• 迅速な解析で5時間以内に結果を取得• 140種類以上のマイコプラズマ属細菌を検出• 10コピー/反応以下の高い検出感度• 実証済みの高い特異性• 最適化されたサンプル調製キットにより効率良くマイコプラズマDNAを回収• 通常のマイコプラズマ属細菌とは判別可能な独自のPositive Control

• 外部機関によるバリデーション済み• 医薬品の最終製品をロットリリース時のマイコプラズマ否定試験で使用した医薬品が日・米・欧の規制当局で複数承認済み

• マウス微小ウイルスとベシウイルスの同時測定可能

MycoSEQMycoplasma Detection Systemマイコプラズマ属細菌検出システム

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MycoSEQ Mycoplasma Detection Assay

PrepSEQ Mycoplasma Sample Preparation Kit （module M）

迅速な解析で5時間以内に結果を取得

図1. 簡略化されたワークフロー

Appl ied Biosystemsは、リアルタイムPCRとApp l i ed B iosys tems ™ Power SYBR™ Greenによる検出技術を利用した

MycoSEQアッセイには、マイコプラズマ検出のためにDNAを効率的に回収できるよう最適化されたApplied Biosystems™

P r e p S E Q ™ M y c o p l a s m a S a m p l e Preparation Kit（module M）が同梱されています。このPrepSEQキット（module M）は、マイコプラズマDNAを哺乳動物細胞の培養サンプルから効率よく抽出するために開発された、独自の磁気ビーズによる分離技術を利用しています。

このキットは、最大108個の細胞を含む100 µL～10 mLの細胞培養液を処理できる柔軟

A p p l i e d B i o s y s t e m s ™ MycoSEQ ™ Mycoplasma Detection Systemは、簡略化されたワークフローで5時間以内に結果を取得できます（図1）。この迅速なシステムを用いて、細胞培養の製造工程におけるマイコプラズマの存在をモニタリングすることが可能なため、可能な限り早期に汚染を検出し、下流工程の装置やプロセス、培地への汚染拡大を防止します。図 2は、バイオ医薬品の製造プロセスで従来の実施ポイントおよび迅速なPCRによるマイコプラズマ試験の実施可能なポイントを示しています。

おもな特徴：• 幅広いサンプル量に柔軟に対応（最大108個の細胞を含む100 µL～10 mLの培養液）

• チューブを密閉したままシングルステップで検出

• 装置にセットしてランした後の検出は完全自動化

• ゲル電気泳動やハイブリダイゼーション、洗浄ステップが不要

• 設備やスペースの要件が最小限• 目的に応じて複数のプロトコールを用意• 日常的な試験で高い感度と特異性を実現する最適化されたワークフロー

プレックスプライマー設計によって、きわめて高感度で特異的、包括的なマイコプラズマ種の検出を可能にします。

• バイオリアクターからの力価の高いCHO細胞培養液

• バイオリアクターからの力価の高いNS0細胞培養液

• 細胞培養ワクチン製造工程のハーベスト• トランスジェニック ミルク• 研究用細胞培養液• バイオアッセイ用細胞株• 幹細胞培養液• 自己移植のためのリンパ球増殖培養液• 細胞療法や組織療法向け培養液• 血清• 細胞培養培地

MycoSEQMycoplasma Detection Assayを開発しました。このシステムは、高度なバイオインフォマティックスと最適化されたマルチ

性を供えています。PrepSEQ 1-2-3は、マイコプラズマのゲノムDNAを迅速に抽出する、小容量用プロトコールです。また10 mLまでの大容量のサンプルには、細胞に付着しているマイコプラズマと遊離性マイコプラズマのDNAを別々に捕獲して抽出するプロトコールを使用し、テストサンプルのマイコプラズマDNAを効率的に抽出します。

さらに、多様なサンプルに最適化されたカスタムメイドのサンプル調製プロトコールを作成できます。すでに試験済みのサンプルは右記のとおりとなります。

Rapid PCR でのマイコプラズマ試験実施ポイント

従来のマイコプラズマ試験実施ポイント

セルバンク スピナーフラスコ細胞培養液の

回収バイオリアクター

細胞培養の製造工程

図 2. マイコプラズマ試験のサンプリングポイント迅速なPCRによるマイコプラズマ試験は、播種からハーベストまで細胞培養の製造工程全体のどの段階でも実施が可能。

マイコプラズマは、自己増殖できる最小の微生物であり、哺乳動物細胞培養液の細菌汚染の原因としてよく知られています。マイコプラズマ感染は、細胞培養に使用する原材料や研究所のスタッフによる汚染、また汚染された培養液からの2次発生などが原因で起こると考えられます。マイコプラズマは、従来の

微生物検出法では検出しにくいため、特に注意が必要です。

規制当局のガイダンスでは、すべての哺乳動物細胞培養由来の製品は、マイコプラズマ試験を実施することを求められています。2007年7月、欧州薬局方（5.8、Sec. 2.6.7）

は、核酸増幅法を用いたマイコプラズマ検出のバリデーション要件を定めたガイダンスを発表しました。

2016年3月には、第17改正日本薬局方（参考情報）にも同様の記載がなされました。

はじめに

キットPrepSEQMycoplasma SamplePreparation Kit plus Module M

(自動化装置による調製も可能）機器AutoMate Express Nucleic AcidExtraction System

キットPrepSEQ Express Nucleic Acid Extraction Kit　

キットMycoSEQ MycoplasmaDetection System

機器7500 Fast Real-Time PCR System

ソフトSDS v1.421 CFR Part 11 Moduleまたは、AccuSEQ Real-Time PCR Software

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マイコプラズマデータの自動解析用AccuSEQ リアルタイムPCRソフトウェア

MycoSEQアッセイは、高度に最適化された Power SYBR Green検出技術を使用し、増幅曲線（Ct）、融解温度（Tm）、微分値（D.V.）といった複数のパラメータから結果を解釈します。複数パラメータによる解析は高い感度と特異性を発揮し、1反応あたり10ゲノムコピー以下のマイコプラズマから検出が可能です（図3）。またすべてのパラメータを数値で読み出すことができるため、データを客観的に評価できます。

最も確実にマイコプラズマ汚染を検出するには、代表的なマイコプラズマ種だけでなく既知のマイコプラズマ種をすべて検出できるアッセイが必要です。そこで高度なバイオインフォマティックス解析を利用して、既知のマイコプラズマやアコレプラズマ、スピロプラズマ種（表1）を包括的に 検出し、同時に他の近縁種の検出を防止できる増幅プライマーと反応条件を開発し ました。

図 4. コントロールとマイコプラズマDNAの融解曲線解析このグラフは、実際のマイコプラズマDNAとコントロールサンプルの融解温度に顕著な違いがあることを示す。

図3. マイコプラズマを高感度で検出(A) M. argininiの精製DNAを1反応あたり100,000～1ゲノムコピーまで段階的に10倍希釈して解析。(B) 1ゲノムコピー/反応のPCRの融解曲線解析。

表 1. MycoSEQ Mycoplasma Detection Assayで検出可能な種のリスト（一部）

このキットは、Acholeplasma laidlawii、Spiroplasma citri、その他のEuropean Pharamacopoeia（欧州薬局方）指定のマイコプラズマほか、延べ140種類以上のマイコプラズマを検出する。一般的にマイコプラズマ試験やバリデーションに推奨される分離種は、太字で記載。

AccuSEQソフトウェアを使用すると、自動的に MycoSEQマイコプラズマ検出システムによるマイコプラズマの陽性/陰性結果を表示することができます。自動で解析結果を読み取るこの最新のアルゴリズムは、MycoSEQ Mycoplasma Detection Assay

とCt値を網羅した完全なデータ表や増幅プロット、マルチコンポーネントプロット、ローデータプロットなどを表示する使いやすい手動解析ツールを備えています。

のデータ解析ガイドラインを使用して開発されました。解析結果は、試験サンプルのTm値や微分値、および試験サンプルと阻害コントロールのCt値をもとに読み取られます。またAccuSEQソフトウェアは、データを詳しく閲覧できるよう、すべてのTm値

Power SYBR Greenテクノロジーを利用した複数パラメータによる解析

140種類以上のマイコプラズマを検出

105104 103

1 コピー

10210 1105104 103

1 コピー

10210 1

A B

検出菌のリスト（一部）Acholeplasma granularum Mycoplasma genitalium Mycoplasma synoviae

Acholeplasma laidlawii Mycoplasma gypis Mycoplasma testudinis

Acholeplasma pleciae Mycoplasma hominis Mycoplasma timone

Mycoplasma alkalescens Mycoplasma hyorhinis Spiroplasma citri

Mycoplasma alvi Mycoplasma imitans Spiroplasma endosymbiont

Mycoplasma anseris Mycoplasma indiense Spiroplasma insolitum

Mycoplasma arginini Mycoplasma lagogenitalium Spiroplasma kunkelii

Mycoplasma auris Mycoplasma lipofaciens Spiroplasma melliferum

Mycoplasma buccale Mycoplasmamobile Spiroplasma mirum

Mycoplasma californicum Mycoplasma molare Spiroplasma phoeniceum

Mycoplasma canadense Mycoplasma mycoides Spiroplasma poulsonii

Mycoplasma capricolum Mycoplasma neurolyticum Spiroplasma sp.

Mycoplasma caviae Mycoplasma orale Mycoplasma bovirhinis

Mycoplasma collis Mycoplasma phocidai Mycoplasma bovis

Mycoplasma cricetuli Mycoplasma pirum Mycoplasma bovigenitalium

Mycoplasma equirhinis Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma canis

Mycoplasma fermentans Mycoplasma salivarium Mycoplasma felis

Mycoplasma gallinaceum Mycoplasma simbae Mycoplasma fastidiosum

Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma sp. Mycoplasma muris

Mycoplasma gateae Mycoplasma spumans Mycoplasma pulmonis

60 857565 958070 90

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

–0.04

M. arginini DNA融解曲線

従来のコントロール

新しいコントロール

温度（°C）

微分値

Discriminatory Positive/Extraction ControlMycoSEQ Mycoplasma Detection Assayには、マイコプラズマのDNA配列を含む巨大プラスミドであるDiscriminatory Positive/Extraction Controlが同梱されています。このコントロールは、アッセイのサンプル調製と検出の際に、マイコプラズマDNAと同様の振舞いをするよう設計されています。またこのコントロールから生成されるアンプリコン（PCR増幅産物）の融解温度（Tm）は、このアッセイでマイコプラズマから生成されるアンプリコンの融

解温度と重複しないようDNA配列を組み換えて約84°Cに設定しています（図4）。そのため試験結果が陽性であった場合は、Tm

値からマイコプラズマとコントロールのDNAを識別することができます。この新しいコントロールによって、ポジティブ コントロールDNAとの予期せぬクロスコンタミネーションによって試験サンプルが偽陽性となるリスクのないDNAスパイク コントロールが生まれ、これを使用した試験プロトコールができました。

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PCR法の外部バリデーション

Cell Culture Rapid Methods Program

アッセイのパフォーマンスを評価・実証し、またユーザーの皆様が内部バリデーション試験を設計する際のお手伝いをできるようにするための試験を、ウィーン（オーストリア）のMycosafe Diagnostics社が実施しました。

試験法はE.P. 2.6.7およびICH Q2（R1）のガイダンスに従って設計し、FDA-CBERが 2008年に実施した迅速なマイコプラズマ

MycoSEQ Mycoplasma Detection System は、哺乳動物細胞培養によるバイオ医薬品の製造工程における3種類のおもな汚染物質を円滑に検出するためのプログラム、

LODを推定し、GC/CFU比を算出しました。 その結果、CHO細胞サンプル10 mLから 回収したDNAによる、PCR法のマイコプ ラズマ試験の感度が初めて明確に実証されました。

また2016年には国内にて、第17改正日本薬局方に収載の核酸増幅法によるマイコプラズマ否定試験に適合していることを確認する外部バリデーションを行いました。

シングルステップのサンプル調製とリアルタイムPCRを組み合わせたこのプログラムは、効率性と製品の品質を向上させる新たなワークフローの基準となるでしょう。

試験に関するワークショップ（Workshop on Rapid Mycoplasma Testing）でフィードバックを収集しました。

この試験では、CHO細胞の試験サンプル10 mLを使用してマイコプラズマのゲノムコピーおよび生菌株の双方の検出限界（LOD）を確認しました。試験では、使用した10種類のマイコプラズマ種すべての

Cell Culture Rapid Methods Programの一環として開発されました。マイコプラズマ、ベシウィルスおよびマウス微小ウィルス（ＭＭＶ）を一つの装置で検出するための

Ordering information

製品名 サイズ 製品番号MycoSEQ Mycoplasma Detection System PrepSEQ Sample Preparation Kit（module M）、 MycoSEQ Mycoplasma Real-Time qPCR Assayを同梱

100反応分 4460626

MycoSEQ Mycoplasma Detection Assay 100反応分 4460623

PrepSEQ 1-2-3 Mycoplasma Nucleic Acid Extraction 100反応分 4452222

Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システム、ノート型パソコン付属 1台 4365464

Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システム、タワー型パソコン付属 1台 4365463

AccuSEQ リアルタイムPCRソフトウェア ver2.0 AccuSEQ ソフトウェア v2.0 と Mycoplasma 解析モジュール付属、Getting Started Guide、 クイック リファレンス カードを同梱

1ライセンス 4443420

AutoMate Express Nucleic Acid Extraction System 自動核酸精製装置 1台 4467754

PrepSEQ Express Nucleic Acid Extraction Kit 自動核酸精製装置専用サンプル調製キット

52反応 4466351

Power SYBR Greenマスターミックス、アッセイミックス、阻害コントロール、ポジティブコントロール、最適化されたPrepSEQ サンプル調製キット

AutoMate Express Nucleic Acid Extraction System

サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。 記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。For Research Use only. Not for use in diagnostic procedures. © 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.価格、製品の仕様、外観、記載内容は予告なしに変更する場合がありますので予めご了承ください。標準販売条件はこちらをご覧ください。 thermofisher.com/jp-tc

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