MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS …
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“MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS EN EL CRECIMIENTO DE E. coli Y S. cerevisiae Y LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO EN Pseudomonas sp Y Bacillus sp, DE USO INDUSTRIAL” SANDRA JOHANA HERNÁNDEZ JIMÉNEZ Cód. 1.088.288.470 ESTEFANIA LUCERO DOMÍNGUEZ TORO Cód. 1.088.293.270 UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA TECNOLOGIA QUÍMICA PEREIRA, RISARALDA 2014
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“MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS EN EL
CRECIMIENTO DE E. coli Y S. cerevisiae Y LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR
FÓSFORO EN Pseudomonas sp Y Bacillus sp, DE USO INDUSTRIAL”
SANDRA JOHANA HERNÁNDEZ JIMÉNEZ
Cód. 1.088.288.470
ESTEFANIA LUCERO DOMÍNGUEZ TORO
Cód. 1.088.293.270
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGIA
TECNOLOGIA QUÍMICA
PEREIRA, RISARALDA
2014
“MONOGRAFÍA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNÉTICOS EN EL
CRECIMIENTO DE E. coli Y S. cerevisiae Y LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR
FÓSFORO EN Pseudomonas sp Y Bacillus sp, DE USO INDUSTRIAL”
SANDRA JOHANA HERNÁNDEZ JIMÉNEZ
Cód. 1.088.288.470
ESTEFANIA LUCERO DOMÍNGUEZ TORO
Cód. 1.088.293.270
Proyecto de Grado Modalidad Monografía presentado como requisito final
para optar al título de Tecnóloga Química
Director de Trabajo de Grado
Luis Gonzaga Gutiérrez
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGIA
TECNOLOGIA QUÍMICA
PEREIRA, RISARALDA
2014
Nota de aceptación
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____________________________
Presidente del Jurado
AGRADECIMIENTOS.
A nuestros padres y hermanos por su apoyo incondicional, al brindarnos
comprensión, recursos, tiempo, paciencia y amor. Por estar en los momentos más
difíciles de nuestra vida estudiantil y animarnos con sus palabras de aliento.
A nuestro Director Luis Gonzaga Gutiérrez por tan valiosa ayuda en la búsqueda
de alcanzar la meta. Por ofrecernos su tiempo y asesoría en el momento que
necesitábamos con paciencia. Por darnos la oportunidad de trabajar con él y
adquirir nuevos conocimientos. Al profesor Fernando Areiza por su contribución a
la monografía.
A todos nuestros amigos, por permitirnos pasar momentos felices a su lado,
aprender y recordar con cariño nuestro paso por la Universidad Tecnológica de
Pereira.
GLOSARIO.
- Absorvancia: Medida de la intensidad de luz que absorbe la muestra a una
longitud de onda establecida.
- Antígeno: Sustancias como proteínas y polisacárido que desencadenan la
formación de anticuerpos.
- ATP: El trifosfato de adenosina es una fuente energética necesaria para
todas las formas de trabajo biológico.
- Campo magnético: Cargas con movimiento, paralelo a una corriente
producida por otras cargas y que experimenta una fuerza perpendicular a
su propia velocidad.
- Carga microbiana: Número de microorganismos viables presentes en un
elemento determinado.
- Célula fotoeléctrica: Ánodo y cátado que convierte la energía luminosa en
energía eléctrica.
- Colonia bacteriana: Agrupación de microorganismos originados de una
única célula y que se incrementan durante un intervalo de tiempo
determinado.
- Diploide: Célula somática que posee dos copias de cada cromosoma.
- Densidad de Flujo magnético: Medida de la concentración de líneas de
flujo en una sección puntual del circuito electromagnético. También se
define como el flujo magnético por unidad de área y su unidad es el tesla.
- Espectrofotómetro: Instrumento utilizado para cuantificar microorganismos
y sustancias químicas al medir la longitud de onda.
- Espora Bacteriana: Estructura en la que el microbio forma una capsula
que protege al material genético de las condiciones adversas, como alta
temperatura y escases de nutrientes.
- Fimbrias: Grupo de filamentos filiformes cortos que rodean algunas
bacterias gram negativas.
- Flagelos peritricos: Apéndices similares a pelos sobresalientes de la
pared celular. Permiten al microbio moverse y rodean toda la superficie
bacteriana.
- Flujo magnético: Número total de líneas de fuerza que atraviesa una
superficie. La unidad del flujo magnético es el voltio segundo (Vs) o weber
(Wb).
- Haploide: Célula cuya dotación genética consta de solo un par de
cromosomas en su núcleo.
- Manitol: Azúcar derivado de la manosa o fructuosa.
- Medio EMB: Medio Eosina azul de metileno, selectivo para el aislamiento
de enterobacterias y otras bacterias gram negativas.
- Meiosis: Es un proceso en que se origina cuatro gametos con la mitad de
los cromosomas de la célula inicial.
- Metabolitos secundarios: Mezcla de compuestos químicos que tiene
distribución taxonómica restringida y se forman al terminar el crecimiento.
- Mitosis: Reproducción en la que se forman dos células idénticas a la
original.
- Paramagnetismo: Característica de algunos materiales para magnetizarse
al ser sometidos a la acción de un campo magnético, por lo que se imanta
en el mismo sentido del campo.
- Pilis: Estructura con forma de pelos, anclados a la membrana de algunas
bacterias. Involucradas en la conjugación bacteriana.
- Plasmólisis: Fenómeno en el que la célula pierde agua, aumentando la
viscosidad intracelular y disminuye el volumen, por lo que la membrana
citoplasmática se retrae.
- Presión osmótica: Tipo de presión celular en la que se evita que pase
solvente a través de una membrana semipermeable, al ejercer una presión
mayor que la del diluyente puro.
- Radicales libres: Molécula o átomo que tiene uno o más electrones
desapareados y pueden existir en dicha forma. Son moléculas reactivas
que producen la oxidación de las células y cambios en el ADN.
- Transmitancia: Cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en una
determinada longitud de onda.
- Telsa: Unidad para expresar la densidad del flujo magnético (B). 1 Telsa (T)
= 104 Gauss
RESUMEN.
La estimulación magnética de microorganismos ha sido de interés investigativo
debido a sus aplicaciones industriales e impacto positivo en el medio ambiente.
Por ello, se ha visto como una alternativa viable para cambiar el crecimiento
microbiano y la capacidad de solubilizar fósforo.
Además, el crecimiento celular es el parámetro más importante en el estudio
microbiológico, ya que es utilizado como base para medir la eficiencia en otras
propiedades de los microorganismos, tales como el metabolismo y la producción
de sustancias de interés científico y tecnológico. Por tal motivo, se describe la
respuesta al campo magnético de Escherichia coli, el microorganismo más
estudiado por habitar en ambientes cotidianos para el ser humano, y
Saccharomyces cerevisiae con aplicaciones en la industria alimenticia.
Por otra parte, los microorganismos solubilizadores de fosfatos son de gran
importancia para la industria agrícola. Gracias a ellos las plantas pueden asimilar
el fósforo que no logran procesar por sí mismas, ayudando así a su crecimiento.
En este trabajo se profundiza en Pseudomonas sp y Bacillus sp por ser buenos
solubilizadores de fósforo y por su capacidad para degradar los sustratos
De ahí, que sea importante recopilar la información científica disponible, donde se
describen los mecanismos por los cuales las microbios se reproducen y/o
solubilizan fósforo, y la respuesta de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae,
Pseudomonas sp y Bacillus sp, a campos magnéticos con densidades variables y
su aplicación industrial.
9
CONTENIDO
GLOSARIO. ............................................................................................................. 5
RESUMEN. .............................................................................................................. 8
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 14
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 15
JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 16
OBJETIVOS ........................................................................................................... 18
METODOLOGÍA .................................................................................................... 19
CAPITULO 1.......................................................................................................... 20
MARCO CONCEPTUAL ........................................................................................ 20
1.1 CAMPOS MAGNÉTICOS. ........................................................................ 20
1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO. ................................................................ 24
1.2.1 Nutrientes. .......................................................................................... 24
1.2.2 Actividad del Agua. ............................................................................. 25
1.2.3 Temperatura. ...................................................................................... 25
1.2.4 pH. ...................................................................................................... 26
1.2.5 Oxígeno. ............................................................................................. 27
1.3 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR. ................................................... 29
1.3.1 Fase de Latencia. ............................................................................... 30
1.3.2 Fase de Crecimiento Logarítmico o Exponencial. .............................. 30
1.3.3 Fase Estacionaria. .............................................................................. 30
1.3.4 Fase de Declinación o Muerte Celular. ............................................. 31
1.4 TIPOS DE REPRODUCCIÓN EN MICROORGANISMOS. ...................... 31
1.4.1 REPRODUCCIÓN ASEXUAL. ........................................................... 32
10
1.4.1.1 Bipartición (división binaria). .................................................................. 32
1.4.1.2 Gemación. ............................................................................................. 33
1.4.1.3 Mitosis. .................................................................................................. 33
1.5 ALGUNOS MÉTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR EN
MICROORGANISMOS. ...................................................................................... 35
1.5.1 Recuento en placa. ............................................................................ 35
1.5.2 Filtración. ............................................................................................ 37
1.5.3 Número más probable (NMP). ........................................................... 37
1.5.4 Espectrofotometría y escala de Mcfarlan. .......................................... 39
1.5.5 DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS EN EL
LABORATORIO. ............................................................................................. 43
1.5.5.1 Preparación del inóculo. ........................................................................ 43
1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. ................................ 44
1.6.1 En medio sólido: ................................................................................. 44
1.6.2 En medio líquido................................................................................. 44
1.7 SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO. .......................................................... 45
1.7.1 Ciclo del Fósforo. ............................................................................... 45
1.7.2 Capacidad de solubilizar fósforo de los microorganismos. ................. 46
1.8 Resistencia a los Antibióticos. .................................................................. 47
2 CAPITULO 2 ................................................................................................... 48
ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO. ....................... 48
2.1 Escherichia coli. ........................................................................................ 48
2.2 Saccharomyces cerevisiae. ...................................................................... 54
3 CAPÍTULO 3. .................................................................................................. 59
ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO. ... 59
11
3.1 Pseudomonas sp. ..................................................................................... 59
3.2 Bacillus sp. ................................................................................................ 64
3.2.1 GENERADOR DE CAMPO MAGNÉTICO UTILIZADO PARA
ESTIMULAR Bacillus substitute. ..................................................................... 67
3.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE ESTIMULAR MAGNETICAMENTE
MICROORGANISMOS. ...................................................................................... 69
DISCUSIÓN GENERAL ......................................................................................... 70
CONCLUSIONES: ................................................................................................. 74
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 75
12
ÍNDICE DE TABLAS.
Pág.
TABLA 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos.. .............................. 28
TABLA 2. Propagación celular ..................................................................................................................... 34
TABLA 3. NMP para calcular carga microbiana. ....................................................................................... 38
TABLA 4. Modelo de ensayo para calcular NMP. ..................................................................................... 39
TABLA 5. Número equivalente de microorganismos en la serie de tubos. ........................................... 41
TABLA 6. Proporción de reactivos para preparar la escala de McFarland. .......................................... 41
TABLA 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos ............................................... 42
TABLA 8. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente E. coli .. .................... 51
TABLA 9. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente S. cerevisiae........... 57
TABLA 10. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Pseudomonas sp.62
TABLA 11. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente Bacillus sp. ........... 68
TABLA 12. E.coli sometida a 2 mT. ............................................................................................................. 71
TABLA 13. Crecimiento de S. cerevisiae y efecto de las variables. ....................................................... 72
13
ÍNDICE DE FIGURAS.
Pág.
FIGURA 1. Parámetros bobina de Helmholtz. ........................................................................................... 20
FIGURA 2. Estimulación magnética usando un Solenoide. ..................................................................... 21
FIGURA 3. Imán superconductor para estimular magnéticamente S. cerevisiae. .............................. 22
FIGURA 4. Bobina para la exposición de cultivos de células. ................................................................. 23
FIGURA 5. Bobina para la exposición de cultivos de células en erlenmeyers. .................................... 23
FIGURA 6. Forma de las células bacterianas. ........................................................................................... 29
FIGURA 7. Curva de crecimiento microbiano. ........................................................................................... 31
FIGURA 8. Reproducción asexual por bipartición. .................................................................................... 32
FIGURA 9. Levadura en proceso de gemación. ........................................................................................ 33
FIGURA 10. División celular por mitosis. .................................................................................................... 34
FIGURA 11. Diluciones sucesivas. .............................................................................................................. 36
FIGURA 12. Colonias rojas de coliformes en medio Tipo-Endo que contiene lactosa........................ 37
FIGURA 13. Fundamento de espectrofotometría en crecimiento celular. ............................................. 40
FIGURA 14. Turbidez de mcfarland comparado con una solución microbiana y un tubo inocuo. ..... 41
FIGURA 15. Vista de Escherichia coli en microscopio de fuerza atómica. ........................................... 48
FIGURA 16. Reproducción de células haploide y diploide de la levadura S. cerevisiae..................... 55
FIGURA 17. Pseudomona sp con flagelos. ................................................................................................ 60 FIGURA 18. Véase el halo de fósforo solubilizado alrededor de la colonia de Pseudomonas en agar
pikovskaya. ............................................................................................................................................. 60
FIGURA 19. Bacillus sp. ................................................................................................................................ 64
FIGURA 20. Influencia del campo magnético alterno, en el fondo congelación y su acción
combinada en el crecimiento de Bacillus cereus: A.Es el control; B. Alternando mf; C. Acción
de Bacillus cereus en frío; D. Acción del campo magnético en frío. ............................................. 66
FIGURA 21. Generador de campo magnético. .......................................................................................... 67
14
INTRODUCCIÓN
El campo magnético es una propiedad física que influye en los seres vivos, por lo
que, es de interés científico y tecnológico estudiar cómo actúa en
microorganismos y su aprovechamiento en la industria alimentaria, agro y
tratamiento de aguas, entre otros.
Investigaciones fijan su atención en un parámetro importante de microbiología, el
crecimiento, ya que las bacterias después de ser expuestas a campos magnéticos
controlados manifiestan cambios en la reproducción celular afectando el
funcionamiento del organismo expuesto, como sucede con Escherichia coli y
Saccharomyces cerevisiae. Además, la capacidad de solubilizar fósforo de
bacterias que ayudan a las plantas en la asimilación del elemento también se
cambia, pues experimentos realizados revelan variaciones en Pseudomonas sp y
Bacillus sp. después de la magneto -estimulación.
El presente trabajo discute la información científica recopilada sobre el crecimiento
de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, y la capacidad de solubilizar
fosfatos de Pseudomonas sp y Bacillus sp después de ser sometidos a campos
magnéticos.
15
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Debido al creciente interés de la sociedad por utilizar los recursos naturales de
manera más responsable, se han buscado métodos amigables con el ambiente
que permitan adquirir eficiencia en procesos industriales a menor costo con
intervalos de tiempo cortos. Buscar una forma de acelerar los procesos de
crecimiento celular bacteriano y aumentar la capacidad de solubilizar fósforo, es
una opción viable a través de la estimulación magnética de los microorganismos
ya que permite obtener resultados en tiempos menores a los esperados. Por otra
parte, la magneto-estimulación en ciertas dosis también tiene efecto bactericida.
Por lo que su utilización puede disminuir la contaminación microbiana en
alimentos, y con esto reducir la transmisión de enfermedades producidas por
bacterias patógenas (Al-Zeyara et al. 2010). De manera que esta técnica tiene
aplicaciones en la industria en general.
En un medio en el que se deben ofrecer más alimentos y productos con cada vez
menos recursos y tierra adecuada para esta actividad, condicionada además a las
severas limitaciones que le impone el cambio climático, es urgente y oportuna la
búsqueda de prácticas tecnológicas alternativas, que se vislumbren como eficaces
y sustentables, capaces de dar salidas a las típicas de la revolución verde, incluida
la fertilización por síntesis química (Patiño, 2010). El fósforo después del
nitrógeno, es el nutriente inorgánico más requerido por plantas y microorganismos
y además, en el suelo es el factor limitante del desarrollo vegetal a pesar de ser
abundante tanto en formas inorgánicas como orgánicas.
En Colombia, estimular magnéticamente microorganismos es una tarea que poco
se ha investigado. Debido a que la respuesta de las bacterias al campo
electromagnético es muy variable y depende directamente del tiempo e intensidad
del campo magnético suministrado, es importante recopilar la información
disponible, que permita tener una idea general sobre lo que es la estimulación
magnética de microorganismos, que produce en el individuo y como ha sido
implementado en la industria.
Por tal razón, se desea discutir cómo un campo magnético controlado afecta la
capacidad de crecimiento de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, y
solubilización de fósforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp. Para tal efecto esta
monografía se encaminará a estudiar la influencia de campos magnéticos sobre
diferentes especies de bacterias para analizar su crecimiento y solubilización de
fósforo.
16
JUSTIFICACIÓN
Debido a que es difícil encontrar tratamientos industriales que resulten benéficos
para los recursos naturales porque la mayoría contaminan los ecosistemas, ha
crecido el interés por investigaciones que conduzcan al desarrollo de prácticas
ambientalmente amigables, capaces de evitar el crecimiento de bacterias
patógenas, incrementar la proliferación de microorganismos de interés científico y
económico, y aumentar la solubilización de fósforo (Zhang et al. 2002). Por tal
motivo, Zapata et al. (2002) plantean que se deben desarrollar mecanismos
posibilitadores del incremento en la reproducción celular de organismos de uso
industrial, mediante estimulación magnética, permitiendo disminuir el tiempo de
fermentación, aumentar rendimiento y reducir costos en la producción de
alimentos, enzimas y fármacos, entre otros.
Con ese fin, Ayed et al. (2007) han venido trabajando en la magneto-estimulación
para cultivar con eficiencia microorganismos utilizando grupos de imanes,
obteniéndose como resultado que el campo magnético ha cambiado la tasa de
crecimiento y ayuda a optimizar la elaboración de productos que son capaces de
fabricar (Zapata et al. 2005). Entre los microbios cultivados con este tipo de
estimulación se encuentra, E. coli ampliamente analizado por su resistencia a
agentes antimicrobianos y fácil duplicación (Johnson, 2011; Romero, 2007). Por
otro lado, S. cerevisiae también ha sido sometida a campos magnéticos, ya que,
es conocida en la elaboración de alimentos; pero además es de interés
investigativo por su fácil manipulación y reproducción rápida (Blackburn, 2006).
Por otro lado, el fósforo es uno de los elementos (macronutrientes) que las plantas
demandan en cantidades relativamente grandes. Su importancia radica en formar
parte de los fosfatos portadores de energía (ATP-ADP), fosfolípidos, ácidos
nucleicos y varias coenzimas esenciales. Las plantas absorben la mayoría del
fósforo como ion dihidrogenofosfato H2PO4- y pequeñas cantidades como ion
hidrogenofosfato HPO42-. No obstante, la mayor parte del elemento en el suelo,
aproximadamente 95-99%, se encuentra en forma de fosfatos insolubles, los
cuales no pueden ser utilizados por las plantas (Kang et al. 2002).
Como medida para suplir la carencia de fósforo en el suelo se ha recurrido a la
aplicación de fertilizantes fosfatados. Sin embargo, una considerable cantidad de
estos fertilizantes es convertida rápidamente a compuestos insolubles, lo cual no
resulta útil para las plantas por terminar almacenados en el suelo (Narloch et al.
2002). Con el fin de incrementar la presencia del elemento de forma asimilable
17
para las plantas se fija la atención en Pseudomonas sp como solubilizadoras de
fósforo, ya que, crecen con rapidez y tiene la habilidad de metabolizar variedad de
sustratos (Ruiz, 2007). Al igual que Bacillus sp, porque posibilita la disponibilidad
de fósforo soluble en el suelo y es importante en el ciclo de carbono y nitrógeno
(Zuñiga et al. 2011).
Como se ha dicho, resulta útil estudiar el crecimiento de bacterias de interés
científico y la solubilización de fósforo de diferentes microorganismos de uso
agroindustrial, después de ser sometidos a diversos campos magnéticos y analizar
los beneficios de esta práctica amigable con el medio ambiente.
18
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Analizar la influencia de densidades de flujo magnético en el crecimiento de
Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae y en la capacidad de solubilizar
fósforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp; comparando respuestas según la
información encontrada.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Discutir cómo la estimulación magnética de E. coli y S. cerevisiae interviene
en el crecimiento celular, según la información científica recopilada.
Discutir el efecto sobre la solubilización de fósforo, según la información
científica disponible, de estimular magnéticamente a Pseudomonas sp y
Bacillus sp.
Evaluar la aplicación industrial de la estimulación magnética para el
crecimiento de E. coli, S. cerevisiae y solubilización de fosforo de
Pseudomonas sp y Bacillus sp.
19
METODOLOGÍA
1. Recolección de información: Es realizada mediante las diferentes
herramientas electrónicas proporcionadas por la biblioteca de la
Universidad Tecnológica de Pereira. Institución que facilita el acceso a
revistas, libros y bases de datos. Además, existen diferentes buscadores
académicos y sitios especializados.
2. Clasificación de la búsqueda: Determinar la cantidad de citas
bibliográficas relevantes y desechar la información que no contribuye al
desarrollo del trabajo.
3. Redacción monografía: Escribir de manera lógica, argumentativa y
organizada, todos los aspectos involucrados con la estimulación magnética
y los microorganismos en cuestión.
20
CAPITULO 1
1 MARCO CONCEPTUAL
1.1 CAMPOS MAGNÉTICOS.
Los campos magnéticos son generados por cargas en movimiento y medidos por
la intensidad, que se define como la concentración de líneas de fuerza por
centímetro cuadrado creadas en un campo magnético, y que existe en proporción
a la acción del campo. La unidad de dicha intensidad es tesla y adopta ese
nombre en honor al científico Nikola Tesla (Ball, 2004). La estimulación magnética
puede ser desarrollada mediante una bobina de Helmholtz que consiste de dos
bobinas circulares de radio R separadas por una distancia igual a su radio (Figura
1). Cada bobina está formada por espiras hechas de un hilo conductor, aislado y
enrollado que produce un campo uniforme en una región situada entre las dos
bobinas. Lo anterior, es obtenido gracias a que el campo magnético de cada
espira se añade al de la siguiente, por lo que, es agrupado en el centro y hay
incremento de la intensidad en dicho punto (Ramsden, 2006; Alcalde, 2008). En
consecuencia el radio de la bobina y su separación tiene campo magnético no
homogéneo, es decir, todos los puntos poseen diferente intensidad magnética, lo
que hace necesario colocar las muestras que se desean estimular en el centro de
la bobina donde se concentra el campo magnético.
Figura 1. Parámetros Bobina de Helmholtz.
(Ramsden, 2006)
21
Por otra parte, Gaafar et al. (2006) utilizo estimulación magnética implementando
un solenoide. Este dispositivo es un electromagneto que produce en el interior de
la bobina un campo magnético intenso y homogéneo, lo que significa que en todo
el circuito magnético se genera la misma cantidad de campo. Consiste en un
alambre conductor largo enrollado en forma de espiras ubicadas una junto a la
otra (Figura 2), una fuente de voltaje y a veces un núcleo de hierro. (Tipler y
Mosca, 2005; Enríquez, 2000).
Figura 2. Estimulación magnética usando un solenoide.
(Gaafar et al. 2006)
Otra forma de generar campos magnéticos es mediante imanes
superconductores. Consta de electroimanes con la capacidad de soportar altas
dosis de electricidad y fuertes campos magnéticos uniformes y estables, difíciles
de obtener por otras técnicas. En comparación con los electroimanes
convencionales, los superconductores poseen ventajas, entre ellas crear
magnitudes de campo grandes en el orden de 10 T, mayor eficiencia y bobinas
más compactas al no necesitar canales para la circulación de refrigerantes (Ford y
Freedman, 2005; Lufkin, 2000).
La Figura 3 muestra el proceso implementado por Iwasaka et al. (2004) para
estimular magnéticamente S. cerevisiae utilizando imanes superconductores:
22
Figura 3. Imán Superconductor para estimular magnéticamente S. cerevisiae.
(Iwasaka et al. 2004)
Por otro lado, debido a su composición electrolítica, los seres vivos son por lo
general buenos conductores de electricidad. Además, en los sistemas biológicos
existen estructuras magnéticamente influenciables como los radicales libres que
presentan propiedades paramagnéticas y aquellas en las que intervienen
sustancias ferromagnéticas. La respuesta de un sistema biológico a un campo
magnético externo depende tanto de las propiedades magnéticas intrínsecas del
sistema como de las características del campo externo y de las propiedades del
medio en el cual tiene lugar el fenómeno (Heredia et al. 2003).
En las últimas décadas, se ha presentado mucho interés en estudiar los posibles
efectos de los campos electromagnéticos en sistemas biológicos complejos y sus
aplicaciones en tratamientos, diagnósticos, monitoreo y control. Los campos
magnéticos de bajas intensidades muestran diferencias significativas entre las
muestras tratadas y el testigo, cuando la energía inducida por los magnetos es
mayor que la energía térmica producida en el sistema durante el tratamiento
(Recalde, 2013).
El campo magnético puede aplicarse en la estimulación de microorganismos de
interés (Figura 4 y 5). A diferencia de otros métodos es posible utilizarlo sin
grandes variaciones en las líneas tecnológicas, disminuyendo así notoriamente los
costos en la producción de la industria alimentaria (Barbosa et al. 2000). En
diferentes lugares del mundo se ha venido estudiando la estimulación magnética
de microorganismos para aumentar la fuente de biomasa, al igual que la
producción de metabolitos de interés químico, farmacéutico e industrial,
23
identificando factores que estimulen su producción a gran escala (Luna et al.
2011).
Figura 4. Bobina para la exposición de cultivos de células.
(Úbeda et al. 2011)
Figura 5. Bobina para la exposición de cultivos de células en Erlenmeyers.
(Villalpanda et al. 2011)
Relacionado con la estimulación magnética de microorganismos, existen
antecedentes. Fojt et al. (2004) estudiaron el campo magnético con Leclercia
adecarboxylata y Staphylococcus aureus resultando bajo crecimiento bacteriano,
por lo que según Strasák et al. (2002) la exposición magnética tiene efecto
bactericida. Además, Streptococcus mutans fue expuesta al magnetismo,
mostrando disminución del crecimiento celular (Masahiro et al. 2000). En
contraste, Chacón et al. (2006) observaron que en Lactococcus lactis se produjo el
doble del volumen celular en presencia del campo magnético, y con respecto a
24
Streptomyces avermitilis aumentó la producción de metabolitos secundarios pero
se inhibió el desarrollo morfológico del microorganismo (Mei et al. 2011).
Zapata et al. (2002) atribuyeron los resultados anteriormente descritos a varios
factores: posibles alteraciones en la orientación o estructura de las proteínas del
microorganismo, a cambios en el flujo de iones que atraviesan la membrana
plasmática al modificarse la velocidad de reproducción celular, a variaciones en la
membrana lipídica y en la síntesis de ADN, produciendo como consecuencia
modificaciones del crecimiento bacteriano.
1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO.
Todos los microorganismos requieren condiciones específicas para su óptimo
crecimiento. Además de las necesidades nutricionales, intervienen factores
externos que permiten su reproducción y que difieren para cada unicelular. Tales
factores incluyen: Actividad del agua, temperatura, pH y oxígeno. (Alarcón, 2001;
Tucker y Featherstone, 2011).
1.2.1 Nutrientes.
Según Tortora et al. (2007) los microorganismos exigen nutrientes como carbono,
nitrógeno, azufre, fósforo y otros elementos que varían de un organismo a otro.
Dicha característica está definida por la composición química de la célula, su
estructura genética y el entorno en el que se desarrollan. Por tal razón, se
encuentran en la naturaleza bacterias que pueden solubilizar fósforo,
biodegradadoras de compuestos orgánicos, fijadoras de nitrógeno o por el
contrario desnitrificadoras, entre otras. En consecuencia, los unicelulares
convierten diferentes sustancias químicas tomadas del medio y las utilizan
dependiendo de su fisiología (Alarcón, 2001).
Starr et al. (2004) afirman que los mecanismos por los cuales los microorganismos
obtienen nutrientes, se pueden clasificar en: quimioheterótrofas, quimioautótrofas,
fotoautótrofas, fotoheterótrofas:
Las bacterias Quimioheterótrofas son parásitos que adquieren energía de su huésped vivo.
25
Las Quimioautótrofas se alimentan mediante sustancias orgánicas e
inorgánicas que utilizan como fuente de carbono.
Las Fotoautótrofas se valen, al igual que las plantas, de la fotosíntesis para
absorber energía y obtienen carbono del CO2.
Las Fotoheterótrofas adquieren energía del sol, pero recibe el carbono de
compuestos orgánicos que provienen de otros seres vivos.
Por otro lado, la investigación de cepas bacterianas en laboratorios, ha sido
posible por la implementación de medios de cultivo artificiales ricos en nutrientes
que permiten el crecimiento microbiano a temperatura y pH controlados. Estos
medios poseen los compuestos específicos que necesita cada tipo de
microorganismo existente, por tal razón, es esencial comprender los
requerimientos nutricionales del organismo en cuestión y suministrar el medio
adecuado. Muestra de ello, es que Escherichia coli puede tener multiplicación
celular por las siguientes fuentes de alimento: Caldo bilis verde brillante, caldo de
enriquecimiento para enterobacterias, entre otros, y sucede de la misma forma
para todos los microorganismos (Corry et al. 2012).
1.2.2 Actividad del Agua.
Bylund (2003), asegura que el agua representa el 80-90% de la célula microbiana.
Es el compuesto esencial para la proliferación de microorganismos en todo tipo de
medio de cultivo, ya que, en el se encuentran disueltos los nutrientes que aquellos
organismos aprovecharan de manera independiente.
En ausencia de humedad es imposible que las bacterias logren sobrevivir a menos
que formen esporas. La escasez de agua se produce cuando la presión osmótica
se eleva, aumentando la concentración de soluto en los medios, lo que causa un
choque osmótico en la bacteria, provocando la plasmólisis e influyendo
negativamente en la proliferación; además, afecta las reacciones metabólicas por
no disponer de la cantidad de agua necesaria (Forbes, 2009; Tortora et al. 2007).
1.2.3 Temperatura.
Existen microbios en todos los ecosistemas, incluyendo aquellos ambientes que
poseen temperaturas extremas como volcanes y zonas polares. Cuando el
microorganismo está expuesto a temperaturas mayores a la que es capaz de
26
crecer, se afecta las funciones metabólicas de la célula, además de las proteínas y
ácidos nucleídos, llevándola a inactivarse (Romero, 2007). Por tal razón, según
Tortora et al. (2007) los unicelulares tienen temperatura óptima de crecimiento, es
decir, en la que se manifiesta mejor su proliferación. Dicha característica permite
clasificarlos en tres grupos principales: sicrófilos, mesófilos y termófilos.
Para los sicrófilos la temperatura óptima está cerca de 15 ºC.
Los mesófilos se propagan entre 26 y 40 ºC, siendo la mayoría de seres
microscópicos responsables de enfermedades en humanos, animales y
deterioro de alimentos.
Los termófilos entre 50 y 60 ºC, por lo que viven en climas cálidos como
aguas termales.
Sin embargo, es importante resaltar que el crecimiento es menor en las
temperaturas máximas y mínimas del intervalo para cada organismo.
1.2.4 pH.
Determina la concentración de iones hidrógeno que posee el entorno de un
microorganismo. La mayoría de las bacterias crece en pH cercano al neutro, es
decir, entre 6.5 y 7.5. Por otra parte, los hongos proliferan en valores alrededor de
5. Por tal razón, se ha agrupado a los microbios según su exigencia de pH en
categorías:
Acidófilos.
Neutrófilos.
Alcalófilos o basófilos.
Dicha necesidad a llevado a producir medios de cultivo que contengan la cantidad
de H+ requerido para el crecimiento del organismo en cuestión, valiéndose de
soluciones buffers como son las peptonas, aminoácidos y sales de fosfato (Tortora
et al. 2007).
27
1.2.5 Oxígeno.
El oxigeno es el elemento determinante en la reproducción celular. Su presencia
establece si crecerá o no un ser microscópico, ya que, varia su requerimiento de
las necesidades de cada organismo. Muestra de ello, es que no todos exigen
incluir O2 en el medio para su propagación (Romero, 2007). Esta característica
permite dividir los microorganismos en seis grupos:
Aerobias. Estrictas y facultativas:
Aerobias estrictas son las que requieren obligatoriamente de oxígeno para
reproducirse, logrando generar más energía a partir de nutrientes que los
microorganismos anaerobios. Por el contrario, las aerobias facultativas pueden
subsistir sin presencia del compuesto al valerse de la respiración anaeróbica o
mediante fermentación (Tortora et al. 2007).
Anaerobias. Estrictas y facultativas:
Según Montoya (2008) y Tortora et al. (2007) las anaerobias estrictas crecen en
ausencia de oxígeno únicamente, pues su existencia en el medio es letal, ya que,
posiblemente acumulan en el citoplasma radicales libres superóxido (O2-) que son
una forma toxica del oxígeno. Sin embargo, las anaerobias facultativas tienen la
capacidad de utilizar parte del elemento que se encuentra disponible en el
entorno, aunque no sea imprescindible para su supervivencia.
Microaerofílicas y Capnófilos:
En contraste, los microaerofílicos necesitan O2 en concentraciones menores a las
requeridas por las anaerobias, porque su multiplicación se inhibe. Por otro lado,
existen bacterias que requieren concentraciones elevadas de CO2 y se conocen
con el nombre de capnófilos (Montoya, 2008; Tortora et al. 2007).
La tabla 1 muestra un resumen general de los factores que intervienen en el
crecimiento de los microorganismos.
28
Tabla 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos.
Fuente (Autores).
CRECIMIENTO
Factor Clasificación Característica.
Nutrientes
Quimioheterótrofas Los sustraen de su
huésped vivo.
Quimioautótrofas Utilizan sustancias
orgánicas e inorgánicas.
Fotoautótrofas Mediante la fotosíntesis y
el CO2.
Fotoheterótrofas. Por fotosíntesis y otros
seres vivos.
Actividad del agua. Todos los
microorganismos.
80-90% de las células. Es
imposible la proliferación
bacteriana en ausencia
del elemento.
Temperatura.
Sicrófilos. Crecimiento óptimo a
15ºC
Mesófilos. 26 – 40 ºC
Termófilos. 50 – 60 ºC
pH.
Acidófilos. Aunque la mayoría de
microorganismos crecen
en pH entre 6.5 y 7.5
existen diferentes
exigencias.
Neutrófilos.
Alcalófilos o basófilos.
Oxígeno.
Aerobias estrictas.
Necesitan
obligatoriamente del
elemento para vivir.
Aerobias facultativas.
Pueden sobrevivir en
ausencia o presencia de
O2.
Anaerobias estrictas. Únicamente crecen sin
oxígeno.
Anaerobias Facultativas. Proliferan en ausencia o
presencia de O2.
29
Oxígeno.
Microaerofílicas.
Requieran del elemento
en pequeñas
concentraciones.
Capnófilos. Necesitan CO2 a elevada
concentración.
1.3 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR.
Las procariotas utilizan reproducción asexual. Esto es, una célula madre se divide
produciendo dos hijas idénticas genéticamente. Lo que lleva a concentrar miles de
células en grupos llamados colonias que tienen diferencias en su color, borde,
forma y superficie, características dependientes del tipo de microorganismo
(Tucker y Featherstone, 2011). Además, el crecimiento permite clasificar los seres
microscópicos según su forma en (Figura 6):
Bacilos (alargados).
Cocos (redondos).
Espirilos (hélice rígida).
Vibrios (coma).
Espiroqueta (hélice flexible).
a) Bacilos. b) Cocos. c) Espirilos. d) Vibrios. e) Espiroqueta.
Figura 6. Forma de las células bacterianas.
(Tortora et al. 2007).
30
Por otra parte, el proceso de multiplicación se divide en cuatro fases: latencia,
exponencial, estacionaria y muerte (Figura 7), y su duración depende del
microorganismo (Tucker y Featherstone, 2011).
1.3.1 Fase de Latencia.
Periodo de adaptación de los microorganismos al medio que lo rodea. Aunque las
células no están inactivas el número de ellas aumenta muy poco o nada y la etapa
puede durar de horas a días (Negroni, 2009). Según Silva et al. (2006) y Romero
(2007), durante esta fase la bacteria produce enzimas esenciales y otras sustancias
que ayudan a su acoplamiento en el medio. También, incrementan su actividad
metabólica y se almacena ARN y otros productos que ayudan para el metabolismo.
A medida que va trascurriendo el tiempo de adaptación comienza su duplicación de
manera lenta.
1.3.2 Fase de Crecimiento Logarítmico o Exponencial.
Terminado el periodo de adecuación, empieza a notarse incremento de células, ya
que, existen condiciones optimas de pH, temperatura y nutrientes. El crecimiento
es máximo en esta etapa llegando a ser constante; por lo tanto, se genera una
relación lineal entre el tiempo y el número de unidades formadas, como ilustra la
Figura 5 (Negroni, 2009). Además, existe mayor producción de metabolitos, lo que
la hace la fase para uso industrial. Sin embargo, cuando los microorganismos
atraviesan el crecimiento exponencial, son más susceptibles a perturbarse por
entornos hostiles que perjudican su reproducción (Tortora et al. 2007).
1.3.3 Fase Estacionaria.
Romero (2007) y Tortora et al. (2007), aclaran que en esta fase las condiciones
declinan, los nutrientes se agotan, empieza a concentrarse desechos nocivos y el
pH del medio de cultivo cambia a estado ácido. Los seres microscópicos terminan
muriendo al generarse un ambiente tóxico en el que solo las bacterias más fuertes
logran mantenerse vivas y multiplicarse. Con esto, inicia un periodo de equilibrio
entre células vivas y muertas en que los organismos viables tienen actividad
metabólica lenta.
31
1.3.4 Fase de Declinación o Muerte Celular.
A medida que trascurre el tiempo las condiciones empeoran cada vez más al no
existir nutrientes e incrementarse los desechos tóxico. Por lo que, las bacterias no
se encuentran en el ambiente propicio para seguir existiendo. Debido a su
entorno, desciende el número de organismos de forma exponencial culminando en
muerte total de la población (Tortora et al. 2007).
Figura 7. Curva de Crecimiento Microbiano.
(Tucker y Featherstone, 2011).
1.4 TIPOS DE REPRODUCCIÓN EN MICROORGANISMOS.
Los seres vivos, independientemente de la especie, necesitan propagarse, debido
a que es la única manera de garantizar la prolongación biológica. Tal condición
obliga a que las células utilicen su capacidad de transmitir material genético a sus
descendientes, produciendo seres idénticos a su antecesor (Jaramillo, 2004).
Existen diferentes mecanismos por los que es posible la duplicación, a
continuación se exponen algunos de ellos:
32
1.4.1 REPRODUCCIÓN ASEXUAL.
Se manifiesta principalmente en organismos unicelulares como bacterias y
hongos, entre otros. Consiste en la división mitótica de la célula implicada, por lo
que es generado uno o varios seres genéticamente idénticos al progenitor. Todo
es posible debido a que el individuo tiene la capacidad de fragmentar o
desprender parte de su cuerpo que contiene material genético y desarrollar un
nuevo individuo. En este tipo de reproducción no es necesaria la presencia de
órganos reproductivos, esa ventaja hace que los organismos logren propagarse de
forma rápida (Jaramillo, 2004). La reproducción asexual se manifiesta de las
siguientes maneras:
1.4.1.1 Bipartición (división binaria).
En este proceso el cromosoma de la célula madre se replica, separándose hacia
extremos opuestos del individuo (Figura 8). Después crea la nueva pared entre
ambas porciones de material genético, produciendo dos células que poseen
cromosomas idénticos a su antecesora (Pierce, 2009).
Figura 8. Reproducción asexual por bipartición.
(Pierce, 2009)
33
1.4.1.2 Gemación.
Tipo de reproducción frecuente en levaduras, en el que la célula desarrolla
protuberancias o yemas que pasan por un periodo de alargamiento hasta
desprenderse, formando así un individuo nuevo semejante al progenitor (Figura 9)
(Montoya, 2008; Jaramillo, 2004).
Figura 9. Levadura en proceso de Gemación.
(Tortora et al. 2007).
1.4.1.3 Mitosis.
Según Flores (2004) y Passarge (2009), es la división propia de las eucariotas.
También conocido como cariocinesis, que genera dos células hijas genéticamente
idénticas al dividirse el núcleo de forma equitativa. Se desarrolla en varias fases
(Figura 10).
1. Profase: Periodo en que los cromosomas son condensados volviéndose
más cortos y gruesos. Además, empieza a formarse el huso mitótico, el cual
se ocupa de orientar los cromosomas hacia polos opuestos de la célula
mediante los centriolos.
1. Metafase: El huso mitótico se forma totalmente como filamentos finos. Los
cromosomas se unen a las fibras del huso, para ser desplazadas al plano
ecuatorial de la célula.
2. Anafase: Se separa el centrómero quedando dos cromátides de cada
cromosoma, que serán extraídas hacia los polos de la célula.
34
3. Telofase: El huso es desintegrado al dispersarse las fibras. Se rompe la
membrana nuclear para formar dos nuevas envolturas y es dividido el
citoplasma, además las cromátides llegan a sus polos.
1. Profase.
Huso.
2. Metafase.
Plano ecuatorial.3. Anafase.
4. Telofase.
Figura 10. División celular por mitosis.
(Flores, 2004)
La Tabla 2 es un resumen de los tipos de reproducción celular:
35
Tabla 2. Propagación celular. Fuente (Autores).
Tipos de reproducción Celular.
Bipartición.
Una célula madre se
divide en partes iguales
produciendo dos hijas
con cromosomas
idénticos a la progenitora.
Gemación.
Las células crean
protuberancias que se
desprenden formando
otro individuo.
Mitosis.
Tipo de reproducción en
eucariotas que se divide
en: Profase, metafase,
anafase y telofase.
1.5 ALGUNOS MÉTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR EN
MICROORGANISMOS.
El crecimiento celular es un parámetro muy importante en el estudio
microbiológico. Por tal motivo, han sido creadas técnicas adecuadas,
desarrolladas hace aproximadamente cien años por científicos, que posibilitan el
análisis confiable de resultados (Tortora et al. 2007) obtenidos al estimular
magnéticamente microorganismos. A continuación se citan algunos de ellos:
1.5.1 Recuento en placa.
Es el método más utilizado. Se basa en presumir que cada célula se divide hasta
formar una colonia. Según Fojt et al. (2009), en la práctica esto no es verídico, ya
que, en el laboratorio se suele utilizar muestras pequeñas de colonias que son
compuestas por más de una sola célula. De ahí que la técnica se reporte en UFC
(Unidades Formadoras de Colonias), que se conoce como el número de bacterias
vivas capaces de formar una colonia.
Para garantizar la lectura correcta del número de elementos presentes en cada
caja de Petri, es necesario que las colonias no se encuentren aglomeradas, pues
en esas condiciones es imposible identificarlas individualmente y no se desarrollan
36
de manera adecuada. Por tal motivo, se deben implementar diluciones en
soluciones estériles (Figura 11) que permiten disminuir la carga microbiana y
calcular las UFC de la muestra inicial (Tortora et al. 2007).
Figura 11. Diluciones sucesivas.
(Tortora et al. 2007)
Cada dilución requiere 9 ml de caldo estéril, a los que será adicionado 1 ml de la
muestra problema, la solución es homogenizada en un tubo tapa rosca marcado
como Dilución 10-1 para sembrarlo en caja de Petri (según el método deseado),
igual que lo muestra la Figura 11. Posteriormente, es tomado 1 ml de la solución
10-1 para agregarlo en 9 ml de caldo contenido en un tubo de ensayo marcado
como 10-2 y sembrarlo. El proceso es repetido cuantas veces necesite el analista
hasta llegar a la cantidad de microorganismos viables que desee, permitiendo así
su recuento adecuado. Añadido a eso, es preciso escoger un método de siembra
entre las diferentes técnicas existentes, es decir, por diseminación y profundidad,
donde la última es también conocida con el nombre de vertido en placa. (Tortora et
al. 2007). Conjuntamente, es importante sembrar por triplicado, pues este es un
método sensible porque existe muchos factores que intervienen en los resultados
como: Desarrollo de colonias muy pequeñas que son pasadas por alto al realizar
el recuento, además no todas se forman a la misma velocidad en idénticas
condiciones de incubación (Madigan et al, 2004).
37
1.5.2 Filtración.
Según Leiva (2006) este método es frecuente para determinar la carga microbiana
en agua. Se utiliza una membrana estéril con poros de 0,45 m que impiden el
paso de las bacterias, por lo que son retenidas en aquel filtro que posteriormente
es incubado sobre un medio selectivo. La técnica permite saber si la muestra de
líquido posee coliformes totales o fecales, debido a que las colonias desarrollan
cierta coloración, dependiendo al medio de cultivo. Mostrando dicha característica
esta el agar Endo, que posee sulfito de sodio y fucsina básica permitiendo crecer
solo bacterias gram negativas, en este medio las colonias de coliformes son
rosadas (Figura 12) ya que el microorganismo tiene la capacidad de fermentar
lactosa.
Figura 12. Colonias rojas de coliformes en medio tipo-Endo que contiene lactosa.
(Leiva, 2006)
1.5.3 Número más probable (NMP).
Desarrollada por la técnica de fermentación en tubos múltiples, la cual permite
establecer mediante cálculos de probabilidades la presencia y cantidad de
coliformes o microorganismos que no crecen en medios sólidos en una muestra
dada. El método se basa en que las bacterias del compuesto a analizar, pueden
separarse agitando el medio de cultivo liquido y de esa manera quedar bien
distribuidas, resultando una suspensión de bacterias homogénea. Mediante
diluciones seriadas es inoculada la muestra problema en tubos de ensayo estériles
que contienen el medio adecuado, permitiendo así que solo en algunas diluciones
crezcan bacterias. De esta manera se produce una mezcla de resultados positivos
38
y negativos que permite estimar el NMP de microorganismos presentes (Roldán y
Ramírez, 2008).
La Tabla 3 expresa resultados de una muestra de agua con 95% de confiabilidad,
arrogados por cálculos estadísticos al observar 3 series de 5 tubos que revelan ser
positivos (poseen turbiedad y/o producción de gas) o negativos (ningún cambio,
por lo tanto no existe crecimiento) con respecto a la proliferación microbiana:
Combinación de
positivos
Índice de
NMP/100 ml
Límite de confianza de 95 %
Inferior Superior
4-2-0 22 9 56
4-2-1 26 12 65
4-3-0 27 12 67
4-3-1 33 15 77
4-4-0 24 16 80
5-0-0 23 9 86
5-0-1 30 10 110
5-0-2 40 20 140
5-1-0 30 10 120
5-1-1 50 20 150
5-1-2 60 30 180
5-2-0 50 20 170
5-2-1 70 30 210
5-2-2 90 40 250
5-3-0 80 30 250
5-3-1 110 40 300
5-3-2 140 60 360
Tabla 3. NMP para calcular carga microbiana.
(Tortora et al. 2007).
39
Ejemplo (Tabla 4.):
Para las series 1,2 y 3 existen 4, 2 y 0 tubos respectivamente, positivos (presencia
de turbidez) lo que significa crecimiento celular. Por lo tanto, según la Tabla 3, el
número más probable de microorganismos es de 22NMP/100ml y el 95 % de las
muestras con este resultado poseen entre 9 a 56 bacterias.
Tubos 1 2 3 4 5
Serie 1 Sin cambio Turbidez Turbidez Turbidez Turbidez
Serie 2 Turbidez Sin cambio Turbidez Sin cambio Sin cambio
Serie 3 Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio
Tabla 4. Modelo de ensayo para calcular NMP.
(Autores)
1.5.4 Espectrofotometría y escala de Mcfarlan.
Cuando los seres microscópicos se reproducen en medios líquidos, estos cultivos
se tornan turbios demostrando así la propagación. Ya que la turbidez es un
parámetro practico para controlar la carga microbiana, es útil implementar
métodos que permitan determinar la concentración de microorganismos en medios
de cultivo acuosos, que por tiempo y recursos, no es posible su recuento en placa.
Por ello, se recurre al espectrofotómetro, pues permite medir con exactitud la
cantidad de organismos del medio al tener una solución lo bastante turbia, es
decir, que existan entre 10 a 100 millones de bacterias por cada mililitro (Tortora et
al. 2007).
El fotómetro mide la intensidad de una fuente luminosa que incurre sobre alguna
superficie. Con microbios, el haz de luz a una longitud de onda determinada,
atraviesa la solución bacteriana, por lo tanto, entre más seres se encuentran en la
suspensión, menos luminosidad llegara a la célula fotoeléctrica (Figura 13). De
este modo, el detector del instrumento mostrará dicho fenómeno en unidades que
el observador pueda analizar, es decir, % de transmitancia o absorbancia, donde
40
la absorbancia será útil para graficar la curva de crecimiento que permite estimar
la concentración de microorganismos (Tortora et al. 2007; Delgadillo et al. 2010).
Figura 13. Fundamento de Espectrofotometría en crecimiento celular.
(Tortora et al. 2007).
Por otro lado, la turbidez estándar de 0,5 o escala de Mcfarland, mediante once
alícuotas de BaCl2•2H20 y H2SO4 almacenadas en tubos de ensayo bien sellados,
permite comparar la solución bacteriana motivo de análisis con parámetros ya
establecidos y presumir la cantidad de microorganismos presentes (Figura 14). Se
trata de una serie de tubos con turbidez definida, donde cada solución
corresponde a una concentración bacteriana, por lo tanto se toman como base
para establecer la carga microbiana de la solución motivo de análisis (Tabla 5). La
exactitud de la escala es verificada mediante fotometría, ya que, a 625 nm la
absorbancia de la turbidez 0,5 debe ser entre 0,08 - 0,1 y de esta manera se
garantiza que concuerde con los valores de concentración microbiana estipulados
(Perilla et al. 2004).
En la Figura 14 se comparan tres tubos. El a forma parte de la turbidez estándar
de Mcfarland y se confronta con b, la solución bacteriana motivo de estudio que no
es traslucida porque los microorganismos cuando crecen en medio acuoso
41
producen soluciones opacas o turbias; en contraste c es un tupo inocuo, por lo
que no presenta turbidez.
Número de la turbidez estándar
Densidad de bacterias aproximada
correspondiente.
0.5 1x108 1 3 x108 2 6 x108 3 9 x108 4 12 x108 5 15 x108 6 18 x108 7 21 x108 8 24 x108 9 27 x108 10 30 x108
Tabla 5. Número equivalente de microorganismos en la
serie de tubos.
(Perilla et al. 2004)
Figura 14. Turbidez de
Mcfarland comparado con
una solución microbiana y un
tubo inocuo.
Aunque en el mercado se encuentra disponible la turbidez estándar, es posible
prepararla a partir de cloruro de bario al 1,175% (p/v) y acido sulfúrico 1% (p/v).
Las cantidades de cada reactivo son las descritas en la Tabla 6 y pueden ser
conservadas durante seis meses, siempre que no se evapore parte de la solución.
Tabla 6. Proporción de reactivos para preparar la escala de Mcfarland. (Perilla et al. 2004)
42
Tabla 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos. Fuente
(Autores).
Técnicas para valorar crecimiento celular.
Método Característica.
Recuento en placa.
Los resultados son
reportados en UFC y el
método propone que se
formada una colonia por
célula.
Filtración.
Es utilizada generalmente
para recuento de
coliformes en agua.
Número más probable.
Mezcla de tubos que
mediante probabilidades
permiten estimar el
número microorganismos
presentes en una
muestra dada.
Espectrofotometría.
Mediante la turbidez de la
suspensión bacteriana a
una longitud de onda
determinada es medida la
cantidad de
microorganismos
presentes.
Turbidez estándar de 0,5
o escala de Mcfarland.
Serie de tubos con
turbidez definida, que se
comparar con los
microorganismos en
medio acuosos para
estimar cualitativamente
la concentración.
43
1.5.5 DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS EN EL
LABORATORIO.
1.5.5.1 Preparación del inóculo.
En un matraz con 100 ml de caldo de nutrientes se inocula con el cultivo de agar
inclinado de Pikovskaya y se incuba a 30 ± 0,2 ° C durante 48 h. Las células se
separaran del caldo mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 20 min, se
lavan dos veces con agua destilada estéril y se resuspenden en agua destilada
estéril. Esta suspensión se utiliza como inóculo. Todos los pasos se llevan a cabo
en condiciones asépticas. (Ramani, 2011).
Los siguientes medios de cultivo se utilizan para el aislamiento, identificación y
detección de bacterias solubilizantes de fosfato:
Medio de agar / caldo de Pikovskaya (g / l)
Glucosa 10 g; fosfato tricálcico (TCP) 5 g; sulfato de amonio 0,5 g; cloruro de
sodio 0,2 g; cloruro de potasio 0,2 g; sulfato de magnesio 0,1 g; extracto de
levadura 0,5 g; sulfato de manganeso, rastrear; ferroso sulfato, traza; agar, se
añaden 15 g a 1 L de agua destilada, el pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la
esterilización. Después de la esterilización se añade 50 g/ml ciclohexamida
asépticamente al medio de enfriado (60 ° C) para inhibir el crecimiento de hongos
(Ramani, 2011).
Agar modificado de Pikovskaya: (g / l)
El medio anterior se modifica mediante la adición de 4,0 ml de 0,16% de solución
de azul de bromofenol (en etanol) a 1 litro del medio antes de la esterilización. Se
utiliza el medio para la detección de fosfato soluble basado en la zona clara de la
solubilización de fosfato alrededor de las colonias.
0,02% de NaCl en el medio de agar original del Pikovskaya se sustituye por
diferentes concentraciones (0,04 a 25%) de NaCl.
El pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la esterilización (Ramani, 2011).
44
Caldo modificado de Pikovskaya: (g / l)
0,02% de NaCl en caldo de la Pikovskaya fue sustituido por diferentes
concentraciones (0,02%, 0,06, 0,1%, 0,2%, 0,6% y 1%) de NaCl que tiene la CE
correspondiente 2 (2,10, 2,69, 3,35, 4,91, 9,74 y 15,51 mS cm -1 ,
respectivamente, a 25 ° C) (Ramani, 2011).
Fosfato tricálcico (TCP) se sustituye de forma individual por el fosfato ferroso (FP),
fosfato de aluminio (AP) y el fosfato dicálcico (DCP) en la cantidad equivalente a
229 mg% de P2O5.
TCP fue reemplazado con los fosfatos de roca (RPS) y harina de hueso (BM) en
cantidad equivalente a 100 mg% de P2O5.
El pH se ajusta a 7,0 ± 0,2 antes de la esterilización (Ramani, 2011).
1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO.
1.6.1 En medio sólido:
En el medio que contiene agar modificado de azul de bromofenol de Pikovskaya
mediante la observación de zona clara solubilizante TCP (Fosfato tricálcico)
alrededor de las colonias. Todas las placas se incuban a 28 ° C ± 0,2 ° C durante
24 h. Se mide la zona de solubilización de fosfato que rodea la colonia
(halo). Tamaño de la zona clara se calcula restando diámetro de la colonia menos
el diámetro total del halo.
1.6.2 En medio líquido.
La actividad en caldo de Pikovskaya contiene 0,5% de TCP (Fosfato tricálcico). En
un matraz que contenga 100 ml de caldo de Pikovskaya se inocula asépticamente
1,0 ml de inóculo. Medio no inoculado sirve como control y se incuba a 28 ° ± 0,2 °
C durante 21 días bajo condiciones estáticas y se agita a 12 intervalos h. 10,0 ml
de medio se retira en cada tercer día y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min.
El sobrenadante se analiza para determinar su contenido de agua soluble en
fósforo por el método de molibdofosfórico reducida chlorostannous azul ácido
45
descrito por Jackson (1973). El pH final del medio se mide utilizando medidor de
pH contra la solución tampón estándar. El experimento se lleva a cabo por
triplicado.
Entre los géneros bacterianos más estudiados por su capacidad para solubilizar
fosfatos se encuentran: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia,
Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium,
Azotobacter y Erwinia observando una cantidad considerablemente mayor en la
rizosfera, en comparación con el suelo no rizosferico (Kumar, 2001). Igualmente,
se ha documentado la actividad fosfato solubilizadora por diferentes hongos
(Pérez, 2012).
Fueron seleccionadas Pseudomonas sp. y Bacillus sp. sobre la base de la
tolerancia a la sal y la actividad de solubilización de fósforo con diferentes formas
de fosfatos (Ramani, 2011).
1.7 SOLUBILIZACIÓN DE FÓSFORO.
1.7.1 Ciclo del Fósforo.
Es el proceso de circulación del elemento en la corteza terrestre. El P se
encuentra principalmente en la litosfera, también existe en huesos fósiles, rocas
fosfatadas y excremento de aves. Las lluvias y los ríos disuelven el fósforo
retenido en las diversas fuentes para ser asimilado por las plantas a través de las
raíces. El proceso hace que el fósforo sea integrado en los ácidos nucleicos para
utilizarlo en el material genético de los microorganismos. Al morir las plantas, se
reintegra el fósforo al suelo como fosfato soluble por la acción de las bacterias. Sin
embargo, el fósforo puede drenarse por la erosión, llegando al mar donde lo toman
animales y seres humanos para consumo, o como medio para producir
fertilizantes, por lo que el fósforo regresa al suelo (De la llata, 2003; Manahan,
2007).
46
1.7.2 Capacidad de solubilizar fósforo de los microorganismos.
El fósforo es uno de los nutrientes inorgánicos más requeridos por plantas, ya que
hace parte de las moléculas de ADN, ARN y posibilita la transferencia de energía
como ATP (Barroti et al. 2001). En el suelo, el elemento limita la producción y
rendimiento vegetal aunque se encuentre presente en formas inorgánicas y
orgánicas, debido a que se halla en concentraciones bajas que varían de 5 y 30
mg Kg-1, tales niveles son producidos al reaccionar el fosforo del suelo con iones
de Calcio, Hierro o Aluminio que provocan precipitación o fijación, disminuyendo
de esta forma la disponibilidad para las plantas (Fernández et al. 2004). Además,
según Peña y Cardona (2010) su disponibilidad está ligada a la naturaleza del
suelo, donde una variable importante es el pH que debe ser entre 5.5 y 7.9.
Los fosfatos inorgánicos aplicados como fertilizantes químicos son retenidos en el
suelo y como resultado no son aprovechados por los cultivos. Por ello, se estima
que la solubilización de rocas fosfatadas y de otras fuentes de fósforo inorgánico
por los microorganismos del suelo es una opción para elevar la cantidad del
elemento disponible para las plantas (Fernández et al. 2004).
La actividad microbiana en la rizosfera es de gran transcendencia, al solubilizar los
fosfatos no disponibles para la planta, los cuales se encuentran bajo formas
orgánicas e inorgánicas. La habilidad para solubilizar los fosfatos se encuentra
presentes en abundantes microorganismos como bacterias, levaduras,
actinomycetes y hongos de vida libre que han sido relacionados con el incremento
en la disponibilidad de fósforo en el suelo. Se ha estimado que entre el 10 - 50 %
de la flora bacteriana existente en el suelo posee la capacidad de solubilizar
fósforo, algunos de ellos con mayor eficacia como Pseudomonas, Micrococcus,
Bacillus y Flavobacterium (Peña y Cardona, 2010). A través de las aplicaciones de
los biofertilizantes a base de microorganismos solubilizadores de fosfatos, la
disponibilidad de fósforo puede incrementarse y el producto de su acción (fosfato
soluble) puede ser absorbido eficientemente por las plantas (Fernández et al.
2004).
El fósforo es limitante para la producción de cultivos y se ha estimado que los
recursos mundiales de fosfato de roca de bajo costo pueden ser agotados para el
año 2050 (Vance et al. 2003). La falta de fósforo de bajo costo ha sido reconocida
como una potencial crisis futura en la agricultura. La mejora de la absorción de
fósforo en las plantas y su utilización tendrá algunos impactos significativos en la
agricultura y en el medio ambiente (Singh y Satyanarayana, 2011).
47
En el laboratorio es evidente que los microorganismos tienen la capacidad de
solubilizar fosfato cuando el medio de cultivo presenta zonas claras, conocidas
con el nombre de halos, que rodean las colonias. Sin embargo, existen
organismos que no forman halos por lo que es necesario realizar pruebas
cuantitativas en medio líquido (Bonilla, 2005).
1.8 Resistencia a los Antibióticos.
Los antibióticos son sustancias producidas por bacterias, hongos y actinomicetos,
que inhiben el crecimiento de otro microorganismo o lo elimina; son de bajo peso
molecular y también se pueden obtener por síntesis química. La resistencia a esos
agentes se debe a que el organismo ha desarrollado mecanismos que restan
actividad al antibiótico o lo hacen inútil, por lo que disminuye su sensibilidad (Díaz
et al. 2001). Según, Restrepo et al. (2003) los aspectos que hacen posible esa
resistencia son: mutaciones espontaneas que afectan a los genes codificadores de
la molécula ligada al antibiótico, reorganización genética u obtención de plásmidos
que otra bacteria transfiere permitiendo pasar dicha resistencia de una célula
medre a sus hijas.
Forbes (2009) explica que la resistencia a los fármacos por parte de un
microorganismo se distingue en:
Intrínseca o inherente: Se presenta de forma natural, siendo parte de la
estructura genética, por lo que es una característica del microorganismo.
Esta particularidad hace posible identificar ciertas bacterias o grupos por
tener resistencia predecible a los antibióticos.
Adquirida: Es impredecible. Puede obtenerse por mutaciones o genes de
otra bacteria, provocando alteraciones en la composición genética de la
célula y con ello cambio en su fisiología y estructura.
La disminución de la sensibilidad de algunas bacterias a los antibióticos se
produce gracias a que los microorganismos poseen la capacidad de eliminar el
fármaco antes de que este ejerza su acción sobre la célula, también pueden
inactivar enzimáticamente el medicamento o restringir la entrada del mismo al
microorganismo (Restrepo et al. 2003). Además, cuando se someten a
estimulación magnética también han demostrado resistencia a los antibióticos
(Ibraheim et al. 2013)
48
2 CAPITULO 2
ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO.
2.1 Escherichia coli.
E. coli es el microorganismo mas estudiado por el ser humano. Su descubrimiento
se remonta a 1885, gracias al pediatra Theodor Escherich (1857-1911) quien aisló
la bacteria de las heces de uno de sus pacientes, y por tal motivo se le atribuye
dicho nombre (Johnson, 2011). Se reproduce con facilidad en ambientes
cotidianos para el hombre y animales tales como tierra, agua y plantas, ya que, su
temperatura óptima de crecimiento se encuentra en 37ºC (Allauca, 2005), lo que la
hace pertenecer al grupo de los mesófilos. Dicha característica vuelve a este
bacilo un ser habitual en el intestino grueso y delgado, por ello es el
microorganismo más relacionado con enfermedades gastrointestinales usuales en
personas y animales (Koneman y Allen, 2008).
Se identifica por ser miembro de la familia enterobacteriaceae. Es un bacilo gram
negativo, aerobio facultativo que mide 1 x 2 m (Figura 15); goza de una sola
cadena en espiral de ADN, se mueve mediante flagelos perítricos, no produce
esporas y forma fimbrias y pilis (Sánchez y Trejo, 2006). E. coli es fermentadora
de lactosa y a partir de glucosa fermenta manitol; además es positiva para indol y
descarboxilasa de lisina. También, es motivo de investigación su resistencia a
antimicrobianos y la capacidad de producir toxinas, fortaleza originada en los
plásmidos porque contienen información genética que lo hace posible (Romero,
2007).
Figura 15. Vista de Escherichia coli en Microscopio de Fuerza Atómica.
(Klinth et al. 2012)
49
Para cultivar en laboratorio, es necesario a 37 ºC utilizar como medio de cultivo
agar EMB, que es específico y da una tonalidad característica de este
microorganismo: verde metálico brillante. Este agar es el más utilizado, ya que,
contiene azul de metileno actuando como agente inhibitorio del crecimiento de
bacterias gram positivas (Alarcón, 2001). Sin embargo, es capaz de crecer en
muchos otros medios sintéticos como agar cromogénico, base de agar endo, agar
eosina azul de metileno, caldo lactosado, entre otros (PANREAC, 2009).
En lo referente a la estimulación magnética E. coli ha sido objeto de varios
estudios, entre ellos se ha observado la respuesta del crecimiento del bacilo, como
se describe a continuación:
Según Shin-ichiro et al. (2002) y Zhang et al. (2002), E. coli fue expuesta a
campos magnéticos durante el periodo de crecimiento exponencial resultando en
muerte bacterial al presentarse disminución de células, en comparación con el
control, por lo que, los investigadores sugieren que la estimulación ocasiona
cambios en el metabolismo de la célula y varia el pH del medio Luria Bertani a
básico, porque E. coli toma los aminoácidos y los transforma en sustancias como
el amoniaco. Además, al afectar la proliferación del microorganismo también existe
interferencia en la actividad oxido-reductiva y esa variación se incrementa a
medida que aumenta el tiempo de exposición (Strasák et al. 2002).
Asimismo, mediante un ensayo Fojt et al. (2004) comparan los efectos de la
estimulación magnética con la viabilidad del bacilo, mediante conteo de UFC. En
esta ocasión E. coli fue expuesta al campo magnético en la fase logarítmica,
encontrando que el número de unidades disminuye, en equivalencia con el control,
de manera exponencial al aumentar dos variables: tiempo de exposición y
densidad de flujo magnético. La causa de muerte bacterial no es clara, pero se
presume, se debe a posibles cambios biológicos como es la alteración en el
transporte de iones y formación de radicales libres producidos por la estimulación
electromagnética, además concluyeron que dicho efecto empieza desde el
momento en que se enciende el campo magnético.
De la misma forma, Wenjin et al. (2009) encontraron como el número de UFC se
ve afectado negativamente cuando incrementa el tiempo de estimulación
electromagnética y aumenta la temperatura a la que es realizado este ensayo (25
a 40 °C), produciéndose daño en la superficie de las células implicadas. Sin
embargo, una vez E. coli ha logrado adaptarse al ambiente hostil, empieza a
disminuir la cantidad de bacterias inhibidas. Según Filipic et al. (2012) E. coli
responde dependiendo la densidad de flujo magnético, por ejemplo, a 17 mT se
50
afectó el crecimiento de manera negativa, pero a 5 y 50 mT la influencia fue
menos pronunciada. Aun así, la estimulación magnética aumentó los niveles de
ATP y la actividad enzimática, que se presume es manifestada al luchar E. coli por
adaptarse al entorno, por la presencia del campo magnético.
En otro caso, Bajpai et al. (2014) demostraron como utilizar la estimulación
magnética añadiendo un sustrato con propiedades de magnetización afecta el
crecimiento de esta población bacteriana, pues los resultados revelaron inhibición
en un 83 % al pasar 4 h de exposición. No obstante, confirmaron que sin
implementar el sustrato también se influye negativamente en la propagación de E.
coli porque causa daño en su membrana desintegrándola y produciendo liberación
de material intracelular (Bajpai et al. 2012). Asimismo, según Kamel et al. (2013), a
40, 80, 120 y 160 mT produce disminución de células viables y variaciones en la
sensibilidad a ciertos antibióticos.
Debido a los resultados, Belyaeva (2011) afirmó que tales efectos dependen
directamente de las variables físicas y biológicas que forman parte del entorno que
envuelve al microorganismo al ser estimulado magnéticamente. Por tal razón, E.
coli disminuye la tasa de crecimiento cuando es tratada a 2 mT y con tiempos de
exposición de 4,6 y 8 horas, y pasadas 24 horas el número de células bacterianas
aumenta, por lo que, los investigadores opinan que el microorganismo posee
capacidad de adaptarse al campo magnético (Segatore et al. 2012).
Por otro lado, según la densidad de flujo magnético y tiempo de exposición será el
efecto en las células expuestas. Muestra de ello, es que en algunos casos E. coli
sometida a este tipo de estimulación electromagnética no han sufrido ningún tipo
de transformación en su capacidad de multiplicarse como lo afirman Del Re et al.
(2003). Y Según Esmekaya et al. (2013), a 2 mT y 24 horas la exposición al
campo no produce ningún cambio en la viabilidad de las células, pero sí afecta su
morfología al formarse poros y desintegrar la membrana.
Por el contrario, Nawrotek et al. (2014) y Fijałkowski et al. (2014) encontraron que
la exposición al campo magnético incrementa la reproducción celular de E. coli.
Del mismo modo, un estudio realizado por Nascimento et al. (2003) mostró que la
magneto-estimulación puede influir positivamente la multiplicación en presencia de
glucosa, al incrementar la entrada del azúcar por la membrana celular, disminuir la
fase estacionaria y aumentar el tiempo que E. coli permanece en periodo de
crecimiento logarítmico.
Es evidente que los resultados cambian dependiendo del campo magnético
aplicado, por tal razón Babushkina et al. (2005) aseguran que utilizar frecuencias
51
bajas produce incremento de la proliferación bacteriana. También, Gaafar et al.
(2006) concluyeron que el tiempo de exposición hace variar drásticamente el
crecimiento de este bacilo, por lo que, depende en mucho del tiempo como factor
clave. Por ello, Rodríguez et al. (2006), hallaron modificación en el crecimiento
bacterial a 0,1 Tesla y 6,5 horas, al manifestarse incremento de 100 %
comparándolo con el control no estimulado.
En la siguiente tabla se describe la respuesta de E. coli al ser sometida a
diferentes campos magnéticos:
Tabla 8. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente E. coli
Fuente (Autores).
Autor(es) Tiempo de exposición (minutos)
Temperatura (ºC)
Densidad de campo
magnético (mT)
Medio de cultivo.
Efecto sobre el
crecimiento.
Belyaev
(2011) 15 No aplica 0,021
Caldo
Luria Inhibición
Bajpai et
al. (2012)
30,60,120,
240 37 100
Medio
Luria
Bertani
Inhibición
Bajpai et
al. (2014)
30, 120,
240 37 100
Medio
Luria
Bertani
con
hidroxiapat
ita y
magnetita.
Inhibición
Filipic et
al. (2012). 0 -25 28 + 0.5 5,17,50.
Medio
Luria
Bertani.
Inhibición
Fojt et al.
(2004) 30 20 - 25 10
Caldo TY y
Agar
nutritivo.
Inhibición
52
Gaafar et
al. (2006) 360 -960 37 2
Agar
nutritivo. Inhibición
Kamel et
al. (2013).
1440,
2880, 4320 No aplica
40, 80, 120,
160
Agar
MacConke
y y caldo
nutritivo.
Inhibición
Shin-
ichiro et
al. (2002)
720 43 5200 -6100
Medio
Luria
Bertani.
Inhibición
Strasak et
al. (2002) 0 -12 20 - 25 2.7 -10
Caldo TY y
Agar
nutritivo.
Inhibición
Wenjin et
al. (2009) 0 -60 25 - 40
45, 450 -
3.500
Medio
Luria
Bertani.
Inhibición
Zhang et
al. (2002) 0 -1500 No aplica
50,100,200,
400,600
Preparado
con:
Extracto
de carne,
peptona,
extracto de
levadura,
Cloruro de
sodio y
agua
destilada.
Inhibición
Del Re et
al. (2003) 3480 37 0,1 - 1
Medio
Luria
Bertani.
Ningún
cambio
Esmekaya
et al.
(2013)
1440 No aplica 2
Medio
Luria
Bertani
con FeCl3.
Ningún
cambio
53
Babushkina
et al.
(2005)
1080 No aplica 25
Medio
Luria
Bertani.
Incremento
Fijałkowski
et al.
(2014) 60 No aplica 25 -34 No aplica Incremento
Nascimento
et al.
(2003) 480 No aplica 0.5
Caldo
glucosa. Incremento
Nawrotek
et al.
(2014)
30 -150 No aplica 30 No aplica Incremento
Rodríguez
et al.
(2006)
60 - 720 No aplica 100 -1000
Agar
nutritivo,
peptona y
extracto de
carne.
Incremento
Segatore
et al.
(2012)
0 -24 37 + 0.3 2
Caldo
Mueller
Hinton.
Incremento
54
2.2 Saccharomyces cerevisiae.
El género Saccharomyces fue expuesto por primera vez en 1838 por Meyer. Con
el paso de los años, se han realizado cambios del mismo hasta clasificarlo en dos
principales grupos: Saccharomyces sensu stricto y Saccharomyces sensu lato. La
categoría sensu stricto enlaza las levaduras relacionadas con S. cerevisiae en su
origen o historia evolutiva, conocido como filogenia; además este tipo de
microorganismos se caracteriza por ser utilizado en la industria alimentaria. Por
otra parte, el grupo sensu lato encierra todos los demás miembros del género
(Fleet, 2006).
Saccharomyces cerevisiae es eucariota, anaerobia facultativa, la forma de su
célula es elipsoidal de aproximadamente 5 m de diámetro, posee una
temperatura optima de crecimiento entre 37-40 ºC y se reproduce por gemación
multilateral, más o menos cada 90 minutos. Además, la levadura puede
propagarse como haploide o diploide y sufrir mitosis (Dickinson y Schweizer,
2004: Páez, 2010).
Las células haploides existen de dos tipos: a y α. Para la formación de diploides
(a/α) se requiere elementos haploides de ambas tipologías a y α que se conjugan
entre sí cuando cada una forma protuberancias que logran fusionarse al entrar en
contacto. Al llegar el momento en que los nutrientes se agotan, las células
diploides atraviesan la meiosis formando cuatro esporas capaces de germinar al
poseer de nuevo condiciones favorables para su crecimiento. Sin embargo, se
generan como haploides, dos del tipo a y dos α (Figura 16) (Dickinson y
Schweizer, 2004).
La figura siguiente describe el proceso de reproducción de los tipos de células
mencionadas:
55
Diploide.
Seudohifas.
Fase
Estacionaria.
Esporulación.
Conjugación.
αa
Fase
Estacionaria.
Filamentos
Invasivos.
Haploide.
(Dickinson, 2004)
(α) y (a)
(a/α)
Figura 16. Reproducción de Células Haploide y Diploide de la Levadura S. cerevisiae
(Dickinson y Schweizer, 2004)
56
S. cerevisiae puede crecer en diferentes medios de cultivo dentro del laboratorio.
Con este objetivo, ha sido implementado los siguientes agares: Glucosa y patata
que es útil en la identificación y recuento de la levadura en productos alimenticios,
BHI, nutritivo, Maltosa Sabouraud y agar diferencial. También algunos
presentados en el mercado como agar o caldo: extracto de malta para aislamiento
y otros fines, Glucosa Sabouraud, entre otros (PANREAC, 2009).
Por otra parte, las levaduras han sido de interés investigativo porque son
eucariotas unicelulares, fáciles de manipular y con capacidad de reproducirse de
maneras rápidas. Además, S. cerevisiae es extensamente estudiada por su uso
en alimentos, entre ellos vino y pan, por lo que se considerada muy útil en la
elaboración de diferentes tipos de víveres que enriquecen las mesas de muchos
hogares (Blackburn, 2006). Esto es posible, debido a que son utilizadas sustancias
de desecho que provienen de la fermentación alcohólica, tales como etanol y
dióxido de carbono, y contribuyen a producir los comestibles (Tortora et al. 2007).
La estimulación magnética de S. cerevisiae ha mostrado resultados variables:
Novák et al. (2007) y Otabe et al. (2009), encontraron que el campo magnético
además de disminuir el número de UFC, retarda el crecimiento de esta levadura
cuando elimina parte de ellas, mientras otras células, se adaptan al ambiente
adverso en el que se encuentran. Por ello, Iwasaka et al. (2004), afirma que la
exposición al campo magnético tiene efecto bactericida. También, Markkanen et
al. (2001) hallan como la radiación UV, junto con este tipo de estimulación
electromagnética, tiene mayor capacidad de disminuir la cantidad de células
presentes de S. cerevisiae, comparándolo con la falta de electro-estimulación.
Por otro lado, según Egami et al. (2010) el efecto depende del tiempo y la
intensidad del campo magnético suministrado. En vista de ello, Anton-Leberre et
al. (2010) afirman que la interacción con el campo magnético a 16 T y 8 horas, no
produce cambios en la forma en que se propaga S. cerevisiae o su sistema
biológico. Al igual, Ruiz et al. (2004) hallan que el crecimiento de S. cerevisiae
puede ejecutarse sin ninguna variación. Además, El-Gaddar et al. (2013) y Ruiz et
al. (2010) concordaron que las células expuestas siguen su ciclo natural.
En contraste, observaron a S. cerevisiae antes, durante y después de la
estimulación magnética, concluyendo que existe un ligero incremento en la
proliferación de esta levadura resultando positivo para su propagación (Motta et al.
2001). También, han implementado densidades de campo diferentes, resultando
que a 20 mG (mili-Gauss) y 30 segundos de exposición magnética la
57
concentración celular aumento 30% con respecto al control (Zapata et al. 2002).
Según Zapata et al. (2005), en un estudio desarrollado en Medellín, Colombia,
hallaron que el cultivo de S. cerevisiae puede superar el efecto inhibitorio del
campo magnético y aprovechar mejor el sustrato (miel virgen de caña), por lo que,
fue observado aumento en el volumen celular en un 14%, en comparación con el
control, con menor consumo de miel virgen (medido por el método antrona).
Asimismo, mostrando como este tipo de estimulación magnética intensifica el
número de individuos, a 25 mT se obtuvo aumento en el crecimiento de S.
cerevisiae entre 8.7 a 43.1 %, concluyendo que el volumen celular depende del
tiempo de exposición al campo (Oliveira et al. 2010), y con este incremento de la
población, mejorar la producción de etanol (Deutmeyer et al. 2011).
En la siguiente tabla se describe la respuesta de S. cerevisiae al ser sometida a
diferentes campos magnéticos:
Tabla 9. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente S.
cerevisiae. Fuente (Autores).
Autor(es) Tiempo de exposición. (minutos)
Temperatura (ºC)
Densidad de campo
magnético (mT)
Medio de cultivo.
Efecto sobre el
crecimiento.
Egami et
al. (2010) 240 No aplica 2930 Agar YPD. Inhibición
Markkanen
et al.
(2001)
430 No aplica 120 Caldo YPD Inhibición
Novák et
al. (2007) 24 24 - 26 0 -10
Caldo
extracto de
malta.
Inhibición
Otabe et
al. (2009) 1800 No aplica 10 Agar YPD. Inhibición
Iwasaka
et al.
(2004)
960 No aplica 9000 -14000
Agar YPD y
medio
peptona-
glucosa.
Inhibición
58
Anton-
Leberre et
al. (2010).
480 No aplica. 16000 Agar YEPD. Ningún
cambio
El-Gaddar
et al.
(2013)
4320 No aplica 500 Agar YEPD. Ningún
cambio
Ruiz et al.
(2004)
1440 y
4320 23 0.35 y 2.45
Caldo
YPD
Ningún
cambio
Ruiz et al.
(2010) 60 y 4320 No aplica 0.35,1.4,2.45
Caldo
YPD.
Ningún
cambio
Deutmeyer
et al.
(2011)
1500 No aplica 100 y 200
Extracto de
levadura y
peptona.
Incremento
Motta et
al. (2001) 1440 No aplica 110 y 220
Agar
Sabouraud
Glucosado
Incremento
Oliveira et
al. (2010) 480 -960 No aplica 25 -34.3 Agar YM Incremento
Zapata et
al. (2002) 0.5 No aplica 0.002
Agar
Sabouraud Incremento
Zapata et
al. (2005) 3 No aplica 0.025
Agar
Sabouraud. Incremento
59
3 CAPÍTULO 3.
ESTIMULACIÓN MAGNÉTICA Y CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FÓSFORO.
Bacterias que tienen la capacidad de solubilizar compuestos ricos en fósforo, que
no está disponible para las plantas, mediante su actividad fisiológica secretan
ácidos orgánicos y enzimas denominadas fosfatasas, que propician la liberación
del fósforo para que las plantas puedan aprovecharlo. Además, estas bacterias
tienen la facultad de promover el crecimiento vegetal a través de la síntesis
de hormonas reguladoras del crecimiento, como el ácido indolacético, así como
de inhibir el crecimiento e incidencia de patógenos de hábito radical, mediante
la secreción de sustancias de tipo antibióticas. El estudio sobre este fenómeno ha
permitido entender cómo las bacterias pueden superar la estrategia terapéutica
mediante intercambio genético, generando así un aumento en la capacidad de
solubilizar fósforo (Sánchez et al. 2012).
3.1 Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp. es un Bacilo Gram negativo, aerobio, no formador de esporas.
Puede presentar de 1.5 a 5 µm de largo y, un diámetro de 0.5 a 1 µm. Las
especies de este género son móviles, debido a las presencia de 1 o más flagelos
polares (Figura 17). Es oxidasa y Catalasa positiva, no fermentadores de lactosa.
La mayoría de especies del género, no crecen bajo condiciones ácidas (pH 4.5 o
menor). El género Pseudomonas es bien conocido por su versatilidad metabólica y
plasticidad genética. Las especies de Pseudomonas, en general, crecen
rápidamente y presentan habilidad para metabolizar una gran variedad de
sustratos. (Ruiz, 2007).
60
Figura 17. Pseudomona sp con flagelos.
(Carrión et al. 2010)
P. putida es conocido por su capacidad para degradar una amplia variedad de
compuestos orgánicos recalcitrantes, y es por lo tanto importante para el
tratamiento de aguas residuales (Ogunseitan, 1996).
Figura 18. Véase el halo de fósforo solubilizado alrededor de la colonia de Pseudomonas
en agar pikovskaya.
(Naik et al. 2008)
61
En lo referente a estimulación magnética, según Anaya et al. (2011), al someter
Pseudomonas sp. a campos magnéticos de 0.015, 0.03 y 0.06 mT y diferentes
tiempos de exposición se evidencia un aumento en el crecimiento bacteriano.
Pseudomonas sp. se hizo pasar por imanes para estimulación magnética de
microorganismos. Recibió una inducción magnética de 0.12 T. Se inoculó una
muestra de bacterias tratada en el intervalo de 0.01-0.16 T junto a antígenos de
Bacillus cereus y Pseudomonas aeruginosa. El incremento de la proliferación
microbiana ha permitido proponer su uso como ayudante inmunológico para la
obtención de sueros policlonales antibacterianos y sugerir su empleo en otros
inmunobiológicos (Martínez, 2004).
Según Ibraheim et al. (2013) al someter Pseudomonas aeruginosa a un campo
magnético controlado de 4 mT y 50 Hz hubo una disminución en la sensibilidad
de las células expuestas a los campos magnéticos. Estos resultados indican que
la viabilidad de las células tratadas durante 14 horas disminuyó en comparación
con las células no expuestas causando inhibición. Se evidenció un incremento en
la sensibilidad de las células estudiadas a norfloxacina y la ciprofloxacina.
También las células estimuladas a 14 h se hicieron más resistentes a estos
antibióticos. Todo esto indica que hay efectos del campo electromagnético
utilizado en la acción del medicamento sobre la célula bacteriana a través de la
inhibición de la síntesis de proteínas, síntesis de la pared celular, la transcripción
de ARN y la replicación de ADN, la síntesis de proteínas y con ello aumento en la
solubilización de fósforo.
Por otra parte, la fuerza magnética alta en Pseudomonas aeruginosa generó
sensibilidad a los antibióticos durante un corto período de tiempo (4-6 horas) y
aumentó su resistencia al mismo antibiótico a largo plazo de exposición (18-20 h)
mostrando, por lo tanto, efecto positivo en la capacidad del microorganismo de
degradar fósforo insoluble. Además, las enzimas bacterianas como TDA
(Triptófano desaminasa), GLU (glutamato), ARA (angiotensina), se efectúan por
el campo magnético (Kamel et al. 2013).
Segatore et al. (2012) observaron que los efectos de la exposición a campos
magnéticos de baja frecuencia (2 mT; 50 Hz) sobre la tasa de crecimiento y la
sensibilidad a los antibióticos de P. aeruginosa influenció significativamente la
tasa de la cepa cuando se incubó en presencia de concentraciones
subinhibitorias de amikacina. En particular, a las 4, 6, y 8 h de incubación el
número de células disminuyó significativamente en las bacterias expuestas a
62
campos electromagnéticos y de la misma manera la solubilización de fósforo.
Además, a las 24 h de incubación, el porcentaje de células de Pseudomonas
aureginosa aumentó en los grupos tratados con respecto al control.
En la siguiente tabla se describe la respuesta de Pseudomonas sp. al ser
sometida a diferentes campos magnéticos:
Tabla 10. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente
Pseudomonas sp. Fuente (Autores).
Autor(es) Tiempo de
exposición.
Temperatura
(ºC)
Densidad
de campo
magnético
y
frecuencia
(Hz)
Medio
de
cultivo.
Efecto
Anaya et
al. (2011) No aplica No aplica
0.015 mT
0.03 mT
0.06 mT
No
aplica
Aumento en el
crecimiento
Martínez
(2004) 0.3m/s 37 0.01-0.16 RPMI
Aumento en el
crecimiento.
Ibraheim
et al.
(2013)
14 h 37 4mT
50Hz
Caldo
nutritivo
Disminución de la
sensibilidad y
degradación de
fosfato.
Kamel et
al. (2013) 2-20 h 37
400, 800,
1200 y
1600
Gauss
Caldo
nutritivo
Disminución en el
crecimiento,
aumento en la
fase logarítmica
Kamel et
al. (2013) 4-6 h 37
400, 800,
1200 y
1600
Gauss
Caldo
nutritivo
Se genera
sensibilidad
antibiótica
63
Kamel et
al. (2013) 18-h 37
400, 800,
1200 y
1600
Gauss
Caldo
nutritivo
Aumenta la
resistencia
antibiótica y la
capacidad de
degradar fósforo.
Segatore
et al.
(2012)
4, 6, y 8 h 37 2 mT
50 Hz
Caldo
Mueller
Hinton
Disminución del
número de células.
Sin cambio en la
actividad
antibiótica.
Segatore
et al.
(2012)
24 h 37 2 mT
50 Hz
Caldo
Mueller
Hinton
Sin cambio en la
actividad
antibiótica.
64
3.2 Bacillus sp.
El género Bacillus pertenece a la familia Bacilliaceae, e incluye más de 60
especies de bacilos. Este género está formado por microorganismos bacilares
Gram positivos, formadores de endosporas, quimiheterotrofos que normalmente
son móviles y rodeados de flagelos periticos. Son anaerobios o aerobios
facultativos, catalasa positiva. Las células bacterianas de este género tienen un
amplio tamaño que varía 0,5 a 2,5 µm x 1,2-10 µm. Se encuentra comúnmente en
suelos y plantas donde tienen un papel importante en ciclo del carbono y el
nitrógeno (Lozada, 2010).
Conjuntamente, los Bacillus formadores de esporas aerobias son
quimioheterótrofos versátil. En algunas ocasiones, fermentan los hidratos de
carbono en una reacción mixta que produce típicamente glicerol y butanodiol.
Algunas especies, como el Bacillus megaterium, no requieren factores de
crecimiento orgánico, mientras que otros pueden requerir aminoácidos, vitaminas
del grupo B, o ambos. La mayoría son mesófilos, con temperatura óptima entre 30
y 45 grados, pero algunos termófilos con óptima de hasta 65 grados. Otros son
psicrófilas, capaces de crecer y esporular a 0 grados. Se encuentran más en un
intervalo de pH de 2 a 11. En el laboratorio, en condiciones óptimas de
crecimiento, las especies de Bacillus exhiben tiempos de generación de unos 25
minutos (Kenneth, 2012)
En la Figura 19 se muestran Bacillus sp. Vistos desde un microscopio.
Figura 19. Bacillus sp.
(Quintero, 2009)
65
Estimular magnéticamente Bacillus sp. facilito la disponibilidad de los nutrientes,
algunas especies del genero Bacillus son capaces de solubilizar el fósforo
contenido en compuestos no asequibles, haciéndolo disponible, mejorando por
tanto, el régimen fosfórico de los suelos. Para la aplicación de esta tecnología una
muestra de Bacillus sp. son sometidos al campo electromagnético de 4,0 mT con
frecuencia de 25 Hz durante 2 h (Zúñiga et al. 2011).
Campos magnéticos de 5.2 a 6.1 T retrasan la muerte celular en cultivos
estacionarios de Bacillus subtilis (Gu et al. 2012). Según Nakamura et al. (1997)
se desarrolló un biosistema imán superconductor, que puede proporcionar un
campo magnético de 0,5-7 T, donde las reacciones biológicas pueden llevarse a
cabo bajo condiciones de temperatura controlada. El crecimiento aeróbico
Bacillus subtilis, se investigó bajo (5.2 a 6.1 T) campos magnéticos homogéneos
(7 T) y no homogéneos. En la fase estacionaria, el número de células en un
campo magnético no homogéneo fue aproximadamente dos veces mayor que la
de la referencia no estimulada, lo que indica que la magnitud de la disminución en
el número de células se redujo por el campo magnético de alta densidad. La
disminución más lenta en el número de células en un campo magnético se
presentó debido a la tasa de muerte más lenta de las células vegetativas. La
inhibición de la formación de esporas a partir de las células vegetativas también se
observó en un campo magnético, que se refleja en la reducción de la actividad de
la fosfatasa alcalina. Transformadas genéticamente B. subtilis produce una mayor
concentración de un antibiótico lipopéptido, surfactina, y por lo tanto aumenta la
capacidad de degradar fosfato en la fase estacionaria en un campo magnético no
homogéneo debido al mayor número de células alteradas en el campo magnético.
Por otra parte, Gu et al. (2012) demostraron que al someter Bacillus subtilis a
densidades de campo magnética altas (5.2 - 6.1T) y frecuencia de 0 -0.03 Hz se
inhibió completamente el crecimiento ocasionando la muerte y con ello afectando
la acción de Bacillus subtilis sobre el fósforo.
Los estudios experimentales de Ramón et al. (2005) mostraron un aumento en el
crecimiento de Bacillus subtilis a 800 Hz a campos magnéticos de 1 kHz con un
período de 2 segundos. La intensidad del campo magnético fue de entre 0,8 y 2. 5
mT. En contraste, el grupo de Bacillus expuestas al campo magnético mostraron
poca o ninguna cohesión; las células parecían estar distribuidas homogéneamente
por toda la muestra. Estos resultados sugieren que los patrones de crecimiento y
de degradación de fosfato de Bacillus subtilis pueden ser alterados como resultado
de los efectos inducidos por el campo magnético.
66
Estudios realizados por Raichenko et al. (2012) dieron como resultado en todos
los casos estudiados un retardo en el crecimiento en Bacillus cereus durante el
período de 1 - 2 días, seguido de la restauración del crecimiento de la población al
someterlos a un campo magnético de 30 - 50mT durante 2 a 15 minutos (Figura
20).
Figura 20. Influencia del campo magnético alterno, en el fondo congelación y su acción
combinada en el crecimiento de Bacillus cereus: A.es el control; B. alternando MF; C.
acción de Bacillus cereus en frío; D. acción del campo magnético en frío.
( Raichenko et al. 2012)
Según Jin et al. (2009) Bacillus subtilis en medio de agar nutritivo fue expuesto a
campos magnéticos de 0,085 a 0,092 T durante 12h, generando resultados
diferentes en cada etapa. El cultivo se comparó con el grupo de control en el
campo geomagnético normal. El valor experimental de densidad óptica de este
aerobio fue significativamente más alto que el del grupo de control de 3h a 9h. Sin
embargo, después de 11 h, no hubo diferencia notable con respecto a los valores
de densidad óptica entre los dos grupos .El contenido de oxígeno disuelto en el
medio agar nutritivo sometido a estimulación magnética durante 12 h produjo un
aumento del 15% en promedio y no hubo diferencia significativa en comparación
con el control. Los resultados mostraron que los campos ferromagnéticos
aumentaron el contenido de oxígeno disuelto en agar nutritivo significativamente.
Estos hallazgos sugieren que los efectos de los campos magnéticos estáticos
sobre Bacillus subtilis se relaciona con el oxígeno disuelto.
67
En una investigación realizada por Wu et al. (2007) sobre la reacción bioquímica-
fisiológica de Bacillus subtilis. se incubó esta bacteria bajo las intensidades de
campo magnético de 100mT y 500mT. Encontrándose fermentación de
carbohidratos bajo la fuerza del campo magnético de 500 mT durante 24h.
3.2.1 GENERADOR DE CAMPO MAGNÉTICO UTILIZADO PARA ESTIMULAR
Bacillus substitute.
Figura 21. Generador de campo magnético.
(Gu et al. 2012)
Este equipo se compone de dos partes: la unidad generadora de ELF- EMF
(Frecuencias extremadamente bajas – Campos electromagnéticos) que contiene
unas bobinas. La otra es el amplificador de corriente.
Con el fin de asegurarse de que las bobinas generan ELF- EMF uniforme, la
corriente eléctrica entra primero al amplificador, de manera tal que la corriente que
finalmente se transporta a las bobinas es estable. La temperatura se controla a
37ºC (Gu et al. 2012).
68
En la Tabla 11 se describe la respuesta de Bacillus sp. al ser sometida a
diferentes campos magnéticos:
Tabla 11. Resumen de parámetros utilizados para estimular magnéticamente
Bacillus sp. Fuente (Autores).
Autor(es)
Tiempo de
exposición.
(minutos)
Temperatura
(ºC)
Densidad de
campo
magnético y
frecuencia
Medio de
cultivo. Efecto
Gu et al.
(2012) 1080-1440 37 5,2 - 6,1T
Extracto
de
levadura
y peptona
Retrasan la
muerte
celular
Zúñiga et
al.(2011) 240 No aplica 4mT y 25 Hz No aplica
Facilitan la
disponibilida
d de
nutrientes
Wu et al.
(2007) 1440 No aplica 100T y 500T No aplica
Aumentan la
capacidad
para
degradar
ácido rojo
Nakamura
et al.
(1997)
No aplica 37 7T
Extracto
de
levadura
y peptona
Reducción
de la
actividad de
la fosfatasa
alcalina
Ramón et
al. (2005) 2 seg No aplica
0,8 y 2. 5 mT
y 800 Hz No aplica
Alteración
de los
patrones de
crecimiento
Raichenko
et al.
(2012)
2-15 37 30 - 50mT Medio
nutritivo
Aumento en
el
crecimiento
69
3.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE ESTIMULAR MAGNETICAMENTE
MICROORGANISMOS.
En lo relacionado con campo magnético y crecimiento microbiano en la industria
se cuentan con algunos informes. Hofmann (1987) plantea que debido a los
múltiples resultados de inhibición, es decir, disminución del número de individuos o
desactivación de los mismos, es posible implementar esta técnica para beneficio
de la industria alimenticia, ya que, permite esterilizar los víveres sin alterar su
sabor u otras características que incluyen las organolépticas, importantes para los
consumidores. Además, el método ayudaría a desinfectar artículos plásticos, que
por su composición química, no pueden ser introducidos en autoclave. Cambiando
de esta manera la técnica que por décadas ha sido implementada, como método
de control de bacterias contaminantes en procesos alimenticios, es decir, los
productos químicos (Baruj y Tufano, 2012).
También, los microorganismos estimulados magnéticamente tienen uso en
biorremediación al ser mezclados con elementos o sales de Na, K, Ca, Mg, P y Cl
(Bitz y Jones, 1996). Incluso en tratamiento de agua disminuye costos, al tomar
una masa del líquido que contiene microbios contaminantes y exponerlo al campo
magnético. Esto es posible debido a que la técnica mata los seres microscópicos
existentes, por lo que, químicos tóxicos usualmente utilizados en agua, serán
manejados en menor cantidad y su impacto ambiental será consecuente a dicha
disminución (Sanderson, 1997). Sin embargo, aumentar el número de algunos
microorganismos ha sido útil para incrementar la producción de proteínas y otras
sustancias por parte del ser microscópico (Chen et al. 2010) lo que hace posible
utilizarlo en agricultura (Wan-kei, 2012).
La estimulación magnética de microorganismos que descomponen moléculas
complejas de material orgánico facilita la absorción de elementos hacia las plantas
(Zúñiga et al. 2011). De igual modo la estimulación magnética de microorganismos
contribuye significativamente a la aceleración del proceso de compostaje (Santillán
et al. 2010).
Los tratamientos magnéticos pueden ser utilizados en la preservación de los
alimentos, mejorar su calidad sensorial, propiedades reológicas y estimular
procesos fermentativos. Además, es necesario profundizar en la genotoxicidad
manifestada en algunos sistemas biológicos tratados con campo magnético
(Anaya et al. 2011).
70
DISCUSIÓN GENERAL
El crecimiento microbiano es una medida importante en microbiología porque
permite analizar otras propiedades de los organismos unicelulares. Para que un
microorganismo se propague requiere óptimas condiciones, su entorno debe
contar con los requerimientos nutricionales, pH, agua, oxígeno y temperatura que
exige el individuo, la unión de todos los componentes posibilitan la reproducción
de las distintas formas de vida celular, ya sea por bipartición, gemación o mitosis.
En el laboratorio es posible determinar la carga microbiana de muestras mediante
técnicas creadas por científicos expertos en el tema. Esos métodos son útiles para
cuantificar microorganismos estimulados magnéticamente y así establecer el
impacto del campo magnético en los individuos expuestos. Los organismos
responden a campos magnéticos debido a que poseen en su sistema estructuras
que se magnetizan al ser expuestas al electromagnetismo. La estimulación
magnética se produce implementando una bobina de Helmholtz, un solenoide o
utilizando imanes superconductores.
La magneto-estimulación de E.coli y S. cerevisiae son ejemplos de la influencia
que tiene el campo magnético en el crecimiento de las bacterias. Es notable que el
tiempo que permanece el microorganismo bajo el magnetismo, la temperatura y la
intensidad de este, son factores importantes, pues de ello dependerá en gran
medida el efecto del campo magnético sobre el individuo.
Cuando el campo magnético produce muerte bacterial, siempre va acompañado
de cambios en el entorno o la estructura del microorganismo que producen tales
efectos. Después de la estimulación magnética, E. coli presenta algunas
diferencias como: alteración en el transporte de iones debido a que cambia la
velocidad de reproducción celular, variación del metabolismo lo que ocasiona en el
medio de cultivo aumento de pH a básico afectando el crecimiento con ello,
desintegración de la pared celular produciendo liberación del material interno
porque se forman poros que permiten la salida del mismo.
Para E. coli el ambiente se torna hostil desde el momento que se enciende el
campo magnético, sin embargo, la bacteria tiene la capacidad de adaptarse al
entorno difícil, por lo que a medida que transcurre el tiempo disminuye el número
de bacterias inhibidas, eleva los niveles de ATP y la actividad enzimática. Someter
microorganismos a campos electromagnéticos en todos los casos no produce
71
inhibición celular. También, puede ser sometida la bacteria sin ningún tipo de
cambio o incrementar el número de individuos presentes hasta en 100%, porque el
periodo en que la bacteria permanece en la fase estacionaria es mas largo.
Por otra parte, en el caso de S. cerevisae se destacan algunos aspectos con
respecto a su respuesta a la estimulación electromagnética: La levadura sometida
al campo magnético sufrió inhibición del crecimiento celular, aunque tiene la
capacidad de adaptarse al ambiente con magnetismo. También es notable que
utilizar radiación UV y electromagnetismo para inhibir la proliferación de
microorganismos es una alternativa viable, pues presenta resultados más
eficaces. Al igual que E.coli, la levadura S. cerevisiae puede incrementar el
volumen celular tras ser sometida a campos magnéticos, notándose aumentos de
8.7 hasta 43.1% lo que es de gran utilidad en la industria alimentaria y de etanol,
pues se conoce a este organismo unicelular como ayudante en la fabricación de
diferentes productos.
La Tabla 12 refleja la dependencia del crecimiento con otras variables. Aunque en
los tres casos E.coli fue sometida a 2 mT, el tiempo de exposición
electromagnética fue diferente para cada estimulación, afectado el crecimiento de
forma distinta.
Tabla 12. E.coli sometida a 2 mT.
Autor(es) Tiempo de exposición (minutos)
Densidad de campo magnético
(mT)
Efecto sobre el
crecimiento.
Gaafar et
al. (2006) 360 -960 2 Inhibición
Esmekaya
et al.
(2013)
1440 2 Ningún
cambio
Segatore
et al.
(2012)
0 -24 2 Incremento
Otro caso que confirma este hecho es el de S.cerevisiae sometida a periodos de
tiempo que se relacionan, pero a diferentes densidades de flujo magnético,
72
provoco resultados distintos con respecto al crecimiento de la levadura como se
observa en la Tabla 13.
Tabla 13. Crecimiento de S. cerevisiae y efecto de las variables.
Autor(es) Tiempo de exposición. (minutos)
Densidad de campo magnético
(mT)
Efecto sobre el
crecimiento.
Iwasaka et
al. (2004) 960
9000 -
14000 Inhibición
Anton-
Leberre et
al. (2010).
480 16000 Ningún
cambio
Oliveira et
al. (2010) 480 -960 25 -34.3 Incremento
Por otro lado, el fósforo soluble es un elemento esencial para las plantas ya que
restringe la producción de los cultivos, por ello, el suelo se vale del ciclo del P para
recircular el nutriente. Existen bacterias solubilizadoras de fosfatos que tienen la
capacidad de producir sustancias antibióticas, por lo tanto esas propiedades están
relacionadas. Cuando Pseudomonas sp. es sometida a la estimulación magnética
incrementa su resistencia a los antibióticos, concluyendo que su capacidad de
solubilizar fósforo aumenta. También se presenta el caso contrario, disminución de
la oposición al agente, notando que todos los resultados van ligados al tiempo y la
intensidad de campo magnético suministrado.
La exposición magnética de colonias del género Bacillus sp. a demostrado el
doble de crecimiento de la bacteria comparándolo con el microorganismo no
estimulado, produciendo mayor concentración de antibióticos, en consecuencia
superior capacidad de solubilizar el fósforo para ser asimilado por las plantas,
revelando que el campo magnético altera esta propiedad en Bacillus sp. Muestra
de ello es que la magneto – estimulación produce que el bacilo tenga una fase de
muerta más lenta, aunque inhibe la formación de endosporas
En la industria es posible aprovechar la estimulación magnética de
microorganismos. Implementarlo en el sector alimenticio es viable debido a que
73
produce inhibición celular, por lo que los microorganismos no contaminaran los
alimentos. Además, utilizarlo para esterilizar artículos que no pueden ser
sometidos a altas temperaturas ahorraría parte del dinero invertido en utensilios
microbiológicos desechables u otros elementos que deben mantenerse inocuos.
Otras ventajas de la técnica es que disminuye el impacto negativo de los
productos químicos en el medio ambiente, pues los agentes tóxicos serán
utilizados en menor medida al ser remplazados por la electroestimulación; también
los microorganismos estimulados pueden ayudar a la absorción de nutrientes de
las plantas para la industria agro.
74
CONCLUSIONES:
Según la información científica encontrada es posible implementar una
gama amplia de densidades de flujo magnético y tiempos de exposición al
campo, que permiten producir resultados variables con respecto a la
multiplicación celular de microorganismos. Sin embargo, identificar la mejor
respuesta a la estimulación magnética depende de lo que pretendemos al
utilizar la técnica, es decir, inhibición o incremento del volumen microbiano
como se evidenció en E. coli y Saccharomyces cerevisiae.
Evitar el crecimiento de agentes patógenos en la industria alimentaria,
tratamiento de aguas y diversos sectores de producción, es de interés
internacional, ya que, controlar este tipo de contaminación permite frenar la
propagación de enfermedades por tener efecto bactericida. Por otro lado,
incrementar el volumen celular permite aprovechar la actividad metabólica
de diversos microorganismos de uso industrial, lo que sucede con
Saccharomyces cerevisiae, pues implementar el método aumentará la
producción de sustancias de interés semejantes a etanol. Además, en
biorremediación es posible beneficiarse de microbios degradadores de
compuestos contaminantes, permitiendo recuperar hectáreas de suelo para
agricultura.
Al someter microorganismos solubilizadores de fósforo como Pseudomonas
sp. y Bacillus sp. a campos magnéticos controlados se puede mejorar su
capacidad de degradación y metabolización, ayudando así a mejorar los
procesos de compostaje y a la disponibilidad de fósforo para el
metabolismo de las plantas.
La solubilización de fósforo en casi todas las circunstancias, se encuentra
ligado al metabolismo y el crecimiento. Una de las dificultades
experimentales en estudios de crecimiento es discernir condiciones
relacionadas con el metabolismo.
El uso de campos magnéticos puede modificar la actividad antibiótica que
poseen los microorganismos, siendo así una alternativa viable para ayudar
a la producción de fármacos.
75
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