Physiologie bactrienne applique

lidentification

Sophie Blevesbleves@imm.cnrs.fr

Microbiologie Biologie des organismes

!levures, moisissures, champignons

(myctes)

!algues

!protozoaires (amibes, parasites)

eucaryotes infrieurs (protistes)

!bactries

procaryotes 2 groupes taxonomiques

eubactriesarches

c pithliales (35!m) GR (8!m) Bactries (1!m) Virus (10-100nm) 1 000 b sur 1 mm

Comment observer les bactries?

- microscopie optique (G 1 000-1 500 fois)

- microscopie lectronique (G >10 000 fois)

Microscopie optique

Etat frais

Contraste de phase

E. coli

Bleu de mthylne

Fixation + Coloration

Acinetobacter(cocci isols ou en chane entours dune capsule)

bactries dun frottis de yaourt

Encre de chine!

bacillescoques sprirales

incurves

btonnets fuseau

sphriques

Formes diffrentes selon les espces Coloration de Gram

Peptidoglycane: rseau delongues chanes polysaccharidespontes par peptides

paisse couche de PG fine couche relche de PG (7 8 nm) dans lepriplasme + membrane externe

paisse couche de PG fine couche dans le priplasme relche+ membrane externe

Coloration de Gram

Peptidoglycane

Membrane plasmique(bicouche symtrique dephospholipides)

Priplasme

ou Mb interne

Mb externe(bicouche asymtriquephospholipides et LPS)

Gram +Gram -

Coloration spores(vert de malachite, contre

coloration fushine)Bacillus thuringiensis

Autres colorations

Coloration flagellaire(Leifson, fuschine basique)

Vibrio

Microscopie lectronique balayage E. coli x30 000

Microscopie lectronique transmissionE. coli

Microscopie lectronique

Identification de bactries

Echantillon -------------------------> Identification ?

Identification de bactries

Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments- environnement-

EnrichissementIsolement

Identification(culture pure)

Il existe de nombreuses espces bactriennes, quon peut classer daprsquelques critres fondamentaux :

- morphologie des colonies- forme & taille des cellules- coloration GRAM- quelques caractres biochimiques simples dorientation- mode respiratoire- mobilit

Croissance et maintien des organismes en laboratoire- aliments essentiels (acides amins, peptides, bases nucliques, sucres),- lments minraux : fer, phosphore, soufre, magnsium,....-facteurs de croissance (sang, protines, vitamines)

Systme tampon pour viter les variations importantes du pH

Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)

Les milieux de culture

1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance dela plupart des organismes)peptones (hydrolysats de protines partir digestion viande, casine, soja,glatine....) = source C et nergie

ex LB (Luria Broth), bouillon au soja

2-milieux synthtiques (ou minimums)composs chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans leauex milieu M9

Plusieurs espces dans lchantillon1- Isoler la bactrie dintrt2-Enrichir

Une espce dans lchantillon1- Enrichir

--> Morphologie des colonies

Morphologie des colonies

Couleur

Aspect (sec, gras, transparent)

Les types de milieux de culture

Milieux solides pour lisolement liquides pour culture de bactries pures ou lors dinfection monobienne

!: bactries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire)

1- milieux slectifs empchent la croissance de certaines bactries et favorisentla croissance de celles dintrt = SELECTION

E. coli et Proteus mirabilis(Drigalski)

S. aureus (Chapman)

ex AntibiotiqueDrigalski (cristal violet) : croissance G-SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, ShigellaChapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus

Antibiogramme (inhibition croissance)

La temprature peut tre slective

Serratia marcescensE. coliBacillus stearothermophilus

Pshycrophiles

Msophiles

Thermophiles

Extrmophiles

4C37C 60C

2- milieux diffrentiels: distinction de diffrents groupes de bactries(caractristiques biologiques) = IDENTIFICATION

Mee proprits biochimiques d'une bactrie pour commencer l'identifier: tudedu mtabolisme respiratoire, des glucides, des protines, des lipides....

Les types de milieux de culture

Lac+ (colonies rouges)

Lac- (colonies incolores)

Utilisation du LactoseMacConkey utilisation --> "pH(indicateur color, rouge neutre)

Caractre fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1) Dgradation Glu -->dchets acides (indicateur de pH, rouge de phnol) Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble)

Fermentation - +- + + +Production H2 - - - + +

test catalase (addition H2O2 )+: dgagement H2

milieu jaune doeuf!: hydrolyse des lipides

Bacillus +

E. coli -

Alcaligenes -

test urase!:Production NH3 --> "pH (indicateurcolor, rouge de phnol)

E. coli - Proteus vulgaris +

glose au sang!: bactries hmolytiques ounon

E. coli - S. aureus +

mobilit (0,5% agar)

Effet de loxygne

Pseudomonas, Acinetobacter,Neisseria

Campylobacter, Mycobacteriaceae

Entrobactries (Escherichia,Salmonella), streptocoques,staphylocoques

Bactries intestinales (Bacteroides,Fusobacterium, Clostridium) et florecommensale

Exemples

Accepteur final dlectrons lorsrespiration arobie (rduit en eau)

Ncessaire < 0,2 atm (PP < celle air)

Pas ncessaire, mais utilis (switch)(oxydation des substrats et fermentation)

Pas ncessaire, non utilis (fermentation)

Toxique (fermentation, respirationanarobie, photosynthse)

Culture sous atmosphre rductrice

-

-

+

+

+

+

+-

+

+

-

Arobie strict(1)

Microarophile(3)

Aro-anarobiefacultatif (2)

Anarobiearotolrant

Anarobiestrict (4)

Effet de lO2+ O2+ O2

231 4

- milieux de culture dont la composition permet de mee une activit enzymatique: -galactosidase (ONPG), lysine dcarboxylase (LDC), ornithine dcarboxylase (ODC), urase(URE)

- activit fermentaire est rvle avec un milieu type contenant un sucre, unindicateur color des changements de pH (fermentation sucre " pH)

Tests didentification en micromthodeGalerie API20-E (Biomrieux)

plus sensiblesmesures photomtriques en continu --> identification des principales bactries isoles en pratique mdicale en moins de 5 h

Systmes automatiss

caractres morphologiques

caractres physiologiques et mtaboliques

caractristiques molculaires :- composition en bases des AN (GC%)- amplification-squenage gne codant ARN16S(phylognie molculaire : appareils de traduction sonttrs conservs, non changs par transfertshorizontaux)- comparaison de protines (squenage, Ac)

Identification de bactries

Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments--environnement

EnrichissementIsolement

Identificationsur culture pure

Gram +

12 groupes de bactries

G-

G+

Gram-Proteobacteria

HelicobacterAgrobacteriumEnterobacteriaPseudomonads

DesulfovibrioThiobacillus

Catalase (+ ou -)

Oxydase (+ ou -)

Coagulase (+ ou -)

Indole (+ ou -)

Utilisation des sucres (fermentation on non)

Activit enzymatique ou non (urase, glatinase, nitrate rductase)

Production dH2S ..

Tous ces caractres permettent dobtenir une identification de plus en plusprcise, et finalement exacte de la bactrie

Caractres biochimiques simples

Gram +

Coques Gram +

Staphylococcus aureus(supuration, septicmie)

En amas : Staphylocoques (grappe de raisins)

Streptococcus pyogenes(angine, scarlatine)

En chanettes: Streptocoques, entrocoques

Streptococcus pneumoniae(otite, pneumonie, mningite)

En diplocoques: Pneumocoques

Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)

Clostridium difficile (diarre post antibiotique)

Bacilles Gram +

Listeria monocytogenes(mningite, avortement)

Bacillus anthracis(maladie du charbon,herbivores transmissible lhomme)

Gram -

Coques Gram -

Neisseria meningitidis (mningocoque: mningite, septicmie)

Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)

Entrobactries

Gram -

Bacilles Gram -

2 familles importantes en pathologie humaine :

Les entrobactries (Enterobacteriacae) Les Pseudomonas (Pseudomonacae)

Pseudomonas aeruginosaBurkholderiaPathognes opportunistes(infections nosocomiales etmucoviscidose)

E. coli - commensal (infection urinaire) - ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticmie)Salmonella (infection digestive simple fivre thyphode)Shigella dysenteriae (infection digestive mineure grave- Yersinia pestis

Vibrio cholerae (eau, pidmie Cholra)Bordetella pertussis (coqueluche)

Mycobactries Bacilles acido-alcoolo rsistants ou BAAR Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen

Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch) Mycobacterium leprae

SpirochtesTreponema pallidum (syphilis)

Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)

Autres genres importants en pathologie humaine

Mycoplasma pneumoniae

Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis (MST)

Rickettsia conorii (fivre boutonneuse-tiques-) Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)

Bartonella henselae: maladie des griffes du chat

Germes intracellulaires : exemples