekmektedir.

Çalışmamızdan elde ettiğimiz sonuçlara göre, ZnSO4'ün, kullanılan doza bağımlı

olarak güçlü bir genotoksik ajan olarak DNA hasarını indükleyebilmektedir. Ayrıca,

Zn ve Zn tuzlarının DNA hasarını uyarma etkisi göz önüne alındığında, çinko ve

çinko bileşiklerine maruz kalma dikkate alınması gerekmektedir.

55

KAYNAKLAR

Agren, M.S., 1990. Percutaneous Absorption of Zinc from Zinc Oxide Applied

Topically to İntact Skin in Man. Dermatologica,180, 36-39.

Agren, M.S.; Krusell, M.; Franzen, L. 1991. Release and Absorption Of Zinc from

Zincoxide and Zinc Sulfate in Open Wounds. Acta Dermato.-Venereol. 71,

330-333.

Akhtar, S. 2013. Zinc Status in South Asian Populations—an Update. Journal of

Health, Population, and Nutrition, 31(2), 139.

Alam, S.; Kelleher, S.L. 2012. Cellular Mechanisms of Zinc Dysregulation: A

Perspectiveon Zinc Homeostasis as an Etiological Factor in the

Development and Progression of Breast Cancer. Nutrients, 4, 875–903.

Alayash AI, Patel RP, and Cashon RE. 2001. Redox Reactions of Hemoglobin and

Myoglobin: Biological and Toxicological İmplications. Antioxid Redox

Signal 3: 313–327

Andreini C, Banci L, Bertini I, Rosato A. 2006. Counting the Zinc-Proteins Encoded

İn The Human Genome. J Proteome Res 5: 196–201,

Andreini C, Bertini I, Cavallaro G. 2011. Minimal Functional Sites Allow a

Classification of Zinc Sites in Proteins. PLoS One 6: e26325,

Andrews, G.K. 2000. Regulation of Metallothionein Gene Expression by Oxidative

Stress and Metal İons. Biochem. Pharmacol., 59, 95–104.

Arcasoy A. 2002. Çinko ve çinko eksikliği. Ankara Talasemi Derneği Yayınları; 2.

Baskı,1-23. 2.

Aydemir, T.B.; Chang, S.M. 2012. Zinc Transporter ZIP14 Functions in Hepatic

Zinc, İron and Glucose Homeostasis During The İnnate İmmune Response

(Endotoxemia). PLoS ONE, 7, e48679.

Azqueta, A. Shaposhnikov, S. Collins, A.R., 2009. DNA Oxidation: Investigating İts

Key Role in Environmental Mutagenesis with The Comet Assay. Mutation

Research, 674, 101-108.

Bao, B., Prasad, A. S., Beck, F. W., Fitzgerald, J. T., Snell, D., Bao, G. W., Cardozo,

L. J. 2010. Zinc decreases C-Reactive Protein, Lipid Peroxidation, and

Inflammatory Cytokines In Elderly Subjects: A Potential Implication Of

Zinc as an Atheroprotective Agent–. The American Journal of Clinical

Nutrition, 91(6), 1634-1641

Belcher, J. D., Chen, C., Nguyen, J., Zhang, P., Abdulla, F., Nguyen, P., Vercellotti,

G. M. 2017. Control of Oxidative Stress and Inflammation in Sickle Cell

Disease with the Nrf2 Activator Dimethyl Fumarate.Antioxidants Redox

Signaling, 26(14), 748-762.

56

Bentley, P. J., Grubb, B. R. 1991. Experimental Dietary Hyperzincemia Tissue

Disposition of Excess Zinc in Rabbits. Trace Elements in Medicine, 8(4),

202-207

Berg, J. M., Shi, Y. 1996. The Galvanization of Biology: a Growing Appreciation for

the Roles of Zinc. Science, 271(5252), 1081-1085.

Bertinato, J., Simpson, J. R., Sherrard, L., Taylor, J., Plouffe, L. J., Van Dyke, D.,

Vresk, L. 2013. Zinc Supplementation Does Not Alter Sensitive Biomarkers

of Copper Status in Healthy Boys. The Journal of Nutrition, 143(3), 284-

289.

Bhutta, Z. A., Bird, S. M., Black, R. E., Brown, K. H., Gardner, J. M., Hidayat, A.,

Rosado, J. L. 2000. Therapeutic Effects of Oral Zinc in Acute and Persistent

Diarrhea in Children in Developing Countries: Pooled Analysis of

Randomized Controlled Trials. The American Journal of Clinical Nutrition,

72(6), 1516-1522.

Biagiotti, S., Menotta, M., Orazi, S., Spapperi, C., Brundu, S., Fraternale, A.,

Magnani, M. 2016. Dexamethasone İmproves Redox State in Ataxia

Telangiectasia Cells by Promoting an NRF2‐Mediated Antioxidant

Response. The FEBS Journal, 283(21), 3962-3978.

Bitanihirwe, B. K., Cunningham, M. G. 2009. Zinc: The Brain's Dark Horse.

Synapse, 63(11), 1029-1049.

Bonaventura, P., Benedetti, G., Albarède, F., Miossec, P. 2015. Zinc and İts Role in

İmmunity and İnflammation. Autoimmunity Reviews, 14(4), 277-285.

Bostanci, Z., Mack Jr, R. P., Lee, S., Soybel, D. I., Kelleher, S. L. 2015. Paradoxical

Zinc Toxicity and Oxidative Stress in the Mammary Gland During Marginal

Dietary Zinc Deficiency. Reproductive Toxicology, 54, 84-92.

Bray, T. M., Bettger, W. J. 1990. The physiological Role of Zinc as an Antioxidant.

Free Radical Biology and Medicine, 8(3), 281-291.

Briefel, R.R., Bialostosky, K., Kennedy-Stephenson, J., McDowell, M.A., Ervin,

R.B., Wright, J. D. 2000. Zinc İntake of the US Population: Findings from

The Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988–

1994. The Journal of Nutrition, 130(5), 1367S-1373S.

Brown, A. M., Kristal, B. S., Effron, M. S., Shestopalov, A. I., Ullucci, P. A., Sheu,

K. F. R., ... Cooper, A. J. 2000. Zn2+ İnhibits α-ketoglutarate-Stimulated

Mitochondrial Respiration and the İsolated α-ketoglutarate Dehydrogenase

Complex. Journal of Biological Chemistry, 275(18), 13441-13447.

Brown, J. L. 1988. Zinc Fume Fever. The British journal of Radiology, 61(724), 327-

329.

Brown, K. H., Peerson, J. M., Allen, L. H. 1998. Effect of Zinc Supplementation on

Children Growth: a Meta-Analysis of İntervention Trials. In Role of Trace

Elements for Health Promotion and Disease Prevention (Vol. 54, pp. 76-83).

Karger Publishers.

57

Brown, M. A., Thom, J. V., Orth, G. L., Cova, P., Juarez, J. 1964. Food Poisoning

İnvolving Zinc Contamination. Archives of Environmental Health: An

International Journal, 8(5), 657-660.

Brownlee, N. R., Huttner, J. J., Panganamala, R. V., Cornwell, D. G. 1977. Role of

Vitamin E in Glutathione-İnduced Oxidant Stress: Methemoglobin, Lipid

Peroxidation, and Hemolysis. Journal of Lipid Research, 18(5), 635-644.

Bryan, S., Baregzay, B., Spicer, D., Singal, P. K., Khaper, N. 2013. Redox-

İnflammatory Synergy in The Metabolic Syndrome. Canadian journal of

Physiology and Pharmacology, 91(1), 22-30.

Bunn, H. F., Jandl, J. H. 1968. Exchange of Heme Among Hemoglobins and

Between Hemoglobin and Albumin. Journal of Biological Chemistry,

243(3), 465-475.

Butterfield, D. A., Di Domenico, F., Barone, E. 2014. Elevated Risk of Type 2

Diabetes for Development of Alzheimer Disease: A Key Role for Oxidative

Stress in Brain. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of

Disease, 1842(9), 1693-1706.

Chasapis, C. T., Loutsidou, A. C., Spiliopoulou, C. A., Stefanidou, M. E. 2012. Zinc

and Human Health: an Update. Archives of Toxicology, 86(4), 521-534.

Chimienti, F., Aouffen, M., Favier, A., Seve, M. 2003. Zinc Homeostasis-Regulating

Proteins: New Drug Targets for Triggering Cell Fate. Current Drug Targets,

4(4), 323-338.

Clayton, P. T. 2017. Inherited Disorders of Transition Metal Metabolism: An

Update. Journal of Inherited Metabolic Disease, 40(4), 519-529.

Clegg, M. S., Hanna, L. A., Niles, B. J., Momma, T. Y., Keen, C. L. 2005. Zinc

Deficiency‐İnduced Cell Death. IUBMB Life, 57(10), 661-669.

Clemens, M. R., Waller, H. D. 1987. Lipid Peroxidation in Erythrocytes. Chemistry

and Physics of Lipids, 45(2-4), 251-268.

Collins, A. R. 2004. The Comet Assay for DNA Damage and Repair. Molecular

Biotechnology, 26(3), 249.

Cousins, R. J. 1985. Absorption, Transport, and Hepatic Metabolism of Copper and

Zinc: Special Reference to Metallothionein and Ceruloplasmin.

Physiological Reviews, 65(2), 238-309.

Cousins, R. J. 1989. Systemic Transport of Zinc. In Zinc in Human Biology (pp. 79-

93). Springer, London.

Coyle, P., Philcox, J. C., Carey, L. C., Rofe, A. M. 2002. Metallothionein: The

Multipurpose Protein. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 59(4),

627-647.

Fernandes Cruz, J. B., Freire Soares, H. 2011. Uma Revisão Sobre O Zinco. Ensaios

e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, 15(1), 207-222.

58

Cruz, K. J. C., de Oliveira, A. R. S., do Nascimento Marreiro, D. 2015. Antioxidant

Role of Zinc in Diabetes Mellitus. World journal of Diabetes, 6(2), 333-337.

Cui, L., Takagi, Y., Sando, K., Wasa, M., Okada, A. 2000. Nitric Oxide Synthase

İnhibitor Attenuates İnflammatory Lesions in the Skin of Zinc-Deficient

Rats. Nutrition, 16(1), 34-41.

Cui, L., Takagi, Y., Wasa, M., Sando, K., Khan, J., Okada, A. 1999. Nitric Oxide

Synthase İnhibitor Attenuates İntestinal Damage İnduced by Zinc

Deficiency in Rats. The Journal of Nutrition, 129(4), 792-798.

Cummings, J. E., Kovacic, J. P. 2009. The Ubiquitous Role of Zinc in Health and

Disease. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 19(3), 215-

240.

Dikilitaş M, Koçyiğit A. 2010. Canlilarda “Tek Hücre Jel Elektroforez” Yöntemi İle

DNA Hasar Analizi (Teknik Not): Comet Analiz Yöntemi. Journal Of

Agriculture Faculty Of Harran University, 14, 77-82.

Dinçer Y, Kankaya S. 2010. DNA Hasarının Belirlenmesinde Comet Assay. Turkiye

Klinikleri Journal of Medical Sciences, 30(4), 1365-73

Dineley, K. E., Votyakova, T. V., Reynolds, I. J. 2003. Zinc İnhibition of Cellular

Energy Production: İmplications for Mitochondria and Neurodegeneration.

Journal of Neurochemistry, 85(3), 563-570.

Duranton, C., Huber, S. M., Lang, F. 2002. Oxidation İnduces a Cl−‐Dependent

Cation Conductance in Human Red Blood Cells. The Journal of Physiology,

539(3), 847-855.

Eder, H. A., Finch, C., McKee, R. W. 1949. Congenital Methemoglobinemia. A

Clinical and Biochemical Study of a Case. The Journal of Clinical

İnvestigation, 28(2), 265-272.

Eide, D. J. 2011. The Oxidative Stress of Zinc Deficiency. Metallomics, 3(11), 1124-

1129.

Eide, D.J., 2006. Zinc Transporters and the Cellular Trafficking of Zinc. Biochim

Biophys Acta, 1763(7), 711–722.

Feng, B., Ruiz, M. A., Chakrabarti, S. 2012. Oxidative-Stress-İnduced Epigenetic

Changes in Chronic Diabetic Complications. Canadian journal of

Physiology and Pharmacology, 91(3), 213-220.

Feng, P., Li, T., Guan, Z., Franklin, R. B., Costello, L. C. 2008. The involvement of

Bax in Zinc-İnduced Mitochondrial Apoptogenesis in Malignant Prostate

Cells. Molecular Cancer, 7(1), 25.

Feng, P., Li, T. L., Guan, Z. X., Franklin, R. B., Costello, L. C. 2002. Direct Effect

of Zinc on Mitochondrial Apoptogenesis in Prostate Cells. The Prostate,

52(4), 311-318.

Fidan, A. F. 2008. DNA Hasar Tespitinde Tek Hücre Jel Elektroforezi. Afyon

Kocatepe Üniversitesi Fen Ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 8(1), 41-52.

59

Formigari, A., Irato, P., Santon, A. 2007. Zinc, Antioxidant Systems and

Metallothionein in Metal Mediated-Apoptosis: Biochemical and

Cytochemical Aspects. Comparative Biochemistry and Physiology Part C:

Toxicology Pharmacology, 146(4), 443-459.

Foster, M., Chu, A., Petocz, P., Samman, S. 2014. Zinc Transporter Gene Expression

and Glycemic Control in Post-Menopausal Women with Type 2 Diabetes

Mellitus. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 28(4), 448-

452.

Foster, M., Samman, S. 2010. Zinc and Redox Signaling: Perturbations Associated

with Cardiovascular Disease and Diabetes Mellitus. Antioxidants redox

signaling, 13(10), 1549-1573.

Fox, M.R.S. 1989. Zinc Excess. In Zinc in Human Biology; Mills, C.F., Ed.;

Springer Verlag: New York, NY, USA,; pp. 366-368.

Fraker, P. J., Telford, W. G. 1997. A Reappraisal of the Role of Zinc in Life and

Death Decisions of Cells. Proceedings of the society for Experimental

Biology and Medicine, 215(3), 229-236.

Fukamachi, Y., Karasaki, Y., Sugiura, T., Itoh, H., Abe, T., Yamamura, K., Higashi,

K. 1998. Zinc Suppresses Apoptosis of U937 Cells İnduced By Hydrogen

Peroxide Through An İncrease of the Bcl-2/Bax ratio. Biochemical and

Biophysical Research Communications, 246(2), 364-369.

Fung, E. B., Gildengorin, G., Talwar, S., Hagar, L., Lal, A. 2015. Zinc Status Affects

Glucose Homeostasis and İnsulin Secretion in Patients with Thalassemia.

Nutrients, 7(6), 4296-4307.

Furuta, T., Ohshima, C., Matsumura, M., Takebayashi, N., Hirota, E., Mawaribuchi,

T., Nagasawa, K. 2016. Oxidative Stress Upregulates Zinc Uptake Activity

Via Zrt/Irt-like Protein 1 (ZIP1) in Cultured Mouse Astrocytes. Life

Sciences, 151, 305-312.

Galvao, T. F., Pontes, R. F., Silva, M. T., Pereira, M. G. 2013. Zinc Supplementation

for Treating Diarrhea in Children: a Systematic Review and Meta-Analysis.

Revista Panamericana de Salud Publica, 33, 370-377.

Ghosh, S., Adisa, O. A., Chappa, P., Tan, F., Jackson, K. A., Archer, D. R., Ofori-

Acquah, S. F. 2013. Extracellular Hemin Crisis Triggers Acute Chest

Syndrome in Sickle Mice. The Journal of Clinical İnvestigation, 123(11),

4809-4820.

Gladwin, M. T., Shelhamer, J. H., Schechter, A. N., Pease-Fye, M. E., Waclawiw, M.

A., Panza, J. A., Cannon, R. O. 2000. Role of Circulating Nitrite and S-

Nitrosohemoglobin in the Regulation of Regional Blood Flow in Humans.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(21), 11482-11487.

Grzywacz, A., Gdula-Argasińska, J., Muszyńska, B., Tyszka-Czochara, M.,

Librowski, T., Opoka, W. 2015. Metal Responsive Transcription Factor 1

(MTF-1) Regulates Zinc Dependent Cellular Processes at The Molecular

Level. Acta Biochimica Polonica, 62(3),491-498.

60

Guo, C. H., Wang, C. L. 2013. Effects of Zinc Supplementation on Plasma

Copper/Zinc Ratios, Oxidative Stress, and İmmunological Status in

Hemodialysis Patients. International journal of medical sciences, 10(1), 79-

89.

Günther, V., Davis, A. M., Georgiev, O., Schaffner, W. 2012. A Conserved Cysteine

Cluster, Essential for Transcriptional Activity, Mediates Homodimerization

of Human Metal-Responsive Transcription Factor-1 (MTF-1). Biochimica

et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1823(2), 476-483.

Günther, V., Lindert, U., Schaffner, W. 2012. The Taste of Heavy Metals: Gene

Regulation by MTF-1. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular

Cell Research, 1823(9), 1416-1425.

Ha, K. N., Chen, Y., Cai, J., Sternberg, P. 2006. Increased Glutathione Synthesis

Through an ARE-Nrf2–Dependent Pathway By Zinc in The RPE:

İmplication for Protection Against Oxidative Stress. Investigative

Ophthalmology Visual Science, 47(6), 2709-2715.

Haase, H., Maret, W. 2003. Intracellular Zinc Fluctuations Modulate Protein

Tyrosine Phosphatase Activity in İnsulin/İnsulin-Like Growth Factor-1

Signaling. Experimental Cell Research, 291(2), 289-298.

Haase, H., Wätjen, W., Beyersmann, D. 2001. Zinc İnduces Apoptosis That Can Be

Suppressed by Lanthanum in C6 Rat Glioma Cells. Biological

chemistry, 382(8), 1227-1234.

Habib, S. A., Saad, E. A., Elsharkawy, A. A., Attia, Z. R. 2015. Pro-inflammatory

Adipocytokines, Oxidative Stress, İnsulin, Zn and Cu: Interrelations with

Obesity in Egyptian Non-Diabetic Obese Children and Adolescents.

Advances in Medical Sciences, 60(2), 179-185.

Liu-Sheng, H., Xiao-Shan, Y., De-Chang, W. 1991. Age-Dependent Variation of

zinc-65 Metabolism in LACA Mice. International Journal of Radiation

Biology, 60(6), 907-916.

Higashi, Y., Segawa, S., Matsuo, T., Nakamura, S., Kikkawa, Y., Nishida, K.,

Nagasawa, K. 2011. Microglial Zinc Uptake Via Zinc Transporters İnduces

ATP Release and The Activation of Microglia. Glia, 59(12), 1933-1945.

Ho, E. 2004. Zinc Deficiency, DNA Damage and Cancer Risk. The Journal of

Nutritional Biochemistry, 15(10), 572-578.

Homma, K., Fujisawa, T., Tsuburaya, N., Yamaguchi, N., Kadowaki, H., Takeda, K.,

Ichijo, H. 2013. SOD1 as a Molecular Switch for İnitiating the Homeostatic

ER Stress Response Under Zinc Deficiency. Molecular Cell, 52(1), 75-86.

Homma, S., Jones, R., Qvist, J., Zapol, W. M., Reid, L. 1992. Pulmonary Vascular

Lesions in The Adult Respiratory Distress Syndrome Caused by İnhalation

of Zinc Chloride Smoke: a Morphometric Study. Human Pathology, 23(1),

45-50.

61

Hotz, C., Lowe, N. M., Araya, M., Brown, K. H. 2003. Assessment of The Trace

Element Status of İndividuals and Populations: the Example of Zinc and

Copper. The Journal of Nutrition, 133(5), 1563S-1568S.

Jackson, M. J. 1989. Physiology of Zinc: General Aspects. In Zinc in Human

Biology (pp. 1-14). Springer, London.

Jain, S. K. 1985. In Vivo Externalization of Phosphatidylserine and

Phosphatidylethanolamine in The Membrane Bilayer and

Hypercoagulability By The Lipid Peroxidation of Erythrocytes in Rats. The

Journal of clinical investigation, 76(1), 281-286.

Jansen, J., Rosenkranz, E., Overbeck, S., Warmuth, S., Mocchegiani, E., Giacconi,

R., Rink, L. 2012. Disturbed Zinc Homeostasis in Diabetic Patients by in

Vitro and in Vivo Analysis of İnsulinomimetic Activity of Zinc. The Journal

of Nutritional Biochemistry, 23(11), 1458-1466.

Jenner A, Ren M, Rajendran R, Ning P, Huat BT, Watt F, Halliwell B 2007. Zinc

Supplementation İnhibits Lipid Peroxidation and The Development of

Atherosclerosis in Rabbits Fed A High Cholesterol Diet. Free Radic Biol

Med 42(4):559–566

Jenner, A., Ren, M., Rajendran, R., Ning, P., Huat, B. T. K., Watt, F., Halliwell, B.

2007. Zinc Supplementation İnhibits Lipid Peroxidation and The

Development of Atherosclerosis in Rabbits Fed a High Cholesterol Diet.

Free Radical Biology and Medicine, 42(4), 559-566.

Johnson, R. M., Goyette Jr, G., Ravindranath, Y., Ho, Y. S. 2005. Hemoglobin

Autoxidation and Regulation of Endogenous H2O2 Levels in Erythrocytes.

Free Radical Biology and Medicine, 39(11), 1407-1417.

Jurowski, K., Szewczyk, B., Nowak, G., Piekoszewski, W. 2014. Biological

Consequences of Zinc Deficiency in The Pathomechanisms of Selected

Diseases. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 19(7), 1069-

1079.

Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. 2015. The Physiological,

Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc

Homeostasis and Metabolism. Physiological Reviews, 95(3), 749-784.

Kay, M. M., Bosman, G. J., Shapiro, S. S., Bendich, A., Bassel, P. S. 1986.

Oxidation as a Possible Mechanism of Cellular Aging: Vitamin E

Deficiency Causes Premature Aging and IgG Binding to Erythrocytes.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 83(8), 2463-2467.

Keen, C.L., Gershwin, M.E., 1990. Zinc Deficiency and Immune Function. Annu

Rev Nutr, 10, 415–431

Kenny, F., Sriram, K., Hammond, J. B. 1989. Clinical Zinc Deficiency During

Adequate Enteral Nutrition. Journal of the American College of Nutrition,

8(1), 83-85.

62

Kim, Y. H., Kim, E. Y., Gwag, B. J., Sohn, S., Koh, J. Y. 1999. Zinc-İnduced

Cortical Neuronal Death with Features of Apoptosis and Necrosis:

Mediation by Free Radicals. Neuroscience, 89(1), 175-182.

Kim, Y. H., Koh, J. Y. 2002. The Role of NADPH Oxidase and Neuronal Nitric

Oxide Synthase in Zinc-İnduced Poly (ADP-ribose) Polymerase Activation

and Cell Death in Cortical Culture. Experimental neurology, 177(2), 407-

418.

King, J. C., Brown, K. H., Gibson, R. S., Krebs, N. F., Lowe, N. M., Siekmann, J.

H., Raiten, D. J. 2015. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)—

Zinc Review–5. The Journal of nutrition, 146(4), 858S-885S.

Kirkland, J. B. 2012. Niacin Requirements for Genomic Stability. Mutation

Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 733(1),

14-20.

Kirschke, C. P., Huang, L. 2003. ZnT7, A Novel Mammalian Zinc Transporter,

Accumulates Zinc in the Golgi Apparatus. Journal of Biological Chemistry,

278(6), 4096-4102.

Kreżel, A., Maret, W. 2007. Dual Nanomolar and Picomolar Zn (II) Binding

Properties of Metallothionein. Journal of the American Chemical Society,

129(35), 10911-10921.

Krishna, S. S., Majumdar, I., Grishin, N. V. 2003. Structural Classification of Zinc

Fingers: Survey and Summary. Nucleic Acids Research, 31(2), 532-550.

Kuhn, V., Diederich, L., Keller IV, T. S., Kramer, C. M., Lückstädt, W., Panknin, C.,

Cortese-Krott, M. M. 2017. Red Blood Cell Function and Dysfunction:

Redox Regulation, Nitric Oxide Metabolism, Anemia. Antioxidants Redox

Signaling, 26(13), 718-742.

Laity, J. H., Andrews, G. K. 2007. Understanding the Mechanisms OF Zinc-Sensing

by Metal-Response Element Binding Transcription Factor-1 (MTF-1).

Archives of Biochemistry And Biophysics, 463(2), 201-210.

Lansdown, A. B. G. 1991. Interspecies Variations in Response to Topical

Application of Selected Zinc Compounds. Food and Chemical Toxicology,

29(1), 57-64.

Lazzerini M, Ronfani L. 2013. Oral Zinc for Treating Diarrhoea in Children.

Cochrane Database Syst Rev;1:CD005436

Lech, T., Sadlik, J. K. 2011. Zinc in Postmortem Body Tissues and Fluids. Biological

Trace Element Research, 142(1), 11-17.

Liang, D., Xiang, L., Yang, M., Zhang, X., Guo, B., Chen, Y., Cao, J. 2013. ZnT7

Can Protect MC3T3-E1 Cells From Oxidative Stress-İnduced Apoptosis Via

PI3K/Akt and MAPK/ERK Signaling Pathways. Cellular Signalling, 25(5),

1126-1135.

Liang, T., Zhang, Q., Sun, W., Xin, Y., Zhang, Z., Tan, Y., Cheng, M. 2015. Zinc

Treatment Prevents Type 1 Diabetes-İnduced Hepatic Oxidative Damage,

63

Endoplasmic Reticulum Stress, and Cell Death, and Even Prevents Possible

Steatohepatitis in The OVE26 Mouse Model: Important Role of

Metallothionein. Toxicology Letters, 233(2), 114-124.

Lichten, L. A., Cousins, R. J. 2009. Mammalian Zinc Transporters: Nutritional and

Physiologic Regulation. Annual Review of Nutrition, 29, 153-176.

Lima, V. B. D. S., Sampaio, F. D. A., Bezerra, D. L. C., Moita Neto, J. M., Marreiro,

D. D. N. 2011. Parameters of Glycemic Control and Their Relationship with

Zinc Concentrations in Blood and with Superoxide Dismutase Enzyme

Activity in Type 2 Diabetes Patients. Arquivos Brasileiros de

Endocrinologia Metabologia, 55(9), 701-707.

Llobet, J. M., Domingo, J. L., Colomina, M. T., Mayayo, E., Corbella, J. 1988.

Subchronic Oral Toxicity of Zinc in Rats. Bulletin of Environmental

Contamination and Toxicology, 41(1), 36-43.

Magalhães, R. N., Araújo, C. G. B., Sousa Lima, V. B., Moita Neto, J. M., Nogueira,

N. N., Marreiro, D. N. 2011. Nutritional Status of Zinc and Activity

Superoxide Dismutase in Chronic Renal Patients Undergoing Hemodialysis.

Nutrición Hospitalaria, 26(6), 1456-1461.

Maret, W. 2008. Metallothionein Redox Biology İn The Cytoprotective and

Cytotoxic Functions of Zinc. Experimental Gerontology, 43(5), 363-369.

Maret, W. 2012. New Perspectives of Zinc Coordination Environments in Proteins.

Journal of İnorganic Biochemistry, 111, 110-116.

Maret, W. 2004. Zinc and Sulfur: a Critical Biological Partnership. Biochemistry,

43(12), 3301-3309.

Maret, W. 2013. Zinc Biochemistry: From a Single Zinc Enzyme to a Key Element

of Life. Advances in Nutrition, 4(1), 82-91.

Maret, W. 2008. Metallothionein Redox Biology in The Cytoprotective and

Cytotoxic Functions of Zinc. Experimental Gerontology, 43(5), 363-369.

Maret, W. 2006. Zinc Coordination Environments in Proteins as Redox Sensors and

Signal Transducers. Antioxidants Redox Signaling, 8(9-10), 1419-1441.

Maret, W., Jacob, C., Vallee, B. L., Fischer, E. H. 1999. Inhibitory Sites in Enzymes:

Zinc Removal and Reactivation by Thionein. Proceedings of the National

Academy of Sciences, 96(5), 1936-1940.

Maret, W. 2013. Zinc Biochemistry: from a Single Zinc Enzyme to a Key Element of

Life. Advances in Nutrition, 4(1), 82-91.

Maret, W., Krężel, A. 2007. Cellular Zinc and Redox Buffering Capacity of

Metallothionein/Thionein in Health and Disease. Molecular Medicine, 13(7-

8), 371-375.

Maret,W.; Sandstead, H.H. 2006. Zinc Requirements and the Risks and Benefits of

Zinc Supplementation. J. Trace Elem. Med. Biol. 20, 3–18.

64

Marreiro, D. D. N., Cruz, K. J. C., Morais, J. B. S., Beserra, J. B., Severo, J. S., de

Oliveira, A. R. S. 2017. Zinc and Oxidative Stress: Current

Mechanisms. Antioxidants, 6(2), 24.

Martins, L. M., de Oliveira, A. R. S., Cruz, K. J. C., de Araújo, C. G. B., de Oliveira,

F. E., de Souza, G. S., Marreiro, D. D. N. 2014. Influence of Cortisol on

Zinc Metabolism in Morbidly Obese Women. Nutr. Hosp, 29, 57-63.

McLaughlin, B., Pal, S., Tran, M. P., Parsons, A. A., Barone, F. C., Erhardt, J. A.,

Aizenman, E. 2001. p38 Activation is Required Upstream of Potassium

Current Enhancement and Caspase Cleavage in Thiol Oxidant-İnduced

Neuronal Apoptosis. Journal of Neuroscience, 21(10), 3303-3311.

Miao, X., Wang, Y., Sun, J., Sun, W., Tan, Y., Cai, L., Wang, Y. 2013. Zinc Protects

Against Diabetes-İnduced Pathogenic Changes in The Aorta: Roles of

Metallothionein and Nuclear Factor (erythroid-derived 2)-like 2.

Cardiovascular Diabetology, 12(1), 54.

Miller, J., McLachlan, A. D., Klug, A. 1985. Repetitive Zinc‐Binding Domains in the

Protein Transcription Factor IIIA from Xenopus Oocytes. The EMBO

Journal, 4(6), 1609-1614.

Mills, D. A., Schmidt, B., Hiser, C., Westley, E., Ferguson-Miller, S. 2002.

Membrane Potential-Controlled Inhibition of Cytochromec Oxidase by

Zinc. Journal of Biological Chemistry, 277(17), 14894-14901.

Morris, C. R., Morris Jr, S. M., Hagar, W., Van Warmerdam, J., Claster, S., Kepka-

Lenhart, D., Vichinsky, E. P. 2003. Arginine Therapy: A New Treatment

For Pulmonary Hypertension in Sickle Cell Disease?. American Journal of

Respiratory and Critical Care Medicine, 168(1), 63-69.

de Oliveira, A. R. S., Cruz, K. J. C., Morais, J. B. S., Severo, J. S., De Freitas, T. E.

C., Veras, A. L., do Nascimento Marreiro, D. 2015. Magnesium Status and

İts Relationship with C-reactive Protein in Obese Women. Biological Trace

Element Research, 168(2), 296-302.

Oteiza, P. I., Olin, K. L., Fraga, C. G., Keen, C. L. 1995. Zinc Deficiency Causes

Oxidative Damage to Proteins, Lipids and DNA in Rat Testes. The Journal

of Nutrition, 125(4), 823-829.

Oteiza, P. I. 2012. Zinc and The Modulation of Redox Homeostasis. Free Radical

Biology and Medicine, 53(9), 1748-1759.

Oteiza, P. I., Clegg, M. S., Zago, M. P., Keen, C. L. 2000. Zinc Deficiency İnduces

Oxidative Stress and AP-1 Activation in 3T3 cells. Free Radical Biology

and Medicine, 28(7), 1091-1099.

Özcelik, D., Nazıroglu, M., Tunçdemir, M., Çelik, Ö., Öztürk, M., Flores-Arce, M.

F. (2012). Zinc Supplementation Attenuates Metallothionein and Oxidative

Stress Changes in Kidney Of Streptozotocin-İnduced Diabetic Rats.

Biological Trace Element Research, 150(1-3), 342-349.

Özçelik D. 1998. Bakır, Çinko, Kurşun ve Kadmiyum Katkılı Besinlerle Beslenen

Civcivlerin Kan, Serum ve Değişik Dokularındaki Element

65

Konsantrasyonlarının Ölçülmesi ve Besi Perfomansın Etkilerinin

Saptanması. Uzmanlık Tezi, İstanbul.

Pagani, A., Villarreal, L., Capdevila, M., Atrian, S., 2007. The Saccha- Romyces

Cerevisiae Crs5 Metallothionein Metal-Binding Abilities and Its Role in

The Response to Zinc Overload. Mol Microbiol, 1, 256–269.

Perry, D. K., Smyth, M. J., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S., Duriez, P., Poirier, G.

G., Hannun, Y. A. 1997. Zinc is a Potent İnhibitor of the Apoptotic

Protease, Caspase-3 a Novel Target for Zinc in the İnhibition of Apoptosis.

Journal of Biological Chemistry, 272(30), 18530-18533.

Pilch, S. M., Senti, F. R. 1984. Assessment of the Folate Nutritional Status of the US

Population Based on Data Collected in the Second National Health and

Nutrition Examination Survey, 1976-1980/edited by Frederic R. Senti,

Susan M. Pilch.

Pisoschi, A. M., Pop, A. 2015. The Role of Antioxidants in The Chemistry of

Oxidative Stress: A review. European Journal of Medicinal Chemistry, 97,

55-74.

Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. 2010. The Essential Toxin: İmpact of Zinc on

human health. International journal of Environmental Research and Public

Health, 7(4), 1342-1365.

Prabasheela, B., Singh, A. K., Fathima, A., Pragulbh, K., Deka, N. J., Kumar, R.

2011. Association Between Antioxidant Enzymes and Breast Cancer.

Recent Research in Science and Technology, 3(11), 93-95.

Prasad, A. S., Bao, B., Beck, F. W., Kucuk, O., Sarkar, F. H. 2004. Antioxidant

Effect of Zinc in Humans. Free Radical Biology and Medicine, 37(8), 1182-

1190.

Prasad, A. S., Beck, F. W., Bao, B., Fitzgerald, J. T., Snell, D. C., Steinberg, J. D.,

Cardozo, L. J. 2007. Zinc Supplementation Decreases İncidence of

İnfections in The Elderly: Effect of Zinc On Generation of Cytokines And

Oxidative Stress–. The American Journal of Clinical Nutrition, 85(3), 837-

844.

Prasad, A.S., 2009. Zinc: Role in Immunity, Oxidative Stress and Chronic

Inflammation. Curr Opinion Clin Nutr Metab Care, 12, 646–652.

Prasad, A. S., Bao, B., Beck, F. W., Sarkar, F. H. 2011. Zinc-Suppressed

İnflammatory Cytokines by İnduction of A20-Mediated İnhibition of

Nuclear Factor-κB. Nutrition, 27(7), 816-823.

Raiten, D. J., Combs, G. F. 2015. Directions in Nutritional Assessment. Sight and

Life, 29, 39-44.

Ranasinghe, P., Pigera, S., Galappatthy, P., Katulanda, P., Constantine, G. R. 2015.

Zinc and Diabetes Mellitus: Understanding Molecular Mechanisms and

Clinical İmplications. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 23(1), 44.

66

Risbano, M. G., Kanias, T., Triulzi, D., Donadee, C., Barge, S., Badlam, J., Gladwin,

M. T. 2015. Effects of Aged Stored Autologous Red Blood Cells on Human

Endothelial Function. American Journal of Respiratory and Critical Care

Medicine, 192(10), 1223-1233.

ROHRS, L. C. 1957. Metal-Fume Fever From İnhaling Zinc Oxide. AMA Archives

of Internal Medicine, 100(1), 44-49.

Roshanravan, N., Alizadeh, M., Hedayati, M., Asghari-Jafarabadi, M., Alamdari, N.

M., Anari, F., Tarighat-Esfanjani, A. 2015. Effect of Zinc Supplementation

on İnsulin Resistance, Energy and Macronutrients İntakes İn Pregnant

Women with İmpaired Glucose Tolerance. Iranian Journal of Public Health,

44(2), 211-217.

Rostan, E. F., DeBuys, H. V., Madey, D. L., Pinnell, S. R. 2002. Evidence

Supporting Zinc as an İmportant Antioxidant for Skin. International Journal

of Dermatology, 41(9), 606-611.

Ruz, M., Carrasco, F., Rojas, P., Codoceo, J., Inostroza, J., Basfi-Fer, K., López, G.

2013. Zinc as a Potential Coadjuvant in Therapy for Type 2 Diabetes. Food

and Nutrition Bulletin, 34(2), 215-221.

Schrier, S. L., Centis, F., Verneris, M., Ma, L., Angelucci, E. 2003. The Role of

Oxidant İnjury in the pathophysiology of Human Thalassemias. Redox

Report, 8(5), 241-245.

Scott, D. A., Fisher, A. M. 1938. The insulin and the zinc content of normal and

diabetic pancreas. The Journal of Clinical İnvestigation, 17(6), 725-728.

Scott, B. J., Bradwell, A. R. 1983. Identification of the Serum Binding Proteins for

İron, Zinc, Cadmium, Nickel, and Calcium. Clinical Chemistry, 29(4), 629-

633.

Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. 2007. Mechanism and

Regulation of Cellular Zinc Transport. Molecular Medicine, 13(7-8), 337-

343.

Sensi, S. L., Paoletti, P., Koh, J. Y., Aizenman, E., Bush, A. I., Hershfinkel, M. 2011.

The Neurophysiology and Pathology of Brain Zinc. Journal of

Neuroscience, 31(45), 16076-16085.

Sheline, C. T., Behrens, M. M., Choi, D. W. 2000. Zinc-İnduced Cortical Neuronal

Death: Contribution of Energy Failure Attributable to Loss of NAD+ and

İnhibition of Glycolysis. Journal of Neuroscience, 20(9), 3139-3146.

Song, Y., Leonard, S. W., Traber, M. G., Ho, E. 2009. Zinc Deficiency Affects DNA

Damage, Oxidative Stress, Antioxidant Defenses, and DNA Repair in Rats.

The Journal of Nutrition, 139(9), 1626-1631.

Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. 1997. Biochemical Characteristics of Caspases-3,-

6,-7, and-8. Journal of Biological Chemistry, 272(41), 25719-25723.

Suliburska, J., Bogdanski, P., Szulinska, M., Pupek-Musialik, D., Jablecka, A. 2014.

Changes in Mineral Status are Associated with İmprovements in İnsulin

67

Sensitivity in Obese Patients Following L-arginine Supplementation.

European journal of Nutrition, 53(2), 387-393.

Sun, Q., Li, Q., Zhong, W., Zhang, J., Sun, X., Tan, X., Zhou, Z. 2014.

Dysregulation of Hepatic Zinc Transporters in a Mouse Model of Alcoholic

Liver Disease. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver

Physiology, 307(3), G313-G322.

Sun, Q., Zhong, W., Zhang, W., Li, Q., Sun, X., Tan, X., Zhou, Z. 2015. Zinc

Deficiency Mediates Alcohol-İnduced Apoptotic Cell Death in the Liver of

Rats Through Activating ER and Mitochondrial cell Death Pathways.

American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,

308(9), 757-766.

Tapiero H, Tew KD 2003. Trace Elements in Human Physiology and Pathology:

Zinc and Metallothioneins. Biomed Pharmacother 5:399–411

Tapiero, H., Tew, K.D., 2003. Trace Elements in Human Physiology and Pathology:

Zinc and Metallothioneins. Biomed Pharmacother, 57, 399–411.

Taylor, K. M., Morgan, H. E., Johnson, A., Nicholson, R. I. 2004. Structure-Function

Analysis of HKE4, a Member of the New LIV-1 Subfamily of Zinc

Transporters. Biochemical Journal, 377(1), 131-139.

Taylor, K. M., Vichova, P., Jordan, N., Hiscox, S., Hendley, R., Nicholson, R. I.

2008. ZIP7-Mediated İntracellular Zinc Transport Contributes to Aberrant

Growth Factor Signaling in Antihormone-Resistant Breast Cancer Cells.

Endocrinology, 149(10), 4912-4920.

Taysi S, Akcay F, Uslu C, Dogru Y, Gulcin I 2003. Trace Elements and Some

Extracellular Antioxidant Proteins Levels in Serum of Patients with

Laryngeal Cancer. Biol Trace Elem Res 91(1):11–18

Tonelli, M., Wiebe, N., Hemmelgarn, B., Klarenbach, S., Field, C., Manns, B., Gill,

J. 2009. Trace Elements in Hemodialysis Patients: A Systematic Review

and Meta-Analysis. BMC Medicine, 7(1), 25.

Toxicological Profile for Zinc. 2005. Agency for Toxic Substances and Disease

Registry Division of Toxicology and Environmental Medicine: Atlanta, GA,

USA,

Trumbo, P., Yates, A. A., Schlicker, S., Poos, M. 2001. Dietary Reference İntakes:

Vitamin A, Vitamin K, Arsenic, Boron, Chromium, Copper, İodine, İron,

Manganese, Molybdenum, Nickel, Silicon, Vanadium, and Zinc. Journal of

the American Dietetic Association, 101(3), 294-301.

Truong-Tran, A. Q., Carter, J., Ruffin, R. E., Zalewski, P. D. 2001. The Role of Zinc

in Caspase Activation and Apoptotic Cell Death. In Zinc Biochemistry,

Physiology, and Homeostasis (pp. 129-144). Springer, Dordrecht.

Tu, Y.P., Xu, H., 1994. Zn2+ İnhibits The Anion Transport Activity of Band 3 by

Binding To İts Cytoplasmic Tail. Bioscience Reports, 14(4), 159-169.

68

Turnlund, J. R., King, J. C., Keyes, W. R., Gong, B., Michel, M. C. 1984. A Stable

İsotope Study of Zinc Absorption in Young Men: Effects of Phytate and a-

Cellulose. The American journal of Clinical Nutrition, 40(5), 1071-1077.

Vallee, B. L., Falchuk, K. H. 1993. The Biochemical Basis of Zinc Physiology.

Physiological Reviews, 73(1), 79-118.

Van der Zee, J., Van Steveninck, J., Koster, J. F., Dubbelman, T. M. A. R. 1989.

Inhibition of Enzymes and Oxidative Damage of Red Blood Cells İnduced

by t-Butylhydroperoxide-Derived Radicals. Biochimica et Biophysica Acta

(BBA)-Biomembranes, 980(2), 175-180.

Van Schoor, J. 2008. Minerals and Trace Elements in Nutritional Supplements. SA

Pharmacist's Assistant, 8(1), 26-27.

Vardatsikos, G., Pandey, N. R., Srivastava, A. K. 2013. Insulino-Mimetic and Anti-

Diabetic Effects of Zinc. Journal of İnorganic Biochemistry, 120, 8-17.

Vergnano, A. M., Rebola, N., Savtchenko, L. P., Pinheiro, P. S., Casado, M., Kieffer,

B. L., Paoletti, P. 2014. Zinc Dynamics and Action at Excitatory Synapses.

Neuron, 82(5), 1101-1114.

Vogelmeier, C., König, G., Bencze, K., Fruhmann, G. 1987. Pulmonary İnvolvement

in Zinc Fume Fever. Chest, 92(5), 946-948.

Walsh, C. T., Sandstead, H. H., Prasad, A. S., Newberne, P. M., Fraker, P. J. 1994.

Zinc: Health Effects and Research Priorities for the 1990s. Environmental

health perspectives, 102 (Suppl 2), 5.

Wang, W. M., Liu, Z., Liu, A. J., Wang, Y. X., Wang, H. G., An, D., Liu, Y. Q.

2015. The Zinc İon Chelating Agent TPEN Attenuates Neuronal

Death/Apoptosis Caused By Hypoxia/İschemia Via Mediating The

Pathophysiological Cascade İncluding Excitotoxicity, Oxidative Stress, and

İnflammation. CNS neuroscience Therapeutics, 21(9), 708-717.

Wastney, M. E., Aamodt, R. L., Rumble, W. F., Henkin, R. I. 1986. Kinetic Analysis

of Zinc Metabolism And İts Regulation in Normal Humans. American

Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology,

251(2), 398-408.

Wätjen, W., Haase, H., Biagioli, M., Beyersmann, D. 2002. Induction of Apoptosis

in Mammalian Cells by Cadmium and Zinc. Environmental Health

Perspectives, 110(Suppl 5), 865-867.

Weglicki, W. B., Chmielinska, J. J., Kramer, J. H., Mak, I. T. 2011. Cardiovascular

and İntestinal Responses to Oxidative and Nitrosative Stress During

Prolonged Magnesium Deficiency. The American Journal of The Medical

Sciences, 342(2), 125-128.

Wessells, K. R., King, J. C., Brown, K. H. 2014. Development of a Plasma Zinc

Concentration Cutoff To İdentify İndividuals with Severe Zinc Deficiency

Based On Results From Adults Undergoing Experimental Severe Dietary

Zinc Restriction and İndividuals with Acrodermatitis Enteropathica. The

Journal of nutrition, 144(8), 1204-1210.

69

Williams, R. J. P. 1987. The Biochemistry of Zinc. Polyhedron, 6(1), 61-69.

Wiseman, D. A., Wells, S. M., Wilham, J., Hubbard, M., Welker, J. E., Black, S. M.

2006. Endothelial Response to Stress From Exogenous Zn2+ Resembles

that of NO-Mediated Nitrosative Stress, and İs Protected by MT-1

Overexpression. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 291(3),

C555-C568.

Yakoob, M. Y., Theodoratou, E., Jabeen, A., Imdad, A., Eisele, T. P., Ferguson, J.,

Bhutta, Z. A. 2011. Preventive Zinc Supplementation in Developing

Countries: İmpact on Mortality And Morbidity Due To Diarrhea,

Pneumonia And Malaria. BMC Public health, 11(3), S23.

Yavuz İ. 2013. Kurşuna Maruz Kalan Bireylerde Lenfosit DNA Hasarının

Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi, Doktora Tezi, Ankara.

Yeşilkaya, A., Yeğin, A. 1998. Inhibition of Human Erythrocyte (Na+-K+) ATPase

by Organic Hydroperoxides and Protection by Ascorbic Acid and Butylated

Hydroxytoluene. General Pharmacology: The Vascular System, 30(4), 495-

498.

Zalewski, P. D., Forbes, I. J., Betts, W. H. 1993. Correlation of Apoptosis with

Change in İntracellular Labile Zn (II) Using Zinquin [(2-methyl-8-p-

Toluenesulphonamido-6-quinolyloxy) Acetic Acid], A New Specific

Fluorescent Probe for Zn (II). Biochemical Journal, 296(2), 403-408.

Zalewski, P. D., Forbes, I. J., Giannakis, C. 1991. Physiological Role for Zinc in

Prevention of Apoptosis (gene-directed death). Biochemistry İnternational,

24(6), 1093-1101.

Zeisel, S. H. 2011. Nutritional Genomics: Defining the Dietary Requirement and

Effects of Choline–. The Journal of Nutrition, 141(3), 531-534.

70

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Tuğba DEMİRAL

Doğum Yeri ve Yılı : Adana, 1986

Medeni Hali : Evli

Yabancı Dili : İngilizce

E-posta : tugba_sdu01@hotmail.com

Eğitim Durumu

Lise : Mehmet Kemal Tuncel Lisesi 2004

Lisans : SDÜ, Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü

Taranmış Fotoğraf

(3.5cm x 3cm)