Monolisa™ HBs Ag ULTRA 1 plaat – 96 testi 72346 5 plaati – 480 testi 72348

KOMPLEKT HEPATIIT B VIIRUSE PINNAANTIGEENI AVASTAMISEKS INIMESE SEERUMIS VÕI PLASMAS IMMUNOENSÜÜMANALÜÜSI TEHNIKAGA

IVD Kasutamiseks In Vitro diagnostikas

Tootjapoolne kvaliteedikontroll Kõik toodetud ja turustatud reaktiivid läbivad täieliku kvaliteedikontrolli alates toorme hankimisest ja lõpetades toote lõpliku turuleviimisega. Iga partii läbib kvaliteedikontrolli ning see lubatakse müüki ainult nõuetele vastavuse korral. Iga partii valmimist ja kontrollimist kajastavaid dokumente säilitatakse meie ettevõttes.

4

SISUKORD

1 - SIHTOTSTARVE

2 - KLIINILINE VÄÄRTUS

3 - MONOLISA™ HBs Ag ULTRA KOMPLEKTI TÖÖPÕHIMÕTE

4 - MONOLISA™ HBs Ag ULTRA KOMPLEKTI KOOSTIS

5 - ETTEVAATUSABINÕUD

6 - TÖÖTERVISHOID JA TÖÖOHUTUS

7 - VAJALIKUD MATERJALID, MIS EI SISALDU KOMPLEKTIS

8 - REAKTIIVIDE ETTEVALMISTAMINE

9 - SÄILITUSTINGIMUSED – SÄILIVUSAEG

10 - PROOVIDE VÕTMINE JA KÄSITSEMINE

11 - ANALÜÜSI PROTSEDUUR

12 – SÜSTEEMI KOHANDAMINE

13 - TULEMUSTE ARVUTAMINE JA TÕLGENDAMINE

14 - PROOVI JA KONJUGAADI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE

KONTROLLIMINE

15 - OMADUSED

16 - TESTI PIIRANGUD

17 - VIITED

5

1 - SIHTOTSTARVE Monolisa™ HBs Ag ULTRA on üheetapiline „võileiva“ tehnikal põhinev immunoensüümanalüüs Hepatiit B viiruse (HBs Ag) pinnaantigeeni avastamiseks inimese seerumis või plasmas.

2 - KLIINILINE VÄÄRTUS HBs Ag avastamine seerumis viitab hepatiit B viiruse nakkusele. See on esimene märk mis ilmneb ja on märgatav 2 või 3 nädalat enne haiguse kliiniliste ja bioloogiliste sümptomite ilmnemist. Tema olemasolu periood võib olla väga lühike (mõni päev) või väga pikk (mõned aastad). HBs Ag püsimine seerumis rohkem kui 6 kuud tähendab „kroonilist hepatiiti“. Tänu mitmetele asümptomaatilistele kroonilistele kandjatele, esindab hepatiit B tähtsat transfusiooni riski ning ülekande ärahoidmine põhineb HBs Ag avastamisel iga vereannetuse käigus. Monolisa™

3 - Monolisa™ HBs Ag ULTRA KOMPLEKTI TÖÖPÕHIMÕTE Monolisa™ HBs Ag ULTRA on üheetapiline „võileiva“ tehnikal põhinev immunoensüümanalüüs, mis kasutab monoklonaalseid ja polüklonaalseid antikehasid, mis on välja valitud tänu oma võimele siduda end WHO poolt täna äratuntavate erinevate HBs Ag alatüüpidega ja enamuse erinevate HBV tüvedega.

Monolisa™ HBs Ag ULTRA tahke faas on kaetud monoklonaalsete antikehadega. Monolisa™ HBs Ag ULTRA konjugaadid põhinevad hiire monoklonaalsete ja kitse polüklonaalsete antikehade kasutamisel HBs Ag vastu. Nimetatud antikehad on seondunud peroksüdaasiga.

Analüüsi protseduur koosneb järgmistest etappidest: 1. Kontrollseerumi ja proovide jaotamine mikroplaadi kannudesse.

Seda jaotamist saab visuaalselt kontrollida : tühja kannu ja prooviga kannu värvuste vahe on selgesti eristatav. Nimetatud jaotamist saab kontrollida ka automaatselt lugemi abil 490/620-700 nm juures (valikuline).

2. Punase värvusega konjugaadi jaotamine kannudesse. Ka seda jaotamist on võimalik visuaalselt kontrollida: peale konjugaadilahuse lisamist muutub kannu värvus punaseks. Nimetatud jaotamist saab kontrollida ka automaatselt lugemi abil 490/620-700 nm juures (valikuline). Analüüsi selles etapis saab automaatselt lugemi abil 490/620-700 nm juures kontrollida ka proovi sadenemist.

3. Peale inkubeerimist 37ºC juures pooleteise tunni jooksul eemaldatakse seondumata konjugaat pesemise teel. 4. Värvitud substraadilahuse jaotamine kannudesse.

Seda jaotamist saab visuaalselt kontrollida : tühja kannu ja roosa värvusega substraadilahuse kannu värvuste vahe on selgesti eristatav. Nimetatud jaotamist saab kontrollida ka automaatselt lugemi abil 490/620-700 nm juures (valikuline).

5. Peale 30 minutilist inkubeerimist pimedas ja ruumitemperatuuril (18-30ºC) substraadi juuresolekul, ilmneb kompleksne konjugaat värvuse muutuse läbi.

6. Stopplahuse jaotamine. Seda jaotamist saab visuaalselt kontrollida : algselt roosa värvusega substraadilahus muutub mittereaktiivsete proovide kannudes värvusetuks ja positiivsete proovide kannudes sinisest kollaseks.

7. Optiliste tiheduste lugemine 450/620-700 nm juures ja tulemuste tõlgendamine.

6

4 - MONOLISA™ HBs Ag ULTRA KOMPLEKTI KOOSTIS

MÄRGIS

REAGENDI TÜÜP

VÄLJASTUSVORM 72346 72348

R1 MIKROPLAAT : 12 riba 8 kannuga, kaetud monoklonaalse anti-HBs antikehaga (hiire) 1 plaat 5 plaati

R2 KONTSENTREERITUD PESEMISLAHUS (20 X) : Tris NaCl puhver, pH 7.4 Säilitusaine: ProClin™ 300 (0.04%)

1 viaal 70 ml

1 viaal 235 ml

R3 NEGATIIVNE KONTROLL : BSA sisaldav Tris HCl puhver Säilitusaine: ProClin™ 300 (0.1%)

2 viaali 2 x 2.5 ml

2 viaali 2 x 2.5 ml

R4 POSITIIVNE KONTROLL (INIMESE) : BSA sisaldav Tris HCl puhver, millele on lisatud segu puhastatud HBs Ag alatüüpidest ad ja ay, Säilitusaine: ProClin™ 300 (0.1%)

1 viaal 2.5 ml

1 viaal 2.5 ml

R6

KONJUGAADI LAHJENDI: Tris HCl puhver, pH 7.4 sisaldab BSA, Tween®20, veise ja hiire immunoglobuliinid koos proovile lisatud kontrollreaktiiviga Säilitusaine: ProClin™ 300 (0.1%) Tsiprofloksatsiin (10µg /ml)

1 viaal 8 ml

2 viaali 2 x 18 ml

R7 KONJUGAAT : Peroksüdaasiga seondunud hiire monoklonaalsed ja kitse polüklonaalsed anti-HBs antikehad. Lüofiliseeritud.

1 viaal sqf 8 ml

2 viaali sqf 2 x 60ml

R8 SUBSTRAAT PUHVER : Sidrunhape ja naatriumatsetaadi lahus pH 4.0 sisaldab H202 (0.015%) ja DMSO (4%)

1 viaal 60 ml

2 viaali 2 x 60 ml

R9 ROOSA VÄRVUSEGA KROMOGEEN: Tetrametüülbensidiini (TMB) sisaldav lahus.

1 viaal 5 ml

2 viaal 2 x 5 ml

R10 STOPPLAHUS: 1 N väävelhappe lahus

1 viaal 28 ml

3 viaali 3 x 28 ml

5 – ETTEVAATUSABINÕUD Tulemuste usaldusväärsus sõltub hea laboritava nõuete järgimisest:

• Testi nimetus, samuti ka testi spetsiifiline identifitseerimisnumber on märgitud iga mikroplaadi raamile. See spetsiifiline ID number on märgitud ka igale ribale.

Monolisa HBsAg Ultra: Spetsiifiline ID number = 51 Veenduge spetsiaalse ID numbri olemasolus enne kasutamist. Kui ID number puudub või on erinev ülalmärgitud numbrist, ei tohi seda riba kasutada.

• Ärge kasutage aegunud reaktiive. • Ärge kasutage analüüsi käigus erinevatest partiidest pärinevaid reaktiive.

MÄRKUS: Pesemislahus (R2, märgistus sildil: 20X, roheline), peroksüdaasi puhverdatud substraat (R8, märgistus sildil: TMB puhv, sinine), kromogeen (R9, märgistus sildil: TMB 11x, purpurpunane) ja stopplahus (R10, märgistus sildil: 1N, punane) võib kasutada ka teisest partiist pärinevaid reaktiive, kui neid kasutatakse ühe analüüsi käigus. Mainitud reaktiive võib kasutada koos mõnede teiste meie firma toodetega. Lisaks võib pesemislahust (R2, märgistus sildil: 20X, roheline) segada kahe teise pesemislahusega, mis sisalduvad erinevates Bio-Rad testkomplektides (R2, märgistus sildil: 10X, sinine või 10X, oranž), kui nad on korrektselt lahjendatud, eeldades, et sama segu kasutatakse ühe testi piires. Detailsema informatsiooni saamiseks võtke ühendust meie tehnilise teenindusega. • Enne kasutamist lasta reaktiividel toatemperatuuril 30 minutit stabiliseeruda ja üks tund lahjendatud pesupuhvril

R2. • Lahustage reaktiivid hoolikalt, vältides saastumist. • Ärge viige analüüsi läbi keskkonnas, kus leidub reaktiivseid aure (happelised, aluselised, aldehüüdide aurud) või

tolmu, mis võib muuta konjugaadi ensümaatilist aktiivsust. • Kasutage klaasnõusid, mis on deioniseeritud veega hoolikalt läbi pestud ja loputatud või mis veelgi parem,

kasutage ühekordseid vahendeid. • Ärge laske pesemise ja reaktiivi jaotamise vahelisel ajal mikroplaadil ära kuivada.

7

• Ensüümreaktsioon on väga tundlik metalliioonide suhtes. Seetõttu vältige erinevate konjugaadi või substraadi lahuste kokkupuudet metallesemetega.

• Ilmutuslahus (puhverdatud substraat + kromogeen) peab olema roosa värvusega. Roosa värvuse muutumine mõne minuti jooksul peale lahuse valmistamist näitab, et reaktiivi ei saa kasutada ning see tuleb asendada. Ilmutuslahust võib valmistada puhtas ühekordselt kasutatavas plastvannis või klaasmahutis, mida on eelnevalt pestud 1N HCL-ga, hoolikalt loputatud destilleeritud veega ning kuivatatud. Nimetatud reaktiivi tuleb säilitada pimedas.

• Kasutage iga proovi jaoks uut pipetiotsikut. • Pesemine on konkreetse protseduuri kriitiline etapp: jälgige soovituslikku pesutsüklite arvu ja vaadake, et kõik

kannud oleksid täielikult täidetud ja hiljem täielikult tühjendatud. Ebakorrektne pesemine võib viia ebatäpsete tulemusteni.

• Ärge kunagi kasutage konjugaadi ja ilmutuslahuse valmistamiseks sama mahutit. • Kontrollige pipettide ja teiste seadmete täpsust ja töökorras olekut. • Ärge muutke analüüsi protseduuri.

6 - TÖÖTERVISHOID JA TÖÖOHUTUS • Kõik komplektis sisalduvad reaktiivid on mõeldud kasutamiseks „in vitro diagnostikas“. • Reaktiivide ja proovide käsitsemisel kandke ühekordselt kasutatavaid kindaid ning nende käsitsemise järgselt

peske hoolikalt käsi. • Ärge pipeteerige suuga. • Positiivne kontroll R4 sisaldab puhastatud HBs Ag, mis on pärit lisandunud ja olemasolevatest alatüüpidest,

valmistatud koos anti-HCV, anti-HIV1 ja anti-HIV2 antikehade suhtes negatiivse inimese plasmaga ja termiliselt inaktiveeritud.

• Ükski tuntud testimismeetod ei anna täielikku kindlust, et puuduvad nakkusetekitajad, käsitsege reaktiive ja patsientide proove justkui suudaksid nad edasi anda nakkavat haigust.

• Materjalid, mis puutuvad otseselt kokku proovidega, inimpäritoluga reaktiividega ning ka pesulahusega tuleb pidada saastunuks ning neid vastavalt käsitleda.

• Vältige proovide või proove sisaldavate lahuste üle ääre loksutamist. • Saastunud pinnad tuleb puhastada 10% pleegitiga. Kui maha valgunud vedelikuks on hape, tuleb saastunud

pinnad esmalt neutraliseerida naatriumbikarbonaadiga, seejärel puhastada pleegitiga ja kuivatada kuivatuspaberiga. Puhastamisel kasutatud materjalid tuleb visata ohtlikke jäätmete mahutisse.

• Inimpäritoluga reaktiivid, proovid, samuti ka saastunud materjalid ja tooted tuleb enne ära viskamist dekontamineerida: - kas asetades need 30 minutiks 5% lõppkontsentratsiooniga naatriumhüpokloriti (1 mahuosa pleegitit 10

mahuosa saastunud vedeliku või vee kohta) lahusesse - või autoklaavides temperatuuril 121ºC vähemalt 2 tundi. Autoklaavimine on parim meetod HIV ja HBV viiruste

inaktiveerimiseks. - ÄRGE ASETAGE NAATRIUMHÜOKLORITIT SISALDAVAID VEDELIKKE AUTOKLAAVI

• Ärge unustage enne kraanikaussi kallamist neutraliseerida ja/või autoklaavida pesemisest ülejäänud lahuseid ja bioloogilist materjali sisaldavaid vedelikke.

• Ohutuskaart on soovi korral kättesaadav. • Kemikaale tuleb käsitseda ja hävitada vastavuses hea laboritava nõuetega. • Vältige puhverdatud substraadi, kromogeeni ja stopplahuse kokkupuudet naha ja limaskestadega (toksiline,

ärritav ja põletav toime).

• Mõned reagendid sisaldavad ProClin™ 300 (0.04%, 0.1% ja/või 0.5%) Xi ärritav R43 : võib nahaga kokkupuutel põhjustada sensibilisatsiooni. S28-37: Pärast vahetut kontakti peske nahka otsekohe suure hulga seebi ja veega. Kandke vastavat kaitseriietust.

• Ohutuskaart väljastatakse nõudmisel.

8

7 - VAJALIKUD MATERJALID, MIS EI SISALDU KOMPLEKTIS • Destilleeritud vesi. • Naatriumhüpoklorit (pleegiti) ja naatriumbikarbonaat. • Automaatsed või poolautomaatsed reguleeritavad, eelseadistatud või mitmekanalilised pipetid mahuga 50 µl,

100µl, 1000 µl ja 10 ml. • Gradueeritud silindrid mahuga 10 ml, 1000 ml. • Mahuti nakkusohtlike jäätmete hoidmiseks. • Vesivann või mikroplaadi inkubaator, termostateeritud 37ºC ± 1ºC juurde (*). • Manuaalne, poolautomaatne või automaatne mikroplaadi pesemise süsteem (*). • Mikroplaadi lugeja varustatud 450, 490 nm ja 620-700 nm filtritega (*). • Kuivatuspaber

(*) Konsulteerige meiega detailse info saamiseks meie tehnikaosakonna poolt soovitatavate seadmete kohta. 8 - REAKTIIVIDE ETTEVALMISTAMINE

MÄRKUS: Enne kasutamist laske reaktiividel soojeneda toatemperatuurini (18-30ºC)

1) Kasutusvalmis reaktiivid Reaktiiv 1 (R1): Mikroplaat

Iga alus, mis sisaldab 12 riba on pakitud sulguriga fooliumkotti. Lõigata kott kääride või skalpelli abil katki 0.5 – 1 cm sulgurist ülevalpool. Avada kott ja võtta alus välja. Kasutamata jäänud ribad asetada tagasi kotti. Sulgeda kott ettevaatlikult ning asetada tagasi +2-8ºC juurde.

Reaktiiv 3 (R3): Negatiivne kontroll Reaktiiv 4 (R4): Positiivne kontroll Reaktiiv 10 (R10): Stopplahus

2) Ettevalmistamist vajavad reaktiivid Kontsentreeritud pesemislahus (20x): Reaktiiv 2 (R2) :

Lahjendage destilleeritud veega vahekorras 1:20, et saavutada kasutamiseks valmis pesulahus. 12 ribaga plaadi jaoks kulub 800 ml.

Konjugaadi töölahus (R6 + R7) : Koputage õrnalt lüofiliseeritud konjugaadi (R7) viaali vastu töölauda, et eemaldada kummikorgi küljest kogu materjal. Eemaldage ettevaatlikult kork ja valage konjugaadi lahjendi (R6) viaali sisu lüofiliseeritud konjugaadi (R7) viaali. Pange kork tagasi peale ja jätke 10 minutiks seisma aeg-ajalt õrnalt segades, et lihtsustada lahustumist.

Ensüümi ilmutuslahus: Reaktiiv 8 (R8) + Reaktiiv 9 (R9) Lahustage kromogeen (R9) puhverdatud substraadis (R8) vahekorras 1:11 (nt.: 1 ml reaktiivi R9+10 ml reaktiivi R8). Valmissegatud lahus püsib pimedas ruumis stabiilsena 6 tundi.

9 - SÄILITUSTINGIMUSED – SÄILIVUSAEG Säilitage komplekti temperatuuril + 2 - 8°C. Säilitades antud temperatuuril, saab kõiki komplektis sisalduvaid reagente kasutada kuni pakendile märgitud aegumistähtajani (väljaarvatud erandjuhtudel). R1: Peale vaakumiga sulgurkoti avamist, saab temperatuuril +2-8ºC ja hoolikalt suletud pakendis säilitatud mikroplaadi ribasid kasutada 1 kuu jooksul. R2: Lahjendatud pesulahust saab +2-30ºC juures säilitada 2 nädalat. Kontsentreeritud pesulahust (R2) saab säilitada +2-30ºC juures. R6 + R7: Peale valmistamist saab +2-8ºC juures säilitatavaid reaktiive kasutada 1 kuu jooksul ja 8 tunni jooksul, kui säilitatakse ruumitemperatuuril (18-30ºC). R8 + R9: Peale lahuse valmistamist saab reaktiivi, mida hoitakse pimedas, kasutada ruumitemperatuuril (18-30oC) 6 tunni jooksul

10 - PROOVIDE VÕTMINE JA KÄSITSEMINE

Võtke vereproov vastavalt tavadele. Analüüsi tuleks läbi viia lahjendamata seerumi või plasmaga (kogutud EDTA, hepariini, tsitraadi, ACD-põhiste antikoagulantidega). Hemolüüsi vältimiseks eraldage seerum või plasma hüübest või punalibledest võimalikult kiiresti. Ulatuslik hemolüüs võib testi läbiviimist raskendada. Proove, milles leidub silmaga nähtavaid osakesi, tuleks enne analüüsi tsentrifuugida. Hõljuvad fibriini kogumid või osakesed võivad põhjustada valepositiivsete tulemuste saamist. Kui analüüs viiakse läbi 7 päeva jooksul võib proove säilitada +2-8ºC juures, vastasel juhul tuleb need sügavkülmutada -20ºC juures. Vältige proovide korduvat sulatamist/külmutamist. Proove mida on külmutatud ja sulatatud rohkem kui 3 korda ei tohi kasutada. Kui proove on vaja transportida, tuleb need pakendada vastavalt etioloogiliste tegurite transportimise vallas kehtivatele seadustele. ÄRGE KASUTAGE SAASTUNUD, HÜPERLIPEEMILIST VÕI HÜPERHEMOLÜSEERUNUD SEERUMIT EGA PLASMAT. MÄRKUS: Kui proovid sisaldavad kuni 90 g/l albumiini, 100 mg/l bilirubiini, lipeemilised proovid sisaldavad kuni 36 g/l triglütseriidi ning hemolüseerunud proovid sisaldavad kuni 1 g/l hemoglobiini, ei mõjuta see analüüsi tulemusi.

9

11 - ANALÜÜSI PROTSEDUUR

Järgige rangelt ettekirjutatud protseduuri. Kasutage iga seeria jaoks negatiivseid (R3) ja (R4) positiivseid kontrolle, et olla kindel testi tulemustes.

Järgige hea laboritava reegleid: 1. Planeerige hoolikalt proovide jaotamine ja identifitseerimine. 2. Valmistage lahjendatud pesemislahus (vt lõik 8). 3. Valmistage konjugaat R6+R7 töölahus (vt lõik 8). 4. Võtke ribahoidik ja vajalik arv ribasid (R1) kaitsvast kotist välja. Kasutamata jäänud ribad asetage tagasi kotti ja

sulgege see. 5. Jaotage kannudesse nimetatud järjekorras (soovituslik mikroplaadile jaotamine) : • Kannudesse A1, B1, C1 ja D1 : 100 µl negatiivset kontrolli (R3) • Kannu E1 : 100 µl positiivset kontrolli (R4) • Kannu F1 : 100 µl esimest tundmatut proovi, kui seda kannu ei kasutata kontrollkannuna proovi ja konjugaadi

sadenemise hindamiseks (valikuline) • Kannudesse G1, H1, …jne : 100 µl tundmatut proovi. Sõltuvalt kasutatavast süsteemist saab kontrollide asukohta või väljajagamise järjekorda muuta. NB: Proovi jaotamist on analüüsi selles etapis võimalik visuaalselt kontrollida : prooviga kannu ja tühja kannu värvuste vahe on selgesti märgata (vaata lõik 14 automaatseks kontrollimiseks).

6. Jaotage kannudesse kiiresti 50 µl konjugaadi lahust (R6 + R7), enne kasutamist tuleks konjugaadi lahust õrnalt loksutada. Homogeniseerige reaktsioonisegu. NB : Proovi ja ka konjugaadi jaotamist on analüüsi selles etapis võimalik visuaalselt kontrollida : Punase värvusega konjugaadilahust (R6 + R7) on menetluse selles etapis võimalik visuaalselt kontrollida (vaata lõik 14 automaatseks kontrollimiseks).

7. Kui võimalik, katke mikroplaat uue kleepkilega ja inkubeerige 1 tund 30 ± 5 minutit 37ºC ± 1ºC juures. 8. Eemaldage kleepkile, aspireerige kõigi kannude sisu ja peske vähemalt 5 korda. Jäätme maht peab olema

väiksem kui 10 µl (vajadusel kuivatage mikroplaat, asetades see ümberpööratuna kuivatuspaberile). 9. Lisage kannudesse kiiresti 100 µl vahetult enne kasutamist valmistatud ilmutuslahus (R8 + R9). Laske

reaktsioonil kulgeda 30 ± 5 minutit ruumitemperatuuril (18-30ºC). Ärge kasutage inkubatsiooni käigus kleepkilet. N.B. : Roosa värvusega ilmutuslahuse jaotamist on analüüsi selles etapis võimalik visuaalselt kontrollida : tühja kannu ja roosat substraadilahust sisaldava kannu värvuste vahe on selgesti eristatav. (vaata lõiku 11 automaatseks kinnitamiseks : PROOVI JA REAKTIIVI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE KONTROLLIMINE)

10. Lisage 100 µl stopplahust (R10) kasutades jaotamisel sama sagedust ja kiirust nagu substraadilahuse puhul. Homogeniseerige reaktsioonisegu. N.B.: Värvitu stopplahuse jaotamist on analüüsi selles etapis võimalik visuaalselt kontrollida. Peale stopplahuse lisamist kaob substraadilahuse roosa värvus (negatiivsete proovide puhul) või värvub sinisest kollaseks (positiivsete proovide puhul).

11. Pühkige ettevaatlikult plaadi põhi. Vähemalt 4 minutit peale stopplahuse lisamist ja 30 minuti jooksul reaktsiooni peatamisest lugege optiline tihedus 450/620-700 nm juures kasutades plaai lugejat.

12. Peale tulemuste lugemist kontrollige spekrofotomeetrilise ja visuaalse lugemise ja plaadi ning proovi jaotamise vahelist kokkulangevust identifitseerimisplaaniga.

12 – SÜSTEEMI KOHANDAMINE • PESEMINE : Parimate tulemuste saavutamiseks järgige hoolikalt kirjeldatud pesemise protseduuri. Mõnede

seadmete puhul tuleb pesemise protseduuri optimeerida (suurendada peutsüklite arvu ja/või pesemispuhvri mahtu), et saavutada negatiivse proovi jaoks piisav OD tausta tase. Spetsiaalsete protseduuride ja muganduste osas võtke ühendust meie firmaga.

10

13 - TULEMUSTE ARVUTAMINE JA TÕLGENDAMINE 1) Negatiivse kontrolli keskmise optilise tiheduse arvutamine : OD R3

Näide Negatiivne kontroll R3 OD 1 0.030 2 0.031 3 0.032 4 0.027 Kogu R3 OD = 0.120

Kogu R3 OD /4 = 0.030 = keskmine OD R3 2) Piirväärtuse arvutamine

Iga meetodi puhul on piirväärtus võrdne : OD R3 + 0.050

Näide : OD R3 = 0.030 Piirväärtus = 0.030 + 0.050 = 0.080 3) Testi kehtivustingimused

Kõik negatiivse kontrolli väärtused peavad olema väiksemad või võrdsed 0.080 optilise tiheduse ühikuga. Positiivse kontrolli väärtus (OD R4) peab olema suurem või võrdne 1.000. Kui üks negatiivse kontrolli väärtus ei vasta antud normidele või on 40% üle negatiivse kontrolli keskmise

väärtuse (OD R3), jätke selline väärtus kõrvale ja arvutage keskmine uuesti kasutades järele jäänud kolme väärtust. Kõrvale võib jätta vaid ühe väärtuse. Test tuleb sooritada uuesti, kui kõik kontrolli väärtused on alla nimetatud normi.

4) Proovi suhtarvu arvutamine Arvutage suhtarv iga proovi jaoks :

Suhtarv =

5) Tulemuste tõlgendamine Proovid, mille suhtarvu väärtused on madalamad kui 1 loetakse Monolisa™ HBs Ag ULTRA kontekstis negatiivseteks. Tulemused, mis on pisut alla piirväärtust (proovi suhtarv vahemikus 0.9 kuni 1) tuleks tõlgendada ettevaatlikkusega. Nimetatud proovid on soovitatav kahes korduses uuesti testida kui süsteemid ja labori protseduurid seda võimaldavad. Proovid, mille suhtarvud on võrdsed või suuremad kui 1 loetakse Monolisa™ HBs Ag ULTRA kontekstis algselt positiivseteks. Enne lõplikku tõlgendamist tuleks proovid kahes korduses uuesti analüüsida. Kui peale kordusanalüüsi on 2 korduse suhtarvud väiksemad kui 1 ei ole algne tulemus korratav ja proov loetakse Monolisa™ HBs Ag ULTRA kontekstis negatiivseks. Kui peale kordusanalüüsi on vähemalt ühe proovi suhtarv 2 kordusest võrdne või suurem kui 1 on algne tulemus korratav ja proov loetakse Monolisa™ HBs Ag ULTRA testi kontekstis positiivseks, allub protseduuri piirangutele, kirjeldatud allpool. Proovid, mida on testitud kaks korda ja mis on olnud Monolisa™ HBs Ag ULTRA testiga negatiivsed, kuid üks väärtus on piirväärtusele lähedal (suhtarv 0.9 ja 1 vahel) tuleks arvestada ettevaatlikkusega. Soovitatav on testida patsienti mõne teise meetodiga või teise proovi põhjal. Et kontrollida reaktsiooni spetsiifilisust tuleks iga positiivne tulemus, mis on vastavuses Monolisa™ HBs Ag ULTRA tõlgendamis kriteeriumitega kinnitada HBs Ag neutralisatsiooni meetodiga. Mittekorduvad reaktsioonid on sageli põhjustatud : • ebakorrektsest mikroplaadi pesemisest, • negatiivsete proovide saastumisest kõrge kontsentratsiooniga HBs Ag seerumi või plasmaga, • substraadilahuse saastumisest oksüdeeruvate agentidega (pleegiti, metalliioonid, jne…), • stopplahuse saastumisest.

11

14 - PROOVI JA KONJUGAADI PIPETEERIMISE SPEKTROFOTOMEETRILINE KONTROLLIMINE - Proovi ja konjugaadi pipeteerimise kontrollimine : 1) Proovi pipeteerimise kontrollimine.

Proovide olemasolu kannus enne konjugaadi jaotamist on võimalik kontrollida automaatse lugemi abil 490/620-700 nm juures : prooviga kannu optiline tihedus peab olema vahemikus 0.050 kuni 0.900. Tühja kannu ja õrnalt kollaka värvusega proovi sisaldava kannu värvuste vahe on selgest eristatav.

2) Konjugaadi pipeteerimise kontrollimine. Kui proovi olemasolu kannus on kontrollitud nagu eelpool mainitud, saab konjugaadi lisamist kontrollida automaatse lugemi abil 490/620-700 nm juures : konjugaati ja proovi sisaldava kannu optiline tihedus on suurem kui 1.100. Õrnalt kollaka värvusega proovi sisaldava kannu värv muutud peale konjugaadi lisamist punaseks.

3) Proovi ja konjugaadi kannus olemasolu üheaegne kontrollimine. (Ainult spektrofotomeetriline kontrollimine). Kui proovi olemasolu ei ole kontrollitud automaatse lugemi abil nagu eelpool mainitud võib proovi ja konjugaadi olemasolu kannus kontrollida automaatse lugemi abil 490/620-700 nm juures, kui on ainult konjugaati sisaldav kann. Nende optiliste tiheduste delta peab olema suurem kui 0.35 490/620-700 nm juures. [DO (proov + konjugaat) - ainult konjugaadi DO] ≥ 0.35

- Ilmutuslahuse pipeteerimise kontrollimine : Roosa värvusega ilmutuslahuse olemasolu kannus on võimalik kontrollida automaatse lugemi abil 490 nm juures : ilmutuslahusega kannu optiline tihedus peab olema suurem kui 0.100 (madalam OD viitab ilmutuslahuse kehvale jaotamisele).

15 - OMADUSED Monolisa™ HBs Ag ULTRA testi omadused on kindlaks määratud testides proove juhuslikelt veredoonoritelt, akuutse ja kroonilise hepatiit B nakkusega kliinilistelt patsientidelt või hepatiit B nakkusega mitteseotud haigustega patsientidelt ning kaubanduslike proovide ja serokonversiooni paneelidega. Tundlikkuse piire testiti kasutades Prantsuse SFTS paneele ja WHO standardeid.

Spetsiifilisus Spetsiifilisus 3 erinevast kohast pärineval 9894 veredoonoril leiti olevat 99.94% (9887/9893). Üks korratud reaktiivne proov kinnitati positiivseks hepatiit B pinnanatigeeni suhtes. Spetsiifilisuse uuringud viidi läbi kliinilises laboratooriumis (Hepatoloogia Keskus) 200 testitud proovist, olid 2 proovi korduvalt reaktiivsed (üks oli algselt kaheldav, suhtarv = 0.97), korduvalt positiivne 1.87 juures, teised olid suhtarvudega 2.29 ja 1.99. Monolisa™ HBs Ag ULTRA komplektiga testiti 289 erinevate patoloogiatega või hepatiit B mitteseotud seisundiga (rasedad naised, reumatoid faktor, tuumavastased antikehad, hiirevastane Ig või teised viiruselised või bakteriaalsed infektsioonid) patsientide proove. 11 korduvalt reaktiivset proovi kontrolliti kommertsiaalse EIA testiga ja neutralisatsiooni analüüsiga. 10 Monolisa™ HBs Ag ULTRA komplektiga korduvalt positiivset proovi 11-st olid positiivsed ka kommertsiaalse HBs Ag analüüsiga. Üks proov, mis osutus neutralisatsiooni analüüsiga tõlgendamatuks jäeti lõplikust arvutusest välja : 2 proovi ei neutraliseeritud; üks oli pärit HSV IgG proovist ja üks müeloomi proovist; proov mis oli positiivne ka kommertsiaalse EIA analüüsiga, andis lõpliku spetsiifilisuse 99.28% (276/278). 9 teist positiivset HSV IgG proovist ja müeloomi proovid olid Monolisa™ HBs Ag ULTRA testiga negatiivsed.

Analüütiline tundlikkus Testi tundlikkuse piir on alla 0.060 ng/ml Prantsuse SFTS 2001 HBs antigeeni paneeliga hindamisel ja alla 0.050 IU/ml WHO standardiga. Järgnevad SFTS 2001 paneeli alatüübid : adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5 ja ayr leiti Monolisa™ HBs Ag ULTRA komplektiga kõik positiivsed olevat, suhtarvuga üle 5.

Tundlikkus Tundlikkuse uuringud viidi läbi 428 positiivse prooviga kroonilise või akuutse HBV nakkusega patsientide järelravist, mis näitasid tundlikkust 100%. Paneeli 15 rekombinantse valguga, mis jäljendavad põhilisi mutatsioone HBs antigeeni aminohappe järjestustes, testiti ja kõik avastati Monolisa™ HBs Ag ULTRA komplektiga. Uuriti ka kokku 60 hästi dokumenteeritud kommertsiaalset HBV serokonversioon paneeli (293 proovi) ja võrreldi turul saada oleva EIA analüüsiga. Bio-Rad HBs Ag Ultra annab Monolisa HBs Ag Plus analüüsiga võrreldavaid tulemusi 29 paneeli ulatuses. Bio-Rad HBs Ag Ultra on tundlikum ühe proovi osas varasema 28 paneeli ulatuses, 2 proovi osas 2 paneeli ulatuses ja 5 proovi osas 1 paneeli ulatuses. Uuriti 25 värsket positiivset lisaproovi (1 päeva jooksul peale verevõtmist) ja kõik andsid positiivse tulemuse.

12

Analüütiline korratavus Monolisa™ HBs Ag ULTRA testi korratavus on kindlaks määratud 4 proovi analüüsimisega : 1 negatiivne proov, 2 HBs Ag positiivset proovi (proovid 2 ja 3) ja 1 tugevalt HBs Ag positiivne proov. Analüüsisisest korratavust on hinnatud testides neid 4 proovi 30 korda sama analüüsi käigus, analüüsidevahelist tundlikkust on hinnatud testides neid 4 proovi kahes korduses 20 päeva jooksul 2 iseseisva analüüsi käigus iga päev. Tulemused on näidatud järgnevates tabelites :

Tabel 1 : Analüüsisisene korratavus n = 30 proov 1 proov 2 proov 3 proov 4

suhtarvude keskmine 0.38 3.17 8.92 14.63

standardhälve (SD) 0.04 0.12 0.34 0.91 CV (%) suhtarvud 10.59 % 3.83 % 3.77 % 6.19 %

Tabel 2 : Analüüsidevaheline korratavus n = 40 proov 1 proov 2 proov 3 proov 4

suhtarvude keskmine 0.48 3.06 8.02 13.85

standardhälve (SD) 0.087 0.251 0.751 1.471 CV (%) suhtarvud 18.1 % 8.2 % 9.36 % 10.63 %

16 - TESTI PIIRANGUD

• Negatiivne tulemus viitab asjaolule, et proov ei sisalda Monolisa™ HBs Ag ULTRA testiga detekteeritavat HBs Ag. Kuigi tänu väga madalale tiitrile ei suudetud HBs Ag avastada, ei välista sellised tulemused hepatiit B viiruse infektsiooni ilmnemist.

• Sõltuvalt kasutatud seadmest (pesija, lugeja, automaatne seade) võib esineda kergeid omaduste kõikumisi. • Mitmed autorid on kirjeldanud B viirushepatiiti (ägedat või kroonilist), kus viiruse DNA on määratav

pinnaantigeeni puudumisel (HBs Ag negatiivsed patsiendid). Kuigi haruldased, on need ebanormaalsed profiilid geenmutatsiooni tulemused, kas S või pre-S geeni tasemel (väldivad immunoloogiliste reaktiivide poolt Ag äratundmist) või tavaliselt X ja pol geeni tasemel, indutseerides nõrka viiruse replikatsiooni. Nende erijuhtude lõplikuks diagnoosimiseks on soovitav lisamarkerite testimine (HBsAg-spetsiifilised antikehad või võimalusel amplifitseeritud viiruse DNA).

• Et määrata kindlaks reaktsiooni spetsiifilisust, tuleks iga positiivne tulemus (vastavuses Monolisa™ HBs Ag ULTRA tõlgendamiskriteeriumitega) kinnitada HBs Ag neutralisatsiooni meetodiga (Monolisa™ HBs Ag kinnitav test näiteks, kood 72408)

• Kolorimeetriline meetod proovide ja konjugaadi ja ilmutuslahuse sadestumise kontrollimiseks ei võimalda kindlaks teha mõõdetud koguste täpsust. See meetod näitab ainult proovi ja konjugaadi olemasolu kannudes. Valede vastuste sagedus nimetatud meetodi kasutamisel on tihedalt seotud kasutatava süsteemi täpsusega (kumulatiivne jaotumise ja mõõtmise variatsioonikoefitsent, mis ületab 10%, vähendab oluliselt kontrollimise kvaliteeti).

• Väga ebaefektiivse pesemise korral peale konjugaadi inkubeerimist, võib ilmutuslahuse pipeteerimise automaatne kontrollimine (lugedes kannude OD 490 nm juures) anda valesid tulemusi OD alla 0.100 ilmutuslahuse puudumisel. Siiski ei ole eelpool mainitud fenomeni täheldatud 939 testitud proovi puhul.

13

17 - VIITED 1. COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag : a study of their specificities for eight different HBs subtypes. Developments in Biological Standardization, 54, 527-534. 2. COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983) Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, 197-211. 3. DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D., (1981) Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, 341-.348. 4. DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981) Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited by Szmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, 706. 5. FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983) Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, 135-142. 6. LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and their utilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium on Monoclonal Antibodies : Paris, France. 7. SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983) Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, 353-358). 8. WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981) Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci., 78, 2, 1214-1218. 9. M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'Ag HBs (1985). Nouvelle Revue Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134. 10. J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985) Nouveaux réactifs de dépistage de l'Ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-HBs. Nouvelle Revue Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134.

14

15

Bio-Rad3, bd Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette - FranceTél.: +33 1 47 95 60 00 06/2011Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 883614