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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PATRICK SIMÃO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À IMOBILIZAÇÃO DE PATA

FORTALEZA – CEARÁ

2012

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PATRICK SIMÃO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À IMOBILIZAÇÃO DE PATA

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Área de Concentração: Ciências Biológicas II

Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso

FORTALEZA – CEARÁ

2012

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará

Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho

C284m Carlos, Patrick Simão Morfologia do nervo isquiático de ratos submetidos a

imobilização de patas / Patrick Simão Carlos. – 2011. 70 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do

Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2011.

Área de Concentração: Ciências Biológicas II. Orientação: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso. 1. Imobilização. 2. Nervo isquiático. 3. Morfologia. I.

Título.

CDD: 591.4

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PATRICK SIMÃO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À

IMOBILIZAÇÃO DE PATA

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Área de Concentração: Ciências Biológicas II

Aprovado em 12 / 04 / 2011

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________

Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso (Orientador) Universidade Estadual do Ceará -UECE

____________________________________________

Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto Universidade Estadual do Ceará - UECE

___________________________________________

Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci Universidade de Brasília - UNB

5

À minha esposa, Daniele de Araújo Oliveira Carlos, que

desde o início foi minha grande incentivadora e

colaboradora para a realização dessa conquista,

mostrando que, com paciência, disponibilidade e amor,

obstáculos são superados e ideais alcançados.

Aos meus pais, Simone e João, por nunca medirem

esforços para dar um ensino de qualidade e por

acreditarem que a educação é uma das maiores riquezas.

6

AGRADECIMENTOS

À Deus, por se fazer presente em todas as horas.

Aos meus irmãos, pelo apoio silencioso e a lembrança permanente de que a música deve

estar presente.

Ao Prof. Henrique Leal, meu orientador, pela sensibilidade, a atenção plena, a confiança e

a paciência. Pelas palavras de incentivo, pelas críticas, os elogios e as ricas sugestões.

Por me acompanhar, lado a lado, no enfrentamento desse grande desafio, encorajando-me

a ser quem sou.

À Dra. Vânia Marilande Ceccatto, pela motivação e incentivo durante todo período do

mestrado.

À Dra. Carolina Madeira Lucci, pela atenção e compreensão prestada ao trabalho.

Aos amigos, por incentivarem e acreditarem que eu chegaria aqui.

Aos funcionários do Mestrado, pelo apoio e disponibilidade em ajudar.

7

Gosto de ser gente porque, inacabado, sei que sou um

ser condicionado mas, consciente do inacabamento, sei

que posso ir mais além dele.

Paulo Freire

8

Resumo

Os tecidos do corpo humano passam por constante reorganização, assim, a maioria dos

tecidos sofrem adaptações às novas demandas. Nesse contexto o objetivo do estudo foi

analisar morfologicamente o nervo isquiático de ratos imobilizados. Trata-se de uma

pesquisa longitudinal, experimental. Onde foram utilizados 6 animais divididos em GI e GC,

cada grupo contendo 3 animais. A imobilização manteve a pata do animal em extensão por

um período de 15 dias. A análise do material se deu através de microscopia eletrônica. Os

resultados mostraram que houve desintegração de fibras e o aparecimento de “cluster” de

axônios. Na distribuição de frequência ocorreu uma diminuição de 17% na faixa de maior

diâmetro e um aumento de 16% na faixa de menor diâmetro. Assim, concluímos que um

período de imobilização foi capaz de ativar a plasticidade neural gerando modificações

morfológicas nas fibras do nervo isquiático.

Palavras – chave: Imobilização. Nervo Isquiático. Morfologia.

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Abstract

The human body tissues change constantly, so the majority of them adapt to the new

demand. The study objective is the morphological analysis of immobilized rats sciatic nerve.

This is an experimental and longitudinal research which took 6 animals dividing them in GI

and GC groups. Each group containing 3 animals. The immobilization kept the animal’s paw

in extension for 15 days. The material analysis was done through an electronic microscope.

The results presented fiber disintegration and appearance of axons clusters. In the

frequency distribution occurred a 17% decrease in the major diameter band and a 16 %

increase in the minor diameter band. Afterwards it is clear that an immobilization period is

able to activate the neural plasticity generating morphological changes in the sciatic nerve

fibers.

Keywords: Immobilization. Sciatic nerve. Morphology.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Página a. Grupo Controle Aumento 10000x 32 b. Grupo Imobilizado Aumento 15000x 32 c. Grupo Imobilizado Aumento 12000x 32

Barra de referência 2µm Figura 2 Diâmetro médio das fibras danificadas 33 Figura 3

d. Grupo Controle Aumento 5000x 34 e. Grupo Imobilizado Aumento 3000x 34 f. Grupo Imobilizado Aumento 3000x 34

Barra de referência 5µm Figura 4 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro 35 Figura 5 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro, comparativo entre faixas. 35 Figura 5.1 Distribuição de frequência do GI . 41 Figura 6 Área média das fibras do nervo isquiático 36 Figura A (Citada de Alves 2010) Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático GC 41 Figura B (Citada de Alves 2010) Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático GI 41

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LISTA DE ABREVIATURAS

SN Sistema Nervoso

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Sistema Nervoso Periférico

GI Grupo Imobilizado

GC Grupo Controle

PFA Paraformaldeido

Caco Cacodilato de Sódio

HCl ácido clorídrico

nm nanômetro

µm micrômetro

H2O água

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SUMÁRIO

1 Introdução 13

1.1 Sistema Nervoso 13

1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Periférico 19

1.3 Plasticidade Neural 21

1.4 Imobilização 23

2 Relevância 26

3 Objetivos 27

3.1 Objetivo Geral 27

3.2 Objetivo Específico 27

4 Materiais e Métodos 28

4.1 Local de Execução e Tipo de Estudo 28

4.2 Animais 28

4.3 Amostra 29

4.4 Tratamento 29

4.5 Sacrifício 29

4.6 Processamento do Tecido 30

4.7 Análise 31

4.8 Estatística 31

5 Resultados 32

6 Discussão 37

7 Conclusão 44

Referências 45

Anexo 50

13

1 Introdução

1.1 Sistema Nervoso

O Sistema Nervoso (SN) é o sistema com a maior complexidade dentro do

organismo humano. Gerencia a constante manutenção da homeostase, além disso, é

encarregado pela geração dos comportamentos reflexos, comportamento alimentar, sono,

vigília, luta, defesa, fuga, comportamentos reprodutivos, dentre vários (BERNE, 2004;

GUYTON, 2002).

O SN é um tecido originário de um folheto embrionário denominado ectoderme, mais

precisamente de uma área diferenciada deste folheto embrionário, a placa neural.

Inicialmente a placa neural contêm cerca de 125 mil células, que darão origem a um

sistema composto por aproximadamente 100 bilhões de neurônios (MOORE, 2004)

A placa neural, por volta da 3º semana de gestação, se fecha, formando um tubo

longitudinal denominado tubo neural que em sua região anterior, sofre uma dilatação que

dará origem a uma parte fundamental do Sistema Nervoso Central (SNC), o encéfalo. Nos

pontos de encontro ou fechamento das extremidades da placa neural, no recém formado

tubo neural, forma-se a crista neural que dá origem a componentes que a neuro-anatomia

denomina como elementos periféricos e componentes celulares gliais (MOORE, 2004).

O SN pode ser dividido baseando-se tanto em características funcionais como

anatómicas. Do ponto de vista funcional temos o sistema somático, que atua em todas as

relações que são percebidas por nossa consciência. E o visceral ou vegetativo que, por

sua vez, age de forma inconsciente no controle e na percepção do meio interno e vísceras

(SILVERTHORN, 2003). Tanto o somático quanto o vegetativo, possuem componentes

sensitivos e motores. Anatomicamente o SN pode ser dividido em Sistema Nervoso Central

14 (SNC) e Sistema Nervoso Periférico (SNP). O SNC é a porção do SN que se localiza no

crânio e na medula espinhal (GUYTON, 2002). Dentre suas funções estão: a integração

das atividades corpóreas, armazenamento de experiências, controle do ambiente interno,

controle de movimentos voluntários, programação de reflexos da medula espinhal, entre

outros (LENT, 2004).

O SNP é constituído basicamente por gânglios nervosos e prolongamentos do SNC

denominados fibras nervosas. As fibras nervosas se dividem em três tipos: As Sensitivas

ou sensoriais que tem o papel de gerar e transmitir alguns impulsos nervosos dos órgãos

receptores até ao SNC; As fibras Motoras são responsáveis por conduzir o impulso

codificado no encéfalo, até o órgão efetor e as Mistas são uma junção dos nervos

sensitivos e motores ao mesmo tempo (BERNE, 2004; GUYTON, 2002).

O SNP gera e transmite impulsos ao SNC, informando-o sobre o estado dos órgãos,

além de receber informações do SNC e transmiti-las a órgãos efetores estabelecendo uma

interface do meio interno com o meio externo. Duas vias possibilitam essa interface: A via

eferente e a via aferente. Na via eferente o impulso nervoso decorrente de uma alteração

elétrica gerada no soma neural é transmitido ao longo do axônio até o órgão efetor. E na

via aferente o impulso é gerado nos receptores e transmitido ao SNC (BARROS, 2002).

Uma via aferente normalmente possui uma terminação nervosa sensível ao estímulo

que caracteriza a via, um trajeto periférico, um trajeto central e uma área de projeção

cortical onde neurônios corticais interpretam a informação (LENT, 2004).

Quando as informações sensoriais chegam ao SNC, podem ser imediatamente

processadas no local, resultando na elaboração de comandos motores reflexos, bem

como, serem retransmitidas para estações sinápticas mais cefálicas através de neurônios

de projeção (KANDEL, 2003).

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Em cada estação de retransmissão dos sistemas sensoriais, o estímulo aferente é

processado localmente por excitação e inibição, proporcionando diferentes níveis de

análise. Em quase todos os sistemas sensoriais ocorrem inibições sobre os próprios

receptores bem como, sobre as vias aferentes, influenciando o nível de excitabilidade do

canal sensorial (LENT, 2004).

Cada tipo de receptor está habilitado para informar o SN apenas sobre

determinados aspectos ou dimensão do meio ambiente, funcionando como um filtro

sensorial e altamente sensível ao estímulo que lhe é adequado. Dentro de cada

modalidade sensorial é possível distinguir diversas qualidades, desse modo o sistema

sensorial avalia vários aspectos de uma mesma modalidade (BERNE, 2004). Com a visão,

por exemplo: pode-se perceber cores, profundidade, relevos, entre outros.

As diferentes modalidades sensoriais enviam as respectivas informações sensoriais

para áreas específicas do córtex sensorial e ocorre a constituição completa do meio

ambiente (GUYTON, 2002).

A principio, ocorre dois tipos de receptores sensoriais: os neurônios sensoriais

periféricos que tem em sua extremidade periférica uma estrutura modificada para a

detecção dos estímulos e células sensoriais epiteliais associados a um neuro-epitélio. Os

receptores sensoriais podem converter os estímulos físicos e químicos do ambiente em

impulsos elétricos e funcionam como transdutores de energia. Através dos prolongamentos

periféricos dos neurônios aferentes as informações sensoriais são conduzidas para o SNC

onde serão percebida e interpretada (KANDEL, 2003).

Os receptores são classificados em função de três critérios: o primeiro é de acordo

com a sua morfologia. Receptores especiais estão associados a um neuro-epitélio e fazem

parte dos órgãos dos sentidos especiais como visão, olfação, gustação, audição e

equilíbrio, todos localizados na cabeça. Possuem células receptoras especializadas não

16 nervosas, associadas às células nervosas propriamente ditas. Receptores gerais ocorrem

em todo o corpo, principalmente na pele e são menos complexos na estrutura podendo ser

classificados em dois tipos: receptores livres e receptores encapsulados. Estes não

possuem células sensoriais secundárias (BARROS, 2002; GUYTON, 2002).

A segunda função seria a classificação de acordo com a localização da fonte

estimuladora. Os exteroceptores são localizados na superfície do corpo, são ativados por

estímulos externos ao corpo como luz, som, pressão, entre outros. Os proprioceptores

estão localizados nos tecidos mais profundos do corpo como músculos, cápsulas

articulares, tendões, ligamentos, são ativados por estímulos mecânicos. E os

Interoceptores localizados nos vasos e órgãos cavitários do corpo. Baseado neste critério é

fácil perceber que os proprioceptores e exteroceptores são responsáveis pelas sensações

somáticas e os interoceptores, pelas sensações viscerais. E ainda, as sensações viscerais,

proprioceptivas e interoceptivas são também consideradas como profundas e as evocadas

pelos exteroceptores de superficiais (BARROS, 2002).

E por fim, classifica-se de acordo com o estímulo mais apropriado. Dado que os

receptores respondem mais especificamente a determinados estímulos funcionando como

filtros seletivos e específicos, os receptores podem ser classificados: fotorreceptores,

glicorreceptores, eletrorreceptores, entre vários (GUYTON, 2002).

A geração de um potencial de ação ocorre quando um estímulo atinge a região

receptora, e gera uma alteração na membrana do receptor semelhante ao de baixa

voltagem que neste caso é denominado potencial receptor. Se a propagação eletrotônica

desta atividade chegar até a zona de gatilho e atingir o limiar para desencadear o potencial

de ação, o impulso nervoso será enviado ao SNC. Como o potencial receptor é um

fenômeno graduado, quanto maior o estímulo, maior será a amplitude de sua resposta e

17 maior será a frequência de descargas dos potenciais de ação na fibra aferente (BERNE,

2004).

A membrana dos diferentes receptores sensoriais possui mecanismos altamente

específicos que convertem os estímulos em potencial receptor. Esses estímulos físicos ou

químicos abrem ou fecham canais iônicos específicos causando ou interrompendo fluxos

iônicos e como consequência, mudanças temporais no potencial de ação (BARROS,

2002).

Além de qualidade e quantidade dos estímulos, a percepção sensorial resulta

também em uma definição temporal do estímulo como, por exemplo, a duração e taxa de

variação de um determinado estímulo. Finalmente, outro aspecto importante é que o

sistema sensorial é capaz de detectar a origem dos estímulos sensoriais e informar-nos

sobre a nossa posição no espaço e nos fornecer informações sobre o nosso mapa corporal

(KANDEL, 2003).

A duração de uma sensação depende das propriedades do receptor. Se um

determinado estímulo persiste por muito tempo, com o tempo ficamos com a sensação de

que ele diminui ou desapareceu. Esta propriedade é denominada de adaptação. Há dois

tipos de receptores percebendo não só o aumento na intensidade do estímulo como

também a sua duração sensorial quanto à capacidade de adaptação: Receptores tônicos

são aqueles cujo potencial receptor é mantido enquanto durar o estímulo e, por

conseguinte, são adequados para realizar a análise de intensidade do estímulo. Já os

Receptores fásicos ou de adaptação rápida são aqueles que se adaptam rapidamente ao

estímulo. Logo, se o estímulo persistir por muito tempo, os potenciais receptores não serão

mais gerados, bem como, os potenciais de ação nas fibras aferentes primárias. A

sensação detectada é de aparente ausência de estímulo (GUYTON, 2002).

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Na ausência de estímulos as células do SN, são dotadas de cargas iônicas

negativas em seu interior, comparando-se com o meio externo, a esse estado dá-se o

nome de potencial de repouso. A magnitude do potencial de repouso da membrana vária

de -40 a -75mv dependendo das características da célula (SILVERTHORN, 2003; BERNE,

2004).

Como vimos anteriormente, as células que encontramos no SN têm a capacidade de

gerar e transmitir impulsos elétricos ou potenciais de ação. O potencial de ação é gerado

devido a uma alteração brusca e rápida da diferença de potencial transmembrana

(GUYTON, 2002). Essa alteração se dá quase sempre pela abertura de canais que

permitem a passagem para o interior da célula, através da membrana citoplasmática, de

íons dotados de carga positiva, e assim, alterando a diferença de potencial elétrico

transmembrana de maneira a positivar o interior da célula. O limiar de voltagem é o ponto

crítico de voltagem transmembrana que, uma vez atingido, promove a deflagração do

potencial de ação. Uma vez gerado o potencial de ação no soma da célula ou em algum

sitio axonal próximo ao receptor sensorial, ele é transmitido através dos axônios.

Igualmente à geração do potencial de ação, a sua transmissão também ocorre por uma

entrada de íons dotados de cargas positivas no interior do axônio. Assim, ele é transmitido

ao longo da estrutura até as ramificações axonais mais periféricas, fazendo com que o

estimulo nervoso, ou seja, o potencial de ação gerado se propague com a mesma

amplitude inicial. Já a transmissão do impulso elétrico de um neurônio para os neurônios

seguintes se processa, na maioria dos casos (transmissão sináptica química), através da

reconstituição do potencial de ação no neurônio pós-sináptico e dessa maneira é levado

até o órgão efetor. A condução e transmissão do impulso nervoso pode ser através das

fibras nervosas mielinizadas ou não mielinizadas (HUANG, 2001; BERNE, 2004;

SILVERTHORN, 2003).

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A função primordial da mielina é o aumento na velocidade de condução do impulso

nervoso. Isto se dá pela disposição da mielina em intervalos regulares, alternados com

nódulos de Ranvier, transmitindo o impulso entre os nódulos de maneira eletrônica, com

recriação do potencial de ação em cada nódulo. Essa forma de condução do potencial nas

fibras mielinizadas é chamada de forma saltatória. A constituição da mielina presente no

SNP se assemelha, em composição geral, tanto de proteínas como lipídios, à mielina

encontrada no SNC; logo, a mielina do SNP é dotada de uma maior quantidade de

esfingomielina e glicoproteínas (LIU, 1997; SILVERTHORN, 2003).

1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Periférico

Macroscopicamente, os nervos do SNP apresentam-se como feixes ou fascículos

brancos e brilhantes que, por sua vez, são unidos por tecido conjuntivo.

Os neurônios não trabalham isolados, mas sim em conjuntos que quando

associados formam redes neurais. Como toda célula, o neurônio apresenta uma membrana

plasmática que envolve um citoplasma contendo organelas com diferentes funções e um

núcleo onde encontra-se o material genético. O que diferencia os neurônios das demais

células é sua morfologia adaptada para o processamento de informações e a variedade

dos seus tipos morfológicos (LENT, 2001).

Uma das principais funções do neurônio é a capacidade de gerar impulsos elétricos

que, por sua vez, funcionam como unidades de informações que processam informações a

respeito do meio ambiente externo e interno comandando assim ações musculares,

ativando glândulas e códigos complexos que veiculam pensamentos, emoções, e memória

no ser humano (GARTNER, 1999).

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O corpo celular ou pericário do neurônio contém um núcleo e o citoplasma. O

núcleo é quase sempre esférico ou ovóide e está localizado no centro, apresentando

cromatina dispersa, indicando intensa atividade de síntese, embora neurônios menores

geralmente apresente a cromatina heterocondensada. O nucléolo é bem visível

(ROMRELL, 1993; GARTNER, 1999).

O citoplasma tem sua constituição bastante complexa e ocupa todo o interior da

célula nervosa. Nele se encontram proteínas dispostas na forma de fibrilas, que compõem

o citoesqueleto responsável pela manutenção da forma do neurônio e da mobilização dos

neurônios jovens durante o desenvolvimento, de forma a garantir sua migração das regiões

germinativas para sítios distantes do organismo embrionário. O citoesqueleto é um dos

responsáveis por emitir, alongar ou retrair ativamente os prolongamentos dos neurônios,

constituindo um sistema de transporte de moléculas sinalizadoras, nutrientes, fatores

tróficos e de vesículas membranosas que se movem do soma até as extremidades dos

prolongamentos assim como no sentido oposto (LENT, 2001).

No citoplasma encontra-se abundante retículo endoplasmático rugoso com muitas

cisternas paralelas, principalmente em neurônios motores, estas cisternas juntamente com

os poliribossomos, aparecem como aglomerados de material basófilo, quando corados com

corante básico, denominados de corpúsculos de Nissl (LENT, 2001; GARTNER, 1999;

ROMRELL, 1993)

Em secções dos nervos periféricos, é possível observar a arquitetura intrincada

desse tecido. Os axônios e células de Schwann localizam-se em compartimentos

endoneurais, que são rodeados pelo perineuro; este por sua vez forma fascículos

individuais que são envoltos por tecido fibroso epineural (ORTIZHIDALGO & WELLER,

1997).

21

Dentre os vários tipos celulares que constituem o SNP as células de Schwann, são

as principais. Elas são confinadas ao SNP e em situações normais raramente são vistas no

SNC. As células de Schwann assumem a função de mielinizar ou envolver os axônios do

SNP, são células extremamente lábeis, que exercem um papel fundamental na formação

dos nervos, além de auxiliarem o SNC e o SNP nos processos regenerativos (MIRSKY &

JESSEN, 2001).

1.3. Plasticidade Neural

Historicamente, em meados de 1800, a hipótese da neuroplasticidade começou a

ser descrita quando estudo sugeriu (NUDO, 2006) que porções vivas de massa encefálica

alteravam suas funções realizando, às vezes, outras e assim contribuindo com a

recuperação do órgão. No entanto, por volta de 1906, é que o termo plasticidade foi

introduzido por um psiquiatra italiano (BERLUCCHI, 2002).

Somente em 1948, a hipótese de plasticidade ganha forma semelhante a atual. A

idéia era que a aplicação de um estímulo proporcionasse dois níveis de mudanças em que

a primeira seria uma alteração funcional relativa às peculiaridades inerentes ao SN,

geração e transmissão de impulsos elétricos e a segunda são alterações permanentes, em

sua função, devido à aplicação de estímulos adequados. A isso chamar-se-ia plasticidade

neural (KANDEL, 2003).

Posteriormente, na década de 60, grandes descobertas relacionadas à plasticidade

neural foram feitas. Pesquisadores postularam que conexões neurais a nível cortical eram

intensificadas e remodeladas pelas experiências (JOHANSSON, 2004; HOLLOWAY,

2003).

22

Na década de 80, a visão dos cientistas sobre a capacidade regenerativa do SNC

de mamíferos adultos começou a sofrer mudanças, com a pesquisa realizada por Albert

Aguayo, que utilizou ratos adultos submetidos à transecção do nervo óptico. Aguayo

relatou duas importantes conclusões: A primeira é que os axônios presentes no SNC são

capazes de regenerar, desde que estejam em contato com o microambiente do SNP, e a

segunda é que o microambiente do SNC não favorece o crescimento regenerativo dos

axônios centrais (LENT, 2004).

Assim, foi somente nas duas últimas décadas que vários relatos de plasticidade

foram demonstrados em modelos experimentais e em humanos, permitindo-nos começar a

traçar os mecanismos implícitos. Os achados sobre neuroplasticidade têm sido observados

em várias formas de análise (NUDO, 2006).

Trabalhos atuais têm relatado a reorganização neural visando uma maneira que

facilite a recuperação da função. Tal fato vem sendo sugerido e, de uma maneira geral,

progressivamente demonstrado, como um objetivo importante da recuperação neural

(NUDO, 2006).

Sendo o SNP composto principalmente por prolongamentos oriundos do SNC torna-

se um alvo mais facilmente passível de lesões, tanto pela quantidade existente, como pela

sua distribuição anatômica. Assim, quando um axônio no SNP é lesado, o neurônio tende à

reparação, aumentando significativamente a síntese de proteínas estruturais, exacerbando

todo o potencial das organelas (SUN, 2010). Um exemplo é o reticulo endoplasmático

rugoso, que com as lesões do respectivo neurônio passa a ter suas cisternas distendidas

com os produtos da síntese proteíca ou os ribossomos aparentando uma desorganização

(SILVERTHORN, 2003).

Concomitantemente com essas ocorrências, o soma apresenta-se edemaciado,

adquirindo a forma arredondada e o núcleo assume uma posição excêntrica. Essas

23 alterações morfológicas refletem o processo citológico ligado ao aumento da síntese de

proteínas (BERNE, 2004).

Apesar de todo o esforço do soma na produção de proteínas estruturais, os

neurônios não são dotados da capacidade de repor apenas as proteínas danificadas

durante a lesão. O que ocorre é uma desintegração de todo o axônio localizado após a

lesão (BOOTH, 1982; SANTOS-JUNIOR, 2010).

Para os axônios mielínicos, não somente o axônio, mas a mielina também sofre

desintegração, chegando ao ponto de uma desenervação do órgão efetor. Contudo, esse

esforço na produção de proteínas, não é em vão; servirá para reconstrução do axônio,

desde o ponto danificado até o órgão efetor, minimizando os danos que poderiam ser

totalmente irreversíveis (GUYTON 2002).

O início da regeneração fica bem caracterizado pelo surgimento de brotamentos no

coto proximal do axônio. Nesse processo, as células de Schwann presentes na porção

degenerada do nervo, não só sobrevivem como se multiplicam, formando um cone de

crescimento que serve de linha guia que indicará qual o caminho original seguido pelo

nervo que antes existia ali. Assim, é possível que, em determinados casos ocorram a re-

inervação e o novo axônio venha a possuir características aproximadamente idênticas as

do axônio previamente existente. (BERNE, 2004). Contudo, a hipótese de plasticidade

neural com suas vias de ação ainda tem muitos pontos a serem esclarecidos.

1.4. Imobilização

Os tecidos do corpo humano estão em constante reorganização, assim, a maioria

dos tecidos sofrem adaptações às novas demandas, seja do próprio organismo, interno ou

do meio externo (BERNE, 2004).

24

É muito comum na prática clínica utilizar técnicas de imobilização como alternativa

para reverter quadros patológicos como fraturas ou entorses. Segundo a literatura

pequenos períodos de imobilização podem ocasionar prejuízos à região imobilizada, sendo

os principais, hipotrofia e/ou atrofia muscular (VASCONCELOS, 2010).

Como resultado da imobilização, temos, inicialmente, a perda da massa muscular

associada à diminuição da força, consequentemente levando a uma redução no tamanho

do músculo (BOOTH, 1982; FALEMPIN e MOUNIER, 1998), sendo mais acentuada nas

primeiras setenta e duas horas, com índices de 14 a 17%. Tendo decorrido

aproximadamente uma semana, o ritmo de perda parece diminuir.

A imobilização causa também transtornos em outras partes do organismo, e esses

transtornos podem interferir inclusive no metabolismo, limitando temporariamente as

atividades cotidianas, diminuindo assim, sua qualidade de vida (SANTOS-JUNIOR, 2010).

Dados histológicos já descrevem diminuição na síntese proteica muscular após 6

horas de imobilização (BOOTH, 1987), aumento intenso no volume de tecido conjuntivo

após 2 dias (WELLIAMS e GOLDSPINK, 1984) e hipotrofia de 35% a 45 % após 7 dias

(APPELL, 1986).

O músculo é o elemento motor do corpo que aciona de forma voluntária ou

involuntária os segmentos do corpo. A musculatura estriada de contração voluntária é

denominada musculatura esquelética (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). O músculo

esquelético é responsável aproximadamente por 45% do peso corporal e é o maior sistema

orgânico do ser humano, sendo um importante tecido na homeostasia bioenergética, tanto

em repouso como em exercício. O músculo esquelético representa também o principal

local de transformação e de armazenamento de energia (SANTOS-JUNIOR, 2010).

Segundo a literatura, o músculo, dentre os tecidos biológicos, é o mais mutável e

responde a demandas com adaptações morfológicas e/ou funcionais. A função do músculo

25 esquelético depende da atividade proprioceptiva intacta, inervação motora, carga mecânica

e mobilidade articular (LIEBER, 1992; SILVEIRA, 1994).

A imobilização provoca mudanças a nível muscular (SANTOS-JUNIOR 2010) e

nervoso (ALVES 2010). Uma das possíveis mudanças decorrentes da imobilização é a

modificação primária do grau da atividade neural sobre o tecido muscular (FALEMPIN e

MOUNIER, 1998). Além do grau de atividade, é possível que haja também modificação

primária (causada simplesmente pela diminuição do uso) da própria estrutura morfológica

neural. Como os casos de imobilização freqüentemente se associam a lesões traumáticas

ou outras patologias, faz-se necessário distinguir o que seja lesão neural primária e

secundária. Visando dar uma contribuição ao aperfeiçoamento da prática clínica

terapêutica em casos de imobilização com dano à função do órgão imobilizado, o presente

trabalho se propõe a averiguar e caracterizar as alterações morfológicas primárias no

nervo isquiático de ratos com o membro correspondente imobilizado.

26

2 Relevância

Atualmente a prática clínica utiliza técnica de imobilização como alternativa na

reversão de quadros patológicos que vão das entorses à fraturas. Logo, pequenos

períodos de imobilização podem gerar prejuízos à região imobilizada, sendo os principais a

hipotrofia e/ou atrofia muscular.

Modelos experimentais vêm dando suporte a pesquisas científicas no intuito de

aprofundar o conhecimento sobre imobilização. Parte da literatura traz modelos tradicionais

que utilizam gesso nas imobilizações. A imobilização pelo gesso tem várias desvantagens,

dentre elas, o edema de pata é a principal e mais grave, também podemos citar a retirada

da imobilização pelo próprio animal, a necessidade de anestesia para o período de

secagem do gesso, entre outros. Para minimizar os problemas da imobilização com o

gesso, desenvolveu-se no Instituto Superior de Ciências Biomédicas - ISCB da UECE um

modelo de imobilização feita com esparadrapo onde preserva-se melhor a integridade do

animal. Essa prática tem demonstrado uma perspectiva bem real com resultados

relevantes.

Contudo, ainda não foi descrito na literatura a análise, do ponto de vista morfológico,

dos nervos de modelos imobilizados com esparadrapo. Assim, esse trabalho, além da sua

relevante contribuição das alterações morfológicas primárias de um nervo periférico pela

imobilização, tem outra contribuição ímpar que é também para o entendimento dos

acontecimentos inerentes a este modelo de imobilização com esparadrapo, contribuindo

para uma possível aplicabilidade em humanos.

27

3 Objetivos

3.1 Objetivo Geral:

- Caracterizar e analisar as alterações morfológicas do nervo isquiático de membro

imobilizado de ratos.

3.2 Objetivos Específicos:

- Apresentar o comportamento morfológico do nervo isquiático, proporcionado pela

imobilização;

- Pesquisar e analisar a distribuição das frequências referente aos diâmetros dos

axônios do nervo isquiático;

- Pesquisar e analisar a área média das fibras do nervo isquiático.

28

4 Materiais e Métodos

4.1 Local da Execução e Tipo de Estudo

O trabalho foi desenvolvido nas dependências do Instituto Superior de Ciências

Biomédicas da Universidades Estadual do Ceará-UECE, Fortaleza-Ceará e na

Universidade de Brasília – UNB Brasília, no período de 01/03/2009 a 30/08/2011. Trata-se

de uma pesquisa longitudinal de cunho experimental.

4.2 Animais

Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais –

Ceua/Uece sob número de protocolo 10244987-2.

Para tal pesquisa foram utilizados ratos Winstar machos (Ratus norvegicus) 180 a

220g com 4 semanas de vida, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do

Ceará (UFC) e mantidos no Centro de Aclimatação do Instituto Superior de Ciências

Biomédicas da Universidade Estadual do Ceará, com ciclo de 12h claro por 12h escuro,

acesso ad libitum a água e ração e temperatura de 24 ± 2ºC.

29

4.3 Amostra

A amostra foi composta por 6 animais divididos em 2 grupos: Grupo Imobilizado n=3

(GI), Grupo Controle n=3 (GC).

4.4 Tratamento

O tratamento de imobilização foi baseada em (SANTOS-JUNIOR, 2010), que utilizou

esparadrapo imobilizando uma pata de cada animal. Essa imobilização manteve a

articulação do joelho em extensão e o tornozelo em flexão plantar por um período de 15

dias. É importante relatar que o acesso à água e ração dos animais imobilizados não foram

prejudicados. O GC não recebeu imobilização na pata.

4.5 Sacrifício

Após 15 dias consecutivos de imobilização os animais foram anestesiados com

Cetamina (60mg/Kg) e Xilasina (8mg/Kg) e perfundidos com solução salina primeiramente

e posteriormente com paraformaldeido (PFA) 4%.

30

4.6 Processamento do Tecido

Após a perfusão o nervo isquiático foi dissecado e retirado, aproximadamente 1cm

de tecido da porção distal, sendo imediatamente imersa na solução Karnovsky modificada,

composta por 2% de PFA, 2,5% de Glutaraldeido em tampão Cacodilato de Sódio (Caco)

0,1M pH 7,4, durante 3h em temperatura ambiente. Posteriormente o material foi lavado,

três vezes, em Caco durante 5 minutos cada lavagem. Na Pós-fixação o tecido foi imerso

em Tetróxido de Ósmio 1% junto com Ferricianeto de K+ClCa 5mM, durante uma hora em

ambiente escuro. Após essa etapa o material foi lavado com dois banhos de Caco 0,1M e

dois banhos de água, cinco minutos cada.

A contrastação foi feita “in bloc”(antes do corte) com Acetato de Uranila no mínimo

duas horas em ambiente escuro. Após a contrastação do material, o mesmo foi lavado três

vezes em água destilada e foi desidratado em banhos de acetona 30%, 50%, 70%, 90%,

trinta minutos em cada e 100% três banhos de dez minutos cada.

Após a desidratação o tecido foi imerso em uma solução contendo acetona e resina

Spurr-s inicialmente em uma proporção de 2 medidas de acetona para 1 de resina, durante

seis horas no mínimo, depois, 1:1, 1:2 e finalmente resina pura com a tampa do ependof

aberta para eliminar qualquer vestígio de acetona, permanecendo somente resina. Durante

o processo para emblocar teve-se o cuidado de posicionar o material para a obtenção de

cortes transversais do nervo, assim o material emblocado permaneceu 72h na estufa a

65°C para a polimerização da resina.

Ocorrendo a polimerização da resina, foi retirado o excesso de resina com gilete

apresentando o formato de pirâmide. O bloco estando piramidado foi encaminhado para o

corte semi-fino (3µm) em navalha de vidro e posterior corte em navalha de diamante com

31 espessura de 70nm, o qual é colocado em telinhas de cobre pré tratadas em ácido

clorídrico (HCl) 1M, H2O e Etanol.

Após a colocação dos cortes nas telinhas, o material foi analisado no Microscópio

Eletrônico de Transmissão JEOL JEM 1011.

4.7 Análise

Em uma primeira fase foi feito uma análise subjetiva através da comparação das

imagens organizadas em pranchetas. Para essa comparação buscou-se organizar as

imagens que apresentassem o mesmo aumento e/ou a mesma barra de calibração.

Posteriormente foi feito uma análise objetiva, escolhendo aleatoriamente 100

axônios mielínicos do GC e 200 axônios mielínicos do GI, onde foi medido o diâmetro e

área. Para essa análise foi utilizado o software Image J.

4.8 Estatística

Na análise estatística foi feito a distribuição de frequência, normalizada pelo

percentual, o diâmetro médio e área média das fibras. Considerou-se o intervalo de

confiança de 95% e o teste utilizado foi o teste t pareado. Para a essa análise utilizamos o

Software Graf Ped Prism 5.0

32

5 Resultados

Foi observado nas fibras nervosas dos animais tratados sinais de degeneração. Na

Fig 1 b notamos fragmentação da mielina (setas) e na Fig 1. c temos associado à

fragmentação uma deformação parcial ou total da fibra (setas). Assim, podemos classificar

em dois tipos: as fibras que apresentaram a mielina fragmentada (Fig 1. b) e as que

apareceram com deformação (Fig 1.c).

Figura 1 (a, b, c)

a

c

b

Figura 1 . Imagens em microscopia eletrônica de transmissão, aumentos de 10000x (a) 15000x (b) e 12000 (c) As figuras acima mostram o GC (a) e GI (b, c). Barra de 2µm

33

A Figura 2 mostra que as fibras com fragmentação representam a maioria, tendo

seu diâmetro entre 6 e 8µm. Já as fibras que apresentaram deformação estão com

diâmetro entre 5 e 6µm. Não apresentando diferença estatisticamente significante entre os

diâmetros das fibras fragmentadas e deformadas.

Figura 2 . Diâmetro médio das fibras que apresentaram algum tipo de alteração morfológica. Média ± erro padrão.

34

Figura 3 (d, e, f)

Nas Figura 3.e e f é possível notar um agrupamento de fibras nervosas de menor

diâmetro próximas uma das outras (setas em verde), formato altamente sugestivo de

“cluster” palavra da língua inglesa utilizada na microscopia eletrônica para designar

agrupameto de células em regeneração.

Figura 3 . Imagens em microscopia eletrônica de transmissão, aumentos de 5000x (d, e) e 3000x (f) As figuras acima mostram o GC (d) e GI (.e, f). Barra de 5µm.

d

f

e

35

Nas figuras 4 e 5 temos a distribuição de frequência do GC e do GI. Na figura 4 o

GC tem uma distribuição similar à normal (Gaussiana), diferente da distribuição do GI. Na

figura 5 observamos um aumento na faixa que vai de 1 a 4,9 de 16% no GI e uma redução

de 17% na faixa de maior diâmetro no GI.

Figura 4 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 médio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.

Figura 5 Distribuição de frequência por faixa de diâmetro, comparativo entre faixas, Normalizado pelo percentual.

36

Analisando a área média das fibras podemos observar que os animais que foram

submetidos a tratamento apresentam uma menor área média das fibras. Comparando com

o GC apresenta diferença estatística significante.

Figura 6. Área média das fibras do nervo isquiático. Teste t pareado. Asterisco igual a p ≤ 0,001

37

6 Discussão

A existência do homem até os dias atuais se reporta aos incansáveis processos

adaptativos sofridos desde os nossos ancestrais, onde suas preocupações giravam em

torno do cassar, pescar, coletar e abrigar-se em local seguro, esses eram comportamentos

essenciais para a sobrevivência. Não só proporcionavam a sobrevivência da espécie como

também serviam de estímulos para adaptações orgânicas relevantes na posterioridade

(DARWIN, 1973).

Adaptações como o aumento do diâmetro da fibra muscular ou da densidade óssea

não tiveram tanto destaque como as adaptações do SN. Percebemos isso quando

observamos a filogenia da mente humana: Passando do controle motor com a praxia fina,

para a descoberta, manipulação e utilização de instrumentos como a pedra bruta e pedra

polida, materiais como metais, enfim, todas essas mudanças foram diretamente

estimuladas pela nessecidade de sobrevivência, culminando em processos adaptativos do

SN (RIBAS, 2006).

Hoje, após o nascimento de um humano, seus tecidos sofrem incontáveis processos

adaptativos. Algumas já pré-progamadas em seu material genético e outras oriundas de

estímulos do meio externo (BERNE, 2004). Contudo, a adaptação fica a mercer da

plasticidade do tecido estimulado. Às vezes, as adaptações são precedidas de

degenerações. Degenerações comumente encontradas na porção distal do SNP em casos

de lesões (DIAS, 2000).

A imobilização proporciona adaptações musculares e sinais de degeneração nas

fibras nervosas dos animais tratados caracterizado pela fragmentação total ou parcial da

fibra. As decrições no que diz repeito à fragmentação das fibras nervosas está bem

relatada na literatura (BERNE, 2004; CORRÊA 2005; MURINSON, 2005; IDE, 1996;

38 LUNDBORG, 1993; GUTMANN e HOLUBAR 1950; SUNDDERLAND, 1945; SEDDON,

1972). Logo, em nosso estudo observamos uma degenaração pouco descrita na literatura

não havendo compatibilidade fidedigna com as caracteristicas já bem relatadas. As

principais classificações aceitas baseiam-se principalmente em Sundderland (1945) e

Seddon (1972).

Seddon classifica os diversos tipos de lesão de nervos periféricos como

neurapraxia, axôniotmese e neurotmese. Na neuropraxia há apenas um dano discreto do

nervo com perda transitória da condutividade, nas suas fibras motoras e o prognóstico é

bom. Na axôniotmese tem-se uma lesão em nível axonal, mas não há dano na formação

estrutural do nervo em si. E por fim, a neurotmese está ligada à lesão traumática, os

nervos são seccionados, rompidos ou destruídos, o prognóstico é ruim.

Sundderland, classifica as lesões de nervos periféricos em 5 graus: lesões de

primeiro grau há o bloqueio da condução nervosa por um determinado período de tempo

mantendo a integridade estrutural do nervo; na lesões de segundo grau ocorrem a secção

axonal completa sem a interrupção da lâmina basal. A lesão de terceiro grau, é vista

quando se observa a secção axonal e endoneural. Na lesão de quarto grau, em que ocorre

a secção axonal, endoneural e perineural e a de quinto grau, na qual se tem a secção

axonal completa.

Alves 2010, demostrou condutividade nervosa após periodo de imobilização, logo

não pode ser classificado como neuropraxia. A classificação de axoniotimese tambem não,

porque na axoniotmese tem-se uma lesão a nível axonal sem dano estrutural e no

presente estudo foi observado dano na estrutura como um todo. A neurotmese está ligada

a lesões traumáticas, fato que não faz parte da nossa metodologia. Assim a classificação

de Seddon não se adequa ao nosso estudo.

39

Os 5 graus da classificação de Sundderland fazem referência a classificação de

Seddon, onde o grau I corresponde a neuropraxia, os graus II, III e IV correspondem a

axoniotmese e o grau V corresponde a neurotmese.

A maioria das lesões nervosas, referentes a essas classsificações, são presentes

em estudos onde ocorrem doenças neuro-degenerativas e/ou lesões mecânicas. Assim,

temos um padrão de degeneração carente de estudos. Esse padrão é caracterizado por

fissuras na mielina sem alteração axonal, tal fissura ora é parcial ora é total podendo haver

os dois tipos na mesma fibra. Além das fissuras mielínicas temos em algumas imagens

desintegração total da fibra, onde uma única fibra apresenta-se em pedaços. E como visto

por Alves (2010) a condutividade é presente.

A fragmentação observada em nosso estudo foi dividida em dois grupos, o primeiro

estaria associada a uma deformação parcial (Fig 1 b) e o segundo seria a desintegração

total da fibras (Fig 1 c). Essa degeneração neural foi observada em uma faixa de 5 a 8µm

de diâmetro, sendo, possivelmente, um processo degenerativo em fase inicial, na

respectiva faixa, pois muitos axônios selecionados para serem analisados, não foram, por

conta da morfologia inviável para essa análise (Fig 2 ).

Assim, esses axônios analisados que apresentavam algum grau de degeneração

não estão sendo utilizados para suas funções. Alves (2010) ao analizar, a nível

eletrofisiológico, o nervo isquiático de ratos submetidos a imobilização de pata, relata

algumas mudanças, como a diminuição no padrão de utilização das fibras que formam a

primeira componente do potencial de ação composto estão bem evidentes. Vale ressaltar

que nosso dados estão coerentes com os achados de Alves (2010) e ambos corroboram

com dados disponíveis na literatura. Esses dados da literatura já mostravam que periodos

de imobilização promovem mudanças no complexo nervo-músculo, mas eles mediram e

40 avaliaram parâmetros diferentes da função neural (APPELL 1990, COUTINHO 2004,

FERREIRA 2004, BOOTH 1982).

A hipótese de lesão nervosa, ao invés da hipótese de adaptação, poderia ser

cogitada nessas circustâncias, no entanto, essa hipótese é anulada pelo surgimento de

“clusters”, em concomitância com a desintegração (Fig. 3 e) (setas vermelhas). Sendo

assim, a degeneração se justifica pela necessidade de novo padrão funcional do membro

imobilizado e não por uma lesão ocorrida durante o processo físico de imobilização. O

novo padrão funcional supra citado, refere-se principalmente as inúmeras alterações

ocorridas na musculatura esquelética (APPELL 1990).

A distribuição Gaussiana apresentada na Fig. 4 GC já era esperado para o GC e

Mazzerm (2006) confirma que os animais que não são submetidos a tratamento tendem a

manter uma distribuição normal das fibras nervosas, diferentemente dos tratados.

Já no GI Fig. 5 fica claro uma redistribuição dos diâmetros das fibras no GI onde

apresentou uma redução de 17% na faixa de maior diâmetro. Ao se comparar o traçado

eletrofisiológico dos animais submetidos a imobilização (Fig. B de ALVES 2010) com a

distribuição de frequência apenas no GI (Fig 5.1 desta dissertação), observamos uma

compatibilidade. A primeira componente, dotada principalmente de fibras com maior

diâmetro apresentou diminuição. E em nossos achados, observamos redução nas fibras

com essas características.

41

encial de ação composto de ALVES, 2010.

Figura 5.1 Distribuição de frequência apenas do GI, por faixa de diâmetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 médio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.

B

Figura B Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático do GI.(B). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.

A

Figura A Traçado eletrofisiológico do potencial de ação composto do nervo isquiático do GC.(A). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.

42

Ainda no comparativo entre a Fig. B (ALVES, 2010) com a Fig. 5.1 . percebemos

também uma corroboração dos resultados da segunda componente da Fig. B (ALVES,

2010) com o aumento de 16% na faixa de menor diâmetro da Fig. 5.1 . para esses

resultados três fatores foram fundamentais: o primeiro está no surgimento de “clusters” os

quais provocam um aumento na quantidade de fibras que compõem a segunda

componente. O segundo fator é a possível redução da bainha de mielina proporcionando

uma mudança na faixa de distribuição. E por fim, diminuição da área média das fibras dos

animais tratados, que apresentou resultado estatisticamente menor que o GC. A segunda

componente do potencial de ação composto, é dotada principalmente de fibras sensitivas

(BERNE, 2004). Assim, observamos um aumento da quantidade de fibras sensitivas e uma

possível redução do limiar dessas fibras, caracterizando assim mudanças eletrofisiológicas

(ALVES, 2010) e morfológicas em busca de um novo ponto de homeostase.

Todas essas alterações nervosas mantém uma relação direta com a musculatura

esquelética. Segundo Falempin (1998) um provável gatilho inicial para as mudanças

posterior à imobilização é a alteração do grau da atividade neural sobre o tecido muscular.

Para Seki (2001a, 2001b) a mudança na estrutura proteíca da musculatura esquelética

analizada após três semanas de imobilização articular, têm estreita relação com as

modificações na modulação do limiar dos motoneurônios do referido músculo. Sugere-se

ainda que estas alterações nos motoneurônios devam ter início muito antes do final de três

semanas de imobilização.

Lima (2007) observou que apenas sete dias de imobilização foi o suficiente para

promover importantes adaptações de sarcômero e alterações na morfometria e mecânica

da musculatura esquelética de ratos. E na mesma linha de curtos períodos de imobilização

Chingui (2008), estudando alterações químicas e metabólicas, mostrou que ocorrem

mudanças a nível muscular como o conteúdo de glicogênio, o percentual de hidratação do

43 músculo, a concentração de DNA, a concentração de proteínas totais e o peso muscular.

Essas mudanças foram observadas até o terceiro dia de imobilização ficando evidente que

apenas um dia é possível observar alterações metebólicas.

Tendo em vista que houve degeneração e regeneração em resposta à mera

imobilização, sem acometimento simultâneo de outra patologia, e dada a rapidez das

alterações musculares na ausência de movimentação, acredita-se que a imobilização, ao

provocar adaptações no tecido muscular esquelético gera novas demandas nervosa.

Assim, de forma aferente, a plasticidade neural possivelmente provocou modificações

morfológicas nas fibras do nervo isquiático, atendendo a nova demanda.

Assim temos duas linhas de processos que foram evidenciadas nesse trabalho. A

primeira está intimamente ligada à degeneração e a outra se reporta à regeneração.

Sugere-se que a junção dessas duas linhas culminou na adaptação. Como adaptação é

definida literalmente como “Processo que permite torna-se mais apto a sobreviver no

ambiente” (AURÉLIO, 2008), no presente caso resta demonstrar os componentes

adaptativos do processo.

Assim, os achados supracitados são sugestivos de plasticidade neural com

brotamento colateral, uma adaptação neural ao novo padrão funcional.

44

7 CONCLUSÃO

Com esse trabalho foi possível concluir que a imobilização foi suficiente para que o

tecido nervoso periférico sofresse alterações.

Concluiu-se também que, como houve, em resposta à imobilização, degeneração e

regeneração com característica de “cluster” axonal, um processo de reparação, o processo

como um todo pode ser caracterizado como um processo adaptivo, de plasticidade

neuronal, portanto.

Concluiu-se ainda que o período de imobilização relativamente curto ao qual os

animais foram submetidos foi o suficiente para que o tecido nervoso periférico sofresse

adaptações, diminuindo a quantidade de fibras com maior diâmetro e aumentando as fibras

com menor diâmetro.

45

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50

ANEXO

ANEXO A-

Limb immobilization alters functional electrophysiological

parameters of sciatic nerve J.S.M. Alves1, J.H. Leal-Cardoso1, P.S. Carlos1, C. M. Lucci, S. N. Báo 3, V.M. Ceccato1and R. Barbosa2 1Instituto Superior de Ciências Biomédicas, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil 2Mestrado em Bioprospecção Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil

3 Instituto de ciências Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil

Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity;

Rheobase; Chronaxy.

Acknowledgments We are thankful to Doctor Daniel Weinreich for the orthographic revision. Research supported by CNPq, CAPES and FUNCAP. Address for correspondence: J.H. Leal-Cardoso Instituto Superior de Ciências Biomédicas Universidade Estadual do Ceará Av. Paranjana, 1700 Campus Itaperi 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil Tel: +55-85-3101-9810 E-mail: lealcard@yahoo.com

51 Abstract

Immobilization used in clinical practice to treat orthopedic and traumatological problems,

cause changes in muscle but it is not known whether changes also occur in nerve. We

therefore investigated the effects of immobilization on excitability and compound action

potential (CAP) of the rat sciatic nerve. Fourteen days after immobilizations of the right leg

of adult Wistar rats, rats were euthanized and right sciatic nerves were dissected, mounted

in a moist chamber. Nerves were stimulated at a baseline frequency of 0.2 Hz and, tested

for 2 min periods with at 20, 50 and 100 Hz. Immobilization significantly altered nerve

excitability: rheobase and chronaxy changed from 3.13 ± 0.05 V and 52.31 ± 1.95 µs (N =

15), respectively, (controls) to 2.84 ± 0.06 V and 59.71 ± 2.79 µs (N = 13). Immobilization

decreased the amplitude of first CAP wave (from 7.03 ± 0.50 mV (control) to 4.92 ± 0.49

mV) but increased second CAP wave (from 3.15 ± 0.52 mV (control) to 4.87 ± 0.51 mV (N =

15)). Immobilization also changed the conduction velocity of the first CAP wave (from 93.63

± 7.49 m/s (control) to 79.14 ± 5.59 m/s) but not the conduction velocity of the second CAP

wave. Increases in frequency of stimulation caused a decrease in CAP amplitudes but

immobilization did not change the frequency-induced amplitude depression for the first and

second wave. At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic

nerves of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was

predominantly a defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective

axon. In conclusion, here we have demonstrated that long-lasting leg immobilizations can

induce alterations in nerve function.

Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity;

Rheobase; Chronaxy.

52

Introduction

Peripheral nerves are frequent targets of traumatic injuries, such as crushing,

compression, stretching, avulsion and partial or full section, resulting in impaired nerve

impulse transmission and reduction or loss of sensation and motor function in the

innervated area. The magnitude of changes to the nerve function depends upon the nature

of the injury, timing, type and diameter of the affected nerve fibers (1,2). Traumatic injuries

lead to partial or total disability of memberlimb that removes the patient from their usual

activities for long periods of time (3). As a part of the healing process neuromuscular

plasticity develops. As an important component of the neural basis of control of movement,

plasticity also occurs as a result of alterations of functional use of neuromuscular body

components, within the normal range of function (3).

Traumatic injuries and their treatments can frequently lead to long lasting limb

immobilization. Since the control of movement and associated neuromuscular plasticity

depends on the continued response of the nervous system activity, neuromuscular plasticity

is expected to occur with simple immobilization. Indeed, it is already documented that long

lasting body immobilization causes skeletal muscle atrophy (4,5) and it would be predicted

that functional alterations to nerve are likely to occur. It is also known that innervations is

critical for the functional and structural integrity of muscle (6,7), with nerve function

degeneration causing loss of muscle weight and ability to generate muscle force (8,9).

Thus, since simple immobilization may cause a negative plasticity in nerve, it is important to

elucidate whether functional alterations occur in nerve as a result of simple immobilization.

If they do occur, it is important to elucidate the underlying mechanism in order to

understand the contribution of negative plasticity on nerve due to immobilization in

traumatic injury healing process.

53

Few studies exist in the literature that assesses immobilization-induced alteration of

physiological and morphological parameters of the sciatic nerve. Since long lasting limb

immobilization is frequent in clinical practice, the objective of the present study was to

elucidate whether immobilization induces alterations of electrophysiological parameters

related to excitability of peripheral nerves and the mechanism. In the present work, we

examined whether immobilization of the right hind paw of the rat for 14 days would alter

electrophysiological and morphological properties of the sciatic nerve. We found that this

experimental condition alters the excitability of this nerve as demonstrated by modifications

of rheobase, chronaxie and various parameters of the compound nerve action potential and

induces axonal and myelin sheet degeneration (CAP).

Materials and methods

Dissection, tissue preparation and immobilization p rotocol

Male Wistar rats (Rattusnorvegicus, 180-200g) were used. All animals were in

compliance with the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, published by U.S.

National Institutes of Health (NIH publication 27-89, revised 1996; http://www.nap.edu) to

minimize the suffering. All procedures described here were analyzed, and received the

approval of the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceara, project

number nº 08351783-9.

Immobilization was performed using the method described by Santos-Junior et al.,

2010 (10). Briefly, the rats were first anesthetized with ketamine 60 mg/kg and xylazine 8

mg/kg of body weight intraperitoneally. A control group received no immobilization and

another group underwent immobilization of right hind leg (immobilized group) using

54 waterproof tap wrapped around the pelvis, hip, knee and ankle in order to achieve full leg

immobilization.

At the end of treatment (14 days immobilization), the rats were sacrificed by cerebral

concussion and the right sciatic nerve (SN) was dissected. The tissues were then

immediately placed in Petri dishes containing refrigerated Locke solution. Afterwards,

nerves were mounted in a moist chamber and used the same day of dissection for

recording of compound action potential. Petri dish and moist chamber contained modified

Locke’s solution, whose composition was (in mM): NaCl 140, KCl 5.6, MgCl2 1.2, CaCl 2.2,

Tris (hydroxymethyl-aminomethane) 10 and glucose 10. The pH of the Locke solution was

7.4. The experiments were performed at room temperature (18-22 °C), and all salts were

purchased from the Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA) or Reagen (Rio de Janeiro,

Brazil) and were of analytical grade.

Electrophysiological recording

The sciatic nerve (SN) was stimulated and evoked CAP was recorded as described

by Lima-Accioly et al. (2006) (11). Briefly, the SN was mounted in a moist chamber and one

of its ends was stimulated with electrical pulses at a frequency of 0.2 Hz (baseline

frequency). A 100 µs, 40 V pulse was delivered by a stimulus isolation unit (Model

SIU4678, Grass Instruments Co., Quincy, MA, USA) connected to a stimulator (Model S48,

Grass Instruments Co., Quincy, MA, EUA). Evoked CAPs were recorded with platinum

electrodes placed 4-5 cm from the stimulation electrodes. The recording electrodes were

connected to an oscilloscope (Model 547, Tektronix, Inc., Portland , OR, USA) through a

high input impedance amplifier (model AM 01/UECE) specially configured and produced in

the laboratory to meet the needs of the research. Digidata 1200 acquisition of computer

hardware (Axon Instruments, Inc., Union City, USA) and AxoScope software (Axon) were

55 used for data capture and analysis. In order to measure conduction velocity of a given CAP

wave we divided the distance between the stimulating and recording electrodes by the time

elapsed between the initiation of the stimulus and the time when the positive peak of that

wave was reached. Strength-duration curves with constant-voltage square waves were

used to determine rheobase and chronaxy (12). Rheobase was measured as the threshold

stimulus voltage for an active response with a long-duration pulse (1000 µs) and chronaxy

as the pulse-width corresponding to twice the rheobase.

Nerves were first stimulated at 0.2 Hz for 120 min, a time period sufficient achieve

stable recording, then the measurements of CAP parameters were done. Nerves that

showed no change in CAP amplitude during the last 30 min were included in the study.

Subsequently, we recorded CAPs evoked at 20, 50 and 100 Hz. Each stimulation period

lasted two min; with 5 min intervals of 0.2 Hz stimulation.

Methodology Preparation for TEM

The animal was anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde. After

perfusion the distal sciatic nerve was dissected and fixed in Karnovsky for 3h, at room

temperature. Post-fixation was done with osmium tetroxide 1% during one hour in the

dark.The contrast was made "in bloc" and the tissue was dehydrated in bathwith increasing

acetone concentration. After dehydration the tissue was embedded in Spurr-s resin. Inorder

to cut tissue slices 70nmthick, a diamond knife was used and imager visualization and

analysis was done in TEM JEOL JEM 1011.

Statistics

Results are presented as the mean +s.e. of mean, with (n) indicating the number of

experiments. Values were analysed using Student’s t test, or ANOVA followed by a contrast

56

test, or a non-parametric test, as appropriate. Results were considered significant at

p < 0.05.

RESULTS

Electrophysiological alterations

The 14 days immobilization of right hind leg affected body weight and the mass of

the right soleus and gasctrocnemius muscles. The body weight for control and immobilized

groups were 370.3 ± 7.20 g and 297.3 ± 14.55 g, respectively. The soleus of control and

immobilized groups were 0.18 ± 0.004 g and 0.11 ± 0.006 g, respectively. The

gastrocnemius of control and immobilized groups were 2.24 ± 0.133 g and 1.60 ±0.100 g,

respectively. All these alterations were statistically significant (P < 0.05, for each group,

unpaired Student’s t test, N = 15).

Immobilization significantly (P < 0.05, for each group, unpaired Student’s t test, N =

15) increased nerve chronaxy and decreased rheobase, the electrophysiological

parameters more directly related to excitability, from the control values, 52.31 ± 1.95 µs

(Figure 1C) and 3.13 ± 0.05 V (Figure 1D), respectively, to 59.71 ± 2.79 µs and 2.84 ± 0.06

V.

Since excitability was altered by immobilization, we examined whether immobilization

affected the CAP. Typically, under our stimulation and recording conditions, CAPs

consisted of two distinct components or waves (Figure 1A). A 3rd component wave was

frequently observed at the end of the stabilization period, but often it diminished in

amplitude progressively becoming indistinguishable from baseline noise during this period

(Leal-Cardoso et al., 2010). In the present study, we only analyzed the first two waves of

the CAP.

57

We analyzed the effect of immobilization on CAP conduction velocities and

amplitudes in preparations stimulated at a baseline frequency and with higher frequencies.

Immobilization significantly (P<0.05) decreased the conduction velocity of the first wave

(Fig. 1E, ANOVA) but had no significant affect on the conduction velocity of the second

wave (Fig. 1F, ANOVA). The amplitude of the CAP waves were differentially affected by

immobilization: the first component was significantly (P < 0.05, ANOVA) decreased (Fig 1G)

while the amplitude of the second component was significantly enhanced (Fig 1H, ANOVA).

The amplitudes and the conduction velocities of the first and second CAP waves

were also analyzed for the effect of frequency (0.2 – 100 Hz) on the parameter value.

Concerning both waves, under the same experimental condition (immobilized, for example),

a tendency (without reaching statistical significance, ANOVA) to decreases in conduction

velocity (Fig 1E and 1F) and amplitude (Fig 1G and 1H) with increasing frequency was

observed.

The size of the decreases in amplitude s and velocity of the first and second CAP

components with increasing frequency (0.2 – 100 Hz) in control and in immobilized animals

were also analyzed and depicted in Table 1. Comparing the size of the decrease in velocity

with that in amplitude, for the first and second components, proportionally, with increase in

frequency the size of the decrease was larger for the amplitude than for the frequency (95

% confidence interval), independent of the condition. Comparing the size of the decrease

inside a given parameter for different conditions, the decrease in amplitude and conduction

velocity for the first component were proportionately larger (without reaching statistical

significance, however) in animals with a limb immobilized as compared to controls (Table

1). Concerning the second component, the alteration of conduction velocity with increase in

frequency was proportionally the same in control and in immobilized condition; for the

58 alterations of amplitudes, the decrease in amplitudes with increase in frequency was

smaller in immobilized than in controls (Table 1).

Morphological alterations

At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic nerves

of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was predominantly a

defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective axon. This

degeneration inflicted predominantly the axons with the largest diameter (Fig 2). An

increase in the number of small and medium size diameter axons was observed (Fig 3). A

large number of these small and medium size diameter axons showed a cluster

organization suggestive of regenerative process (Fig 4).

Discussion

The major discovery of the present study is that immobilization causes alterations of

the excitability and of the morphological structure of a peripheral nerve of the non mobilized

limb. It is already reported that long last immobilization causes decrease of functional

performance and atrophy of muscles of the non mobilized limb (4,5,10), but no studies were

available to functional and morphological nerve parameters. Surprisingly and contradictorily

to what is expected based on analogy with skeletal muscle, an stimulatory effect on a basic

parameter to measure excitability, the rheobase, was found. This adds relevance to the

data here presented. Not less surprising was the pattern of the axonal and myelinic

degeneration, affecting predominantly the axons with the largest diameters, and of the

regeneration,which was characterized by the appearance of clusters of axons with medium

size diameter. To the best of our knowledge, this is the first time that this is reported.

59

In order to diminish the scars and ulcerations of the non mobilized limb we

developed adaptations of the immobilization procedures (4,5,10). To assure that our

method was able to promote the expected effects on muscles, we weighed the

gastrocnemius and the soleus muscle. Both underwent a significant decrease in muscle

mass. We also measured body weight, which was decreased. These data agree with the

literature (4,5) and assure that the nerve alterations were really obtained in a situation of

appropriate limb immobilization.

Concerning the decrease in rheobase value, which shows an increase in excitability,

it may result from alterations of several factors related to active or passive properties of the

axons. It may result from leakage conductivity and membrane time constant, geometric

factors and voltage-dependent sodium conductance alterations (12). Geometric factors are

believed not to play a role, since all procedures related to the nerve placement and

chamber preparation for recording are the same in control and experimental condition. Little

can be advanced about the contribution of the other factors for this increase in excitability.

One aspect of this decrease in rheobase, however, deserves consideration: it is

simultaneous with an increase in chronaxy. If this rheobase diminution was caused only by

primary alteration of active factors related inward Na current, without membrane time

constant modification, then a decrease in voltage threshold for firing would imply alterations

in rheobase and chronaxy in the same direction, it is to say, decrease for both values in the

present case. This did not occur suggesting that a primary increase in membrane time

constant occurred. It is the membrane resistance or membrane capacitance which

determines the membrane time constant (13,14). Therefore one of these parameters or

both are likely to be altered in immobilization.It is known that axonal myelination decreases

membrane capacitance (12). Electron microscopy data showed that demylination occurred

and gave support to the hypothesis of a primary increase in membrane capacitance.

60

Immobilization had a depressive effect on both the amplitude and the conduction

velocity of the first CAP component, yet on the second component it caused increase in

amplitude and did not affect conduction velocity. It is difficult to analyze the causes of

modifications of first and second component with the data available. This is because

modifications in CAP component waves may result from modifications at the level of

individual axons, like the dV/dt of intracellular axonal action potentials, and from action

potential population parameters, like the synchronization of intracellular axonal action

potentials on the nerve (15, 16). At the first interpretation of electrophysilogical data, it is

tempting to conclude that lack of mobilization acted with different mechanisms in the two

components, so as to promote nearly opposite effects. This hypothesis was supported by

electron microscopy data. The myelin degeneration affected predominantly the axons with

the largest diameter, which explains the decrease in velocity and amplitude of the first wave

of the action potential. The increase in the number of small and medium size diameter

axons partially due cluster organization suggestive of regenerative process (Fig 3) explains

the increase in amplitude of second component without alteration of conduction velocity.

Based on the velocity of conduction and on classifications of mammalian nerve fibers (22),

for the two components rat CAP of sciatic nerve we suggest that the first consists of

contribution of Aα and Aα/β fibers (30–120 m/s) and the second component consists of Aγ

fibers (15–30 m/s) (17, 18 and 19). This would lead to the conclusion that, regarding

myelinated fibers, immobilization affects predominantly and depressively Aα and Aβ fibers.

We cannot exclude the possibility that an alternative mechanism might have

contributed to the increase in second component amplitude. It is the fact that the

contribution of an action potential of a given axon to any component depends on its

conduction velocity. Therefore, with a decrease in conduction velocity proportionally uniform

for all axons, the first component only loses contribution. The second component, however,

61 whilst likely also losing, probably wins the contribution of the axons which previously

contributed to the first component with the lowest velocity of conduction and underwent

further decrease in velocity.

It is documented that stimulations at frequencies ≥ 50 Hz and lasting minutes cause

a decrease in action potential amplitude and conduction velocity. This depressive effect has

been attributed to reversible micro-alterations of the structure of the node of Ranvier (20).

Since we observed degeneration at electron microscopy, we investigated whether

depressive effect on CAP parameters by stimulation at high frequency was amplified. Our

data here, in accordance with the literature, showed a depressive effect on CAP. The

depressive effect on velocity of conduction seemed to be more pronounced on

immobilization, since at 100 Hz velocity of the first and second CAP component decayed

more in this condition than in control (Table 1). To the velocity of conduction, however, the

sizes of the decrease at 100 Hz was larger for the first and smaller for second component.

We have no explanation for that so far.

In conclusion, here we have demonstrated that long lasting immobilizations have

depressive effect on nerve function. The data here presented suggest various facts and

raises several questions with clinical implications. This study shows that not only the

muscles but, at least in rats, the nerve function deteriorates with long lasting

immobilizations. This brings the question whether the same happens in humans and, if it

does, how to stimulate the nerve and not only muscles to achieve good nerve preservation.

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65

TABLE AND FIGURE LEGENDS

Table 1. Comparing amplitude and velocity of the first component for control versus

immobilized in different frequency. Data are reported expressed as absolute values

percentage (%) 0,2 Hz compared whit 100 Hz . With 95% confidence interval for %

decrese and mean of absolute value at 0.2 Hz (n=15 per group).

Figure 1. Effect of immobilization on compound action potential (CAP) parameters. Panels

show: A and B, representative CAP tracings in control (A) and immobilization (B) conditions;

C and D, chronaxy (C) and rheobase (D) in control and immobilized rats. E, F, G and H

panels show: velocity of conduction of first (E) and second (F) components and positive

amplitude of first (G) and second components (G) of CAP at different frequencies in control

and immobilized rats. Data are reported as mean±S.E.M. (n=15 per group). * indicates

P<0.05 ANOVA followed by Bonferroni's post-hoc test.

Figure 2 (frame 2). Immobilization-induced degeneration of myelin sheet of large diameter

axons of

the sciatic nerve. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The arrows

in B show axons with the myelin sheet undergoing degeneration.

Figure 3-Freuquency distribution of fibers diameters. Measurement done one 130 and 120

fibers in control experimental condition respective. D,diameter; C, control; I, immobilized.

66 Figure 4 (frame 5). Regeneration of myelin sheet of axons of the sciatic nerve of

immobilized limb of rat. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The

arrows in B show axons with the myelin sheet undergoing regeneration. Observe the

pattern of cluster for regenerating axons.

67

B

C D

E F

G H

A

Figure 1.

68

fig 2: imagens degeneração

fig 3: gráfico da distribuição de frequência " em anexo PPT" fig:4 imagens regeneração

69

Table 1. Control Group Immobilized Group

Parameter

Mean ± SEM*

of Absolute Value at 0.2 Hz

Decrease observed at

100 Hz (in % of

value at 0.2 Hz)

(CD100)

95% confidence interval for % decrease

Mean ±

SEM* of

Absolute Value

at 0.2 Hz

Decrease observed at

100 Hz (in % of value

at 0.2 Hz) (ID100)

95% confidence interval for % decrease

Diference in decrease from immobilized to

control observed at 100 Hz

(ID100-CD100)

Velocity 1st Component

(m/s) 93.63 ± 7.49 16.94%

12.61 - 21.26

79.14 ± 5.59 22.08%

13.62 - 30.55

5.15

Amplitude 1st Component

(mV) 6.98 ± 0.49 28.79%

23.40 - 34.19

4.60 ± 0.45 35.84%

30.94 - 40.73

7.04

Velocity 2nd Component

(m/s) 32.46 ± 1.55 17.30%

14.63 - 19.97

32.85 ± 2.00 21.64%

18.50 - 24.79

4.35

Amplitude 2nd Component

(mV) 3.25 ± 0.30 37.88%

31.92 - 43.84

4.91 ± 0.69 33.95%

28.76 - 39.15

-3.93

* 13 ≤ N ≤ 15

1