Multienzimski kompleksi

7/22/2019 Multienzimski kompleksi

1/68


2/68


3/68


4/68


5/68


6/68


7/68


8/68


9/68


10/68


11/68


12/68


13/68


14/68


15/68


16/68


17/68


18/68


19/68


20/68


21/68


22/68


23/68


24/68


25/68


26/68


27/68


28/68


29/68


30/68


31/68


32/68


33/68


34/68

Aspartat transkarbamoilaza

Karbamoil fosfat + aspartat ------> N-karbamoil aspartat + fosfat

C6R6 - 2 seta C3 u kompleksu sa 3 seta R2

Heterotropno inhibirana CTP-om kad se CTP utroi ielijski CTP pul opadne,on disosuje sa enzima i deinhibira ga Heterotropno aktivirana ATP-om kad je koncentracija ATP ve a od CTPenzim se aktivira da sintetie pirimidine i obrnuto (koordinisana sinteza purina ipirimidina)

Disosovane kataliti ke subjedinicezadravaju kataliti ku aktivnost, ali nemajukooperativnost i neosetljive su na CTP i ATP


35/68

ASPARTAT TRANSKARBAMOILAZA


36/68

FEEDBACK INHIBICIJA-Heterotropna alosterna inhibicijatreonin dehidrataze krajnjimproizvodom metaboli kog putakonverzije treonina u izoleucin (Ile)

-Nekovalentno i reverzibilno vezivanjealosternog modulatora (Ile)-Specifi no vezivanje


37/68

Odre ivanja Kd - Ska ardova analiza

Meri koncentraciju slobodnog ili vezanog liganda zahvaljuju i razlici u molekularnimosobinama slobodnog i vezanog za protein.

Rastvor protein se titruje ligandom pri emu je poznata ukupna koncentracijadodatog liganda

Nekooperativno vezivanje

Kad je sistem u ravnotei neto koncentracije svake od tri komponente se nemenjaju - dinami ka ravnotea


38/68

Krive vezivanja liganda:

Sigmoidna kooperativno vezivanje, multipla vezuju a mesta (Hb)Hiperboli na MM jedna ina, jedno vezuju e mesto (Mb)

Sa zasi enjem raste afinitet afinitet vezivanja 4. Molekula O2 je nekoliko stotinaputa ve i od afiniteta vezivanja 1. molekula O2

Ovo se ne moe objasniti sa postojanjem 4 neinteraguju a mesta razlli itih

afiniteta u tom slu aju prvo bi se zasitila visoko-afinitetna mesta, pa bi delimi nookupirani molekuli Hb imali nii afinitet od deoxyHb.

Stoga, pove anje afiniteta sa pove anjem zasi enja nastaje usled postojanjamesta koja interaguju, tako da vcezivanje liganda na jednom mestu dovodi do

pove anja afiniteta na drugom mestu.Sli na kooperativnost postoji kod vezivanja supstrata za neke enzime

Kooperativno vezivanje - vezivanje kiseonika za Hb


39/68

POZITIVNA KOOPERATIVNOST


40/68

Sa vezivanjem liganda raste i afinitet. Sva

vezivna mesta su identina.


41/68

Hilova jednaina

Enzim sa n ekvivalentnih supstrat vezujuih mesta:

Za tetramerni enzim:

Ili uoptem sluaju (Hilova jednaina)

Vo/Vmax - frakcija zasienog enzima supstratom,n - broj supstrat vezujuih mesta po molekulu enzima,Kx - konstanta koja obuhvata faktore interakcije a,b,c,..i sopstvenu konstantu disocijacije Ka

Kx= K1 K2 K3 K4

U Lineweaver Burk obliku:


42/68

U Lineweaver_Burk obliku:

Logaritamska forma Hilove jednaine:

Linearna forma - direktna procenuprividnog broja supstrat vezuju ih mesta pomolekulu (nagib je n)

Ako se meri ravnoteno vezivanje liganda umesto po etnih brzina, onda Vo/Vmax mora dase zameni sa Y (Y - frakciono zasi enje proteina ligandom)

Osnova Hilove jednaine - pretpostavka beskonane kooperativnosti, jedino su brzoekvilibriui sistemi pogodni za Hilovu analizu Izbegavanje korienja kinetikihpodataka pri bilo kakvoj primeni Hilove jednaina na stredy-state enzimima

KVANTITATIVNA ANALIZA


43/68

KOOPERATIVNOSTIHilova jedna ina: mera kooperativnosti

Za kineti ka merenja:

Stepen zasi enja:


44/68

U regionu 50% zasi enja (10-90%) kriva je pravah (Hilova konstanta, mera koperativnosti) se dobija iz nagiba u regionu od 50%saturacije to je ve a ve a je kooperativnost

Ako je h=1 nema kooperativnosti(MM jednaina) , h

1 pozitivna, a h

1 negativnakooperativnost


45/68

Modeli za opisivanje kooperativnog vezivanja

liganda

Mono-Vajman-aneov (MWC) simetri ni model

Koland, Nemeti i Filmerovi modeli (KNF) sekvencijalni model

MONO VAJMAN ANEOV ORGANIZOVANI MEHANIZAM


46/68

MONO-VAJMAN-ANEOV ORGANIZOVANI MEHANIZAM(MWC)

- Mono, Vajman I ane - ujedinjen strukturni model za alosterne proteine ienzime

Postulati:

Protein je oligomeran -protomeri su asosovani tako da svi zauzimajuekvivalentne pozicije (molekuli poseduju najmanje jednu osu simetrije)Protein postoji u dve forme (T i R) i ove dve forme su u ravnotei i kad je

vezan ligand i kada nijeSimetrija ostaje ouvana kada protein prelazi iz jedne forme u drugu, kao i pri

vezivanju liganda koncertirana promena konformacijeT stanje ima nii afinitet za ligand;Za svaki ligand postoji jedno jedino mesto na svakom protomeruSva vezivna mesta su ekvivalentna i imaju identine vezivne konstante za

ligandeKonformacija svakog protomera je ograniena njegovom asocijacijom saostalim protomerimaSamo konformaciona promena moe promeniti afinitetprotomera za ligand

MONO-VAJMAN-ANEOV


47/68

MONO VAJMAN ANEOV

ORGANIZOVANI MEHANIZAM(MWC)

Strukturni model dva stanja, Sve ili nita


48/68

Svega 3 parametra:L (alosterna konstanta, konstanta ravnotee) - odnos konc. T i R za neligiranastanja,Kt - konstante disocijacije za svako mesto u T formiKr - konstante disocijacije za svako mesto u R formi Model daje teorijsku krivu koja se slae sa krivom vezivanja kiseonika zahemoglobin Objanjava kontrolu enzimske aktivnosti na jednostavan na in (efektor menjaR/T ravnoteu):

U odsustvu alosternih aktivatora/inhibitora supstrat se vezuje kooperativno

Efektor se vezuje nekooperativno za jedno od stanja i menja R/T ravnoteupreferencijelno stabiliu i jednu od te dve forme.Aktivator se vezuje za R formu i pove ava njenu koncentraciju, a inhibitor sevezuje za T formu i oteava prelaz u R formu vezivanjem liganda.

U ekstremnim slu ajevima aktivator ukida R-T ravnoteu i R stanje predominira tad nema koperativnosti i kinetika postaje MM..Mane: koncept simetrije (nema intermedijernih stanja, jedna kvaternernastrukturna promena).MWC je sutinski strukturna teorija


49/68

K sistemi i V sistemi


50/68

Kontrola alosternih enzima moe imati dve ekstremne forme :

kodK(=binding) sistema supstrat i efektor imaju razli ite afinitete za R i Tforme vezivanje efektora menja afinitet enzima za supstrat i obrnuto.

KodV (=rate)-sistema supstrat ima isti afinitet za oba stanja, ali jedno stanjeima mnogo ve u vrednost za kcat.

Efektor se vezuje preferenciejlno za jedno od dva stanja i tako modulira

aktivnost promenom poloaja ravnotee izmeu dva stanjaKako se supstrat podjednako vezuje za oba stanja nema kooperativnog

vezivanja supstrata, i vezivanja alosternog efektora ne menja afinitet enzima zasupstrat

Koland Nemeti i Filmerovi modeli (KNF model)


51/68

Koland, Nemeti i Filmerovi modeli (KNF model)

KNF model izbegava pretpostavku simetrije MWC modela - progress T R je sekvencijalan

Konformacija svake subjedinice se menja svakim vezivanjem liganda, bez dramati nogprelaza iz jednog stanja na drugo

MWC model koristi kvaternernu strukturnu promenu, KNF model koristi seriju tercijernihstrukturnih promena.

KNF model ispituje slede e varijable:

- Geometrijski odnos subjedinica- Konstante vezivanja liganda za protein- Ja inu interakcija izme u subjedinica-Efekat neidenti nih subjedinica

Uopte, broj konstanti je jednak broju vezuju ih mesta, za razliku od MWC koji uvek koristi 3Iako sloeniji KNF model je optiji i bolje opisuje neke proteine od MWC modela,

.

KOLAND NEMETI FILMEROV


52/68

KOLAND-NEMETI-FILMEROVSEKVENCIJALNI MODEL (KNF)

1. U odsustvu liganda, protein postoji u jednoj konformaciji;

2. Po vezivanju, ligand indukujekonformacionu promenu u subjediniciza koju se vezao. Ova promena semoe preneti na susedne podjedinicepreko dodirnih povrina medju njima.

3. Molekularna interpretacija Adair-ove jedna ine

Pretpostavke:

Opti model


53/68

Opti model

MWC I KNF modeli - ekstremni slu ajevi optijeg modela koji uklju uje sve mogu e kombinacijeOpti model za alosterni enzim sa 4 vezuju a mesta uklju uje hibridne oligomere

Postoji 25 razli itih formi enzima - Prva I etvrta kolona MWC, a dijagonala KNF

Svi gore navedeni modeli su ekvilibrijumski modeli kad je Vo/ Vmax prava mera YF

Kooperativnost se moe javiti I iz isto kineti kih razloga - u mehanizmima koji uopte nepokazujuju kooperativnost kada se vezivanje meri u ravnotei (pr. Heksokinaza D).

U praksi je suvie komplikovanpa se eksperimeatlni rezultati

interpretiraju kroz KNF i MWCsimplifikacije


54/68

OPTI MODEL

Negativna kooperativnost (antikooperativnost) i


55/68

g p ( p )reaktivnost polovine mesta

Neki enzimi sukcesivno vezuju ligande sa opadaju im afinitetom, to semoe objasniti time da se ligand prvo vezuje za mesta sa najve im afinitetom. Me utim, u mnogim slu ajevima ovo se javlja kod oligomera sa identi nim

subjedinicama tirozil-tRNA sintetaza i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazaAntikooperativnost se ne moe objasniti MWC teorijom vezivanje prvogliganda moe stabilisati samo visoko-afinitetno stanje i ne moe pove atiudeo T stanja.

Ali se moe opisati KNF teorijom vezivanje liganda za jedno mesto dovodido konf. promene koja se prenosi na slobodnu subjedinicu

Negativna kooperativnost je dijagnosti ki test KNF modela

Reaktivnost polumesta enzim koji poseduje 2n mesta reaguje brzo samo nan od njih moe se detektovati samo presteady state kinetikom (tirozil-tRNAsintetaza)Ne moe se opisati MWC teorijom jer jer mesta gube svoju ekvivalenciju igubi se time i simetrija.

Pore enje MWC i KNF modela


56/68

j

MWC je u osnovi strukturna teorija, dok KNF model izbegava pretpostavku simetrije alikoristi druge simplifikacije

KNF pretpostavlja da je progress iz T u R sekvencijalan process (konformacija svakesubjedinice se menja kako se koji ligand vee, bez dramati ne promene iz jednog stanjau drugo) - KNF model je optiji od MWC

Negativna kooperativnost isklju uje MWC model, dok za pozitivnu koperativnost vaeoba modela


57/68

Negativna kooperativnost je dijagnosti ki test za KNF model.HSR se moe odrediti jedino pre-steady state kinetikom. Neophodno je ta no znati koncentracijuu vezivnih mesta enzima.


58/68

MWC vezivna kriva

Prema MWC teoriji kriva zasi enja za bilo koji oligomerni protein sastavljen od nprotomera se definie samo sa 3 nepoznata parametra i koncentracijom liganda (L,Kr, Kt i S)

Kr konstanta disocijacije sa RKt konstanta disocijjacije sa T

C relativni afiniteti R i T stanja, faktor za koji se pomera ravnotea vezivanjem

ligandaL - alosterna kostanta, relativne stabilnosti R i T stanja

Frakcija proteina za koju je vezan ligand, Y, se ra una iz jedna ine balansa masa


59/68


60/68

MWC VEZIVNA KRIVA

- Normalizovana koncentracija liganda

Jedna ina za opisivanje MWC modela alosterije za homotropneinterakcije:

Frakcija proteina u R stanju:

Y frakcija proteina sa vezanim ligandom


61/68

Zavisnost Hilove konstante od L i c

h i ti k j t ki fit j j d i


62/68

h se moe izra unati kompjuterskim fitovanjem u jedna inu

Plotovanje h vs. L pri konstantnom c daje zvonastu krivu.

h je 1 za L mnogo ve e ili manje od c, a maksimalan je kad je L=c-n/2Kad je L malo inicijalno postoji dovoljno proteina u R stanju daju i dobro vezivanjepa nema znatnog pomeranja ravnotee ka RKad je L jako veliko koncentracija R stanja je jako mala da bi zna ajno doprinelavezivanjuZvonasta kriva je od naro itog interesa u analizi kako strukturne promene proteinauti unaL .


63/68

Pr. Aspartat transkarbamoilaza 6 kataliti kih I 6 regulatornihsubjedinica, kataliti ke bez

regulatornih su aktivene ali nepokazuju ni alosteriju nikooperativnost (MWC model)


64/68

DIJAGNOSTIKI TESTOVI ZAKOOPERATIVNOST & MWC VS KNF

Dijagnosti ki test za kooperativnost i MWC vs. KNF


65/68

mehanizme

Kooperativnost se odre uje iz h Hilove jedna ine ili iz karakteristi nihdevijacija od ravnih saturacionih krivih ili iz Ska ardovih krivih

Negativna kooperativnost isklju uje jednostavan MWC model, ali pozitivna seuklapa u oba modela

Analiza oblika vezuju ih krivih je diskutabilna jer oba modela predvi aju sli neoblike

Teoretski merenje brzina vezivanja liganda moe razlikovati ova dva modela

MWC model predvi a manje relaksacionih vremena, jer ima manje stanja

Kineti ari preferiraju KNF model jer su kineti ka merenja mnogo osetljivija naprisustvo intermediejra - KNF ima vie varijabli i fleksibilnija je u fitovanjupodataka.

KNF vezuju a kriva


66/68

MWC model daje jednostavnu jedna inu usled pretpostavke samo 2 konstantedisocijacije

KNF model zahteva razli ite konstante disocijacije za svako intermedijerno

stanje, i ne postoji jednostavna opta jedna

ina za Y to je vie vezuju

ihmesta to je i vie varijabli

Napomena: to to eksperimentalne krive vezivanja fituju u MWC jedna inu, izkoje se mogu dobiti L i c vrednosti, ne zna i da i strukturne promene sledeMWC model, jer i KNF model predvi a istu krivu vezivanja.

Pozitivna koperativnost


67/68

Aderova jedna ina

Enzim sa dva vezujua mesta - ako vezivanje jednog supstrata promeni konstantudisocijacije KAza factor , a kcat ostane isto sekvenca reakcije je:

Ako je Vmax = 2 kcat Eo, I izvodjenje jednaine brzine je zasnovano na pretpostavci

brze ravnotee dobijamo

Enzim sa 4 identina mesta - ako vezivanje prvog supstrata menja Ka za factor a,vezivanje sledeeg menja konstantu disocijacije za ostala neokupirana mesta za factor


68/68

b, , onda efektivna konstanta disocijacije za vezivanje prvog, drugog, I teeg supstrata je:

Napomena: promena indukovana prvim molekulom supstrata se zadrava, tako dapromena indukovana drugim I treim je kumulativna .

Multienzimski kompleksi

Documents

Transcript of Multienzimski kompleksi