MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DE EMULSIONES DE …
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I MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO WILSON YESID MOLINA TORRES UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTA D.C 2010
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I
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO
WILSON YESID MOLINA TORRES
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C
2010
II
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN DE EMULSIONES DE PERFLUOROCARBONO
WILSON YESID MOLINA TORRES
Trabajo de grado para
optar por el título de Ingeniero Químico
Asesor(a)
CAMILA IRENE CASTRO PÁEZ, Ms.
Departamento de Ingeniería Química
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C
2010
III
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a
mis padres Jairo Molina y Lilia Torres
quienes siempre estuvieron a mi lado
y me apoyaron en todo momento.
IV
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, siempre estuvieron conmigo, apoyándome y aconsejándome en los
momentos de dificultad y alegría. No sería nada sin el apoyo incondicional de
ellos.
A mis asesores, Camila Castro y Juan Carlos Briceño, por su paciencia, tiempo
y confianza. Ellos me ayudaron durante el transcurso del proyecto guiándome de
la manera adecuada y enseñándome día a día en mi formación como ingeniero.
A mis amigos de Ingeniería Química: Isabel Cristina Velasco, Diana Marcela
Vásquez, David Camilo Parra, Daniel Felipe Jaramillo y Juan Rodrigo Reyes su
preocupación y apoyo durante la realización del proyecto.
Y en general a todos mis amigos y personas que aunque no mencioné siempre
estuvieron conmigo.
2
TABLA DE CONTENIDOS
LISTA DE ILUTRACIONES .............................................................................................. 4
LISTA DE TABLAS ............................................................................................................ 5
1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 6
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 8
2.1 Objetivo general .................................................................................................. 8
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 8
3 ESTADO DEL ARTE ................................................................................................... 9
3.1 Introducción .......................................................................................................... 9
3.2 Emulsiones ............................................................................................................ 9
3.2.1 Estabilidad en las emulsiones .............................................................. 10
3.2.2 Emulsiones de perfluorocarbono ........................................................ 13
3.3 Emulsión de perfluorocarbono colombiana ............................................ 16
3.4 Métodos de esterilización .............................................................................. 17
3.4.1 Por destrucción total de microorganismos. .................................... 17
3.4.2 Por muerte o inactivación. ..................................................................... 18
3.4.3 Por eliminación con medios físicos.................................................... 18
4 METODOLOGÍA ......................................................................................................... 19
4.1 Materiales ............................................................................................................. 19
4.2 Preparación de la emulsion ........................................................................... 19
4.3 Tratamiento térmico ......................................................................................... 20
4.4 Métodos de caracterización .......................................................................... 22
4.4.1 Potencial Zeta ............................................................................................. 22
4.4.2 Tamaño de partícula ................................................................................. 24
4.4.3 Osmolaridad ................................................................................................ 25
4.4.4 pH .................................................................................................................... 25
4.5 Comparación PFC 99% y PFC recuperado ............................................... 25
4.5.1 Espectroscopia infrarroja cercana ...................................................... 26
5 Resultados y discusión .......................................................................................... 28
3
5.1 Comparación métodos de esterilización .................................................. 28
5.2 Diseño experimental .............................................................................................. 29
5.2.1 Perfiles de espectroscopia infrarroja cercana (NIR) de las emulsiones ..................................................................................................................... 33
5.2.2 Experimentación fraccionada ............................................................... 38
6 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................................... 40
7 BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................... 42
8 ANEXO 1 ...................................................................................................................... 44
4
LISTA DE ILUTRACIONES
Ilustración 1. Diferentes tipos de emulsiones.
Ilustración 2. Diferentes tipos de fenómenos de inestabilidad en emulsiones.
Ilustración 3. Perfluorocarbonos utilizados como medio de transporte de oxígeno.
Ilustración 4. Procedimiento de preparación de una emulsión de perfluorocarbono.
Ilustración 5. Perfiles de temperatura alcanzados para una temperatura de 121 °C
y los tres tiempos de residencia de temperatura máxima.
Ilustración 6. Esquema de potencial zeta.
Ilustración 7. Comportamiento del potencial zeta en función del pH para una
emulsión.
Ilustración 8. Espectro obtenido para el PFC en una prueba de espectroscopia infrarroja cercana.
Ilustración 9. Representación entre el cambio de tonalidad obtenido para una
alícuota de emulsión después de ser tratada a una temperatura de 121 °C para los
tres (3) tiempos de residencia.
Ilustración 10. Resultados obtenidos para una temperatura de 115°C para cada uno de los niveles evaluados. Ilustración 11. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de 121 °C a diferentes tiempos de residencia. Ilustración 12. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de 115 °C a diferentes tiempos de residencia.
Ilustración 13. Resultados obtenidos para una temperatura de 100°C por un tiempo de esterilización de 40 minutos.
Ilustración 14. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de
100 °C durante 40 minutos.
Ilustración 15. Representación del cambio generado por la depolimerización del alginato de sodio.
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Niveles de evaluación para los factores del experimento.
Tabla 2. Comparación de los métodos de esterilización más usados en la industria.
Tabla 3. Resultados obtenidos para el factor temperatura °C, para 4 diferentes
respuestas.
Tabla 4. Resultados obtenidos para el factor tiempo de residencia (min), para 4
diferentes respuestas.
Tabla 5. Resultados de pH y tamaño de partícula para un método de esterilización
de temperatura 100°C y 40 minutos
Tabla 6. Resultados obtenidos para el pH de las soluciones binarias de la
experimentación fraccionada
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1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La mayoría de los problemas que se presentan en la actualidad en el campo de la
salud son de gran importancia en la ingeniería por que incluyen aspectos
fundamentales de diseño, análisis de sistemas y aplicaciones prácticas del mundo
ingenieril; la participación de los ingenieros en el campo de la salud es conocida
como ingeniería biomédica.
Tratando de solucionar los problemas y restricciones asociados a las
transfusiones sanguíneas como la necesidad de la compatibilidad entre el grupo
sanguíneo y Rh del donante con el paciente, los inconvenientes relacionados con
el almacenamiento de la sangre (donde a medida que el tiempo de
almacenamiento aumente la concentración de glóbulos rojos decrece y cambian
propiedades como el pH, la viscosidad y la afinidad de la hemoglobina por el
oxígeno) (1), y la escasez de sangre entre otros, se han desarrollado sustancias
denominadas Hemosustitutos.
Los Hemosustitutos son sustancias que pueden remplazar parcialmente a la
sangre especialmente su función de transportar oxígeno a los tejidos del cuerpo.
Estas sustancias poseen restricciones de uso y debido a que no están diseñadas
para suplir todas las funciones de la sangre como la coagulación y la respuesta
inmune. Entre estas sustancias es posible encontrar el tranporte de oxígeno
basado en hemoglobina modificada (HBOC) y emulsiones de perfluorocarbono
(PFCOCs) (2)
Las PFCOCs son emulsiones perfluorocarbonadas, que son sustancias que
pueden reemplazar a la sangre en una o más de sus funciones, particularmente la
de transportar oxígeno a los tejidos y recoger dióxido de carbono (3). Estas
7
emulsiones son compuestos cuya formulación esta basada en una solución buffer
de fosfato, lecitina de soya, perfluoro-octil bromuro, alginato (alginic acid sodium
salt from brown algae, Sigma Aldrich, GmbH Germany) y dextrosa.
Con el propósito de buscar la aceptación de este tipo de emulsiones como una
solución momentánea a un problema de oxigenación causada por hemorragias, es
indispensable cumplir los requerimientos de esterilidad y toxicidad determinados
por la agencia de Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus
siglas en inglés).
Para lograr un grado de esterilidad en las emulsiones, éstas pueden ser expuestas
a tratamientos de calor en los cuales se inactiva o elimina el crecimiento
espontáneo de microorganismos presentes. Este tipo de tratamientos aseguran
un grado de esterilidad de en la emulsión aunque también afectan las propiedades
de la misma. Los tratamientos por calor pueden terminar generando el fenómeno
de floculación de las gotas de aceite de la emulsión, para posteriormente llegar a
una separación de fases (Srinivasan, 2002). El efecto del tratamiento de calor en
la estabilidad de la emulsión depende directamente del composición del producto,
incluyendo factores como pH, composición iónica y la intensidad del tratamiento
(4).
8
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Determinar teóricamente cual técnica de esterilización tiene mayor grado de
afinidad con respecto a las propiedades de las emulsiones de perfluorocarbono y
su grado de efectividad. Por medio de ensayos experimentales evaluar la
efectividad de la técnica escogida y su desempeño.
2.2 Objetivos específicos
Realizar una revisión bibliográfica detallada de las diferentes técnicas de
esterilización y selección de la técnica de esterilización apropiada para las
emulsiones de perfluorocarbono.
Realizar y ejecutar un diseño experimental para evaluar la técnica escogida
en una emulsión de perfluorocarbono preparada por el grupo de
investigación.
Obtener un protocolo de esterilización de las emulsiones de
perfluorocarbono. Considerando las condiciones de operación optimas en la
esterilización con las que obtendrá un mayor grado de efectividad.
9
3 ESTADO DEL ARTE
3.1 Introducción
Para llevar a cabo este proyecto y entender el contexto en el que se encuentra
realizado es necesario conocer la naturaleza de una emulsión y que
características poseen, los métodos de esterilización más frecuentes en el mundo
industrial para la esterilización de sistemas, y el desarrollo de emulsiones de
perfluorocarbono como una opción para transportar oxígeno en el cuerpo de forma
segura y su desarrollo en Colombia.
3.2 Emulsiones
Dispersiones de gotas de un líquido (la fase interna o discontinua) en un
segundo líquido inmiscible (la fase externa continua) con el primero, que
presentan una cierta estabilidad respecto a la coalescencia, estabilidad cuya
magnitud o escala de tiempo depende esencialmente de las aplicaciones. La
estabilidad, en el sentido de inhibición de la coalescencia de las gotas entre sí,
está asegurada por la presencia de una pequeña cantidad de una tercera
sustancia llamada emulsionante, que es en general un surfactante. Cuando dos
gotas de la fase dispersa están ubicadas a distancia suficientemente pequeña
entonces están sometidas a dos tipos de fuerzas. De un lado las fuerzas atractivas
de Van der Waals que tienen que ver con la masa de materia presente en las dos
gotas, y por otra parte las fuerzas de repulsión que dependen de las propiedades
interfaciales que el surfactante adsorbido les confiere y que resulta en una fuerza
repulsiva. La presencia de surfactante en las dos interfaces que se acercan puede
producir varios tipos de fenómenos de naturaleza eléctrica, estérica, entrópica o
osmótica (5).
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Normalmente se representa que las fases se encuentran compuestas por agua y
por aceite, ya que así no sean específicamente estas sustancias, son una forma
de representar una fase polar y una fase no polar en el sistema. De esta manera
se definen las emulsiones directas como una dispersión de gotas de aceite en
agua (o/w) y una emulsión en donde las gotas de agua están dispersas en aceite
se conocen como emulsiones inversas (w/o). Existen además emulsiones
múltiples cuando dentro de una gota se encuentra dispersa una gota más pequeña
de la fase continua (w/o/w), como se observa en la figura 1. Las cantidad relativas
de cada una de las fases dentro de la emulsión afectan directamente las
propiedades de la misma, Por lo cual es necesario realizar una clasificación de
estas sustancias según las cantidades de cada una de las fases en el sistema.
Para una emulsión en la que se tiene menos de un 20% de la fase dispersa, se
considera una emulsión de bajo contenido de la fase interna o diluida.
Ilustración 1. Diferentes tipos de emulsiones (5).
3.2.1 Estabilidad en las emulsiones
La estabilidad de la emulsión en una medida relativa, pero hace referencia a un
cambio generado dentro de la emulsión en una intervalo de tiempo que está
relacionado con la aplicación de la sustancia (5). Las emulsiones cambian sus
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propiedades al perder su estabilidad, este cambio se presenta en la consistencia,
la viscosidad, el tamaño de gota, entre otros.
La estabilidad de la emulsión puede verse afectada debido a factores externos
como el pH, la presencia de microorganismos, la temperatura de preparación y
almacenamiento y la contaminación del sitio de trabajo. Pero debe entenderse que
las emulsiones tienden a ser sustancias inestables que se separan con el tiempo,
por lo cual deben usarse métodos para estabilizarlas. Existen dos métodos para
estabilizar las emulsiones, el primero es la estabilización electroestática, que se da
cuando se utilizan surfactantes aniónicos que son absorbidos por las gotas de
aceite, logrando la formación de una capa de carga negativa rodeada por una
capa de carga opuesta. Por otro lado existe la estabilización estérica, que se
presenta cuando se utilizan emulsificantes de tipo polimérico o no iónico, donde
los efectos estéricos se van representados en forma de repulsiones de Van der
Waals (6).
Existen principalmete cinco (5) métodos de inestabilidad de las emulsiones:
Cremaje o sedimentación. En este proceso no existe un cambio en el
tamaño de las gotas, sino una acumulación de ellas debido a una diferencia
de densidades y a la acción de la gravedad (7). El cremaje ocurre cuando la
fase interna es más ligera que la fase continua, mientras que la
sedimentación es el caso contrario. Estos procesos siguen la ley de Stokes,
donde se puede determinar que para disminuir la velocidad de bajada o
subida de las gotas es necesario disminuir el radio de las gotas, disminuir la
diferencia de densidades e incrementar la viscosidad de la fase externa (8).
Flocuación. Se presenta en sistemas en los cuales existen fuerzas
atractivas entre gotas que logran formar un agregado de gotas que no
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pierden su identidad. Dependiendo de la intensidad de la fuerza neta, este
fenómeno puede ser reversible o irreversible (8) (6).
La floculación puede ser reducida si se crean barreras entre las gotas que
evitan el acercamientos entre ellas cuando las fuerzas de Van der Waals
son suficientemente grandes (6).
Coalescencia. Es un proceso irreversible que se basa en el
transporte de materia entre gotas, lo que quiere decir que dos gotas
pequeñas se unen para formar una más grande. Este fenómeno es
instantáneo cuando las fuerzas son lo suficientemente grandes y la
películas que las separa se ha adelgazado lo suficiente que las
perturbaciones interfaciales son capaces de romperla. La coalescencia se
puede presentar después de presentarse fenómenos de floculación,
sedimentación o cremaje, donde las gotas se encuentran aglomeradas y las
atracciones entre ellas se incrementan. La coalescencia se puede disminuir
si se usan surfactantes mixtos, que reducen los efectos de las
fluctuaciones.
Ostwald Rippening. Este proceso ocurre debido a una diferencia de la
solubilidad entre gotas grandes y gotas pequeñas.
Inversión de fases. Este fenómeno se presenta cuando la fase externa se
convierte en la fase interna, y la fase interna se convierte en la fase externa.
Éste proceso puede ocurrir de forma simultanea, lo cual genera que la
descripción y análisis de la inestabilidad de la emulsión sea más difícil (8).
13
Ilustración 2. Diferentes tipos de fenómenos de inestabilidad en emulsiones (6).
3.2.2 Emulsiones de perfluorocarbono
3.2.2.1 Perfluorocarbono
El perfluorocarbono (PFC) es un compuesto de carbono y flúor, líquido, inodoro,
que cuentan con estabilidad térmica, una alta densidad, baja viscosidad, baja
tensión superficial, cuentan con un potencial de ionización bajo y son poco
polares (9). Debido a la efectiva sobreposición de orbitales, el enlace C-F es el
enlace simple más estable dentro de la química orgánica, debido a esto la
mayoría de perfluorocarbonos tienden a ser química y biológicamente inertes, una
excepción es el perfluoroisobutileno (CF3)2CF=CF2 que es extremadamente
reactivo y tóxico (9).
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Las características de los PFC se atribuyen a la fortaleza del enlace carbono-flúor
y la electronegatividad del flúor que reduce la distribución de carga de las nubes
de electrones, ofreciendo una alta capacidad de disolución a gases como el O 2 y
CO2, transportando 20 veces más oxígeno que la sangre, dependiendo de la
presión parcial de oxígeno y obedeciendo la ley de Henry. El perfluorocarbono es
un aceite por lo que es inmiscible en sangre y agua, debido a esto se debe
emulsificar este compuesto para su uso intravascular, formándose las emulsiones
de perfluorocarbonos PFCOCs, con diámetros promedio < 0.2 µm (10).
Después que las emulsiones son aplicadas intravascularmente las gotas de la
emulsión son retenidas por los macrófagos del sistema retículo endotelial que las
fagocitan, donde el perfluorocarbono es temporalmente almacenado en el hígado
y en el vaso. Después el perfluorocarbono es lentamente reintroducido al sistema
circulatorio donde es disuelto por portadores de lípido en una tasa que depende
principalmente de su peso y finalmente son excretados en la exhalación corporal
(11).
Debido al tamaño tan reducido de las emulsiones de perflurorcarbon, éstas
pueden recorrer incluso los capilares más pequeños de 4 a 5 µm de diámetro,
lugares donde los glóbulos rojos no pueden fluir bajo ciertas condiciones. Es en
estas zonas donde las emulsiones de perfluorocarbono ejercen los mayores
efectos, aumentando la liberación de oxígeno local más de lo esperado. El
oxígeno transportado por las emulsiones de perfluorocarbono se encuentra
disuelto, las fuerzas de Van der Waals entre el oxígeno y el perfluorocarbono son
un orden de magnitud menor que el enlace covalente entre el oxígeno y el hierro
en la hemoglobina, dando lugar a una mayor presión parcial de oxígeno en la
micro circulación e incrementando la presión de arrastre para la difusión de
oxígeno disuelto al tejido (6).
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Los perfluorocarbonos más analizados y utilizados actualmente como
transportadores de oxígeno inyectables son los que se presentan a continuación
en la ilustración 3.
Ilustración 3. Perfluorocarbonos utilizados como medio de transporte de oxígeno
(12).
Respecto a los perfluorocarbonos incluidos en la ilustración 3 no ha se han
reportado problemas de toxicidad, efectos mutagénicos, cancerígenos o
reacciones inmunológicas.
3.2.2.2 Alginato de sodio
Las soluciones de alginato de sodio son el resultado de suspender una cantidad
determinada de ácido algínico en alcohol (metanol o etanol) en condiciones de
Perfluorocarbonos utilizados como posibles transportadores de oxígeno
Fórmula CódigoVida media en el cuerpo humano
(días)
16
temperatura determinadas. El intercambio de iones de H+ y Na+ es lento ya que el
ácido algínico no se caracteriza por ser una sustancia soluble.
En la mayoría de los casos el alginato de sodio formado se encuentra en
pequeñas fibras, debido a que el ácido algínico se precipita de esta manera. El
grosor de estas fibras genera una limitación en el máximo tamaño de partícula que
puede ser obtenido por medio del método de conversión por alcohol, siendo ésta
una de sus desventajas. Estas fibras de alginato son difíciles de disolver ya que no
se dispersan fácilmente en agua (13).
Estabilidad de los alginatos
El grado de polimerización de un alginato es una medida del peso molecular
promedio de las moléculas y es el número de unidades de ácido urónico por cada
cadena promedio. El grado de polimerización y el peso están relacionados
directamente a la viscosidad de la solución de alginato; un cambio en la viscosidad
es una media de la depolimerización del alginato.
El alginato de sodio es producido con diferentes viscosidades, representadas
por un nivel bajo, medio y alto dependiendo del 1% de la solución acuosa (13). Los
alginatos con un alto grado de polimerización son menos estables que los que
poseen un bajo grado de polimerización, ya que entre mayor sea el tiempo de
almacenamiento y las condiciones de almacenamiento de los mismos los alginatos
con mayor viscosidad tienden a ser menos estables.
3.3 Emulsión de perfluorocarbono colombiana
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En Colombia, la preparación de hemosustitutos es realizada por el grupo de
Ingeniería Biomédica (GIB) de la Universidad de los Andes, probando diferentes
formulaciones y métodos de preparación para obtener emulsiones estables que
transporten oxigeno, así como realizando ensayos experimentales in vitro y
modelos de evaluación en ratones y cerdos.
Para certificar la funcionalidad a largo plazo de las emulsiones es necesario
garantizar que estas tengan un grado de esterilidad determinado con el objetivo de
disminuir los riesgos de infección o intoxicación del modelo animal utilizado. Hasta
el momento el grupo de investigación no se ha enfocado en este campo
3.4 Métodos de esterilización
Teniendo en cuenta la información anterior es necesario revisar los métodos de
esterilización y las variables de cada uno, con el objetivo de especificar las
posibles técnicas de esterilización que se podrían emplear con las emulsiones
perfluorocarbonadas.
El proceso de esterilización depende de la ef icacia del equipo y las limitaciones
que son propias de cada producto y es necesario un compromiso entre estos
factores para llevar a cabo la esterilización requerida.
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
3.4.1 Por destrucción total de microorganismos.
Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre
implica calentamiento apreciable del material o el uso de poderosos agentes
oxidantes (6).
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3.4.2 Por muerte o inactivación.
La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que
exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por
calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor
húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor
en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria
cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación. En el
caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmósferas (6). En
escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor saturado bajo
presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo
y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre también en el caso
de los autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso.
Después de la esterilización se mantienen las condiciones asépticas, haciendo
pasar vapor por las válvulas y sellos (7).
3.4.3 Por eliminación con medios físicos.
La eliminación física está restringida a la esterilización de gases y líquidos, es
fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros
fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de metal
sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los microorganismos no
es posible. Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser
lana de vidrio, amianto y ésteres de celulosa (6).
19
4 METODOLOGÍA
4.1 Materiales
Solución buffer de monofostfatos preparada siguiendo el protocolo de preparación
PRO-PPH-25—00 y PRO-PPH-30-00 (Laboratorio de Hemosustitutos FCI
UAndes). Lecitina de soya (Epikuron 170 Degussa GmbH Germany), perfluorooctil
bromuro 99% (Exfluor Research Corp, USA), solución de alginato preparada
siguiendo el protocolo de preaparación PRO-PPH-26-00 Y PRO-PPH-31-00, y
dextrosa al 50% estéril.
4.2 Preparación de la emulsion
La preparación de la emulsión se lleva a cabo siguiendo el protocolo PRO-PPH-
28-00, realizado y modificado por el grupo de ingeniería biomédica de la
Universidad de los Andes. Dicha preparación se lleva a cabo teniendo en cuenta
que dos (2) de las tres (3) emulsiones se prepararon con PFC recuperado de
emulsiones anteriormente preparadas, y la última se preparó con PFC al 99%.
Ilustración 4. Procedimiento de preparación de una emulsión de perfluorocarbono
20
4.3 Tratamiento térmico
Las emulsiones fueron repartidas en diez (10) alicuotas de 20 ml, que se
colocaron en envases de vidrio transparente para poder observar todos los
cambios que se presentaran durante el tratamiento. Dichos envases fueron
cerrados por un sello de gasa que se diseño para evitar que el acumulamiento de
gases provenientes de la evaporación del líquido durante la etapa de
esterilización. Estas alícuotas fueron sometidas a diferentes tiempos de residencia
y temperaturas máximas de esterilización, como se muestra en la Tabla 1.
Los perfiles generados por el equipo de vapor húmedo (autoclave) a los que se
someten las emulsiones se observa en la ilustración 5.
Tabla 1. Niveles de evaluación para los factores del experimento.
Nivel \ Factor
Temperatura Tiempo de residencia
°C Minutos
Alto 121
20,10,5
Medio 115
Bajo 110
Bajo* 100 40
*Este nivel se evaluó solamente para una alícuota de la emulsión con su
respectiva replica basado en referenciado en (Arlen, Le Blanc, & Riess, 2000)
Como se observa en la ilustración 5, el perfil de temperatura del autoclave
depende principalmente de las condiciones iniciales de operación y el método
seleccionado para llevar a cabo la esterilización. Este método se cambia para
21
llegar al tiempo de residencia de temperatura máxima deseado, es por esto que
se da el comportamiento de los perfiles para un misma temperatura a diferentes
tiempos.
En los intervalos de tiempo en los que la emulsión de encuentra en la temperatura
máxima del proceso, es donde se lleva a cabo la esterilización ya que las
condiciones del sistema, tanto presión como de temperatura, no permiten o
inhiben el crecimiento de cualquier microorganismo presente en el momento de la
preparación de la emulsión.
Ilustración 5. Perfiles de temperatura alcanzados para una temperatura de 121 °C y los
tres tiempos de residencia de temperatura máxima.
22
4.4 Métodos de caracterización
Para determinar un cambio en las propiedades de la emulsión, se realizó la
caracterización de las mismas antes y después del tratamiento térmico. La
caracterización de las emulsiones consiste en la determinación del pH, la
osmolaridad, el tamaño de partícula, el potencial zeta y en algunos casos la
viscosidad.
4.4.1 Potencial Zeta
La capa líquida que rodea la partícula se presenta en dos regiones; una región
interna, llamada la Capa de Stern, donde los iones están unidos por enlaces muy
fuertes y una región externa (difusa), donde las partículas están unidas de una
forma menos rígida. Dentro de la capa externa hay límites hipotéticos en los
cuales las partículas forman una estructura estable. Cuando una partícula se
mueve como respuesta a alguna fuerza externa, los iones dentro de los límites se
mueven con ella, pero lo iones que no se encuentran dentro de estos limites no se
mueven con la partícula. Este límite se denomina como la superficie de esfuerzo
hidrodinámico o plano de deslizamiento (Ilustración 6).
Ilustración 6. Esquema de potencial zeta.
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El potencial que existe en este plano se conoce como el potencial zeta (15).
La magnitud del potencial zeta muestra una indicación del potencial de estabilidad
de un sistema coloidal. Un sistema coloidal es cuando uno de los estados de la
materia (líquido, sólido o gas) está disperso en un estado diferente de materia.
Si todas las partículas en una suspensión poseen un valor de potencial zeta alto
(positivo o negativo) entonces las partículas tenderán a repelerse entre ellas
evitando el fenómeno de floculación. Sin embargo, si las partículas poseen un
potencial zeta bajo no existirán fuerzas que se encarguen de prevenir la fuerzas
de atracción entre las mismas, llevando a la floculación en la suspensión.
Generalmente el rango de estabilidad está dado para suspensiones que presenten
valores mayores a +30 mV y menores a -30mV (15). El factor que afecta
principalmente el potencial zeta en una suspensión es el pH de la misma
(Ilustración 7).
Ilustración 7. Comportamiento del potencial zeta en función del pH para una
emulsión (Instruments, 2005).
24
4.4.2 Tamaño de partícula
El tamaño de las partículas en una emulsión es un factor muy importante porque
determina su estabilidad; la coalescencia y la difusión molecular son factores
concluyentes en la estabilización de la emulsión, de la cual depende su
funcionamiento como hemosustituto.
Con el objetivo de medir el tamaño de partícula de las emulsiones se utiliza el
método Dynamic Light Scattering (Dispersión de láser), el cual mide las
fluctuaciones de la luz difractada en las partículas que sufren movimientos
Brownianos, que hace referencia a las colisiones entre las partículas suspendidas
y las moléculas del solvente.
Se utiliza una función que interrelaciona la intensidad, el coeficiente de difusión y
el radio hidrodinámico rh, mediante las ecuaciones 1,2 y 3. El radio hidrodinámico
es el reportado por el equipo, esta relación tiene en cuenta el movimiento de un
rayo de luz en un tiempo t determinado, y la variación en la posición del mismo
después de un tiempo experimental . Teniendo en cuenta este cambio de
posición y el ángulo que se difracto el mismo se realiza una aproximación del
radio hidrodinámico de la partícula.
Donde I hace referencia la intensidad, es la diferencia en el tiempo, t es el
tiempo, D es el coeficiente de difusión, T es la temperatura, n es la viscosidad del
solvente y k es la constante de Boltzman.
25
4.4.3 Osmolaridad
Es una medida usada en el campo farmacéutico y médico para expresar la
concentración total (medida en osmoles/litro) de sustancias en disoluciones
usadas en medicina (16).
En un organismo vivo la osmolaridad de los fluidos depende de la concentración
de aniones, cationes y otras sustancias. En el plasma sanguíneo la osmolaridad
está definida por la concentración de cationes de Na, la concentración de agua
presente y la concentración de la hormona antidiurética, generada en el paso de la
sangre por el hipotálamo y responsable de equilibrar la relación entre iones de
sodio y agua en el plasma sanguíneo, y ésta se oscila entre 290 +/- 10 mOsm
(17).
4.4.4 pH
Las emulsiones de perfluorocarbono van a ser administradas intravascularmente,
por lo cual se debe asegurar que su pH sea el mismo de la sangre, el cual tiene
un promedio entre 7.35 a 7.45.
La determinación de pH se realiza mediante la medición del potencial que separa
dos soluciones con diferente concentración de protones. Se introducen el
electrodo de cloruro de mercurio, que cuenta con un extremo sensible de vidrio
polarizable. El voltaje en el interior del extremo del electrodo es constante
manteniendo su pH en 7, de manera que la diferencia de potencial solo depende
del pH del medio externo.
4.5 Comparación PFC 99% y PFC recuperado
26
Como se mencionó anteriormente se prepararon emulsiones con PFC nuevo y
PFC recuperado. El uso de PFC recuperado de emulsiones anteriores se genera
debido a sus altos costos de comercialización.
Teniendo en cuenta que el PFC recuperado no tiene el mismo porcentaje de
pureza que el propuesto para realizar la emulsión en el protocolo PRO-PPH-28-
00, es necesario realizar un análisis de espectroscopia infrarroja cercana de una
muestra del PFC recuperado y de esta manera determinar las diferencias entre los
PFC’s.
4.5.1 Espectroscopia infrarroja cercana
Se llevó a cabo un análisis mediante el método de espectroscopia infrarroja NIR,
donde se compara el espectro del PFC nuevo con el de PFC recuperado; este
método está basado en la absorción de energía de las moléculas presentes en la
emulsión, se asocian cambios en un espectro a cambios de las propiedades
químicas y físicas de las partículas. La radiación en el infrarrojo tiene la energía
necesaria para generar transiciones vibracionales en las moléculas, provocando
que las frecuencias estudiadas presenten frecuencias simulares a la vibración de
moléculas previamente identificadas (18).
En relación al espectro obtenido para el PFC 99% y el PFC recuperado se
determina que el porcentaje de impurezas presentes en el PFC recuperado no
tiene una gran concentración por lo cual el uso de cualquiera de los dos generará
un resultado positivo en la preparación de las emulsiones (Ilustración 8),
corroborando así que en la preparación de la emulsión no se generará una nueva
variable a tener en cuenta para un análisis posterior.
27
Ilustración 8. Espectro obtenido para el PFC en una prueba de espectroscopia infrarroja cercana.
28
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Comparación métodos de esterilización
Métodos de esterilización
Destrucción total de
microorganismos
Por eliminación con medios
físicos Por muerte o inactivación
Calentamiento Agentes
oxidantes Filtro absoluto Filtro fibroso Radiación Agentes químicos
Calentamiento húmedo
Ven
taja
s
El grado de esterilidad
alcanzado es alto
Grado de esterilidad alto
Alto porcentaje en la filtración de
microorganismos
Porcentaje de filtración de
microorganis
mos medio, bajo costo
Alto grado de
esterilidad en
solución
translucidas
Efectivo en la esterilización
de material termolábil
Alto grado de esterilidad en
soluciones, determinando
condiciones de
operación apropiadas
Desventa
jas
Debido a las altas
temperaturas
alcanzadas se genera un daño en la
solución
Pueden
ocasionar un cambio a la
formulación de
la emulsión
Riesgo en la
operatividad del filtro
debido a su
material
Riesgo en el rompimiento
de la
membrana
Debido a la
opacidad de la
emulsión
la luz UV no
alcanza a
penetrar
Compuestos reaccionan
con gran facilid
ad
Puede generar el rompimiento de
emulsiones
Tabla 2. Comparación de los métodos de esterilización más usados en la industria.
29
Por medio de una análisis realizado respecto a las técnicas de esterilización
usadas actualmente (tabla 2) y la naturaleza de la emulsión de perfluorocarbono,
se determinó llevar a cabo el procedimiento de esterilización de la emulsión
mediante el método de vapor húmedo, ya que éste método además que ofrece un
alto grado de esterilidad en el sistema se puede modificar teniendo en cuenta las
propiedades de las emulsiones. Posteriormente se realizará un análisis sobre las
condiciones de operación de dicho método para de esta manera determinar las
condiciones óptimas de operación, y que de esta manera no se presente un
cambio en la propiedades de la emulsión respecto a sus propiedades iniciales
determinadas en el momento de la preparación.
5.2 Diseño experimental
Teniendo en cuenta las variables que se pueden manejar en la experimentación,
es posible determinar que los factores más importantes son la temperatura
máxima de esterilización y el tiempo de residencia de cada una de la alícuotas en
el proceso de tratamiento por calor.
Los niveles evaluados para cada uno de los factores se escogieron teniendo en
cuenta las propiedades de emulsiones de aceite en agua, además de la
importancia de las propiedades de cada uno de los compuestos de la emulsión de
forma individual (19). Respecto a los niveles escogidos para el factor temperatura,
se tuvo en cuenta la temperatura de ebullición, ignición o degradación de cada
uno de los compuestos. Teniendo en cuenta esto se encontró que la lecitina tiene
un punto de ignición de 167 °C, teniendo como referencia a este compuesto ya
que es uno de los compuestos más inestables de la emulsión, debido a que se
degrada con la luz o las condiciones ambientales (20).Además es importante tener
en cuenta el punto de ebullición del agua presente en la emulsión, ya que las
temperaturas a las cuales se realiza la experimentación, sobrepasan la
temperatura de ebullición del agua, por lo cual se espera una disminución de
30
volumen de la fase acuosa de la emulsión, modificando directamente la viscosidad
de la misma. Teniendo en cuenta la información encontrada en la referencia (19)
se determinaron tres (3) niveles para evaluar cada uno de los factores. Los niveles
para factor se encuentran registrados en las tablas 2 y 3, donde para la
temperatura (Tabla 2) el nivel ‘Alto’ representa una temperatura de 121 °C, el nivel
‘Medio’ representa una temperatura de 115°C , y el nivel ‘Bajo’ representa una
temperatura de 110 °C. Mientras que para el tiempo de residencia en la
temperatura máxima (Tabla 3) el nivel ‘Alto’ representa un tiempo de exposición de
20 minutos, el nivel ‘Medio’ representa un tiempo de 10 minutos, y el nivel ‘Bajo’
representa un tiempo de 5 minutos. Con los niveles definidos, y después de
realizada la experimentación se encontró que nivel influye de forma directa en las
propiedades de la emulsión.
El la tablas 2 y 3 se encuntran las respuestas obtenidas para cada uno de los
niveles, estas respuestas están representadas por un símbolo , donde el
símbolo representa que hubo un cambio en la propiedad medida con respecto a
un valor inicial medido en el momento de preparación de la emulsión. Y el espacio
en blanco muestra que no se presentó un cambio significativo, o no se presento
ningún cambio en las propiedades medidas.
Tabla 3. Resultados obtenidos para el factor temperatura °C, para 4 diferentes
respuestas.
Factor pH Osmolaridad Tamaño de partícula Potencial zeta
Alto
Medio
Bajo
31
Tabla 4. Resultados obtenidos para el factor tiempo de residencia (min), para 4
diferentes respuestas.
Basado en los resultados mostrados en las tablas anteriores, se presenta un
cambio en las propiedades medidas para una temperatura de 121 °C y para
cualquier tiempo de exposición evaluado. Dicho cambio de propiedades se puede
observar además en el cambio de tonalidad, como se observa en la Ilustración 9.
Ilustración 9. Representación entre el cambio de tonalidad obtenido para una alícuota de
emulsión después de ser tratada a una temperatura de 121 °C para los tres (3) tiempos
de residencia.
Factor pH Osmolaridad Tamaño de partícula Potencial zeta
Alto
Medio
Bajo
32
Para una temperatura de 110°C, se obtuvo que se presenta un cambio en el pH y
la osmolaridad de la emulsiones, pero para el tamaño de partícula y potencial zeta
se mantienen dentro de un rango constante, aunque se presenta un leve cambio
en la coloración de la emulsión (Ilustración 10).
Los resultados obtenidos para la temperatura de 110 °C muestran que ninguno de
los tiempos de residencia marca un cambio en las propiedades características de
la emulsión. Sin embargo se genera un cambio en la coloración de la emulsión.
Es por esto que es necesario realizar un análisis de espectroscopía infrarroja
cercana, y de ésta manera, encontrar si se presenta un cambio en las propiedades
químicas de la emulsión.
Ilustración 10. Resultados obtenidos para una temperatura de 115°C para cada uno de
los niveles evaluados.
33
5.2.1 Perfiles de espectroscopía infrarroja cercana (NIR) de las emulsiones
Las ilustraciones 11 y 12 representan los perfiles generados para las emulsiones
que fueron tratados por calor a 121 y 115°C. En estas gráficas se hace una
comparación entre una alícuota de una emulsión sin haber sido sometida a el
proceso de esterilización. El comportamiento obtenido muestra que para dichas
temperaturas se presentó un cambio en las propiedades químicas de la emulsión,
corroborando de esta manera los resultados obtenidos para las propiedades de
osmolaridad, pH, tamaño de partícula y potencial zeta. Este cambio químico se
genera por la depolimerización del alginato de sodio con la temperatura, y la
posible descomposición de la lecitina con los choques bruscos de temperatura,
generados en el proceso de esterilización.
Ya que la lecitina es el componente que funciona como surfactante de la emulsión,
la degradación de ésta, genera y fomenta el fenómeno de coalescencia en las
emulsiones. En las muestras que fueron sometidas a una temperatura de 121 °C,
éste fenómeno estuvo presente. A diferencia de las emulsiones en las cuales el
fenómeno de floculación esta presente, la forma de homogeneizar dichas
emulsiones no se puede lograr en emulsiones donde se presenta la coalescencia.
Debido a que la floculación es un fenómeno en el cual se necesita una energía
mínima que ayuda las fuerzas interfaciales que se presentan en las gotas de la
emulsión, mientras que en la coalescencia, se genera un aumento en el tamaño
de partícula de las gotas de la emulsión, generando de esta manera un
precipitación del la fase oleosa.
34
Ilustración 11. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de 121 °C a diferentes tiempos de
residencia.
35
Ilustración 12. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de 115 °C a diferentes tiempos de
residencia.
36
Como se mencionó anteriormente se realizó una medición en la cual el tratamiento
de calor se lleva a cabo a una temperatura de 100°C por un tiempo de 40 minutos
(21). Como se muestra en la Tabla 4 no se presenta un cambio significativo en el
pH, osmolaridad, tamaño de partícula y potencial zeta.
Tabla 5. Resultados de pH y tamaño de partícula para un método de
esterilización de temperatura 100°C y 40 minutos.
Temperatura 110°C
Respuesta Valores iniciales Valores finales
pH 7,521 7,179
Osmolaridad mOsm 310 302
Tamaño de partícula nm 175,4 169,4
Potencial zeta mVolt -35 -34
Según los resultados obtenidos no se presenta un cambio significativo en las
propiedades de la emulsión ni en la tonalidad de la emulsión (Ilustración 13), se
considera una opción para lograr la esterilización de la emulsión de
perfluorocarbono.
Ilustración 13. Resultados obtenidos para una temperatura de 100°C por un tiempo de
esterilización de 40 minutos.
37
Ilustración 14. Perfil obtenido por el NIR para una emulsión a una temperatura de 100 °C durante 40 minutos.
38
5.2.2 Experimentación fraccionada
Por medio de la experimentación previa, es posible determinar que el
denominador común en las emulsiones que han sido tratadas por el método de
esterilización, es el cambio de tonalidad de éstas. Debido a que esto, se realizó un
proceso de esterilización fraccionada, en la cual se realizaron mezclas binarias,
que fueron llevadas al autoclave a una temperatura de 121 por 20 minutos, para
de esta manera determinar cual de los compuestos es el responsable del cambio
de tonalidad de las PFCOC’s.
Como se observa en los resultados de la Tabla 5, ninguna de las mezclas binarias
presenta un cambio significativo en el pH de las mismas. Las soluciones de
lecitina/ agua y dextrosa, no presentan ningún cambio de tonalidad, mientras que
la solución de buffer/alginato 50% presenta un proceso de depolimerización o
carbonización, como se muestra en la Ilustración 15.
Tabla 6. Resultados obtenidos para el pH de las soluciones binarias de la
experimentación fraccionada.
Solución Buffer/Alginato 50%
Volumen 20 ml
pH inicial 8,531
pH final 8,138
Solución Lecitina/Agua (1gr)
Volumen 20 ml
pH inicial 6,026
pH final 6,015
39
Dextrosa 50%
Volumen 20 ml
pH inicial 2,531
pH final 2,51
5.2.2.1 Estabilidad de alginatos sólidos
El grado de polimerización de un alginato es la medida del peso molecular
promedio de las moléculas y el número de unidades de acido urónico por cadena
promedio. El grado de polimerización y el peso molecular esta relacionado
directamente con la viscosidad de las soluciones de alginato. Una baja viscosidad
define el grado de depolimerización que puede presentarse (13).
La temperatura es un factor importante en la realización de soluciones de
alginato a base de sales algínicas. Debido a las cadenas largas del alginato, es
propenso a sufrir un rompimiento en sus enlaces, modificando propiedades como
la solubilidad, pH, y peso molecular (22).
Ilustración 15. Representación del cambio generado por la depolimerización del alginato
de sodio.
40
6 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Por medio de revisión una bibliográfica para los métodos de esterilización más
usados en la industria y el campo médico-quirúrgico, realizando un análisis de
ventajas y desventajas basado en las condiciones de operación y requerimientos
para llevar a cabo dicho procesos, se escogió el método de vapor húmedo,
basado en la transferencia de calor, como el método más óptimo para la
esterilización de emulsiones de perfluorocarbono teniendo en cuenta las
restricciones de la emulsión (propiedades físicas y químicas) y de esta manera
modificar esta técnica con las condiciones de operación mínimas requeridas.
Se determinó por medio de la experimentación que el método de tratamiento
por calor para lograr un mayor grado en la esterilidad de la emulsión es una
alternativa viable, aunque es indispensable tener en cuenta que las condiciones de
operación para llevar a cabo esta técnica deben ser de una temperatura de 110°C
por un tiempo de exposición de 40 minutos. Estas condiciones se determinaron ya
que la emulsión presenta cambios en el tamaño de partícula, el pH, la osmolaridad
y el potencial zeta cuando las temperaturas de exposición son mayores a 115°C.
Para una temperatura de 110°C la emulsión presenta un cambio en su tonalidad
debido a la depolimerización que presenta el alginato, aunque este cambio de
tonalidad no afecta directamente el pH de la emulsión, debido a la presencia de la
solución buffer en la emulsión, es importante que la emulsión no sufra ningún tipo
de cambio para de esta manera asegurar que continua cumpliendo su función de
transporte de oxígeno de forma segura.
Para obtener mejores resultados respecto a la esterilidad de la emulsión se
recomienda el seguimiento preciso de cada uno de los protocolos de preparación
de las emulsiones, y las soluciones (buffer, alginato) necesarios para la
41
preparación de la misma, ya que de esta manera se disminuye el riesgo de
contaminación de los reactivos por microorganismos presentes en el ambiente.
Además de tener en cuenta los protocolos de preparación, es importante leer,
analizar y utilizar los protocolos para mantener un ambiente limpio dentro del área
de trabajo, resaltando el uso de prendas limpias, y esterilización de equipos y
materiales por medio del método de vapor húmedo.
42
7 BIBLIOGRAFÍA
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43
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22. McHugh, D.J. Chapter2- Production, properties ad uses of alginates. s.l. :
Campbell: Australian Defence Force Academy, 2008.
44
8 ANEXO 1
Protocolo de esterilización de emulsiones de perfluorocarbono
1. OBJETIVO
Describir todos los pasos que se deben llevar a cabo para la esterilización de
una emulsión de perfluorocarbono.
2. ALCANCE
Este procedimiento aplica para emulsiones de perfluorocarbono 30% v/v.
3. DEFINICIONES
3.1. Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida de
vida microbiana, incluidas las esporas.
4. CONDICIONES GENERALES
4.1 Los investigadores del Laboratorio de Hemosustitutos son los encargados
de la divulgación, cumplimiento y actualización de este procedimiento.
4.2 El personal asignado para llevar a cabo este procedimiento es responsable
de cada actividad.
Está totalmente prohibido el ingreso de personal que no lleve el uniforme
completo requerido como lo son bata, gafas y guantes para ingresar a las
áreas respectivas y/o que no haya realizado la capacitación de ingreso.
5. MATERIALES Y EQUIPOS
5.1. Bata de laboratorio limpia y estéril.
5.2. Material de vidrio.
5.3. Autoclave Sterilof (laboratorio de tejidos ML 302)
45
6. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
6.1 Preparación de la emulsión de perfluorocarbono 30% v/v.
6.2 Limpieza del material o recipientes en los cuales se realizará la segregación de
la emulsión.
6.3 Segregación de alícuotas de volumen determinado por el usuario.
6.4 Realización de tapones de gasa, de diámetro mayor a la boquilla del recipiente
donde se envaso la emulsión.
6.5 Ingreso de recipiente al autoclave (se recomienda leer el manual de operación
del equipo).
6.6 Entrar al modulo cinco ‘5’ de operación del autoclave, determinar temperatura
de 100 °C y tiempo de residencia de 40 minutos.
6.7 Después de realizado el proceso de esterilización, esperar a que se enfrie el
equipo y el recipiente.
6.8 En la cámara de flujo laminar realizar el paso de la sustancia entre el recipiente
donde se llevo a cabo el proceso, y el recipiente final de almacenamiento (éste
recipiente debe estar estéril).
7. ANEXOS
Manejo interno.
8. REFERENCIAS
N/A.
