1 [HR]

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 posuda - 96 72561 5 posuda - 480 72562 KOMBINIRANI KOMPLET PROBIRA ZA ANTI-HCV PROTUTIJELA I VIRALNI ANTIGEN VIRUSA HEPATITISA C U KRVNOM SERUMU ILI PLAZMI TEHNIKOM IMUNOENZIMSKOG TESTA

862224 – 2014/09

2 [HR]

SADRŽAJ

1. NAMJENA ....................................................................................................... 3 2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA .................................................................. 3 3. NAČELA POSTUPKA ...................................................................................... 3 4. REAGENSI ..................................................................................................... 4 5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA ................................................................... 5 6. UZORCI .......................................................................................................... 7 7. POSTUPAK .................................................................................................... 7 8. OGRANIČENJE TESTA ................................................................................. 10 9. KARAKTERISTIKE IZVEDBE ......................................................................... 11 10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE ..................................................................... 13

3 [HR]

1. NAMJENA

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 je kvalitativni imunoenzimski test za otkrivanje infekcije virusom hepatitisa C (HCV) koji se temelji na otkrivanju anti-HCV protutijela i kapsidnog antigena u ljudskom krvnom serumu ili plazmi. Ovaj test probira hepatitisa C može se koristiti u dijagnostičkim laboratorijima ili u bankama krvi.

2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA

Virus hepatitisa C (HCV) je RNK pozitivno usmjereni virus s ovojnicom (9.5 kb) iz obitelji Flaviviridae s identificiranih šest glavnih genotipova. HCV je prepoznat kao glavni uzrok non-A i non-B viralnog hepatitisa. Infekciju HCV karakterizira akutni i kronični oblik koji može dovesti do ciroze i hepacelularnog karcinoma. Serološki dokaz infekcije HCV-a može se dobiti putem nalaza krvi testiranjem na HCV antigene i/ili protutijela i/ili RNK-a. U usporedbi s testiranjem koje otkriva samo anti-HCV protutijela, korištenje kombiniranog testa probira koji otkriva i i anti-HCV protutijela i anti-HCV kapsidni antigen može smanjiti razdoblje takozvanog serološkog prozora i poboljšati otkrivanje infekcije.

3. NAČELA POSTUPKA

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 temelji se na uporabi čvrste faze pripremljene s pročišćenim antigenima: dva rekombinirana proteina iz nestrukturnog područja (NS3 i NS4) i peptida iz strukturnog područja (kapsida) virusa hepatitisa C, te monoklonskog protutijela protiv kapsida hepatitisa C. Tekuća faza sastoji se od dva konjugata. Prvi konjugat (R6) sastoji se od biotiniziranog monoklonskog mišjeg protutijela na kapsid hepatitisa C. Ovo monoklonsko protutijelo ne ne reagira s kapsidnim peptidom korištenim u čvrstoj fazi. Drugi konjugat (R7) je mješavina anti-human IgG protutijela miševa, vezanih za peroksidazu i streptavidina, vezanog za peroksidazu. Testni postupak uključuje sljedeće korake:

1) Konjugat 1 i uzorke koji će se testirati te kontrolne serume raspodijelimo po jažicama pločice. Ako su protutijela na HCV prisutna, ona će se vezati na antigene fiksirane u čvrstoj fazi. Ako je prisutan kapsidni antigen hepatitisa C, ovaj antigen vezat će monoklonska protutijela obložena u čvrstoj fazi i biotinizirana monoklonska protutijela protiv kapsidnog antigena hepatitisa C (konjugat 1).

2) Nakon inkubacije na temperaturi od 37°C tijekom 90 minuta i ispiranja, konjugat 2 koji sadržava anti-human lgG protutijela vezana za peroksidazu i streptavidin vezan za peroksidazu dodaju se u svaku jažicu mikrotitarske pločice. Ako je prisutan humani lgG, koji je reagirao sa čvrstom fazom, anti-humani lgG kunjugat veže se za humana protutijela. Konjugat peroksidaze/streptavidina veže se za biotin konjugata 1 ako je kapsidni antigen HCV prisutan u uzorku.

3) Nakon 30 minuta inkubacije na temperaturi od 37°C, nevezani enzimski konjugat uklanja se ispiranjem, a prisustvo kompleksa antigen-protutijelo- peroksidaza otkriva se dodavanjem supstrata.

4) Nakon 30 minuta inkubacije na temperaturi laboratorija (18 - 30°C) te kad je reakcija zaustavljena spektrofotometrijski se očitava pri 450/620-700 nm. Izmjerena apsorpcija uzoraka omogućuje otkrivanje prisutnosti ili odsutnosti HCV protutijela i/ili kapsidnog antigena hepatitisa C u uzorku. Intenzitet boje je proporcionalan količini HCV protutijela i/ili kapsidnog antigena hepatitisa C vezanog u čvrstoj fazi.

4 [HR]

4. REAGENSI

4.1. Opis

Identifikacija na oznaci Opis Prezentacija

Priprema 72561

Prezentacija Priprema

72562

R1 Microplate

Mikrotitarska pločica 12-traka s 8 jažica, obložene s monoklonskim anti-kapsidnim protutijelom VHC-a, pročišćenim rekombinantim antigenom hepatitisa C (NS3, NS4) i HCV kapsidnim peptidom. Specifični ID broj = 93

1 pločica Spremno za

uporabu

5 pločica Spremno za

uporabu

R2 Concentrated washing solution (20X)

Koncentrat sredstva za ispiranje (20x) Tris NaCl pufer pH 7.4 Konzervans: ProClin™ 300 (0.04%)

1 bočica 70 ml Treba

razrijediti

1 bočica 235 ml Treba

razrijediti

R3 Negative control

Negativna kontrola Tris HCI pufer, koji sadrži BSA (Bovine Serum Albumin - goveđi serumski albumin); Konzervans : ProClin™ 300 (0.1%)

1 bočica 1 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 1 ml

Spremno za uporabu

R4 Positive control

Pozitivna kontrola Ljudski serum koji sadrži protutijela za HCV, negativan na HBs antigen i na HIV-1 i anti-HIV-2 protutijela, razrijeđen u Tris HCI puferu koji sadrži BSA i fotokemijski je inaktiviran. Konzervans: ProClin™ 300 (0.1%)

1 bočica 1,5 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 3 ml

Spremno za uporabu

R5a Antigen positive control

Pozitivna kontrola antigena Pozitivna kontrola umjetnog antigena sadrži liofilizirane kapsidne peptide.

1 bočica q.s. ad

1 ml Treba

rekonstituirati

1 bočica q.s. ad

1 ml Treba

rekonstituirati

R5b Antigen diluent Diluent za R5a Destilirana voda koja sadrži konzervans: ProClin™ 300 (0.5 %)

1 bočica 1 ml

Treba rekonstituirati

1 bočica 1 ml

Treba rekonstituirati

R6 Conjugate 1

Konjugat 1 Mišja biotinizirana monoklonska protutijela na kapsid HCV antigena. Ljubičasto obojeno Konzervans: Natrijev azid (< 0,1%), Cosmocil

® CQ (0,025%)

1 bočica 15 ml

Spremno za uporabu

2 bočica 2 x 30 ml

Spremno za uporabu

R7 Conjugate 2

Konjugat 2 Mišja protutijela usmjerena na humani lgG/peroksidazu i streptavidin/peroksidazu. Zeleno obojeno. Konzervans: ProClin™ 300 (0.5 %)

1 bočica 15 ml

Spremno za uporabu

2 bočice 2 x 30 ml

Spremno za uporabu

5 [HR]

R8 Substrate buffer

Supstrat Limunska kiselina i otopina natrij-acetata, pH 4.0, sadrži H2O2 (0,015%) i dimetil sulfoksid (DMSO) 4%

1 bočica 60 ml Treba

rekonstituirati

2 bočice 2 x 60 ml

Treba rekonstituirati

R9 Chromogen: TMB solution (11X)

Kromogen: TMB otopina Otopina sadrži 3.3’, 5.5’ tetrametilbenzidina (TMB).

1 bočica 5 ml

Treba rekonstituirati

2 bočice 2 x 5 ml Treba

rekonstituirati

R10 Stopping solution

Otopina za zaustavljanje

Otopina sumporne kiseline (H2SO4 1N)

1 bočica 28 ml

Spremno za uporabu

3 bočice 3 x 28 ml

Spremno za uporabu

4.2. Uvjeti za čuvanje i rukovanje

Komplet treba čuvati na temperaturi od +2-8°C. Svaki pojedini dio kompleta koji se čuva na temperaturi do +2-8°C može se koristiti do isteka roka trajanja naznačenog na pakiranju (osim ako nije drukčije naznačeno). Nakon otvaranja i uz odsutnost kontaminacije, reagensi R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 i R10 koji su se čuvali na temperaturi od 2-8°C mogu se koristiti do isteka roka trajanja naznačenog na naljepnici.

Identifikacija Čuvanje

R1 Nakon otvaranja vakuumski zatvorene vreće mikrotitarske trake koje se čuvaju na + 2-8°C mogu se 1 mjesec koristiti u njihovoj pažljivo ponovno zatvorenoj originalnoj vreći s ljepljivom trakom.

R2 Razrjeđena otopina za ispiranje može se čuvati 2 tjedna na temperaturi od +2-30°C. Koncentrirana otopina za ispiranje (R2) može se čuvati na temperaturi od +2-30°C.

R5a + R5b Nakon rekonstitucije, radna otopina pozitivne kontrole antigena (R5) može se čuvati mjesec dana na temperaturi od +2-8°C i 2 mjeseca na temperaturi od -20°C (do najviše 5 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja nakon zamrzavanja na -20°C).

R8 + R9 Nakon rekonstitucije reagens čuvan na tamnom mjestu može se koristiti 6 sati na sobnoj temperaturi (18-30°C).

5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA

Za in vitro dijagnostičku uporabu od strane zdravstvenog djelatnika.

5.1. Mjere zdravlja i sigurnosti

• Ovim testnim kompletom treba rukovati samo kvalificirano osoblje obučeno za laboratorijske postupke i upoznato s njima povezanim potencijalnim rizicima. Nosite odgovarajuću zaštitnu odjeću, rukavice, zaštitu za oči/lice te rukujte na odgovarajući način, uz potrebnu primjenu dobre laboratorijske prakse.

• Testni komplet sadrži sastojke ljudske krvi. Humani izvorni materijal korišten u pripravljanju R4

reagensa (pozitivna kontrola) testiran je te je utvrđeno kako ne reagira s hepatitis B površinskim antigenom (HBs Ag) i protutijelima na virus humane imunodeficijencije (HIV-a i HIV-2 Ab) te je pozitivan na anti-HCV protutijela. Pozitivna kontrola R4 inaktivirana je zagrijavanjem. Niti jedna poznata metoda testiranja ne može ponuditi potpunu sigurnost kad je riječ o nepostojanju infektivnih agenasa. Zato se svi derivati ljudske krivi, reagensi i ljudski uzorci trebaju tretirati kao da mogu prenijeti zarazne bolesti, te slijediti preporučene univerzalne mjere opreza za patogene koji se prenose putem krvi, kako je definirano lokalnim, regionalnim i nacionalnim propisima.

• Proliveni biološki materijali: Proliveni ljudski izvorni materijal treba tretirati kao potencijalno zarazan.

Prolivene sadržaje koji ne sadrže kiseline treba odmah dekontaminirati, uključujući i mjesto na kojem su proliveni, kao i kontaminiranu površinu i opremu, s odgovarajućim kemijskim dezinficijensom koji je učinkovit protiv potencijalno biološki opasnih tvari, ovisno o vrsti prolivenih uzoraka (obično 1:10

6 [HR]

razrijeđeni kućni izbjeljivač, 70-80% etanol ili isopropanol, iodofor [kao npr. 0,05% Wescodyne™ Plus, itd.) te dobro obrisati. Prolivene sadržaje koji sadrže kiseline treba adekvatno apsorbirati (obrisati) ili neutralizirati, područje treba isprati vodom i osušiti brisanjem; materijali korišteni za apsorbiranje prolivenog sadržaja mogu zahtijevati zbrinjavanje kao biološki opasan otpad. Tada područje treba dekontaminirati nekim od kemijskih dezinficijenasa.

NAPOMENA: Ne stavljajte otopinu koja sadrži izbjeljivač u autoklav!

• Sve uzorke i materijale korištene prilikom izvođenja testa zbrinite na način kao da sadržavaju zarazni agens. Laboratorijskim, kemijskim ili biološki opasnim otpadom mora se rukovati i zbrinuti ga u skladu s lokalnim, regionalnim i nacionalnim propisima.

• Za preporuke o rizicima i mjerama opreza povezanim s nekim kemijskim spojevima u ovom testnom

kompletu, molimo pogledajte piktogram(e) na naljepnicama, kao i informacije na kraju uputa za uporabu. Sigurnosno-tehnički list dostupan je na www.bio-rad.com.

5.2. Mjere opreza povezane s postupkom

5.2.1. Priprema

Pouzdanost rezultata ovisi o ispravnoj primjeni sljedeće dobre laboratorijske prakse: • Ne koristite reagense kojima je istekao rok trajanja. • Ne miješajte i ne povezujte reagense iz različitih lotova u okviru serije testiranja. • Prije uporabe pričekajte 30 minuta da se reagensi stabiliziraju na sobnoj temperaturi (18-30°C). • Naziv testa, kao i specifični identifikacijski broj testa napisan je na okviru svake mikrotitarske pločice.

Ovaj specifični identifikacijski broj nalazi se i na svakoj traci. Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2: Specifični ID broj = 93

Provjerite specifični identifikacijski broj prije uporabe. Ako identifikacijski broj nedostaje ili se ne podudara s brojem testa kojeg koristite, tada traku ne bi trebalo koristiti.

NAPOMENA: Za otopinu za ispiranje (R2, identifikacijska oznaka: 20X zeleno obojena) pufer supstrata peroksidaze (R8 identifikacijska oznaka: TMB pufer, plavo obojen), kromogen (R9, identifikacijska oznaka: TMB 11X, ljubičasto obojen) i otopinu za zaustavljanje (R10, identifikacijska oznaka: 1N, crveno obojen) moguće je koristiti druge lotove od onih sadržanih u kompletu, ako se isti lot koristi u okviru određenog testiranja. Ovi reagensi mogu se koristiti s drugim proizvodima naše tvrtke. Za detaljne informacije kontaktirajte našu tehničku službu.

• Pažljivo rekonstituirajte reagens izbjegavajući bilo koji oblik kontaminacije. • Koristite posude od stakla koje su dobro oprane i isprane deioniziranom vodom ili, poželjno, materijal

za jednokratnu uporabu. • Pazite da se mikrotitarska pločica ne osuši u vremenu između završetka pranja i dodavanja

reagensa. • Enzimska reakcija jako je osjetljiva na metalne ione. Stoga, ne dozvolite metalnim elementima da

dođu u kontakt s različitim konjugatima ili otopinama supstrata. • Razvojna otopina (pufer supstrata + kromogen) mora biti ružičaste boje. Promjena ružičaste boje

unutar nekoliko minuta nakon rekonstitucije znači da se reagens ne smije koristiti i mora se zamijeniti. Priprema razvojne otopine može se izvršiti u čistoj jednokratnoj plastičnoj posudi ili staklenom spremniku koji prvo treba oprati s 1N HCl te dobro isprati destiliranom vodom i osušiti. Ovaj reagens mora se čuvati na tamnom mjestu.

• Nikad ne koristite isti spremnik za raspoređivanje konjugata i za razvojnu otopinu.

5.2.2. Obrada

• Ne mijenjajte postupak testa. • Ne obavljajte testiranje u prisustvu reaktivnih para (kiselinskih, alkalnih, aldehidskih para) ili prašine

koja može izmijeniti enzimsku aktivnost konjugata. • Koristite novi nastavak za raspodjelu svakog uzorka. • Dobro ispiranje je ključni korak u ovom postupku - pridržavajte se preporučenog broja ciklusa

ispiranja i vodite računa da su sve jažice potpuno ispunjene i potom potpuno ispražnjene. Neispravno ispiranje može rezultirati netočnim rezultatima.

7 [HR]

• Pažljivo slijedite opisani postupak ispiranja kako biste dobili najbolju izvedbu testa. Kod nekih instrumenata bit će potrebno optimizirati postupak ispiranja (povećati broj ciklusa ispiranja i/ili obujam pufera za pranje u svakom ciklusu) u cilju postizanja prihvatljive razine OD pozadine za negativne uzroke.

• Kontaktirajte našu tvrtku za prilagodbe i posebne postupke.

6. UZORCI

Prikupite krvne uzorke prema trenutnoj praksi. Testiranje se treba izvršiti s nerazrijeđenim serumom ili plazmom (prikupljenim na EDTA, natrijevom citratu ili ACD-u). Uporaba uzoraka uzetih iz epruveta koje sadrže litij heparinat se ne preporučuje. Slabi signal primijećen je u uzorcima koji su bili pozitivni na HCV antigen. Uzorci koji sadrže agregate moraju se pročistiti centrifugiranjem prije testiranja. Preostale čestice fibrina ili agregata mogu dati lažne pozitivne rezultate. Uzorci se trebaju čuvati na temperaturi od +2-8°C ako se testiranje vrši u roku od 7 dana ili se moraju duboko zamrznuti na temperaturi od -20°C. Ne ponavljajte više od 3 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Uzorci se moraju otopiti na sobnoj temperaturi (18-30°C). Preporučuje se homogenizirati ih okretanjem prije uporabe. Uzorci koji sadrže do 120 g/l albumina, 50 µg/l biotina i 200 mg/l bilirubina, uzorci koji sadrže do 33 g/l trioleina i uzorci koji sadrže do 2 g/l hemoglobina ne utječu na rezultate. Međutim, ne preporučuje se koristiti kontaminirane hiperlipidemične i hiperhemolizirane uzorke. Ne preporučuje se zagrijavati uzorke, jer to može značajno smanjiti mogućnost otkrivanja HCV antigena. Ako uzorke treba otpremiti, treba ih zapakirati u skladu s važećim propisima za prijevoz etioloških agensa te se preporučuje prevoziti ih zamrznute.

7. POSTUPAK

7.1. Potrebni materijal koji nije dostavljen

• Destilirana voda. • Natrijev hipoklorit (izbjeljivač za primjenu u kućanstvima) i natrijev bikarbonat. • Upijajući papir. • Adhezivne folije. • Rukavice za jednokratnu uporabu. • Zaštitne naočale. • Epruvete za jednokratnu uporabu. • Automatske ili poluautomatske, podesive ili prethodno podešene pipete ili višestruke pipete za

mjerenje i pipetiranje 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl i 1 ml. • Graduirani cilindri od 10 ml, 200 ml i 1000 ml. Vortex mješalica. • Automatski, poluautomatski ili ručni sustav za ispiranje mikrotitarskih pločica. • Vodena kupelj ili ekvivalentni inkubator za mikrotitarske pločice, termostatski podešen na

temperaturu od 37°C ± 1°C (*). • Spremnik za biološki opasan otpad. • Čitač mikrotitarske pločice s 450, 490 nm i 620-700 nm filterima (*).

(*) Posavjetujte se s nama vezano za detaljne informacije o opremi koju preporučuje naš tehnički odjel.

7.2. Priprema reagensa

7.2.1. Reagensi spremni za uporabu

Reagens 1 (R1) Mikrotitarska pločica Svaki potporni okvir koji sadrži 12 traka umotan je u zatvorenu vrećicu od folije. Razrežite vrećicu pomoću škara ili skalpela i to 0,5 do 1 cm iznad ruba vakumiranja. Otvorite vrećicu i izvadite okvir. Nekorištene trake vratite natrag u vrećicu. Pažljivo zatvorite vreću ljepljivom trakom i ponovno je uskladištite na +2-8°C. Reagens 6 (R6): Konjugat 1 Homogenizirati okretanjem prije uporabe.

8 [HR]

Reagens 7 (R7): Konjugat 2 Homogenizirati okretanjem prije uporabe.

7.2.2. Reagensi za rekonstituciju

Reagens 2 (R2): Koncentrat sredstva za ispiranje (20x) Razrijedite 1:20 u destiliranoj vodi za dobivanje otopine spremne za ispiranje. Pripremite 800 ml za jednu pločicu s 12 traka. Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9): Enzimska razvijena otopina Razrijedite 1:11 kromogen (R9) u puferu supstrata (npr. 1 ml reagensa R9 + 10 ml reagensa R8) s tim da je 10 ml neophodno i dovoljno za tretiranje 12 traka. Homogenizirajte. Reagens 5a (R5a) + Reagens 5b (R5b): Radna otopina (R5) Prelijte sadržaj R5b diluenta u liofiliziranu Ag R5 bočicu. Zatvorite bočicu i neka odstoji 10 minuta na sobnoj temperaturi (18-30°C), s vremena na vrijeme protresite i okrećite ju radi lakšeg otapanja.

7.3. Postupak analize Strogo se pridržavajte postupka. Koristite pozitivne i negativne kontrolne serume za svaki test radi potvrđivanja kvalitete testa. Slijedite sljedeću dobru laboratorijsku praksu: 1) Pažljivu utvrdite raspodjelu uzoraka i plan identifikacije. 2) Pripremite razrjeđenu otopinu za ispiranje R2 i radnu otopinu pozitivnog kontrolnog antigena

(R5a + R5b). (pogledajte § 7.2) 3) Izvadite iz zaštićenog pakiranja okvir i potreban broj traka (R1). Neiskorištene trake vratite

natrag u pakiranje. Zatvorite pakiranje i pohranite ga pri temperaturi od +2-8°C. 4) Raspodijelite po jažicama, i to prema sljedećem rasporedu (preporučeno raspoređivanje

pločice): • 100 μl konjugata 1 (R6) u svaku jažicu, zatim • 50 μl negativne kontrole (R3) u jažicu A1, • 50 μl pozitivne kontrole (R4) u jažice B1, C1, D1, • 50 μl radne otopine pozitivne kontrole antigena (R5a + R5b) u jažicu E1, • 50 μl prvog uzorka u jažicu F1, • 50 μl drugog uzorka u jažicu G1, itd.

Homogenizirajte mješavinu s barem 3 aspiracije ili s treskalicom mikrotitarske pločice tijekom 5 sekundi. Ako raspodjela uzoraka traje duže od 10 minuta, preporučuje se raspodijeliti negativne i pozitivne kontrole nakon uzoraka koji će se testirati. Ovisno o korištenom sustavu, moguće je izmijeniti položaj kontrola ili način raspodjele.

NAPOMENA: Nakon raspodjele uzoraka, jažica koja sadrži uzorak (ili kontrole) poprimit će ljubičastu ili plavu boju. Moguće je potvrditi prisutnost (uzorak + konjugat 1) u jažicama pomoću spektrofotometrijskog očitanja pri 620 nm (pogledajte § 7.7). 5) Kada je moguće prekrite pločicu s novom adhezivnom folijom. 6) Inkubirajte mikrotitarsku pločicu 90 minuta (± 5 min.) pri temperaturi od 37°C ± 1°C. 7) Ako je potrebno, uklonite adhezivnu foliju. Aspirirajte sadržaj svih jažica u spremnik za tekući

otpad i u svaki otvor dodajte minimalno 370 µl otopine za ispiranje. Aspirirajte ponovo i ponovite ispiranje najmanje 5 puta. Preostali volumen mora biti manji od 10 μl (ako je potrebno osušite trake okretanjem naopako na upijajući papir). Ako imate automatsku perilicu, slijedite isti ciklus rada.

8) Brzo pipetirajte 100 μl otopine konjugata 2 (R7) u svaku jažicu na pločici. Konjugat treba lagano protresti prije uporabe. Ako je potrebno prekrijte novom adhezivnom folijom i inkubirajte 30 minuta (± 5 min.) na temperaturi od 37°C ± 1°C.

NAPOMENA: Konjugat je zelene boje. Moguće je potvrditi prisustvo konjugata u jažicama pomoću spektrofotometrijskog očitanja pri 620 nm (pogledajte § 7.7).

9) Uklonite adhezivnu foliju, ispraznite sve jažice aspiriranjem te isperite najmanje 5 puta kao što je gore opisano.

10) Pripremite enzimsku razvojnu otopinu (reagens R8 + R9).

9 [HR]

11) Brzo raspodijelite 80 μl pripremljene enzimske razvojne otopine (R8 + R9) u sve jažice. Dozvolite da se reakcija razvije u mraku u vremenu od 30 minuta (± 5 min) na sobnoj temperaturi (18 - 30°C). Tijekom ove inkubacija ne koristite adhezivnu foliju.

NAPOMENA: Raspoređivanje razvojne otopine, koja je ružičaste boje, može se vizualno kontrolirati u ovom koraku rada. Jasno se uočava razlika u boji između prazne jažice i pune jažice koja sadrži ružičastu otopinu supstrata. (Pogledajte § 7.7) 12) Dodajte 100 μl otopine za zaustavljanje (R10) koristeći isti redoslijed i istu brzinu raspodjele kao i

za razvojnu otopinu.

NAPOMENA: Raspodjela bezbojne otopine za zaustavljanje može se vizualno kontrolirati na ovoj razini rukovanja. Boja supstrata, ružičasta ( za negativne uzorke) ili plava (za pozitivne uzorke), blijedi u jažicama koje postaju bezbojne (za negativne kontrole) ili žute (za pozitivne kontrole) nakon dodavanja otopine za zaustavljanje. 13) Pažljivo obrišite dno svake pločice. Pričekajte barem 4 minute nakon dodavanja otopine za

zaustavljanje i unutar 30 minuta od zaustavljanja reakcije očitajte optičku gustoću pri 450/620-700 nm pomoću čitača pločice.

14) Provjerite da li se podudaraju rezultati spektrofotometrijskog i vizualnog očitavanja te da li su pločice i uzorci raspoređeni prema planu identifikacije.

7.4. Kontrola kvalitete Koristite pozitivne kontrole (R4 i R5) i negativne kontrole (R3) za svaku seriju testiranja radi potvrde analize. (Pogledajte §7.5)

7.5. Kriterij za validaciju testa Ovaj test je potvrđen ako su se poštovali donji uvjeti:

1) Za negativnu kontrolu R3: Izmjerena vrijednost apsorpcije mora biti manja od 60% od granične (cut-off) vrijednosti: O.D. < granična vrijednost x 0.6

2) Za pozitivnu kontrolu protutijela R4: 0,800 ≤ Srednja vrijednost O.D. R4 ≤ 2700 Ako se jedna od pojedinačnih vrijednost pozitivne kontrole R4 razlikuje za više od 30% od srednje vrijednosti, zanemarite tu vrijednost i ponovo izvršite kalkulaciju s dvije preostale vrijednosti pozitivne kontrole.

3) Za radnu otopinu R5:

O.D. > 0,500

7.6. Izračun/interpretacija rezultata Granična vrijednost (cut-off) određena je pomoću R4 pozitivne kontrole. Izračunajte srednju izmjerenu vrijednost apsorpcije za pozitivnu kontrolu R4. Izračunajte graničnu vrijednost:

Srednja vrijednost OD R4 CO = --------------------- 5

Prisutnost ili odsutnost anti-HCV protutijela i/ili HCV kaspidnog antigena je određena uspoređivanjem izmjerene apsorpcije prema izračunatoj graničnoj vrijednosti svakog uzorka. Sljedeći omjer izračunat je za svaki uzorak: Omjer = OD uzorka / CO vrijednost Uzorci s optičkom gustoćom manjom od granične vrijednosti smatraju se negativnima (omjer < 1) prema Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2.

10 [HR]

Rezultate malo ispod granične vrijednosti (CO-10 % < O.D. < CO, omjer između 0.9 i 1) treba interpretirati s oprezom. Preporučuje se ponovo testiranje u duplikatu odgovarajućih uzoraka kada to sustav i laboratorijski postupci dozvoljavaju. Uzorci čije su vrijednosti optičke gustoće jednake graničnoj vrijednosti ili veći od nje (omjer ≥ 1) smatraju se inicijalno pozitivnima prema Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Prije konačne interpretacije trebaju se ponovo testirati u duplikatu. Ako je nakon ponovnog testiranja vrijednost omjera barem jednog od 2 duplikata ista ili veća od 1, inicijalni rezultat je ponovljiv i uzorak se može proglasiti pozitivnim prema Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Ako je vrijednost omjera 2 duplikata manja od 1, inicijalni rezultat nije ponovljiv i uzorak se proglašava negativnim. Kod uzoraka koji su ponovo testirani dvaput i proglašeni negativnim pomoću Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, ali koji pritom pokazuju vrijednosti blizu granične vrijednosti (omjer između 0.9 i 1) treba biti oprezan. Preporučuje se ponovo testirati bolesnika primjenom druge metode ili testirati drugi uzorak. U slučaju da je optička gustoća testiranih uzoraka vrlo niska (negativan OD), a kontrolirana je prisutnost uzoraka i reagenasa, rezultati se mogu interpretirati kao negativni. Preporučuje se za potvrdu pozitivnih uzoraka slijediti trenutne nacionalne preporuke i algoritme.

7.7. Spektrofotometrijska verifikacija uzorka i pipetiranje konjugata (opcija)

Verifikacija pipetiranja uzorka i konjugata 1 (R6) Moguće je potvrditi prisutnost konjugata 1 (R6) + uzorka u jažici automatskim očitanjem pri 620 nm. Svaka jažica koja sadrži uzorak i konjugat 1 (R6) mora imati OD veći od 0,800. NAPOMENA: Nakon dodavanja uzorka, konjugat 1 (R6) postaje ljubičast do plav. Verifikacija pipetiranja konjugata 2 (R7) Konjugat 2 (R7) je zelene boje. Prisutnost konjugata 2 (R7) u jažici moguće je kontrolirati automatskim očitanjem pri 620 nm. OD vrijednost svake jažice mora biti veća od 0,300 (vrijednost ispod ove obično ukazuje na loše raspodjelu konjugata). Verifikacija pipetiranjem razvojne otopine Moguće je potvrditi prisutnost ružičaste razvojne otopine u otvoru automatskim očitanjem pri 490 nm. Jažica s razvojnom otopinom mora imati optičku gustoću veću od 0,100 (manja OD ukazuje na lošu raspodjelu razvojne otopine). Javlja se značajna promjena boje kod praznih jažica - od bezbojne do ružičaste nakon dodavanja pripremljene otopine kromogenog supstrata.

8. OGRANIČENJE TESTA

Obzirom na različite imunološke odgovore kod bolesnika zaraženih virusom hepatitisa C (posebice tijekom serokonverzije), mogu se uočiti neke razlike u detekciji između testova, ovisno o vrsti antigenih proteina koji se koriste. Negativan rezultat tijekom testiranja ne isključuje mogućnost izloženosti infekciji virusom hepatitisa C. Prema literaturi, nositelji HCV-a koji su podvrgnuti imunosupresivnom liječenju ili su zaraženi s HIV-HCV-om mogu imati izrazito niske razine protutijela, ispod granice otkrivanja HCV testova. Svaka ELISA tehnika može rezultirati lažno pozitivnim reakcijama. Preporučuje se provjeriti specifičnost reakcije svakog uzorka koji je kod ponovljenog testiranja bio pozitivan, u skladu s kriterijom interpretacije za Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 komplet, primjenom odgovarajuće metode: primjenom ELISA testiranja samo na anti-HCV protutijela ili primjenom imunoblot testa za otkrivanje anti-HCV protutijela kojima se potvrđuje prisutnost anti-HCV protutijela. Ako je potrebno, koristite molekularno biološki test za testiranje HCV genoma. Kolorimetrijska metoda provjere nanošenja uzoraka i/ili konjugata i/ili razvojne otopine ne dozvoljava provjeru točnosti raspodijeljenih volumena te samo otkriva prisutnost uzorka i/ili konjugata i/ili razvojne otopine. Učestalost krivih odgovora kod ove metode je usko povezana s točnošću korištenog sustava (kumulativni koeficijent varijacije raspodjele i očitavanja iznad 10% značajno smanjuju kvalitetu verifikacije). Uporaba Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testa nije odobrena za mješavine (pool) uzoraka ili razrijeđene uzroke. Iznimno se fine čestice mogu primijetiti kod diluenta uzorka (R6) - njihova prisutnost ni u kojem slučaju ne mijenja kvalitetu reagensa.

11 [HR]

9. KARAKTERISTIKE IZVEDBE

9.1. Mjerenje preciznosti

Reproducibilnost i srednja preciznost utvrđeni su pomoću uzoraka s različitim koncentracijama anti-HCV protutijela i HCV antigena. Uzorci su testirani 30 puta tijekom iste serije testova radi utvrđivanja ponovljivosti. Srednja preciznost ocijenjena je testiranjem duplikata uzoraka tijekom 20 dana u 2 nezavisna testiranja svaki dan. Izračunati su omjer, standardna devijacija i koeficijent varijacije (CV).

9.1.1. Ponovljivost

Uzorci N Srednja

vrijednost omjera

Standardna devijacija

CV %

Negativni S1 30 0,23 0,024 10,4

Pozitivni na HCV

antigen

S2 30 1,21 0,048 4,0

S3 30 1,43 0,053 3,7

S6 30 7,18 0,166 2,3

Pozitivni na anti-HCV

protutijela

S4 30 1,42 0,046 3,2

S5 30 1,35 0,083 6,1

S7 30 6,73 0,153 2,3

Koeficijenti varijacije (CV), dobiveni od 6 pozitivnih uzoraka, su <10%.

9.1.2. Srednja preciznost

Uzorci N

Srednja vrijed nost

omjera

Unutar testa (tzv. intra-

assay)

Unutar testa / operater

Unutar dana Ukupna

reproducibil nost

SD CV %

SD CV %

SD CV %

SD CV %

Negativni S1 80 0,22 0,017 7,5 0,028 12,5 0,029 12,7 0,043 19,4

Pozitivni na HCV antigen

S2bis 80 2,80 0,143 5,1 0,277 9,9 0,283 10,1 0,421 15,0

S3 80 1,56 0,124 7,9 0,129 8,2 0,083 5.3 0,197 12,6

S6 68 6,69 0,500 7,5 0,621 9,3 0,557 8,3 0,973 14,5

Pozitivni na anti-

HCV protutijel

a

S4 80 1,57 0,062 3,9 0,125 8,0 0* N/A 0,140 8,9

S5 80 1,75 0,075 4,3 0,164 9,3 0* N/A 0,181 10,3

S7 80 7,69 0,285 3,7 0,531 6,9 0* N/A 0,603 7,8

*: Vrijednost negativne varijance procijenjena je na 0.

Koeficijenti varijacije (CV) dobiveni od 6 pozitivnih uzoraka nisu veći od 15%.

9.2. Klinička izvedba

Izvedba testa Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 utvrđena je testiranjem uzoraka od slučajno odabranih davatelja krvi, hospitaliziranih bolesnika, bolesnika s akutnim i kroničnim infekcijama virusom hepatitisa C i od bolesnika s kliničkim znacima nevezanim s infekcijom virusom hepatitisa C. Ove studije provodile su se na 2 lokacije na kojima se darovala krv, u bolnici i u prostorima Bio-Rada.

9.2.1. Dijagnostička specifičnost

Ova studija provodila se na uzorcima seruma i EDTA plazme prikupljenim u 2 centra za davanje krvi od slučajno odabranih davatelja. Studija specifičnosti provedena je na uzorcima hospitaliziranih bolesnika. Svi uzorci su testirani s anti-HCV testom s CE oznakom.

12 [HR]

Populacija Lokacije Tip uzorka Broj Ponavljajući

reaktivni uzorci (RR)

Specifičnosti (%)

Interval pouzdanosti 95%

Davatelji krvi

#1 serum 537 1 536/537

plazma 2002 0 2002/2002

#2 serum 2638 2 2636/2638

#1 + #2 5177 3 99,94%

5174/5177 99.83% – 99.99%

Hospitalizirani pacijenti

#3 serum 502 1 99,80% 501/502

98.92% - 100.00%

*: 3 donora su bila neodređena pa je referentni test uklonjen iz izračuna.

9.2.2. Dijagnostička osjetljivost

Dijagnostička osjetljivost proučavana je na 575 uzorka bolesnika inficiranih virusom hepatitisa C. Između tih uzoraka 25 su dobivena od bolesnika kojima je uzorak uzet 24 sata prije analize. Testirani su uzorci s 481 različita genotipa (1; 2; 3; 4; 5; 6).

Tablica 1: Testirani genotipovi

Genotipovi 1 2 3 4 5 6 Ukup

no (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a,

2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c)

(4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r)

(5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n)

N 241 56 107 63 8 6 481

Dijagnostička osjetljivost svih testiranih uzoraka bila je 100% (575/575) s intervalom pouzdanosti 95% [99.4-100.0].

Uzorci bolesnika s akutnom infekcijom; 39 serokonverzijska panela (10 kapsidnih profila, 10 NS3 profila i 19 višestrukih profila) testirani su s Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 analizom i uspoređeni s kombiniranom analizom antigen/protutijela i s testom za anti-HCV protutijela, svaka sa CE oznakom. Vrijeme detekcije izmjereno je kod svih panela. Kod ovih 39 panela, test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 nije otkrio jedan panel, a tri nisu otkrivena kombiniranim Ag-Ab testom koji je proveden radi usporedbe. Kod 38 panela otkrivenih testom Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, u 5 je primijećena ranija detekcija, 27 je imalo istodobnu detekciju, 6 je imalo zakašnjelu detekciju u usporedbi s kombiniranim Ag-Ab testom. U usporedbi s testom anti-HCV protutijela, 28 panela je imalo raniju detekciju, 9 je imalo istodobnu detekciju i 1 je imao zakašnjelu detekciju.

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2

nasuprot kombiniranog Ag-Ab HCV testa

Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 nasuprot Anti-HCV testa

Broj panela 38 38

Ranija detekcija 5 28

Istodobna detekcija 27 9

Kasnija detekcija 6 1

9.3. Analitička specifičnosta / studija križne reaktivnosti

365 potencijalno interferirajuća uzorka koji sadrže protutijela protiv patogena koji mogu izazvati zarazne bolesti (citomegalovirus, Epstein Barr virus, VZV, virus ospica, virus rubeole, virus zaušnjaka, virus herpesa, virus gripe, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B , HIV 1/2, HTLV 1/2, sifilis, Toxoplasma gondii, Dengue, Chagas), uzorci iz rizične skupine (bolesnici na dijalizi, nehepatična ciroza, trudnice, višerotke) ili uzorci uzeti od bolesnika s premećajima imunog sustava (autprotutijela, reumatoidni faktori, anti-mišja protutijela i mijelomi), testirani su Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom.

13 [HR]

Za dva testa ponovoljno su dobiveni pozitivni rezultati testiranjem Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 testom. Primijećena specifičnost kod ove ciljane populacije od 99.45% (363/365) slična je specifičnosti kod kliničkih uzoraka.

9.4. Prozonski učinak (hook effect) Postojanje mogućeg prozonskog učinka proučavana je testiranjem 5 uzoraka s visokim titrom primjenom različitih razrjeđenja. Ujednačenost rezultata kod nerazrijeđenih i razrijeđenih uzoraka ukazuje na odsutnost prozonskog učinka.

10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE • Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T.

Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328–332.

• Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : 211-218.

• Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby A., Barp P.J., Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455.

• EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64.

• Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole–blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729.

• Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel), 2007, 127: 113-121.

• Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T., Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-HCV antibodies improves the early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): 3877-83.

• Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045.

• Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32.

• Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., Katlama C. and Thibault V. Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay : Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, 1561-1563.

• Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171.

• Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281.

14 [HR]

15 [HR]

16 [HR]

17 [HR]

18 [HR]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/09 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 862224 www.bio-rad.com