Morpho Logie

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    15-Jan-2016
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MorphoLogie bacterienne

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  • Physiologie bactrienne applique

    lidentification

    Sophie Blevesbleves@imm.cnrs.fr

    Microbiologie Biologie des organismes

    !levures, moisissures, champignons

    (myctes)

    !algues

    !protozoaires (amibes, parasites)

    eucaryotes infrieurs (protistes)

    !bactries

    procaryotes 2 groupes taxonomiques

    eubactriesarches

    c pithliales (35!m) GR (8!m) Bactries (1!m) Virus (10-100nm) 1 000 b sur 1 mm

    Comment observer les bactries?

    - microscopie optique (G 1 000-1 500 fois)

    - microscopie lectronique (G >10 000 fois)

    Microscopie optique

    Etat frais

    Contraste de phase

    E. coli

    Bleu de mthylne

    Fixation + Coloration

    Acinetobacter(cocci isols ou en chane entours dune capsule)

    bactries dun frottis de yaourt

    Encre de chine!

  • bacillescoques sprirales

    incurves

    btonnets fuseau

    sphriques

    Formes diffrentes selon les espces Coloration de Gram

    Peptidoglycane: rseau delongues chanes polysaccharidespontes par peptides

    paisse couche de PG fine couche relche de PG (7 8 nm) dans lepriplasme + membrane externe

    paisse couche de PG fine couche dans le priplasme relche+ membrane externe

    Coloration de Gram

    Peptidoglycane

    Membrane plasmique(bicouche symtrique dephospholipides)

    Priplasme

    ou Mb interne

    Mb externe(bicouche asymtriquephospholipides et LPS)

    Gram +Gram -

  • Coloration spores(vert de malachite, contre

    coloration fushine)Bacillus thuringiensis

    Autres colorations

    Coloration flagellaire(Leifson, fuschine basique)

    Vibrio

    Microscopie lectronique balayage E. coli x30 000

    Microscopie lectronique transmissionE. coli

    Microscopie lectronique

    Identification de bactries

    Echantillon -------------------------> Identification ?

    Identification de bactries

    Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments- environnement-

    EnrichissementIsolement

    Identification(culture pure)

    Il existe de nombreuses espces bactriennes, quon peut classer daprsquelques critres fondamentaux :

    - morphologie des colonies- forme & taille des cellules- coloration GRAM- quelques caractres biochimiques simples dorientation- mode respiratoire- mobilit

  • Croissance et maintien des organismes en laboratoire- aliments essentiels (acides amins, peptides, bases nucliques, sucres),- lments minraux : fer, phosphore, soufre, magnsium,....-facteurs de croissance (sang, protines, vitamines)

    Systme tampon pour viter les variations importantes du pH

    Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)

    Les milieux de culture

    1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance dela plupart des organismes)peptones (hydrolysats de protines partir digestion viande, casine, soja,glatine....) = source C et nergie

    ex LB (Luria Broth), bouillon au soja

    2-milieux synthtiques (ou minimums)composs chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans leauex milieu M9

    Plusieurs espces dans lchantillon1- Isoler la bactrie dintrt2-Enrichir

    Une espce dans lchantillon1- Enrichir

    --> Morphologie des colonies

    Morphologie des colonies

    Couleur

    Aspect (sec, gras, transparent)

  • Les types de milieux de culture

    Milieux solides pour lisolement liquides pour culture de bactries pures ou lors dinfection monobienne

    !: bactries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire)

    1- milieux slectifs empchent la croissance de certaines bactries et favorisentla croissance de celles dintrt = SELECTION

    E. coli et Proteus mirabilis(Drigalski)

    S. aureus (Chapman)

    ex AntibiotiqueDrigalski (cristal violet) : croissance G-SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, ShigellaChapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus

    Antibiogramme (inhibition croissance)

    La temprature peut tre slective

    Serratia marcescensE. coliBacillus stearothermophilus

    Pshycrophiles

    Msophiles

    Thermophiles

    Extrmophiles

    4C37C 60C

    2- milieux diffrentiels: distinction de diffrents groupes de bactries(caractristiques biologiques) = IDENTIFICATION

    Mee proprits biochimiques d'une bactrie pour commencer l'identifier: tudedu mtabolisme respiratoire, des glucides, des protines, des lipides....

    Les types de milieux de culture

    Lac+ (colonies rouges)

    Lac- (colonies incolores)

    Utilisation du LactoseMacConkey utilisation --> "pH(indicateur color, rouge neutre)

    Caractre fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1) Dgradation Glu -->dchets acides (indicateur de pH, rouge de phnol) Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble)

    Fermentation - +- + + +Production H2 - - - + +

    test catalase (addition H2O2 )+: dgagement H2

    milieu jaune doeuf!: hydrolyse des lipides

    Bacillus +

    E. coli -

    Alcaligenes -

    test urase!:Production NH3 --> "pH (indicateurcolor, rouge de phnol)

    E. coli - Proteus vulgaris +

    glose au sang!: bactries hmolytiques ounon

    E. coli - S. aureus +

    mobilit (0,5% agar)

  • Effet de loxygne

    Pseudomonas, Acinetobacter,Neisseria

    Campylobacter, Mycobacteriaceae

    Entrobactries (Escherichia,Salmonella), streptocoques,staphylocoques

    Bactries intestinales (Bacteroides,Fusobacterium, Clostridium) et florecommensale

    Exemples

    Accepteur final dlectrons lorsrespiration arobie (rduit en eau)

    Ncessaire < 0,2 atm (PP < celle air)

    Pas ncessaire, mais utilis (switch)(oxydation des substrats et fermentation)

    Pas ncessaire, non utilis (fermentation)

    Toxique (fermentation, respirationanarobie, photosynthse)

    Culture sous atmosphre rductrice

    -

    -

    +

    +

    +

    +

    +-

    +

    +

    -

    Arobie strict(1)

    Microarophile(3)

    Aro-anarobiefacultatif (2)

    Anarobiearotolrant

    Anarobiestrict (4)

    Effet de lO2+ O2+ O2

    231 4

    - milieux de culture dont la composition permet de mee une activit enzymatique: -galactosidase (ONPG), lysine dcarboxylase (LDC), ornithine dcarboxylase (ODC), urase(URE)

    - activit fermentaire est rvle avec un milieu type contenant un sucre, unindicateur color des changements de pH (fermentation sucre " pH)

    Tests didentification en micromthodeGalerie API20-E (Biomrieux)

    plus sensiblesmesures photomtriques en continu --> identification des principales bactries isoles en pratique mdicale en moins de 5 h

    Systmes automatiss

    caractres morphologiques

    caractres physiologiques et mtaboliques

    caractristiques molculaires :- composition en bases des AN (GC%)- amplification-squenage gne codant ARN16S(phylognie molculaire : appareils de traduction sonttrs conservs, non changs par transfertshorizontaux)- comparaison de protines (squenage, Ac)

    Identification de bactries

    Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments--environnement

    EnrichissementIsolement

    Identificationsur culture pure

  • Gram +

    12 groupes de bactries

    G-

    G+

    Gram-Proteobacteria

    HelicobacterAgrobacteriumEnterobacteriaPseudomonads

    DesulfovibrioThiobacillus

    Catalase (+ ou -)

    Oxydase (+ ou -)

    Coagulase (+ ou -)

    Indole (+ ou -)

    Utilisation des sucres (fermentation on non)

    Activit enzymatique ou non (urase, glatinase, nitrate rductase)

    Production dH2S ..

    Tous ces caractres permettent dobtenir une identification de plus en plusprcise, et finalement exacte de la bactrie

    Caractres biochimiques simples

    Gram +

    Coques Gram +

    Staphylococcus aureus(supuration, septicmie)

    En amas : Staphylocoques (grappe de raisins)

    Streptococcus pyogenes(angine, scarlatine)

    En chanettes: Streptocoques, entrocoques

    Streptococcus pneumoniae(otite, pneumonie, mningite)

    En diplocoques: Pneumocoques

    Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)

  • Clostridium difficile (diarre post antibiotique)

    Bacilles Gram +

    Listeria monocytogenes(mningite, avortement)

    Bacillus anthracis(maladie du charbon,herbivores transmissible lhomme)

    Gram -

    Coques Gram -

    Neisseria meningitidis (mningocoque: mningite, septicmie)

    Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)

    Entrobactries

    Gram -

  • Bacilles Gram -

    2 familles importantes en pathologie humaine :

    Les entrobactries (Enterobacteriacae) Les Pseudomonas (Pseudomonacae)

    Pseudomonas aeruginosaBurkholderiaPathognes opportunistes(infections nosocomiales etmucoviscidose)

    E. coli - commensal (infection urinaire) - ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticmie)Salmonella (infection digestive simple fivre thyphode)Shigella dysenteriae (infection digestive mineure grave- Yersinia pestis

    Vibrio cholerae (eau, pidmie Cholra)Bordetella pertussis (coqueluche)

    Mycobactries Bacilles acido-alcoolo rsistants ou BAAR Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen

    Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch) Mycobacterium leprae

    SpirochtesTreponema pallidum (syphilis)

    Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)

    Autres genres importants en pathologie humaine

    Mycoplasma pneumoniae

    Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis (MST)

    Rickettsia conorii (fivre boutonneuse-tiques-) Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)

    Bartonella henselae: maladie des griffes du chat

    Germes intracellulaires : exemples