Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik - Campus … · • Hinweise zur Auswertung, Bewertung ......
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Formales
• Tagesablauf• Gruppenaufteilung, Teilnahmeliste• Sicherheitsbelehrung• Laborverantwortliche• Protokollbögen• Labortagebuch• Hinweise zur Auswertung, Bewertung• Literatur
Molekulare Ökologie: Themen• Molekulare Identifikation: Arten, Individuen, Geschlecht, DNA-
Barcoding• Verhaltensbiologie: Fortpflanzungserfolg, Elternschaft,
Nahrungswahl, Ausbreitung• Populationsgenetik: Populationsgröße, Populationsstruktur,
Fragmentierung, Wachstum, Mortalität, Migration• Phylogeographie: Verbreitungsgeschichte, Verbreitungsgebiet,
Hybridisierung, Herkunftsbestimmung• Genetik im Artenschutz: genetische Diversität, Inzuchtdepression,
Auszuchtdepression, Warenkontrolle• Genetische Ökotoxikologie: Umweltselektion, Anpassung,
Bioindikation• Genetische Mikrobiologie: mikrobielle Gemeinschaften,
Identifikation von Arten• Genetisch modifizierte Organismen: Vertikaler Gentransfer,
Horizontaler Gentransfer
Genetik im Artenschutz (Conservation Genetics): Zielsetzungen
• Reduzierung des Aussterberisikos durch Reduzierung von Inzucht und Verlust genetischer Diversität
• Identifikation von Risikopopulationen• Beschreibung der Struktur einer Population• Klärung des taxonomischen Status• Ableitung von Managementeinheiten• Entdeckung von Hybridisierungen• Nicht-invasive Beprobung• Beschreibung geeigneter Wiederansiedlungsgebiete• Auswahl geeigneten Besatzmaterials• Identifikation einer Art anhand geringer Probenmengen• Besseres Verständnis der Biologie einer Art (Populationsgröße,
Geschlechterverhältnis, Paarungssystem, Ausbreitung...)
Small populationsForensics
Understandingspecies biology
Evolutionary genetics
Taxonomic uncertainties
Introgression
population structure/fragmentation
Outbreeding
Loss of genetic diversityInbreeding Mutational accumulation
Extinction
Reproductive fitness
Genetic management
Identify management unit
wild captive
reintroductionGenetic adaptation to captivity
Nach Frankham et al. 2003
Conservation Genetics
Ist die Taxonomie eindeutig?
Nein Ja
Genetischer Vergleich der Populationen
Chromosomen in identischer Zahl und Form?
Nein Ja – vermutlich eine Art
Unterschiede zwischen Populationen?
Ist Introgression ein Problem?
NeinJa – unterschiedliche Art
Unterschiede innerhalb Populationen?
NeinJa Unbekannt
Einsatz genetischer Marker
Nein Ja – Polymorphismen innerhalb Art
Einsatz weiterer Marker
Nach Frankham et al. 2003
Ist die Taxonomie eindeutig?
Nein Ja
Kleine Population?
NeinJa
Probleme durch Inzucht oder geringe genetische Diversität?
NeinJa
Population zur Kreuzung vorhanden?
Fragmentierung der Population?
NeinJa
Populationstruktur?
Ausreichender Genfluß?
NeinJa Unbekannt
Einsatz genetischer MarkerNach Frankham et al. 2003
Sind bei der Art alle relevanten Aspekte der
Biologie bekannt?
NeinJa
Abstammung? ja nein
Paarungssystem? ja nein
Genfluss? ja nein
Populationsgröße? ja nein
Bottlenecks? ja nein
Falls nein, können genetische Marker hierzu Informationen liefern?
Unterliegt die Art illegaler Jagd oder Handel?
Falls ja, können genetische Marker genutzt werden, um diese zu
entdecken?
Nach Frankham et al. 2003
DNA im ZellkernArt Größe des Genoms
[bp] Chromosomen
Hefe 14 x 106 16
Fadenwurm 80 x 106 4
Taufliege 165 x 106 4
Krallenfrosch 3000 x 106 18
Maus 3000 x 106 20
Mensch 3000 x 106 23
Mais 5000 x 106 10
Zwiebel 15000 x 106 8
Knippers 1997
Vergleich Prokaryoten / Eukaryoten
Prokaryot Eukaryot
Arten Bakterien, blaugrüne Algen
Tiere, Pflanzen, Pilze, Protisten
Organisation der DNA als dichtes Knäuel in der Zelle (Nucleoid)
im Zellkern eingeschlossen,
Protein-DNA-Komplex (Chromatin)
Mitochondrien, (Chloroplasten) nicht vorhanden vorhanden
Endoplasmatisches Reticulum nicht vorhanden vorhanden
Organisation des Eukaryoten-Genoms
• Gene– Kodierungssequenzen (Exons)– Nichtkodiderungssequenzen (Introns)
• Repetitive DNA-Elemente– Satelliten-DNA
• Centromer-DNA• Telomer-DNA• Minisatelliten• Mikrosatelliten
– andere repetitive Elemete• SINE-DNA (short interspersed repetitive elements)• LINE-DNA (long interspersed repetitive elements)
Organisation des Eukaryoten-Genoms
• Minisatelliten: Kopien von DNA-Abschnitten aus 16-64 Basenpaaren (bp)
• Mikrosatelliten: 10 bis 50 Kopien von einfachen Sequenzen aus 2 bis 4 bp
• SINE-DNA (short interspersed repetitive elements): Abschnitte von 100 bis 500 bp
• LINE-DNA (long interspersed repetitive elements): 6000 bis 7000 bp
http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/pv92/aluframeset.htm
Alu-Element-Polymorphismus PV92
• Alu-Elements:– Short INterspersed Elements (SINE)– Erkennungsstelle für Alu– Transposon / „jumping gene“
(Alu→mRNA →DNA →Insertion)– Nur bei höheren Primaten (Entstehung vor 60. Mio. Jahren) )
• PV92:– für Menschen spez. Insertion eines Alu-Elements auf
Chromosom 16– 2 Allele (715 bp = „+“Allel; 415 bp = „-“Allel)
www.geneticorigins.org
Alu-Element PV92
Interview mit Prof. Dr. Lynn Jorde, Eccles Institute of Human Genetics, Utah:
• Vererbung von Alu-Elementen und Verwendung im Studium der menschlichen Abstammung
http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/usingalu.rm
• Hinweise auf fortlaufende Insertionen und Entstehungsrate
http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/genetics.rm
Wobble-Hypothese (engl. to wobble = wackeln, schaukeln, schwanken)
• durch Kombination der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bzw. Uracil (U) lassen sich 64 verschiedene Tripletts bilden
• Drei Tripletts werden als Stopp-Signal interpretiert, die übrigen 61 codieren Aminosäuren
• da nur 21 Aminosäuren (einschließlich Selenocystein) vorkommen, kann eine Aminosäure durch verschiedene Codon-Tripletts (Synonyma) codiert werden:– Arginin, Leucin → 6 synonyme Tripletts– übrigen Aminosäuren → 4, 2 oder eins (Methionin)
(Wikipedia)
Wobbles in der Primersequenz
• R = A+G• Y = C+T• M = A+C• K = G+T• S = G+C• W = A+T• H = A+T+C• B = G+T+C• D = G+A+T• V = G+A+C• N = G+A+T+C
Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen
• Vertreter der Art Homo erectus wanderten vor 1,5 Mill. aus Afrika aus und bildeten Populationen in Europa und angrenzenden Gebieten (→ Homo neanderthalensis). Jüngste Funde sind ca. 30.000 Jahre alt.
• 40.000 bis 100.000 Jahre alte Fossilfunde des „modernen“ Menschen Homo sapiens sind aus Afrika, Europa und Asien bekannt.
Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen
• Theorie 1 - Multiregionale (polyphyletische) Abstammung:Der „moderne“ Mensch entwickelte sich aus den regionalen Populationen des Homo erectus.
• Theorie 2 – Monophyletische (Out-of-Africa) Abstammung:Der „moderne“ Mensch entwickelte sich in Afrika, erreichte von dort die übrigen Kontinente und verdrängte Homo erectus.
Methoden
• DNA-Extraktion mit Chelex• Elektrophoretischer Nachweis des Alu-Element-
Polymorphismus PV92• Sequenzanalyse eines mitochondriellen
Genabschnitts
Auswertung
• Allelhäufigkeit• Genotypenhäufigkeit• Heterozygotiegrad• Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Vergleich mit anderen Gruppen→ www.bioservers.org
Links:https://www3.nationalgeographic.com/genographic/index.htmlhttp://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1069
Fragestellung 2:
Wirken Querbauwerke im Verlauf der Haardtrandbäche als
Wanderungshindernisse für Gammariden (Gammarus
fossarum)?
Probestellen
Gewässer (Probestelle) Mündung
Triefenbach (oberhalb Hilschweiher) Speyerbach
Modenbach (unterhalb Buschmühle) Speyerbach
Hainbach (unterhalb Walddusche) Speyerbach
Schwelterbach (bei Grillhütte) Queich
Gewässergüte
Schw
elte
rbac
h Hainbach
Modenbach
Triefbach
http://www.geoportal-wasser.rlp.de/geoportal/html/geoportal_homepage.html
Wie variable sind Proteine?
Anteil polymorpher Proteine(häufigstes Allel < 99 %):
Säugetiere 15%Vögel 22%Insekten 33%Pflanzen 25%
AllozymanalyseVorteile: kostengünstig; Marker
sind co-dominantNachteile: erfasst nur kleinen
Anteil von DNA-Variationen. Viele DNA Varianten führen nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz (z.B. synonyme Substitutionen) bzw einer Änderung der Mobilität im Gel.
Anwendungen:Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung
Interpretation des Bandenmusters
Bandenmuster für a) ein monomeres Enzym, b) ein dimeres Enzym und c) ein tetrameres Enzym. Die Homozygoten werden durch 11 und 22 repräsentiert, die Heterozygoten durch 12.
Restriktionsenzyme
• Restriktionsenzyme schneiden an spezifischen Erkennungssequenzen. Diese Sequenzen sind oft Palindrome:6-cutter: GAATTC 4-cutter: TCGA
CTTAAG AGCT
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html
RFLP-AnalysePCR-Analyse:1) PCR-Reaktion2) Restriktionsverdau3) Gelelektrophorese
Southern-Analyse:1) Restriktionsverdau2) Gelelektrophorese3) Hybridiserung
? ? ?
RFLP-Analyse
Vorteile: Marker sind co-dominant. Genetische Variationen werden direkt auf Ebene der DNA-Sequenz festgestellt.
Nachteile: hoher Arbeitsaufwand, benötigt viel Probenmaterial
Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung
RFLP-Analyse
Aufgabe:• Fragmentgröße 1800 bp• Schnittstellen:
– Allel A – 400bp & 800bp– Allel B – 400bp
→Fragmentmuster für AA, AB, BB?
PCR(polymerase chain reaction)
http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1017
RAPD
Vorteile: schnell, kostengünstig, hochvariabel.Nachteile: Marker sind dominant. Geringe
Reproduzierbarkeit.Anwendungen: Populationsstrukturierung,
geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung
AFLP(amplified fragment length
polymorphism)
Digestion of DNA with
two enzymes
Ligation of adapters
Primers complementary to adapters and to 3’ region of some of the fragments
AFLP
Vorteile: schnell, kostengüstig, hochvariabel, gute Reproduzierbarkeit.
Nachteile: Marker sind dominant.Anwendungen: Populationsstrukturierung,
geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung
Minisatelliten / Mikrosatelliten (VNTR)
→ http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1074
Mikrosatelliten
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
195 200 205 210 215 220 225 230 235 240
6cSQ_S0005.F11_07050703Z8
Size (nt)
Dye
Sig
nal
2 0 0
2 07 . 5 5
2 0 8 . 6 3
2 0 9 . 6 52 1 0 . 7 0
2 1 1 . 6 7
2 1 2. 7 9
2 1 3 . 7 7
2 1 4 . 8 9
2 1 5 . 8 6
2 1 6 . 8 5
2 2 0
2 4 0
Fragmentlängenbestimmung mit Hilfe eines Sequencers
Größenmarker 212 bp-Peak 216 bp-Peak
Mikrosatelliten
Vorteile: hochvariabel, co-dominantNachteile: kostenintensiv, lange
EntwicklungszeitAnwendungen: Populationsstruktur, geograph.
Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Forensik
Sequenzanalyse
• Sequenzierung nach Sanger(Anfang 1970er Jahre)
http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1189
• Automatische Sequenzierunghttp://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html
Sequenzanalyse
Vorteile: hochvariabel, co-dominantNachteile: kostenintensivAnwendungen: Populationsstruktur, geograph.
Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung, Phylogenetik
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem
deutschen Arzt Wilhelm Weinberg.• HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population:
– Sehr große Individuenzahl– Panmixie– Keine Selektion– Keine Mutationen– Keine Migration
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
p + q = 1 p2 + 2pq + q2 = 1
• p: relative Häufigkeit des Auftretens des Allels A• q: Allelfrequenz des (zu A komplementären) Allels a• p² = h(AA)• 2pq = h(Aa)• q² = h(aa)
Hobs = Hexp ?
p = 0,5; q = 0,5p² = h(AA) = 0,252pq = h(Aa) = 0,5q² = h(aa) = 0,25
AA
AA
AB
AB
AB
AB
BB
BB
Hobs = Hexp ?
Wahlund-Effekt:Separation von Teilpopulationen führt zu einem Rückgang der Heterozygotie
AB
AA
AA
BB
AB
BB
BB
AA
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem
deutschen Arzt Wilhelm Weinberg.• HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population:
– Sehr große Individuenzahl– Panmixie– Keine Selektion– Keine Mutationen– Keine Migration
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Inzucht:
Conner & Hartl 2004
0
0
HHHF −
=
F = InzuchtkoeffizientH0 = erwartete HH = beobachtete H
Grundlagen der genetischen Vielfalt
• Zunahme der genetischen Vielfalt durch:
1. Generation 2. Generation
Mutation Migration
→http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1073
Grundlagen der Populationsgenetik
• Migration: Inselmodell des Genflusses
)(
)1(
11
1
−−
−
−=−=
+−=
ttt
tt
ppmppp
mpmpp
∆
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Selektion:
wirkt über Unterschiede in der individuellen Überlebensrate und im Fortpflanzungserfolg
1. Generation 2. Generation
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Genetische Drift:
nur ein Teil der Population reproduziert sich erfolgreich; hierdurch können sich Merkmalshäufigkeiten zufällig ändern
1. Generation 2. Generation
Grundlagen der genetischen Vielfalt
• Genetische Drift: Inzuchtkoeffizient∆F = 1 / 2Ne (Wright 1931)Ft = 1 - (1 - 1/(1/2 Ne)t
Primack 1995
Grundlagen der genetischen Vielfalt
• Migration vs. Drift
Conner & Hartl 2004
mNF
eST 41
1+
=
FST = Fixierungsindex
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Flaschenhals-Effekt (bottleneck effect)
Gründer-Effekt (founder effect)
1. See 2. See1. Generation
2. See2. Generation
1. Generation 3. Generation2. Generation
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Ebene der VariationBeobachtete Heterozygotieinnerhalb von Teilpopulationen (HI)
Differenzierung zwischen Teilpopulationen (FST)
Effekt auf all Loci?
Mutation ↑ ↑ NeinGenfluss (Migration) ↑ ↓ JaGendrift ↓ ↑ JaSelektion ↑↓ ↑↓ Nein
Grundlagen der genetischen Vielfalt
Inzucht:
Paarung nahverwandter Tiere kann zur Kombination von zwei defekten Genen an einem Genort führen
Zunahme von Erbkrankheiten, verminderte Überlebens- und Fortpflanzungsrate (Inzuchtdepression)
Grundlagen der genetischen VielfaltHybridisierung:
die Kreuzung bereits differenzierter Populationen oder (Unter-)Arten kann die genetische Vielfalt erhöhen oder zu einem Verlust der genetischen Identität führen (Auszuchtdpression)
1. See 2. See
3. See
Projekte
Laufend/ abgeschlossen:• Nicht-invasive Bestandsschätzung von Wildschweinen
(Kolodziej, Thometzek, Eckert)• Phylogenetik von Bachforellenpopulationen des
Pfälzerwaldes (Holzhäuser)• Erfolgskontrolle von Fischwanderhilfen (Wolf)• Sozialstruktur bei Waschbären (Peter)• Warenkontrolle von Heilpflanzen (Süß)
Geplant:• Phylogenetik von Edelkrebspopulationen• Genfluss zwischen Fischbeständen der Rheinaltarme