Monodon Baculovirus: The Detection of Infection in Penaeus monodon

ว.วทย. มข. 41(3) 518-531 (2556) KKU Sci. J. 41(3) 518-531 (2013)

เชอโมโนดอนแบคควโลไวรส: การตรวจสอบการตดเชอในกงกลาด า Monodon Baculovirus: The Detection of Infection

in Penaeus monodon ดวงแขฑตา กาญจนโสภา1

บทคดยอ

โรคตดเชอโมโนดอนแบคควโลไวรสในกงกลาด า หรอ เอมบว (MBV; Monodon baculovirus) ไมไดกอใหเกดการตายของกงกลาด าในระยะกงเตมวย แตเปนสาเหตท าใหกงเตบโตชาสงผลใหเกดความเสยหายแกเกษตรกรผเลยงกง และการตดเชอดงกลาวเปนสาเหตหลกใหกงระยะ larva, post larva และ juvenile ตายถง 90% ซงเปนปญหาแกโรงเพาะฟก การตรวจวนจฉยโรคไวรสท าไดดวยการตรวจทางเนอเยอวทยาโดยตรวจหากอนโปรตน (inclusion body) ในนวเคลยสของเซลลตบและตบออนดวยการท า squash mount เซลลตบและตบออนแลวยอมดวยมาลาไคลกรนหรอยอมดวยฮมาโตไซลนและอโอซนบนเนอเยอตบทตรงบนแผนสไลด ในปจจบนใชวธการตรวจหาเชอไวรสในระดบชวโมเลกลดวยเทคนค polymerase chain reaction (PCR) ซงวธการ PCR ทพฒนาโดย Belcher and Young (1998) เปนวธทนาเชอถอและนยมใชในการตรวจโรคไวรส MBV ทระบาดในประเทศออสเตรเลย อนเดย และไทย ตอมาไดพฒนาวธการตรวจใหมความแมนย าขนกวา PCR เชน real time PCR และ loop-mediated isothermal amplification (LAMP) เนองจากการตรวจเชอดวย PCR ไมเหมาะสมตอการตรวจในฟารม ท าใหมการพฒนาวธการตรวจเชอโดยใชหลกการทางอมโมโนวทยา (immunological method) ดวยการผลตแอนตบอดท จ า เพาะตอเ ชอไวรส เพอพฒนาเปนแผนตรวจไวรส (immuno-chromatographic strip test) แมวธการตรวจไวรสดวยชดตรวจสอบ จะมความแมนย านอยกวาการตรวจดวย PCR แตชดตรวจสอบทพฒนาขนสามารถน ามาใชไดงายในการปฏบตงานฟารม ขนตอนการใชไมยงยาก ไมตองอาศยเครองมอราคาแพงและเกษตรกรสามารถตรวจสอบไดเอง ซงน าไปสการควบคมการแพรระบาดของเชอไวรสอยางยงยน 1สาขาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการเกษตร คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขต- สราษฎรธาน ต าบลมะขามเตย อ าเออเมอง จงหวดสราษฎรธาน 84100 E-mail: [email protected]

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 3 519บทความบทความ วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 3 519

ABSTRACT Monodon baculovirus (MBV) may cause reduction of growth rate and increase of culture

period in shrimp. In addition, virus infection in the larva, post larva and juvenile stages shows a high rate of death to 90%. This has indicated very serious in many hatcheries. Diagnosis of MBV was originally accomplished by microscopic observation of inclusion bodies in hapatopancreatic cells via malachite green staining of hepatopancreatic squash mounts or hematoxylin and eosin staining (H&E) of hepatpancreatic tissue sections. Now a day, polymerase chain reaction (PCR) that is more sensitive molecular method has been reported. However, only the method of Belcher and Young (1998) has been found to be reliable for the detection of MBV from Australia, India and Thailand. Recently, other highly sensitive nucleic acid amplification methods were developed, including a real-time PCR method and a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method. Although PCR-based methods are used widely for the detection of MBV in the laboratory, they are not suitable for pond-side detection by farmers. Simpler immunological methods using monoclonal antibody have been developed into immunochromatographic strip test. Although less sensitive than PCR, antibody-based diagnostic methods trend to be simpler, less expensive and more amenable to use in less well equipped laboratories or by unskilled personnel in the field. It is sustainable to restrict a prevalence of MBV virus.

ค าส าคญ: เชอโมโนดอนแบคควโลไวรส เอมบว กงกลาด า Keywords: Monodon baculovirus, MBV, Penaeus monodon บทน า

จากการขยายตวของอตสาหกรรมการเพาะเลยงกงสามารถสรางรายไดเขาสประเทศไทยปละหลายหมนลานบาทตดตอกนเปนระยะเวลามากกวา 15 ป โดยประเทศไทยสามารถกาวขนมาเปนผสงออกกงอนดบหนงของโลกตงแตป พ.ศ. 2533 ตดตอกนจนถงปจจบน อตสาหกรรมกงไดสรางรายไดเขาประเทศแลวเปนรายไดสทธถงประมาณ 1 ลานลานบาท ตงแตป พ.ศ. 2540-2554 (สมศกด, 2554) กงกลาด า (Penaeus monodon) มถนก าเนดในมหาสมทรอนเดย ทะเลจนใต และมหาสมทรแปซฟก ถกน ามา

เลยงกนมากในทวปเอเชยและทวปออสเตรเลย ในประเทศไทยพบการแพรกระจายทวไปในอาวไทย พบมากบร เ วณ เกาะ ชา ง บร เ วณนอกฝ ง ช มพรถ งนครศรธรรมราช ทางฝงอนดามนพบมากทจงหวดอเกตและจงหวดระนอง อาศยอยบรเวณน าลกหางจากฝงและชอบพนทเปนดนทราย สามารถทนอยในน าทมอณหอมสงและความเคมต าได เชน ปาชายเลน กงกลาด าสามารถปรบตวเขากบสอาพแวดลอมไดด ทนทาน เลยงงาย โตเรว เนอมรสชาตด จงนยมเพาะเลยงเพอการคาโดยมผลผลตเกอบทงหมดเพอการสงออก ประเทศไทยจงเปนผน าดานการผลตและ

KKU Science Journal Volume 41 Number 3520 Review520 KKU Science Journal Volume 41 Number 3 Review

สงออกกงกลาด าตดตอกนมาตงแตป พ.ศ. 2534 ตอมาเกดปญหากงตดเชอและกงโตชาท าใหผลผลตลดลงไมสามารถทจะรกษาระดบการผลตใหคงท ไดอยางตอเนอง (ชลอ, 2543) ตงแตกรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ อนญาตใหมการน าพอแมพนธกงขาว แวนาไม (Litopenaeus vannamei) ทปลอดเชอเขามาทดลองเลยงในประเทศไทยในป พ.ศ. 2545 จนถงสนเดอนกมอาพนธ พ.ศ. 2546 ปรากฏวาเกษตรกรทเลยงกงชนดนสวนใหญประสบความส าเรจมากกวาทเลยงกงกลาด า (ชลอ, 2543) และตงแตป พ.ศ. 2549 เปนตนมา ประเทศไทยไดปรบเปลยนจากอตสาหกรรมการผลตกงกลาด ามาเปนผลตกงขาว เนองจากการผลตกงขาวท าได งายและใหผลผลตมากกว า เม อเปรยบเทยบพนท การผลต เท ากน เนองจากกงขาวสามารถอยในน าไดทกระดบของบอ และอกเหตผลหนงเนองมาจากการพฒนาสายพนธของกงขาวทไดรบการพฒนามาแลวกวา 20 ป (Flegel, 2006) อยางไรกตาม ในปจจบนอาครฐไดมการสงเสรมใหพฒนาสายพนธกงกลาด าซงเปนกงพนเมองของไทยอยางตอเนองเพอใหไดสายพนธทปลอดโรคและโตเรว กงกลาด ามขอดคอมขนาดใหญกวากงขาวทระยะเวลาการเพาะเลยง 4-5 เดอน ซงเปนระยะทจบขายได มสแดงจดเมอตมสกโดยไมจ าเปนตองใหอาหารเสรมเพอเร งส และมผลก าไรตอก โลกรมมากกวาก งขาว ประกอบกบปจจบนการผลตกงขาวเรมประสบปญหาราคาตกต า เนองจากผลผลตทมปรมาณมาก รวมทงปญหาการเกดโรค จงมแนวโนมวาการเลยงกงกลาด าจะกลบคนมาอกคร ง เพ อ เปนการ ชวยส ง เสร มอตสาหกรรมการเพาะเลยงกงกลาด า การชวยแกปญหาตาง ๆ ดวยงานวจยนบวาเปนส งจ า เปนเพอการเพาะเลยงทยงยน

โรคโมโนดอนแบคควโลไวรส (Monodon baculovirus; MBV)

โรคทพบบอยและกอใหเกดความเสยหายตอผลผลตกงกลาด า สวนใหญเกดจากเชอไวรส เชน ไวรสหวเหลอง (yellow head virus; YHV) ไวรสตวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus; WSSV) ไวรสทกอใหเกดโรคแคระแกรน (infectious hypodermal and hematopoeitic necrosis virus; IHHNV) ไวรสทกอใหเกดโรคตดเชอในทางเดนอาหาร (hepatopancreatic pavovirus; HPV) ทอราซนโดรมไวรส (taura syndrome virus; TSV) และโมโนดอนแบคควโลไวรส (monodon baculovirus; MBV) (Lightner and Redman, 1998) ซงโรคตดเชอโมโน-ดอนแบคควโลไวรสในกงกลาด าเปนโรคทพบไดทวไปในประเทศไทยและในหลายอมอาคทวโลก เกดจากไวรส Penaeus monodon types Baculovirus หรอ เอมบว (MBV) ซงเปนไวรสทมขนาด 75×300 นาโนเมตร มสายพนธกรรมเปนดเอนเอสายค ม envelope รปรางแทง เพมจ านวนในนวเคลยสของเซลล จดอยในครอบครว Baculoviridae (Theilmann and Blissard, 2008)

ในเอเชย พบไวรสชนดนครงแรกในป พ.ศ. 2524 จากลกกงกลาด าในประเทศไตหวน (Lightner and Redman, 1981) หลงจากนนมการรายงานการระบาดหลายประเทศทวโลกและพบในกงทะเลหลายชนด ประเทศไทยไดตรวจพบเชอไวรส MBV ในลกกงกลาด าครงแรกในป พ.ศ. 2534 ซงกอใหเกดปญหาตออาคอตสาหกรรมเลยงกงอยางมาก เนองจากกงทตดเชอ MBV จะไมใชสาเหตท าใหกงตาย จงไมไดกอใหเกดความเสยหายตอเกษตรกรผเลยงกงกลาด ามากนก แตการทกงตดเชอจะท าใหกงมความยาวล าตวลดลงและกงโตชากวากงปกต (Flegel et al., 2004) จงตองเพม


ระยะเวลาในการเลยงนานขนเพอใหไดขนาดตามทตลาดตองการ สงผลใหสนเปลองคาใ ชจายของเกษตรกร อยางไรกตาม พบวาเชอ MBV เปนสาเหตหลกท าใหลกกงกลาด าระยะลารวา (larva) โพสทลาร-วา post larva และจวไนล (juvenile) เกดอตราการตายถง 90% เนองจากเชอจะเขาอยไปในเซลลตบและตบออนโดยไมแสดงอาการปวยใหเหนจนกวาจะมการเปลยนแปลงสอาพแวดลอมหรอมการเลยงทหนาแนนเกนไป ท าใหกงเกดความเครยด รางกายออนแอลง จงพบการแสดงอาการของโรค คอ เซลลตบและตบออนถกท าลายหลงจากนนแบคทเรยทมอย ในน าเขาสรางกายกงท าใหเกดความเสยหาย (Lightner et al., 1983) ท าใหเชอ MBV เปนปญหากบระบบโรงเพาะฟกเปนอยางมาก

การปองกนโรค MBV ในปจจบนท าโดยการลางไขกงและนอเพลยส (nauplius) ดวยน าทะเลสะอาดทไหลผานเปนเวลา 30 นาท หลงจากนนจมไขกงและนอเพลยสลงในน าผสมฟอรมาลนทความเขมขน 300 พพเอม เปนเวลา 30 วนาท ตามดวยการจมไขกงและนอเพลยสลงในน าผสมไอโอดนทความเขมขน 50-200 พพเอม เปนเวลา 30 วนาท แลวลางตอในน าทะเลทสะอาดอยางนอย 3 นาท แลวจงยายลงไปเลยงในถงเพาะฟก วธปฏบตเชนนไดท าในทกโรงเพาะฟก นอกจากการปองกนการตดเชอโดยการลางฆาเชอไขและนอเพลยสแลว การตดตามการตดเชอในโรงเพาะฟกกเปนสงจ าเปนทควรปฏบตกอนการยายลกกงเลยงในบอ

การตรวจวนจฉยโรคเอมบว (MBV) ปจจบนการตรวจจบเชอในโรงเพาะฟกม

ดวยกน 2 วธหลก คอ การตรวจทางเนอเยอวทยาและการตรวจทางชวโมเลกล

1. วธทางเนอเยอวทยา (histological methods) เชอ MBV สามารถตรวจหาไดดวยการท า

สวอช เมานท (squash mount) เซลลตบและตบออนของกงในระยะโพสตลารวา (post larva; PL) เพอตรวจหา กอนโปรตน (inclusion body) บางครงอาจเรยกวา occlusion body ซงเปนถงโปรตนทหอหมอนอาคไวรสหลาย ๆ อนอาคไว ถงโปรตนนจะป ร ะ ก อ บ ด ว ย โ ป ร ต น ห ล ก ค อ พ อ ล ไ ฮ ด ร น (polyhedrin) การตรวจวนจฉยโรคท าโดยการตรวจหาถง inclusion body อายในนวเคลยสของเซลลตบและตบออน โดยน าตบและตบออนกงมาบดบนแผนสไลดและหยดสารละลายมาลาไคตกรน (malachite green) ความเขมขน 0.1% หรอ 5% แลวน ามาสองดดวยกลองจลทรรศนจะสงเกตพบ inclusion body อยในนวเคลยสซงจะตดสเขยว โดยดเปรยบเทยบกบถงไขมนทยอมไมตดส (รปท 1) เมอเซลลตบและตบออนของกงถกท าลาย inclusion body จะถกขบออกมากบขกงและถกกนโดย larva ตวอน ๆ ในบอเดยวกนท าใหเกดการตดเชอไปยงลกกงแบบฮอรซอนทอลทรานสมสชน (horizontal transmission) ในกรณทเปนกงโตเตมวยหรอเปนพอแมพนธ อาจน าขกงจากบอเลยงมาตรวจดวยวธดงกลาว ท าใหสามารถวนจฉยโรคไดโดยไมตองใชเนอเยอกง

นอกจากนยงสามารถตรวจ inclusion body ไดโดยตรงจากเนอเยอกงทเรมเขาสระยะ PL โดยสองไฟผานชนควตเคล (cuticle) อายใตกลองจลทรรศนขนาดก าลงขยาย 40 เทา (40x) (รปท 2ก) หากน าเนอเยอตบและตบออนของกงระยะ PL ตรงบนแผนสไลดยอมดวยฮมาโตไซลน (hematoxylin) และอโอซน (eosin) (H&E) ในระยะแรกของการตดเชอ (early stage) จะพบนวเคลยสมการบวมใหญขนและเกดการอดแนนของสายโครมาตน (chromation) (รปท 2ข)


แตเมอการตดเชอเขาสระยะสดทาย (late stage) อายในนวเคลยสจะมกอนโปรตน inclusion body (occlusion body) เกดขน เมอเขาสระยะสดทายของการตดเชอเซลลจะตายและสลาย inclusion body จะถกก าจดออกทางทอตบและตบออนผสมออกมากบอจจาระท าใหเกดการแพรกระจายของเชอได (รปท 2ข) วธการตรวจหา inclusion body ดวยการยอม H&E ท าไดโดยหยดสารละลายน าเกลอความเขมขน 2.8% ทมสวนผสมของฟอรมาลนความเขมขน 10% ลงบนสไลดตามดวยการบดเนอเยอตบและตบออนจากบอกงลงแผนสไลด รอใหแหงแลวยอมดวย H&E น าไปดอายใตกลองจลทรรศนจะพบ inclusion body หรอจะดอายใตกลองฟลออเรสเซนต (fluorescence) หากในสารละลายอ โอซนม ส วนผสมของส ฟลอซ น (phloxine) (รปท 3) 2. วธทางชวโมเลกล (Molecular methods)

2.1 การตรวจวนจฉยเชอไวรสระดบดเอนเอ การตรวจเชอไวรส MBV ในกงดวยปฏกรยา

ลกโซพอลเมอเรส (polymerase chain reaction; PCR) เกดขนครงแรกในประเทศออสเตรเลย (Vickers et al., 1992) งานวจยดงกลาวไมไดรายงานล าดบ นวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในการตรวจไวรส ตอมานกวจยกลมประเทศไตหวนตรวจเชอ MBV ดวยไพรเมอรทออกแบบจากบร เวณอนรกษ (conserved region) ยนพอล ไฮดร ลของแมลง (insect polyhedrin) ใหผลผลตพซอาร (PCR product) ขนาด 600 คเบส (Chang et al., 1993; Lu et al., 1993) น าไปออกแบบเปนโพรบ (probe) ใชในการท า dot blot hybridization และ in situ hybridization เพอตรวจเชอ MBV ในเนอเยอกงกลาด าแตพบวาไพรเมอร (primer) ทออกแบบมาไมสามารถใชตรวจเชอ MBV สายพนธทระบาดในประเทศไทย ออสเตรเลย และ

อนเดยได (Belcher, 1998; Satidkanitkul et al., 2005; Flegel, 2006) ทงนเนองจากความหลากหลายของสายพนธ ไวรสท ระบาดในแตละพนทมความแตกตางกน จงไดมการพฒนาเทคนค nested PCR ซงเปนปฏกรยา PCR 2 ขนตอนอาศยไพรเมอร 2 ค ไพรเมอรคแรกจะขยายสวน DNA ทมขนาดใหญและอยนอก DNA เปาหมาย น าผลผลตจาก PCR จากขนตอนแรกเปนดเอนเอแมพมพ (DNA template) ใชไพรเมอรคท 2 เพอเพมขยาย DNA เปาหมายท าใหไดผลผลต PCR ทมขนาดสนกวาผลผลต PCR ในขนตอนแรก ซง nested PCR ชวยเพมประสทธอาพในการตรวจจบ MBV ทระบาดในประเทศไทยและออสเตรเลยไดอยางจ าเพาะเจาะจง เนองจากไพรเมอรทใชในการตรวจถกออกแบบจากชนสวน DNA ของไวรส MBV เอง ล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรแสดงในตารางท 1 ซงใหผลผลต PCR จากปฏกรยา PCR และ nested PCR ขนาดเทากบ 533 และ 361 คเบส ตามล าดบ วธนมความแมนย าสงในการตรวจทระดบ DNA ของเชอ MBV เทากบ 0.01 เฟมโตกรม (fg) (รปท 4ข) (Belcher and Young, 1998) การตรวจเชอ MBV ดวยวธ PCR แบบขนตอนเดยว สามารถตรวจพบการตดเชอ MBV ทระดบ DNA ของไวรสเทากบ 10 พโคกรม (pg) เทานน (รปท 4ก) หากมการตดเชอในปรมาณทต ากวาระดบดงกลาว จ าเปนตองตรวจการตดเชอดวย nested PCR รวมดวยซง จะชวยเพมประสทธอาพการตรวจเชอ MBV ในกงนอกจากน Belcher and Young (1998) น าอจจาระกงมาตรวจการตดเชอ MBV ดวยวธ dot blot DNA hybridization และ PCR โดยใชโพรบและไพรเมอรดงกลาวไดส าเรจเปนครงแรก ท าใหสามารถตรวจสอบการตดเชอ MBV ในพอแมพนธและกงในบอกงทสงสยวามการตดเชอไดโดยไมจ าเปนตองน าเนอเยอกงมาตรวจวเคราะห


รปท 1 การตรวจเชอ MBV ดวยการท า squash mouth ของเนอเยอตบและตบออนของกงกลาด าระยะ PL

ก. นวเคลยสตดสเขยวของมาลาไคตกรนพบ inclusion body อยในนวเคลยสท าใหนวเคลยสมขนาดใหญขน สวนเมดไขมนจะไมตดส

ข. เซลลตบและตบออนมกอนโปรตนอยในนวเคลยสและเมดไขมนในไซโตพลาสซม ทมา: Flegel (2006)

รปท 2 ถง inclusion body ในเนอเยอกง

ก. inclusion body ในเนอเยอกงระยะ PL สองผานชนควตเคลอายใตกลองจลทรรศนก าลง ขยาย 40 เทา

ข. เนอเยอกงยอม H&E แสดงการตดเชอระยะ early stage, late stage และ inclusion body จ านวน 4 กอนถกขบออกทางทอของตบและตบออน

ทมา: Flegel (2006)

ก

ก ข

ข


รปท 3 กอน inclusion body ในเนอเยอตบและตบออนจากกงวยออน (juvenile shrimp) สองดอายใตกลอง-

จลทรรศนแบบธรรมดา (ก) และกลองจลทรรศนฟลออเรสเซนต (ข) ทมา: Flegel (2006)

ตารางท 1 ล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในการตรวจเชอ MBV ดวยปฏกรยา PCR ปฏกรยา ไพรเมอร ล าดบนวคลโอไทด Tm (°C)

PCR MBV 1.4F 5-CGA TTC CAT ATC GGC CGA ATA-3 62 MBV 1.4R 5-TTG GCA TGC ACT CCC TGA GAT-3 64

nested PCR MBV 1.4NF 5-TCC AAT CGC GTC TGC GAT-3 65 MBV 1.4NR 5-CGC TAA TGG GGC ACA AGT CTC-3 66

ทมา: Belcher and Young (1998)

รปท 4 การตรวจเชอ MBV ดวยวธ PCR โดยใช p4Ec196 เปน DNA แมพมพในการท าปฏกรยา PCR ทมการ

เจอจาง DNA แมพมพลง 10 เทา เทากบ 100 พโคกรม ถง 0.001 เฟมโตกรม โดยวธ PCR (ก) และ nested PCR (ข)

ทมา: Belcher and Young (1998)

ก ข

ก

ข


ตารางท 2 จ านวนตวอยางทมการตรวจพบเชอไวรส WSSV IHHNV และ MBV ดวย TaqMan real time และ fast short-fragment PCR จากจ านวนตวอยางชนดละ 24 ตวอยาง

เชอไวรส TaqMan Fast PCR WSSV69 17 24 WSSV154 2 19 IHHNV81 0 21 IHHNV77 13 18 MBV135 0 0 ทงหมด 32 82

ทมา: Mrotzek et al. (2010)

จากปญหาความหลากหลายของสายพนธไวรสท าใหมการพฒนาไพรเมอรทสามารถตรวจ MBV ทจ าเพาะกบไวรสทระบาดในแหลงเลยงกง 4 แหลง คอ ฮาวาย ไทย ไตหวน และมาเลเซย ซงมความจ าเพาะและสามารถตรวจไวรสในแหลงดงกลาวทระดบ DNA ไวรส 100 ชด (copy) (Surachetpong et al., 2005) นอกจากวธ PCR แลว ยงมการใชเทคนค real-time PCR เพอตรวจเชอ MBV ในเนอเยอกงไทยและอนโดนเซย (Yan et al., 2009) และยงสามารถตรวจ DNA ไวรส จ านวน 1 copy ซงมความไวในการตรวจจบมากกวา PCR แตมขอจ ากด คอตองอาศยเครองมอทมราคาแพง ซงเปนปญหาตอการน ามาใชในหองปฏบตการทวไปหรอระบบฟารม จงไดพฒนาเทคนค fast short-fragment PCR (Mrotzek et al., 2010) ซงเปน PCR ทมการประยกตใชวธการท าปฏกรยาใหรวดเรวขนโดยปรบลดปรมาตรของปฏกรยา รวมท งข นตอนของอณหอมท ใ ชท าปฏก ร ย าใหเกดปฏกรยาทอณหอมเดยวกน และใชสารยอมวนทมความไวมากขน คอใชปรมาตรของปฏกรยา 5-10 ไมโครลตร อณหอม 2 ระดบ คอ การท าใหดเอนเอแมพมพเสยสอาพ (denaturation) ทอณหอม 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วนาท ตามดวยการท าใหไพรเมอร เขาเกาะบร เวณจ าเพาะในสายด เ อนเอ

(annealing) แ ล ะ เ พ ม ป ร ม า ณ ส า ย ด เ อ น เ อ (extension) ทอณหอม 60 องศาเซลเซยส โดยท าปฏกรยาจ านวน 40 รอบ ใชเวลาในการท าปฏกรยา PCR เพยง 25-30 นาท วเคราะหผลผลต PCR ขนาด 70-150 ค เบส ดวยเจลอเลคโตรโฟรซส (gel elctrophoresis) เปนเวลา 10 นาท ยอมสวนดวยเจลสตาร (GelStar) ซงเปนสารสยอมทมความไวในการตรวจจบมากกวาสยอมชนดอนๆ รวมเวลาในการตรวจสอบทงหมดประมาณ 1 ชวโมง ซงมความแมนย าและรวดเรวกวาการใช TaqMan real-time PCR ดงแสดงในตารางท 2

เทคนคทกลาวมา เ ชน Histopathology, PCR, nested PCR มขอดอยในการตรวจไวรส คอ มความไวต า ใชเวลานาน ใชสารเคมบางชนดทเปนพษ ไม เ หม าะ ในกา รปฏ บ ต ง านอาคสนาม ต อม า Nimitphak et al. (2010) ไดพฒนาวธการตรวจเชอไวร ส ให รวด เ ร วและ งาย โดยใ ช เทคน ค loop-mediated isothermal amplification (LAMP) รวมกบ lateral-flow dipstick (LFD) เรยกวา LAMP-LFD ตรวจเชอไดอายในเวลา 75 นาท (ไมรวมเวลาในการสกด DNA) วธนมความแมนย าในการตรวจ DNA เชอไวรส เทากบ 0.1 พโคกรม ซงไวกวาการตรวจดวย PCR รวมกบ nested PCR (มความไวในการตรวจ 1


พโคกรม) (Belcher and Young, 1998) LAMP เปนเทคนคทพฒนาขนโดยนกวจยชาวญปน (Notomi et al., 2000) หลกการคอ การเพมขยายยนจ าเพาะโดยตองใชไพรเมอรจ านวน 2 ชด ซงล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรจะจ าเพาะกบยนถง 6 ต าแหนง การเพมขยายยนจะ ใ ชอณหอ ม ค งท และ ใ ชคณสมบต strand displacement ของเอนไซม Bst DNA polymerase ในการท าปฏกรยา วธนมความจ าเพาะสงและราคาไมแพง เนองจากตองการเครองมองาย ๆ ในการควบคมอณหอมท 60-65 องศาเซลเซยส แทนการใชเครอง PCR เชน อางน าควบคมอณหอมในการท าปฏกรยา หลงจากนนตรวจสอบผลผลต PCR ทเกดขนจากป ฏ ก ร ย า ด ง ก ล า ว ด ว ย แ ผ น เ ม ม เ บ ร น chromatographic lateral-flow dipsticks (LFD) โดยใชหลกการ hybridization ระหวาง DNA เปาหมายกบโพรบทมการตดฉลาก ซงในขนตอนนจะใชเวลาตรวจจบเพยง 10-15 นาท และจะพบแถบสทระบวามการตดเชอบนแผนเมมเบรน วธนไมจ าเปนตองใชเครองมอทซบซอนในการท าปฏกรยาแตมความไวสงและวธการตรวจผลดวยแผนเมมเบรนจะรวดเรวกวาการตรวจผลดวยเจลอเลคโตรโฟรซส (รปท 5) LAMP-LFD ไดน ามาประยกตใชในการตรวจเชอไวรสหลายชนด เชน Taura syndrome virus (TSV), Penaeus monodon densovirus (PmDNV) และ infectious myonecrosis virus (IMNV) (Kiatpathomchai et al., 2008; Nimitphak et al., 2008; Puthawibool et al., 2009)

2.2 การตรวจวนจฉยเชอไวรสระดบโปรตน การตรวจจบเชอในระดบ DNA ดวย PCR

เปนวธทเหมาะในการตรวจเชอ MBV ในระดบหองปฏบตการ แตไมเหมาะในการปฏบตงานฟารมส าหรบเกษตรกร จงมการพฒนาวธการตรวจเชอโดยใช

หลกการโมโนโคลนอลแอนตบอด (monoclonal antibody) ขน แมวาวธนจะมความแมนย านอยกวา PCR แตเปนวธทเปนมตรกบสงแวดลอม ราคาไมแพง และในปจจบนไดมการพฒนาใหวธการดงกลาวมความสะดวกและแมนย าในการใชงานมากขนโดยพฒนาระบบการตรวจแบบแผนตรวจจบ (strip test) ซงเหมาะในการใชงานในระดบฟารม (Sithigorngul et al., 2011) การพฒนาการตรวจเชอไวรส MBV ดวยระบบ monoclonal antibody จ าเปนตองท าบรสทธโปรตนของไวรสเพอน ามาผลต antibody ทมความจ าเพาะตอไวรส MBV โดย Satidkanitkul et al. (2005) ไดประสบความส าเรจในการท าบรสทธโปรตนพอลไฮดรนจากเชอไวรส MBV และหาล าดบของกรดแอมโนจากดานปลายไนโตรเจน (N-terminal) จ านวน 25 ชนด น ามาสงเคราะหและผลตเปนโพลโคลนอลแอนตบอด (polyclonal antibody) ทมความจ าเพาะต อ โปรตนพอล ไฮดรนของ เ ช อ แต polyclonal antibody ทผลตไดมความไวและความจ าเพาะต า ตอมา Boonsanongchokying et al. (2006) ไดสกดโปรตนพอลไฮดรนจากเนอเยอตบกงทเปนโรค น ามาตรวจสอบน าหนกโมเลกล ใหคาน าหนกเทากบ 58 กโลดาลตน (kDa) (รปท 6ก) และน าโปรตนดงกลาวมาผลต monoclonal antibody ได 7 ชนด (รปท 6ข) เมอน า antibody ดงกลาวมาทดสอบทางเนอเยอวทยา พบวามความจ าเพาะตอเนอเยอกงทตดเชอ MBV และไมท าปฏกรยากบเนอเยอกงทตดเชอไวรสชนดอน เชน HPV, YHV และ WSSV

ตอมาไดมการโคลนยนพอลไฮดรนของ MBV หาล าดบยนและผลตเปนรคอมบแนนตโปรตนพอลไฮ- ดรนทางดาน N-terminal (OB-N) และ C-terminal (OB-C) พบวา โปรตนทง 2 สวนมความจ าเพาะตอ monoclonal antibody ทผลตได ในงานวจยกอน


หนาน (ตารางท 3) (Chaivisuthangkura et al., 2008) ไดน าโปรตนทงสองสวนมาผลต monoclonal antibody และทดสอบความจ าเพาะดวยวธ dot blotting และ western blotting พบวา สามารถตรวจจบเชอ MBV ไดและไมมความจ าเพาะกบเชอไวรสชนด TSV, YHV, WSSV และ PmDNV เมอเปรยบเทยบกบ PCR พบวา มความไวนอยกวา PCR 100 เทา (Sridulyakul et al., 2011) จากผลงานวจยดงกลาวท าใหทมวจยของ Wangman et al. (2012) ได พฒนาแผ นตรวจอ มม โ น โครมา โตกราฟฟค

(immunochromatographic strip test) เพอใชตรวจสอบเชอ MBV ในระดบฟารมไดโดยมขนตอนการเตรยมตวอยางงาย ๆ คอ บดเนอเยอกงดวยสารละลายฟอสเฟตบฟเฟอรซาลน (phosphate buffer saline, PBS) ใหความรอนเปนเวลา 15-60 นาท น าไปตรวจเชอดวยแผน strip test รอเวลา 15 นาท จะทราบผลการตรวจ (รปท 7) ซงมความไวนอยกวา PCR ปกต 200 เทา ถงแมวาความไวจะต า แตวธการตรวจสอบเชอท าไดงายและรวดเรว ซงเหมาะในการน าไปใชตรวจเชอในโรงเพาะฟกและฟารมได

รปท 5 เจลอเลคโตรโฟรซส และ LAMP-LFD แสดงความไวในการตรวจไวรส MBV ในกงระยะ PL เมอใช DNA แมพมพ ทระดบ 1 นาโนกรม ถง 0.1 เฟมโตกรม

ข

ก

ค


รปท 5 เจลอเลคโตรโฟรซส และ LAMP-LFD แสดงความไวในการตรวจไวรส MBV ในกงระยะ PL เมอใช DNA

แมพมพ ทระดบ 1 นาโนกรม ถง 0.1 เฟมโตกรม (ตอ) ก. LAMP ข. Nested PCR (commercial kit, Ezee Gene) ค. One step PCR (Nimitphak et al., 2010) ง. LAMP-LFD

หมายเหต: M คอ DNA มาตรฐาน (DNA marker), N คอ ปฏกรยาทไมมการเตม DNA แมพมพ (negative control), P คอ ปฏกรยาทม DNA plasmid เปนชดควบคม (positive control)

ทมา: Nimitphak et al. (2010)

รปท 6 SDS-PAGE

ก. น าหนกโมเลกลของโปรตนพอลไฮดรน ทสกดไดจากไวรส MBV ข. Western blot polyhedrin เมอท าปฏกรยากบ MBV polyclonal antibody (a) และmonoclonal

antibody จ านวน 7 ชนด (b-h) ทมา: Boonsanongchokying et al. (2006)

ก ข

ง


ตารางท 3 การทดสอบความจ าเพาะของ monoclonal antibody ชนดตาง ๆ ตอรคอมบแนนต MBV polyhedrin ดวย Western blotting (Chaivisuthangkura et al., 2008)

รปท 7 ผลการตรวจการตดเชอ MBV ในกงดวย MBV strip test

ก. โปรตนสกดของกงตดเชอ ข. โปรตนสกดของกงไมตดเชอ

ทมา: Wangman et al. (2012)

สรป แมวาเชอ MBV จะไมกอใหเกดความเสยหาย

รนแรงตออตสาหกรรมการเล ยงก งก ลาด า เม อเปรยบเทยบกบ YHV หรอ WSSV แตหากกงในระยะวยออนตดเชอ MBV จะท าใหเกดการตายในอตราการทสง สงผลกระทบตอโรงเพาะฟกในการผลตลกกงใหไดปรมาณตามท ตองการและปลอดจากเ ชอ MBV เนองจาก หากน ากงทตดเชอลงเลยงในบอ กงจะโตชากวากงปลอดเชอจงตองเพมระยะเวลาในการเลยงนานขน การเฝาระวงการตดเชอจงเปนสงจ าเปนตอระบบโรงเพาะฟก เทคนคทไดกลาวมา การพฒนาการตรวจเชอในระดบเนอเยอจนถงระดบ DNA และโปรตนจน

สามารถพฒนาเปนชดตรวจสอบ ซงชดตรวจสอบทพฒนาขนแมจะมความแมนย าในการตรวจจบนอยกวาการตรวจในระดบด เอนเอ แตการตรวจดวยชดตรวจสอบมวธการใชงาย ไมตองอาศยเครองมอราคาแพง เกษตรกรสามารถตรวจหาเชอไดดวยตวเอง ซงน าไปสการปองกนการแพรระบาดของเชอได

กตตกรรมประกาศ ผเขยนขอขอบคณ ศาสตราจารยเกยรตคณ

ดร.นธยา รตนาปนนท และ ดร.อททรา พงษทพยพาท ส าหรบค าแนะน าในการเขยนและตรวจทานแกไขบทความวจยฉบบน

ก

ข


เอกสารอางอง สมศกด ปณตธยาศย. (2554). อตสาหกรรมกงไทยป 2554 และ

แนวโนม. สมาคมกงไทย. แหลงขอมล: http:// www.thaichamber.org/userfiles/file/7(1).pdf. คนเมอ วนท 14 กนยายน 2555.

ชลอ ลมสวรรณ. (2543) กงไทย 2000. กรงเทพ: เจรญรตนการพมพ. 259 หนา.

Belcher, C. R. (1998). Molecular detection and characterization of monodon baculovirus. Thesis. University of Queensland, Brisbane.

Belcher, C. R. and Young, P. R. (1998). Colourimetric PCR-based detection of monodon baculovirus in whole Penaeus monodon postlarvae. Journal of Virological Methods 74: 21-29.

Boonsanongchokying, C., Sang-oum, W., Sithigorngul, P., Sriurairatana, S., and Flegel, T. W. (2006). Production of monoclonal antibodies to polyhedrin of monodon baculovirus (MBV) from shrimp. ScienceAsia 32: 371-376.

Chang, P. S., Lo, C. F., Kou, G. H., Lu, C. C., and Chen, S. N. (1993). Purification and amplification of DNA from Penaeus monodon-type baculovirus (MBV). Journal of Invertebrate Pathology 62: 116-120.

Chaivisuthangkura, P., Tawilert, C., Tejangkura, T., Rukpratanporn, S., Longyant, S., Sithi gorngul, W., and Sithigorngul, P. (2008). Molecular isolation and characterization of a novel occlusion body protein gene from Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus. Virology 381: 261-267.

Flegel, T. W., Nielsen, L., Thamavit, V., Kongtim, S., and Pasharawipas, T. (2004). Presence of multiple viruses in non-diseased, cultivated shrimp at harvest. Aquaculture 240: 55-68.

Flegel, T. W. (2006). Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a historical

perspective with emphasis on Thailand. Aquaculture (258): 1-33.

Kiatpathomchai, W., Jaroenram, W., Arunrut, N., Jitrapakdee, S., and Flegel, T. W. (2008). Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with the lateral flow dipstick test for specific detection of the Taura syndrome virus. Journal of Virological Methods 153: 214-217.

Lightner, D.V. and Redman, R.M. (1981). A baculovirus-caused disease of penaeid shrimp, Penaeus monodon. Journal of Invertebrate Pathology 38: 299-302.

Lightner, D.V. and Redman, R.M. (1998). Shrimp disease and current diagnostic methods. Aquaculture. 164 (1-4): 201-220.

Lightner, D. V., Redman, R. M and Bell, T. A. (1983). Observations on the geographic distribution, pathogenesis and morphology of the baculovirus from Penaeus monodon fabricius. Aquaculture 32: 209-33.

Lu, C. C., Tang, K. F. J., Kou, G. H. and Chen, S. N. (1993). Development of a Penaeus monodon type baculovirus (MBV) DNA probe by polymerase chain reaction and sequence analysis. Journal of Fish Diseases 16: 551-559.

Mrotzek, G., Haryanti, Koesharyani, I., and Tretyakov, A. N., Sugama, K., and Saluz, H. P. (2010). Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses. Journal of Virological Methods 168: 262-266.

Nimitphak, T., Kiatpathomchai, W., and Flegel, T. W. (2008). Shrimp hepatopancreatic parvovirus detection by combining loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow dipstick. Journal of Virological Methods 154: 56-60.


Nimitphak, T., Meemetta, W., Arunrut, N., Senapin, S., and Kiatpathomchai, W. (2010). Rapid and sensitive detection of Penaeus monodon nucleopolyhedro virus (PemoNPV) by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral-flow dipstick. Molecular and Cellular Probes 24: 1-5.

Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28 (12): e63.

Puthawibool, T., Senapin, S., Kiatpathomchai, W., and Flegel, T. W. (2009). Detection of shrimp infectious myonecrosis virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. Journal of Virological Methods 156: 27-31.

Satidkanitkul, A., Sithigorngul, P., Sang-oum, W., Rukpratanporn, S., Sriurairatana, S., Withyachumnankul, B., and Flegel, T.W. (2005). Synthetic peptide used to develope antibodies for detection of polyhedrin from P. monodon baculo virus (MBV). Diseases of Aquatic Organisms 65: 79-84.

Sithigorngul, P., Rukpratanporn, R., Chaivisuthang kura, P., Sridulyakul, P., and Longyant, S. (2011). Simultaneous and rapid detection of white spot syndrome virus and yellow head virus infection in shrimp with a dual immunochromatographic strip test. Journal of Virological Methods 173: 85–91.

Sridulyakul, P., Suwannaka, T., Chaivisuthangkura, P., Longyant, S., Rukpratanporn, S., and

Sithigorngul, P. (2011). Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus detection using monoclonal antibodies specific to recombinant polyhedrin protein. Aquaculture 321: 216-222.

Surachetpong, W., Poulos, B.T., Tang, K.F.J., and Lightner, D.V. (2005). Improvement of PCR method for detection of Penaeus monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp. Aquaculture 249: 69-75.

Theilmann, D. A. and Blissard, G. W. (2008). Baculoviruses: molecular biology of nucleopolyhedroviruses. In: Encyclope- dia of Virology 254-265.

Vickers, J. E., Lester, R. J. G., Spradbrow, P. B., and Pemberton, J. M. (1992). Detection of Penaeus monodon-type baculovirus (MBV) in digestive glands of postlarval prawns using polymerase chain reaction. In Shariff, M., Subasinghe, R.P., Arthur, J.R. (Eds.), Diseases in Asian Aquaculture, vol. I. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines, pp. 127-133.

Wangman, P., Longyant, S., Chaivisuthangkura, P., and Sridulkakul, P. (2012). Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus detection using an immunochromatographic strip test. Journal of Virological Methods 183: 210-214.

Yan, D., Tang, K.F.J., and Lightner, D.V. (2009). Development of a real-time PCR assay for detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp. Journal of Invertebrate Pathology 102: 97-100.

Monodon Baculovirus: The Detection of Infection in Penaeus monodon

Documents

Transcript of Monodon Baculovirus: The Detection of Infection in Penaeus monodon